CN111850031B - 蛋白质GmFULc在调控植物产量中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蛋白质GmFULc在调控植物产量和/或光周期和/或株高和/或开花时间中的应用，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。实验证明，提高大豆中蛋白质GmFULc的表达量和/或活性，得到转基因大豆；与野生型大豆相比，转基因大豆的开花时间提前，株高、荚数、四粒荚数和单株粒数均显著增加。蛋白质GmFULc可以调控植物产量、光周期、株高和开花时间。本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质GmFULc在调控植物产量中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质GmFULc在调控植物产量中的应用。
背景技术
大豆为短日照植物(short day plant，SDP)，对光周期反应十分敏感，这一特性严重阻碍大豆品种的适应性，限制大豆播种范围，影响产量水平的有效发挥。
大豆的开花时间和成熟期是重要的农艺性状，控制着大豆品种的产量、品质和适应性。大豆生育期性状的改良一直是研究的热点问题。早熟性是各地区对大豆育种的普遍要求，也是我国大豆等植物向北扩展种植的基础和高海拔地区利用土地资源的基础。现代生物工程技术可以打破生物之间的界限来实现遗传物质的重新组合，按照人类预先设计进行育种，使之符合人类的需要。生物工程技术与传统育种技术相结合，通过对早熟、高产的优良基因的遗传选育，培育出具有早熟、高产性状的大豆新品种，并且为大豆转基因育种提供必需的理论佐证，一方面可以为通过基因转化的方法培育其他作物新品种提供资料，同时还将产生巨大的社会经济及生态效益。
发明内容
本发明的目的是提高植物产量。
本发明首先保护蛋白质GmFULc的应用，可为如下S1)至S5)中的至少一种：
S1)调控植物产量；
S2)调控植物株高；
S3)调控植物开花时间；
S4)调控植物光周期；
S5)培育产量增加和/或株高增加和/或开花时间提前和/或光周期改变的转基因植物。
上述应用中，所述蛋白质GmFULc可为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物产量和/或株高和/或开花时间和/或光周期相关的蛋白质。
其中，序列表中序列2由239个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护编码上述任一所述蛋白质GmFULc的核酸分子的应用，可为如下S1)至S5)中的至少一种：
S1)调控植物产量；
S2)调控植物株高；
S3)调控植物开花时间；
S4)调控植物光周期；
S5)培育产量增加和/或株高增加和/或开花时间提前和/或光周期改变的转基因植物。
上述应用中，所述编码蛋白质GmFULc的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质GmFULc的DNA分子；
b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质GmFULc的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表中序列1由720个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质GmFULc的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质GmFULc的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质GmFULc，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质GmFULc的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述任一所述的应用中，所述调控植物产量可为增加植物产量或降低植物产量。
上述任一所述的应用中，所述调控植物株高可为增加植物株高或降低植物株高。
上述任一所述的应用中，所述调控植物开花时间可为开花时间提前或开花时间延迟。
上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)豆科植物；c4)大豆；c5)大豆品种东农50；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥Columbia-0亚型。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中所述蛋白质GmFULc的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的产量增加和/或株高增加和/或开花时间提前和/或光周期改变。
上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质GmFULc的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高出发植物中上述任一所述蛋白质GmFULc的表达量和/或活性的效果。
上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质GmFULc的表达量和/或活性”具体可通过向出发植物中导入编码蛋白质GmFULc的核酸分子实现。
