CN111848509A - 分子转子型红光线粒体探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了分子转子型红光线粒体探针及其制备方法和在活细胞和组织中的应用。所述分子转子型红光线粒体探针结构式如下：
Figure DDA0002631129040000011
命名为SQ。本发明还给出了SQ的制备方法：利用三苯胺，DMF和POCl3反应得到4‑(二苯胺)苯甲醛；利用4‑甲基‑喹啉与1‑碘乙醇反应得到1‑(2‑羟乙基)‑2‑甲基喹啉‑1‑吲哚碘盐；将4‑(二苯胺)苯甲醛与1‑(2‑羟乙基)‑2‑甲基喹啉‑1‑吲哚碘盐通过Knoevenagel反应得到SQ。本发明的分子转子型红光线粒体探针具有高信噪比、高选择性、良好的生物兼容性和较低的细胞毒性，在生物标记领域具有良好的应用前景。

Description

分子转子型红光线粒体探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及线粒体荧光探针技术领域，尤其涉及分子转子型红光线粒体探针及其制备方法和应用。
背景技术
线粒体是有氧呼吸进行的主要场所，在细胞的生命活动中发挥着重要作用。研究表明，线粒体具有特殊的界面结构，可以参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并且还具有调节细胞生长和细胞周期的能力。线粒体的功能变化，可以通过其形态和数量的变化反映出来，与不同的人类疾病有关，包括阿尔茨海默氏症和帕金森氏病等。因此，高保真可视化和长期跟踪线粒体动态变化对生理学、病理学和药理学领域至关重要。
目前，已有多种方法可以实现线粒体的可视化，包括线粒体蛋白免疫印迹，柠檬酸合酶活性测定，扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)等。但是这些方法成本高，耗时长，而且不可用于线粒体在活细胞或组织中的完整过程的可视化。为了解决这一问题，提出了一种荧光成像方法，其在敏感性、可视化和对活细胞和组织的无创检测方面具有许多优势。传统的线粒体探针如罗丹明123可以清晰地成像活细胞和组织中的线粒体，但这些探针高度依赖于线粒体膜电位(MMP)。当活细胞中的MMP降低时，他们将从线粒体上脱落，更不用说跟踪和可视化组织中的线粒体了；并且罗丹明123存在细胞毒性大、不适宜长时间线粒体成像等诸多劣势。因此，需要设计一种不受MMP影响的分子转子型线粒体探针，使其紧密嵌入到线粒体内膜磷脂双分子层膜中，增强与线粒体的结合亲和力且细胞毒性低，这对于推动荧光探针在实际中的应用具有至关重要的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供分子转子型红光线粒体探针及其制备方法和应用。本发明制备的分子转子型红光线粒体探针具有高信噪比、高选择性、良好的生物兼容性和较低的细胞毒性，在生物标记领域具有良好的应用前景。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一方面，提供分子转子型红光线粒体探针，其化学结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002631129020000021
化学名称为(E)-2-(4-(二苯胺)苯乙烯基)-1-(2-羟乙基)喹啉-1-吲哚碘盐，命名为SQ。
本发明的第二方面，提供上述分子转子型红光线粒体探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)在冰浴中，向DMF中滴加POCl3，搅拌后得DMF和POCl3混合溶液；将三苯胺溶于CHCl3得三苯胺溶液，将DMF和POCl3混合溶液与三苯胺溶液混合后得到反应液，反应液于60℃油浴加热回流12h，冷却至室温后将反应液倒入冰水中，用NaOH溶液中和，再用二氯甲烷萃取，收集有机相，用饱和食盐水水洗有机相，然后用无水硫酸镁干燥；干燥后通过柱层析法分离得到4-(二苯胺)苯甲醛；
(2)将4-甲基吡啶和1-碘乙醇混合，油浴加热回流；反应结束后将得到的产物加入二氯甲烷中至产物完全溶解，再倒入石油醚中，生成棕色固体即为1-(2-羟乙基)-2-甲基喹啉-1-吲哚碘盐；
(3)将1mmol步骤(1)得到的1-(2-羟乙基)-2-甲基喹啉-1-吲哚碘盐和1mmol步骤(2)得到的4-(二苯胺)苯甲醛混合，再加入无水乙醇使其完全溶解，然后滴加哌啶，回流反应，反应结束后通过柱层析法分离得到SQ。
上述制备的反应式如下：
Figure BDA0002631129020000022
优选的，步骤(1)中，DMF与POCl3的体积比为30∶5.7；三苯胺与CHCl3的加入量之比为5g∶30mL；DMF与CHCl3的体积比为1∶1。
优选的，步骤(1)中，所述油浴的温度为60℃，时间为12h。
优选的，步骤(1)中，NaOH溶液的质量分数为20％。
优选的，步骤(1)中，所述柱层析法使用的是硅胶柱柱层析；所述洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚(1∶8，v/v)。
