CN111848740B - 一种***分泌源性多肽及其在抑制白色念珠菌感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种***分泌源性多肽及其在抑制白色念珠菌感染中的应用，涉及生物技术领域，通过一种新型多肽PDMAC抑制白色念珠菌感染***上皮细胞。所述的多肽氨基酸序列为ATPTSTLRTAPPPKVLT，理论分子量为1751.06Da，理论等电点为11，不稳定系数49.74，脂肪系数74.71，亲水性为‑0.21，通过固相法合成，且在C端和N端分别通过聚乙二醇和氨甲酸进行化学修饰。

Description

一种***分泌源性多肽及其在抑制白色念珠菌感染中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种***分泌源性多肽及其在抑制白色念珠菌感染中的应用。
背景技术
外阴***念珠菌病(Vulvovaginal candidiasis,VVC)是最常见的女性外阴***炎症之一。统计表明，约75％的女性一生中至少患过一次VVC，45％的女性经历过两次或以上发病。长期患VVC，不但给患者的生活带来巨大烦恼，还将导致***和***、输卵管***、***，继发性***，生殖道恶性肿瘤等疾病；妊娠期妇女患VVC，有发生胎膜早破、早产、胎儿宫内感染、新生儿鹅口疮等风险。因此，VVC的预防和治疗是女性生殖道感染研究的重中之重。
VVC的主要致病菌为白色念珠菌，是一种上皮细胞内的寄生菌，具有菌丝相和酵母相两种形态。在人体内，白色念珠菌通常以非致病的酵母相存在于***、皮肤、口腔、上呼吸道及肠道，与宿主共生。当***正常菌群组成改变(应用广谱抗菌素)或全身及***局部免疫受到抑制时(妊娠、糖尿病、应用皮质类固醇激素等)，白色念珠菌转化为能够快速生长并破环宿主细胞的菌丝相粘附定植于***上皮细胞，随后在多种酶的作用下完成入侵***上皮细胞的过程；另外，白色念珠菌还可寄生于巨噬细胞内逃避机体免疫应答机制，导致局部白色念珠菌的迅速生长繁殖，打破***微生态平衡，最终导致以白色念珠菌为主，同时伴有棒状杆菌、类杆菌、葡萄球菌增多的混合感染。
目前VVC的治疗方案以局部短疗程使用抗真菌药物、恢复***正常菌群为主，但其临床疗效不如人意，仍有许多患者在接受规范化抗真菌治疗后出现反复发作的外阴***念珠菌病(Recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)，且易产生耐药。近年来，针对VVC开发新型药物时有报道，如：棘白菌素可以非竞争性抑制白色念珠菌细胞壁多糖——β-(1,3)-D-葡聚糖的生物合成，破环细胞壁完整性，从而达到杀菌目的；小檗碱、丁香罗勒等植物类提取物可阻断白色念珠菌利用L-甲基-蛋氨酸合成细胞膜重要组分麦角甾醇、且可抑制白色念珠菌由酵母相转为菌丝相，降低其致病能力；Histatin、BM2等阳离子多肽可结合白色念珠菌细胞膜磷脂双分子层外部的酸性磷脂、脂多糖，破环脂质双分子层结构而达到抑制白色念珠菌生长繁殖的目的。
生物体内存在多种具有生理活性的多肽，与感染、免疫调节、肿瘤病变等密切相关。***分泌物检查是目前妇产科疾病诊断中的常规检查手段，具有方便、快捷、无创的优势。而女性***分泌物主要由***、宫颈腺体、子宫内膜的分泌物和***粘膜的渗出液、***菌群、脱落的***上皮细胞混合而成，行使物理屏障、菌群平衡、免疫应答等功能，从而起到对机体的抗菌和保护作用。***分泌物中存在近千种抗菌的内源性多肽，且广泛受到激素水平(***、黄体期、月经期、妊娠期、围绝经期等)的影响，这为理解***分泌物的功能提供了一定的分子基础，但***分泌物的成分和作用机理复杂，继续挖掘其中新的保护成分和机制成为了一条有效的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型***分泌源性多肽PDMAC，氨基酸序列为ATPTSTLRTAPPPKVLT，具有分子量低、亲脂性好、易于入胞与入核等优点。
本发明的另一目的是提供多肽PDMAC在抑制白色念珠菌感染***上皮细胞中的应用，通过调控Beclin-1的表达来影响***上皮细胞的自噬功能，从而增强其清除入侵胞内白色念珠菌的作用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种***分泌源性多肽，所述的多肽氨基酸序列为ATPTSTLRTAPPPKVLT。
优选的，所述的多肽理论分子量为1751.06Da，理论等电点为11，不稳定系数49.74，脂肪系数74.71，亲水性为-0.218。
优选的，所述的多肽通过固相法合成丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-丝氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-苏氨酸-丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-亮氨酸-苏氨酸的氨基酸序列。
优选的，所述多肽的C端和N端分别通过聚乙二醇和氨甲酸进行化学修饰。
一种***分泌源性多肽在抑制白色念珠菌感染中的应用。
优选的，所述的多肽通过调控Beclin-1的表达来影响***上皮细胞的自噬功能。
优选的，所述的多肽通过对***上皮细胞自噬功能的影响来增强其清除入侵胞内白色念珠菌的作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、该发明中，多肽PDMAC理论分子量为1751.06Da，理论等电点为11，不稳定系数49.74，脂肪系数74.71，亲水性为-0.218，具有分子量低、亲脂性好、易于入胞与入核等优点，具备开发为药物或日化添加剂的优势；
2、该发明中，多肽PDMAC具有调节***上皮细胞自噬功能的作用，增强***上皮细胞清除入侵胞内白色念珠菌的能力，抑制***白色念珠菌感染的能力，具备开发为抗真菌感染药物或日化添加剂的能力；
3、该发明中，多肽PDMAC具有成为抗生素替代物的潜力，具有一定机率能克服真菌耐药的问题；