上述方法中，所述“向出发植物中导入编码蛋白质GmFULc的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体***编码所述蛋白质GmFULc的核酸分子，得到的重组质粒。所述重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pB7WG2-GmFULc。重组质粒pB7WG2-GmFULc中含有序列表中序列1所示的DNA分子。
所述转基因植物具体可为实施例提及的转GmFULc基因拟南芥株系(如OX-1、OX-5、OX-23)或转GmFULc基因大豆株系(如GmFULcOX-1、GmFULcOX-2)。
本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质GmFULc的含量和/或活性，从而增加产量和/或增加株高和/或开花时间提前和/或改变光周期。
上述任一所述的方法中，所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)豆科植物；c4)大豆；c5)大豆品种东农50；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥Columbia-0亚型。
上述任一所述产量可表现为百粒重、单株粒数和荚数中的至少一种。
上述任一所述荚数具体可为四粒荚数。
上文中，植物光周期的改变可表现为开花时间的改变。光周期是指昼夜周期中光照期和暗期长短的交替变化。植物开花对日照长度的反应有三种类型，分别为长日照植物、短日照植物和日中性植物。长日照植物指在24h昼夜周期中，日照长度长于一定时数才能成花的植物。短日照植物指在24h昼夜周期中，日照长度短于一定时数才能成花的植物。日中性植物的成花对日照长度不敏感，只要其他条件满足，在任何长度的日照下均能开花。
实验证明，在短日照条件下，在野生型拟南芥中过表达GmFULc基因可以增加株高、开花时间提前、较少莲座叶数和增加结荚数目；在长日照条件下，在野生型拟南芥中过表达GmFULc基因可以增加株高、开花时间提前、较少莲座叶数、增大叶片表面积和增加结荚数目；向大豆品种东农50中导入重组质粒pB7WG2-GmFULc，经筛选得到T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株。与大豆品种东农50相比，T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株早花，株高、荚数、四粒荚数、单株粒数和百粒重均显著增加。由此可见，蛋白质GmFULc可以调控植物产量、株高、开花时间和光周期。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为重组质粒pB7WG2-GmFULc的构建过程图谱。
图2为T3代纯合转GmFULc基因拟南芥的分子鉴定结果。
图3为长日照培养22天时，T3代纯合转GmFULc基因拟南芥和野生型拟南芥植株的表型。
图4为长日照培养22天时，T3代纯合转GmFULc基因拟南芥和野生型拟南芥植株的叶片大小比较。
图5为长日照培养52天时，T3代纯合转GmFULc基因拟南芥和野生型拟南芥植株的表型。
图6为短日照培养76天时，T3代纯合转GmFULc基因拟南芥和野生型拟南芥植株的表型。
图7为采用免疫胶体金试纸条检测T0代拟转GmFULc基因大豆的检测结果。
图8为草铵膦涂抹鉴定T1代转GmFULc基因大豆。
图9为T1代转GmFULc基因大豆的分子鉴定。
图10为生殖生长时期植株表型比较。
图11为生殖生长时期花序比较。
图12为T1代转GmFULc基因大豆的豆荚形态。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大豆品种东农42记载于如下文献中：陈立君.不同播期对大豆东农42产质量性状动态变化规律研究.[J].大豆科学，2008.。在下文中，大豆品种东农42简称为东农42。大豆品种东农50记载于如下文献中：Yu JIN，Juanjuan QU，Guangming REN，Lei DONG.Effectsof Transgenic DREB Soybean Dongnong50on the Diversity of Soil Ammonia-oxidizing Bacteria.Agricultural Science&Technology.2013，14(7):988-992.在下文中，大豆品种东农50简称为东农50。
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)记载于如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A geneticlink between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171，公众可以从东北农业大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验。在下文中，拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)简称野生型拟南芥。
根癌农杆菌LBA4404记载于如下文献中：陈中健，刘兵，王宏斌，王金发，刘良.(2003)水稻重复序列RRD3缺失体介导gusA在水稻愈伤组织中的表达式.热带亚热带植物学报，lI(2)：127-131.
pB7WG2载体为invitrogen公司的产品。
实施例1、蛋白质GmFULc的编码基因(GmFULc基因)的克隆
1、采用Trizo1法提取生长30天的东农42幼苗的叶片的总RNA，然后利用反转录酶反转录出第一链cDNA，得到东农42的cDNA。
2、以步骤1获得的东农42的cDNA为模板，采用5’-ATGGGGAGGGGAAGAGTGGAG-3’和5’-CTATTCATTTGTAGGAAGAGGCATCA-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到约720bp的双链DNA分子。
反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
将步骤2得到的双链DNA分子进行测序。测序结果表明，步骤2得到的双链DNA分子(GmFULc基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
实施例2、转GmFULc基因拟南芥的获得及鉴定
一、重组质粒pB7WG2-GmFULc的构建
重组质粒pB7WG2-GmFULc的构建过程图谱见图1。
1、采用Trizo1法提取生长至30天的东农42幼苗的叶片的总RNA，然后利用反转录酶反转录出第一链cDNA，得到东农42的cDNA。
2、以步骤1获得的东农42的cDNA为模板，采用5’-CACCATGGGGAGGGGAAGAGTGGAG-3’和5’-CTATTCATTTGTAGGAAGAGGCATCA-3’组成的引物对进行PCR扩增，回收约720bp的DNA片段。
反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
3、完成步骤2后，将回收的DNA片段和pENTRY D-TOPO载体(invitrogen公司的产品)进行TOPO反应，得到重组质粒pENTRY D-TOPO-GmFULc。
4、完成步骤3后，将重组质粒pENTRY D-TOPO-GmFULc和pB7WG2载体进行LR反应，得到重组质粒pB7WG2-GmFULc。
将重组质粒pB7WG2-GmFULc进行测序。测序结果表明，重组质粒pB7WG2-GmFULc中含有序列表中序列1所示的DNA分子。
重组质粒pB7WG2-GmFULc表达序列表中序列2所示的蛋白质GmFULc。
二、LBA4404/pB7WG2-GmFULc的获得
将重组质粒pB7WG2-GmFULc导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，命名为LBA4404/pB7WG2-GmFULc。
三、转GmFULc基因拟南芥的获得
1、野生型拟南芥的种植
(1)取离心管，加入少量干燥的野生型拟南芥种子，密封；然后置于4℃春化3-5d。
(2)完成步骤(1)后，取所述野生型拟南芥种子，用75％(v/v)乙醇水溶液清洗10-30s，然后用灭菌的蒸馏水反复吹吸冲洗2-3次。
(3)完成步骤(2)后，取所述野生型拟南芥种子，用10％(m/v)的次氯酸钠水溶液涡旋吹打8min，然后用灭菌的蒸馏水反复吹吸3-5次。
(4)完成步骤(3)后，取所述野生型拟南芥种子，加入灭菌水，吹吸种子使其重悬；然后吸取种子均匀的点到MS固体培养基上，封口膜密封，组培室中培养。当野生型拟南芥种子发芽长出3-4片叶子时(约5-7天)，将其转至灭菌的人工土(由蛭石、珍珠岩和花土混合而成；蛭石、珍珠岩和花土的体积比为3:1:1)，然后22℃、光暗交替培养。光暗交替培养是指光培养(16h)和暗培养(8h)交替进行；光培养时为白光，光照强度为350μmol m-2s-1。
2、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将步骤二获得的LBA4404/pB7WG2-GmFULc转至野生型拟南芥中，获得T1代转GmFULc基因拟南芥种子。具体步骤如下：
(1)取LBA4404/pB7WG2-GmFULc的单克隆，加入20mL含25mg/mL利福平、25mg/mL链霉素和100mg/mL壮观霉素的YEP液体培养基，28℃、200rpm震荡培养，得到OD600nm值为0.5左右的农杆菌菌液1。
(2)将步骤(1)得到的农杆菌菌液1接种至200mL含25mg/mL利福平、25mg/mL链霉素和100mg/mL壮观霉素的YEP液体培养基(接种体积比为1:10)，28℃、200rpm震荡培养，得到OD600nm值为1.6-2.0的农杆菌菌液2。
(3)取步骤(2)得到的农杆菌菌液2，室温、5000rpm离心10min，收集沉淀。
(4)取步骤(3)收集的沉淀，用渗透培养基(含5％(m/v)蔗糖和0.02％(v/v)silwetL-77的1/2MS固体培养基)重悬，得到OD600nm值为0.8的重悬液。
(5)将步骤(4)得到的重悬液倒入平皿，然后将野生型拟南芥植株横倒在平皿边，使植株花序在重悬液中浸泡30s；之后将野生型拟南芥植株横放入暗箱中恒温室培养过夜，然后竖直培养。侵染4-5d后，根据拟南芥的生长情况继续浸染1-2次。培养3-4周，待种子成熟后，收取种子，干燥器中存放。
3、将步骤2获得的T1代转GmFULc基因拟南芥种子播种于含有5mg/LPPT的MS固体培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转GmFULc基因阳性苗，T1代转GmFULc基因阳性苗收到的种子即为T2代转GmFULc基因拟南芥种子。