4、该发明中，多肽PDMAC为人体分泌的内源性物质，具备良好的免疫相容性。
附图说明
图1为本发明的对照组白色念珠菌入侵***上皮细胞的数量；
图2为本发明的多肽PDMAC作用后白色念珠菌侵入***上皮细胞的数量；
图3为本发明的对照组白色念珠菌感染小鼠***组织和PDMAC作用后白色念珠菌感染小鼠***组织的HE染色对比图；
图4为本发明的多肽PDMAC的二级结构预测图；
图5为本发明的pull-down裂解液PAGE胶分离后银染分析筛选与PDMAC多肽相互作用的蛋白分子；
图6为本发明的多肽PDMAC和Beclin-1在***上皮细胞VK2/E6E7中的共定位分析；
图7为本发明的多肽PDMAC对***上皮细胞VK2/E6E7中自噬相关蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
一种***分泌源性多肽，多肽氨基酸序列为ATPTSTLRTAPPPKVLT。
进一步，多肽理论分子量为1751.06Da，理论等电点为11，不稳定系数49.74，脂肪系数74.71，亲水性为-0.218。
实施例1
通过固相法合成氨基酸序列为丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-丝氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-苏氨酸-丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-亮氨酸-苏氨酸(ATPTSTLRTAPPPKVLT)的多肽PDMAC。
对多肽的主链基团和侧链基团进行化学修饰，利用聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和氨甲酸分别修饰多肽PDMAC的C端和N端，以提高PDMAC的活性和稳定性，抑制酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。
将合成的多肽PDMAC加入到***上皮细胞VK2/E6E7的培养基中，制造多肽作用组和对照组，孵育24小时后在多肽作用组内加入白色念珠菌菌液，采用PI/SYTO9染色及流式细胞仪技术检测两组白色念珠菌入侵VK2/E6E7细胞情况。
结合图1和图2，结果显示多肽PDMAC作用后，VK2/E6E7细胞内侵入的白色念珠菌显著减少。
一种***分泌源性多肽在抑制白色念珠菌感染中的应用。
实施例2
购买SPF级别6-8周龄雌性BALB/c小鼠，每天保持12小时明暗环境，温度控制在25℃，食物与水随机喂养。
在感染***前9天和感染前2天皮下注射50μg***(溶于100μL过滤的无菌芝麻油)预处理，用微量加样器取20μL白色念珠菌(109CFU/mL)接种于小鼠***内，***深度约1-1.5cm，注入后使菌液贮留约2小时，每日一次。7天后，取小鼠***分泌物进行镜检和生化病理检查。
结果显示，接种白色念珠菌后，小鼠的外阴肿胀、分泌物增多；结合图3中a图HE染色显示，接种白色念珠菌后的小鼠***组织间质增厚疏松、甚至发生断裂，炎症症状明显。说明小鼠***感染白色念珠菌致霉菌性***炎模型建立成功。
同时，以30μM多肽PDMAC每天***注射一次，连续注射一周。
结果显示，与对照的模型组相比，结合图3中b图HE染色显示，多肽PDMAC干预组的小鼠外阴充血红肿症状明显改善，其***炎症表现减轻；取***分泌物稀释涂板后进行菌落计数，结果显示白色念珠菌数量明显减少。
实施例3
利用PredictProtein(www.predictprotein.org)网站分析PDMAC的二级结构，结果显示该多肽中存在多个具有蛋白结合能力的氨基酸以及多个与蛋白相互作用的位点(如图4显示)，提示PDMAC的功能可能通过与靶蛋白相互作用来实现。
使用pull-down方法筛选与PDMAC多肽相互作用的蛋白分子(如图5显示)。经过生物素标记、与细胞的蛋白裂解液共孵育、洗脱液洗脱、SDS-PAGE梯度胶分离、银染后取差异条带行质谱分析，发现了三条差异性较大的肽段——β-Tubulin、SLP-2、Beclin-1，且质谱信号较强。
再将PDMAC转入VK2/E6E7细胞，通过免疫荧光实验观察PDMAC和Beclin-1的定位。
结合图6结果表明PDMAC和自噬相关蛋白Beclin-1存在较大程度的共定位，提示Beclin-1为PDMAC作用的靶标。
通过Western方法检测PDMAC干预后VK2/E6E7细胞内自噬相关蛋白p62、LC3-I及LC3-II的表达水平。
结合图7结果表明与对照组相比，PDMAC干预后LC3-II的表达水平提高，而p62、LC3-I表达水平明显降低，由此证明自噬是PDMAC抑制***白色念珠菌感染的机制，Beclin-1为其潜在靶基因。
因此，PDMAC通过调控Beclin-1的表达来影响***上皮细胞的自噬功能，从而增强其清除入侵胞内白色念珠菌的作用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (3)

1.一种***分泌源性多肽，其特征在于：所述的多肽氨基酸序列为ATPTSTLRTAPPPKVLT。
2.根据权利要求1所述的一种***分泌源性多肽，其特征在于：所述的多肽通过固相法合成丙氨酸-苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-丝氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-苏氨酸-丙氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-亮氨酸-苏氨酸的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的一种***分泌源性多肽，其特征在于：所述多肽的C端和N端分别通过聚乙二醇和氨甲酸进行化学修饰。
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