4、将步骤3筛选出的不同株系的T2代转GmFULc基因拟南芥种子播种于含有5mg/LPPT的MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为GmFULc基因***一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转GmFULc基因拟南芥种子。
5、将步骤4筛选出的T3代转GmFULc基因拟南芥种子再次播种于含有5mg/LPPT的MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转GmFULc基因拟南芥。将其中3个T3代纯合转GmFULc基因拟南芥株系分别命名为GmFULcOX-1(以下简称OX-1)、GmFULcOX-5(以下简称OX-5)和GmFULcOX-23(以下简称OX-23)，并进行后续实验。
四、分子鉴定
待测拟南芥种子为OX-1的T3代种子、OX-5的T3代种子、OX-23的T3代种子或野生型拟南芥种子。
(1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化2天。
(2)完成步骤(1)后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天，得到待测拟南芥幼苗。
(3)提取待测拟南芥幼苗的基因组DNA并以其作为模板，采用GmFULc-F：5’-ATGGGGAGGGGAAGAGTGGAGTT-3’和GmFULc-R：5’-CTATTCATTTGTAGGAAGAGGCATCA-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约720bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的待测拟南芥幼苗为阳性苗。
部分鉴定结果见图2(M为DNA Marker，WT为野生型拟南芥)。结果表明，OX-1的T3代种子、OX-5的T3代种子和OX-23的T3代种子获得的幼苗均为阳性苗。
五、表型分析
1、长日照处理拟南芥的表型分析
长日照培养指光培养(16h)和暗培养(8h)交替进行；光培养时为白光，光照强度为350μmol m-2s-1。
待测拟南芥种子为OX-1的T3代种子、OX-5的T3代种子、OX-23的T3代种子或野生型拟南芥种子。
(1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后4℃春化2-3天。
(2)完成步骤(1)后，将所述待测拟南芥种子铺于MS固体培养基上，长日照培养7-10天，获得待测拟南芥植株。
(3)完成步骤(2)后，将所述待测拟南芥植株移植于营养土中，长日照培养22天，然后观察待测拟南芥植株的表型。
实验结果见图3(WT为拟南芥野生型)和图4(WT为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T3代纯合转GmFULc基因拟南芥株系(OX-1、OX-5和OX-23)的莲座叶数明显减少、开花时间明显提前且叶片表面积明显增大。
(4)完成步骤(2)后，将所述待测拟南芥植株移植于营养土中，长日照培养52天，然后观察待测拟南芥植株的表型。
实验结果见图5(WT为拟南芥野生型)和表2(WT为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T3代纯合转GmFULc基因拟南芥株系(OX-1、OX-5和OX-23)的株高明显增加、开花时间明显提前、莲座叶数明显减少和结荚数目明显增加。
表2.长日照下的表型数据
开花时间(天) 莲座叶数目(片) 株高(cm) 结荚数目(个)
WT 29.06±2.29 14.2±1.92 16.66±2.11 21.2±10.64
GmFULcox-1 24.65±1.93** 13.3±1.07* 29.94±1.46** 80.05±8.70**
GmFULcox-5 25.82±1.74** 13.5±1.36* 27.02±0.99** 71.60±6.53**
GmFULcox-23 20.80±1.81** 11.9±0.93* 30.10±2.87** 86.85±10.35**
注：**表示P<0.01，*表示P<0.05。
上述结果表明，在长日照条件下，在野生型拟南芥中过表达GmFULc基因可以增加株高、开花时间提前、较少莲座叶数、增大叶片表面积和增加结荚数目。
2、短日照处理拟南芥的表型分析
短日照培养指光培养(8h)和暗培养(16h)交替进行；光培养时为白光，光照强度为350μmol m-2s-1。
待测拟南芥种子为OX-1的T3代种子、OX-5的T3代种子、OX-23的T3代种子或野生型拟南芥种子。
(1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后4℃春化2-3天。
(2)完成步骤(1)后，将所述待测拟南芥种子铺于MS固体培养基上，短日照培养7-10天，获得待测拟南芥植株。
(3)完成步骤(2)后，将所述待测拟南芥植株移植于营养土中，长日照培养76天，然后观察待测拟南芥植株的表型。
实验结果见图6(WT为拟南芥野生型)和表3(WT为拟南芥野生型)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T3代纯合转GmFULc基因拟南芥株系(OX-1、OX-5和OX-23)的开花时间明显提前、莲座叶数明显减少、株高明显增加、结荚数目明显增加。
表3.短日照下表型数据
开花时间(天) 莲座叶数目(片) 株高(cm) 结荚数目(个)
WT 77.93±3.32 39.33±4.56 19.11±2.98 32.86±9.24
GmFULcox-1 52.43±2.98** 25.40±1.38* 22.53±1.87* 50.77±5.36*
GmFULcox-5 59.05±3.36** 26.05±2.03* 21.41±1.55 45.06±7.14*
GmFULcox-23 51.27±2.81** 23.22±1.45* 25.15±1.91* 54.35±6.73*
注：**表示P<0.01，*表示P<0.05。
上述结果表明，在短日照条件下，在野生型拟南芥中过表达GmFULc基因可以增加株高、开花时间提前、较少莲座叶数和增加结荚数目。
实施例3、转GmFULc基因大豆的获得及鉴定
光照培养时为白光，光照强度为350μmol m-2s-1。
一、重组质粒pB7WG2-GmFULc的构建
同实施例2中步骤一。
二、LBA4404/pB7WG2-GmFULc的获得
同实施例2中步骤二。
三、T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株的获得
1、T0代拟转GmFULc基因大豆的获得
采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法(记载于如下文献中Olhoft P M，Donovan C M，Somers D A.Soybean(Glycine max)transformation using maturecotyledonary node explants[J].Methodsin Molecular Biology，2006，343(12)：385)，将步骤二获得的LBA4404/pB7WG2-GmFULc转至大豆品种东农50中，获得T0代转GmFULc基因大豆。具体步骤如下：
(1)取大豆品种东农50的种子，先用氯气灭菌16h，然后无菌水浸泡12h，得到吸涨的大豆。
(2)完成步骤(1)后，取吸涨的大豆，去皮，将2个子叶分开，用刀片在子叶节附近轻划出伤口，然后将其放入农杆菌重悬液中侵染30min。
农杆菌重悬液的制备方法如下：取步骤二获得的重组农杆菌的单克隆，加入20mLYEP液体培养基，28℃、200rpm震荡培养，得到OD600nm值为0.5左右的菌液1；将菌液1接种至200mL YEP液体培养基，28℃、200rpm震荡培养，得到OD600nm值为1.6-2.0的菌液2；取菌液2，室温、5000rpm离心10min，收集沉淀；取沉淀，用液体浸染培养基重悬，得到OD600nm值为0.8的农杆菌重悬液。
液体浸染培养基的溶质及其浓度为0.321g/LB5培养基(GamborgB-5BasalMedium)，30g/L蔗糖，3.9g/LMES，1.67mg/L6-BA，0.25mg/LGA3和0.04g/LAS；溶剂为水；pH值为5.4。
(3)完成步骤(2)后，取大豆子叶，先用滤纸吸干重悬液，然后置于固体共培养培养基，25℃光照培养5天。
固体共培养培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基，30g/L蔗糖，3.9g/LMES，1.67mg/L6-BA，0.25mg/LGA3，0.04g/LAS，0.4g/LL-Cys，0.15g/LDTT，0.5％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；pH值为5.4。
(4)完成步骤(3)后，将大豆子叶转移至丛生芽诱导培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)28天。
丛生芽诱导培养基的溶质及其浓度为0.321g/L B5培养基，30g/L蔗糖，0.59g/LMES，1.67mg/L 6-BA，200mg/LCef，200mg/LTim，5mg/L草铵膦和0.75％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；pH值为5.4。
(5)完成步骤(4)后，先从大豆子叶上切下丛生芽，然后将该丛生芽转移至丛生芽伸长培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)至丛生芽中再生的植株伸长至2cm。
丛生芽伸长培养基的溶质及其浓度为4.43g/L MS，30g/L蔗糖，0.59g/LMES，0.5mg/LGA3，1mg/LZR，1mg/LAsp，0.1mg/LIAA，200mg/L Cef，200mg/LTim，3mg/L草铵膦和0.75％(w/v)琼脂；溶剂为水；pH值为5.6。
(6)完成步骤(5)后，将丛生芽中再生的植株从基部切下，然后转移至生根培养基，25℃、光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)，得到T0代拟转GmFULc基因大豆。
生根培养基的溶质及其浓度为0.321g/LB5培养基，20g/L蔗糖，3.9g/LMES，1mg/LIBA和0.8％(w/v)琼脂粉；溶剂为水；pH值为5.6。
2、T0代拟转GmFULc基因大豆的鉴定
(1)分别取大豆品种东农50的植株或T0代拟转GmFULc基因大豆的植株，采用免疫胶体金试纸条(EnviroLogix公司的产品)检测是否有BAR蛋白的表达(具体步骤参考免疫胶体金试纸条的说明书)。有BAR蛋白的表达即为T0代转GmFULc基因大豆。
部分检测结果图7(WT为大豆品种东农50，1和2为T0代转GmFULc基因大豆)。
(2)提取T0代转GmFULc基因大豆植株的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用35S-GmFULc-F：5’-CGACAGTGGTCCCAAAGATGGA-3’和GmFULc-R：5’-CTATTCATTTGTAGGAAGAGGCATCA-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约1370bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的T0代转GmFULc基因大豆植株再次被鉴定为T0代转GmFULc基因大豆植株。
3、T1代转GmFULc基因大豆的获得和鉴定
(1)待T0代转GmFULc基因大豆成熟后采收，自交，得到T1代转GmFULc基因大豆。
(2)将大豆品种东农50或T1代转GmFULc基因大豆的种子播种于温室中，当三出复叶完全展开后，通过在叶片上涂抹浓度为120mg/L的草铵膦水溶液进行抗性鉴定。具有草铵膦抗性的植株即为T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株。
部分鉴定结果见图8(WT为大豆品种东农50，1和2为T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株)。
(3)提取T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用35S-GmFULc-F：5’-CGACAGTGGTCCCAAAGATGGA-3’和GmFULc-R：5’-CTATTCATTTGTAGGAAGAGGCATCA-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约1370bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株再次被鉴定为T1代转GmFULc基因大豆植株。
将“T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株”替换为大豆品种东农50的植株，其它步骤均不变，作为阴性对照。
将“T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株”替换为水，其它步骤均不变，作为对照。
检测结果见图9(M为DNA Marker，WT为大豆品种东农50，1和2为T1代转GmFULc基因大豆)。
经过上述步骤，将其中2个T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株分别命名为GmFULcOX-1和GmFULcOX-2，并进行后续实验。
四、表型分析
分别播种待测大豆(大豆品种东农50、GmFULcOX-1或GmFULcOX-2)，长日照培养(光培养(13h)和暗培养(11h)交替进行；光培养时为白光，光照强度为350μmol m-2s-1)，观察表型并统计株高、荚数、节数、分枝数、四粒荚数、单株粒数和大豆开花时间。
部分结果见图10(WT为大豆品种东农50)、图11(WT为大豆品种东农50)、图12(WT为大豆品种东农50)、表4(R1为始花期，R2为盛花期，R3为始荚期，R4为盛荚期，R5为始粒期，R6为鼓粒期，R7为成熟初期，R8为完熟期)和表5。表4和表5中，GmFULc-OX为GmFULcOX-1和GmFULcOX-2的平均值。结果表明，与大豆品种东农50相比，T1代转GmFULc基因大豆的阳性植株早花，株高、荚数、四粒荚数、单株粒数和百粒重均显著增加。
上述结果表明，在长日照条件下，在大豆品种东农50中过表达GmFULc基因开花时间提前，株高、荚数、四粒荚数、单株粒数和百粒重均显著增加。
表4.花期数据
Figure BDA0002024431870000131
注：*表示P<0.05。
表5.表型数据
Figure BDA0002024431870000132
注：**表示P<0.01，*表示P<0.05。
<110> 东北农业大学
<120> 蛋白质GmFULc在调控植物产量中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> Glycine max
<400> 1
atggggaggg gaagagtgga gttgaagagg atcgagaaca agatcaatag gcaagtgacg 60
ttctcaaaga gaaggtctgg tttgctgaag aaagcgcgcg agatctctgt gctgtgcgat 120
gctgatgtgg ctctcatcgt cttctccacc aaaggcaagc ttttggacta ctccaaccaa 180
ccttgtacgg aaagaattct tgaacggtat gagaggtatt cgtatgcgga gaggcaactt 240
gttggagatg atcaaccacc aaatgaaaac tgggttatag aacatgaaaa gctcaaggct 300
agggtggagg tactacagag aaatcaaagg aattttatgg gagaagatct ggacagctta 360
aatcttagag gacttcagag tttggagcaa caacttgatt ccgctctcaa acacattaga 420
tcacgaaaga accaagccat gaatgaatct atttctgagc ttcagaaaaa ggataggaca 480
ctccgtgaac acaacaactt gctctccaag aagataaagg aaaaagagaa ggagctgacc 540
ccacaagagc aagaaggact gcaaaataac atggatgtga gctctgtcct tgtaactcaa 600
ccactggagt ccctgactat tggaggctcc ccagaagtca aatctaatga agaaactcca 660
acctcatgtc gacctaaaac cattcttccc cctttgatgc ctcttcctac aaatgaatag 720
<210> 2
<211> 239
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 2
Met Gly Arg Gly Arg Val Glu Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala
20 25 30
Arg Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe
35 40 45
Ser Thr Lys Gly Lys Leu Leu Asp Tyr Ser Asn Gln Pro Cys Thr Glu
50 55 60
Arg Ile Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Ser Tyr Ala Glu Arg Gln Leu
65 70 75 80
Val Gly Asp Asp Gln Pro Pro Asn Glu Asn Trp Val Ile Glu His Glu
85 90 95
Lys Leu Lys Ala Arg Val Glu Val Leu Gln Arg Asn Gln Arg Asn Phe
100 105 110
Met Gly Glu Asp Leu Asp Ser Leu Asn Leu Arg Gly Leu Gln Ser Leu
115 120 125
Glu Gln Gln Leu Asp Ser Ala Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Lys Asn
130 135 140
Gln Ala Met Asn Glu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Asp Arg Thr
145 150 155 160
Leu Arg Glu His Asn Asn Leu Leu Ser Lys Lys Ile Lys Glu Lys Glu
165 170 175
Lys Glu Leu Thr Pro Gln Glu Gln Glu Gly Leu Gln Asn Asn Met Asp
180 185 190
Val Ser Ser Val Leu Val Thr Gln Pro Leu Glu Ser Leu Thr Ile Gly
195 200 205
Gly Ser Pro Glu Val Lys Ser Asn Glu Glu Thr Pro Thr Ser Cys Arg
210 215 220
Pro Lys Thr Ile Leu Pro Pro Leu Met Pro Leu Pro Thr Asn Glu
225 230 235

Claims (10)

1.蛋白质GmFULc的应用，为如下S1)或S2)：
S1)提高植物产量；
S2)培育产量增加的转基因植物；
所述蛋白质GmFULc为a1)或a2)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述植物为大豆或拟南芥。
2.编码权利要求1中所述蛋白质GmFULc的核酸分子的应用，为如下S1)或S2)：
S1)提高植物产量；
S2)培育产量增加的转基因植物；
所述植物为大豆或拟南芥。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：编码权利要求1中所述蛋白质GmFULc的核酸分子为如下b1)或b2)所示的DNA分子：
b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
4.根据权利要求1至3任一所述的应用，其特征在于：所述产量表现为百粒重、单株粒数和荚数中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述荚数为四粒荚数。
6.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中权利要求1中所述蛋白质GmFULc的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的产量增加；
所述植物为大豆或拟南芥。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高出发植物中权利要求1中所述蛋白质GmFULc的表达量和/或活性通过向出发植物中导入编码所述蛋白质GmFULc的核酸分子实现。
8.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1中所述蛋白质GmFULc的含量和/或活性，从而增加产量；
所述植物为大豆或拟南芥。
9.根据权利要求6至8任一所述的方法，其特征在于：所述产量表现为百粒重、单株粒数和荚数中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述荚数为四粒荚数。
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