优选的，步骤(2)中，4-甲基吡啶与1-碘乙醇的加入量之比为1.43g∶0.936mL。
优选的，步骤(2)中，所述油浴的温度为105℃，时间为12h。
优选的，步骤(3)中，所述无水乙醇与哌啶的加入体积之比为50∶1。
优选的，步骤(3)中，所述柱层析法使用的是硅胶柱柱层析；所述洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(15∶1，v/v)。
本发明的第三方面，提供上述分子转子型红光线粒体探针在标记或显示线粒体中的应用。
优选的，标记或显示线粒体在活细胞和组织中分布。
优选的，所述活细胞为永生化细胞。
优选的，所述永生化细胞为HeLa细胞。
优选的，所述组织为骨骼肌组织。
优选的，所述分子转子型红光线粒体探针以在高粘度溶剂甘油中荧光增强的方式，使得SQ高选择性地靶向高粘度环境的线粒体内膜。
本发明的有益效果为：
1.由于分子内运动受限，本发明的转子型吲哚盐类化合物SQ在H2O中的荧光强度较低，而在高粘度溶剂甘油(Gly)中荧光强度明显增强，这一物理特性使得SQ可以高选择性地靶向高粘度环境的线粒体内膜。SQ对线粒体进行染色不受MMP的影响，它可以实时、长期地追踪活细胞中的线粒体和线粒体自噬过程，并能成像组织中的四种线粒体。
2.与其功能相近的线粒体荧光探针相比，本发明的分子转子型红光线粒体探针具有高信噪比、高选择性、良好的生物兼容性和较低的细胞毒性，在生物标记领域具有良好的应用前景。
3.本发明的分子转子型红光探针可以在活细胞和组织中高选择性靶向线粒体，并且不受MMP影响。为线粒体相关的病理学研究提供了快速、便捷、直观的生物检测试剂。所以本发明的分子转子型红光线粒体探针具有非常好的应用前景。
附图说明
图1：SQ的核磁氢谱图。
图2：SQ的核磁碳谱图。
图3：用1μM SQ和1μM MTDR(商业化线粒体追踪红探针)先后培养10min后活的、经CCCP处理的、固定的HeLa细胞的伪色多色图像。合并后的图像中数字为SQ和MTDR的共定位系数。SQ：Ex＝473nm，Em＝540-640nm；MTDR：Ex＝635nm，Em＝655-755nm。比例尺＝10μm。
图4：(a)用1μM SQ染色10min HeLa细胞后通过空中扫描得到的去卷积高分辨率三维重建图像。(b，c)(a)中绿色框的放大图像，箭头处为嵴。Ex＝473nm，Em＝540-640nm。
图5：骨骼肌组织中线粒体的共聚焦图像。用5μM SQ和5μM Hoechst 33342染色20min后骨骼肌组织中的四种线粒体。骨骼肌组织在(a)20×、(b)40×、(c)60×放大倍数时的共聚焦荧光图像；(d)图(c)中框选部分的放大图。SQ：Ex＝473nm，Em＝540-640nm；Hoechst33342：Ex＝405nm，Em＝420-460nm。比例尺＝20μm。
图6：SQ染色骨骼肌的光学截面荧光图像(5μM，20min)。SQ：Ex＝473nm，Em＝540-640nm。
图7：(a)经10μM CCCP和7.5μM胃蛋白酶抑制剂处理后，用SQ和LTDR(商业化溶酶体追踪红探针)染色HeLa细胞的不同时间点的共染图片。比例尺＝10μm；(b)活性HeLa细胞中SQ和LTDR在不同时间点的共定位系数图。SQ：Ex＝473nm，Em＝540-640nm；LTDR：Ex＝635nm，Em＝655-755nm。
图8：(a)不同浓度的SQ和MTDR培养12小时后HeLa细胞的存活率；(b)用1μM SQ和0.2μM MTDR培养不同时间后HeLa细胞的存活率。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所述，现有的线粒体探针高度依赖于线粒体膜电位，并且毒性大、不适宜长时间线粒体成像。基于此，本发明提供分子转子型红光线粒体探针，由于分子内运动受限，本发明的转子型吲哚盐类化合物SQ在H2O中的荧光强度较低，而在高粘度溶剂甘油(Gly)中荧光强度明显增强，这一物理特性使得SQ可以高选择性地靶向高粘度环境的线粒体内膜。线粒体内膜可以提供一个高粘度环境，而通过实验证明SQ在高粘度环境中荧光强度可以明显增强，所以SQ在线粒体内膜中具有高强度的荧光，有高分辨率成像的能力。
本发明还给出了SQ的制备方法：(1)利用三苯胺，DMF和POCl3反应得到4-(二苯胺)苯甲醛；(2)利用4-甲基-喹啉与1-碘乙醇反应得到1-(2-羟乙基)-2-甲基喹啉-1-吲哚碘盐；(3)将4-(二苯胺)苯甲醛与1-(2-羟乙基)-2-甲基喹啉-1-吲哚碘盐通过Knoevenagel反应得到SQ。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1
一种分子转子型红光线粒体探针的制备方法，包括：
(1)4-(二苯胺)苯甲醛的合成：将三颈烧瓶置于0℃冰浴中，加入30mL DMF，然后滴加5.7mL POCl3，搅拌30min；将5g三苯胺溶于30mL CHCl3，然后将溶液转移至烧瓶中，将烧瓶置于油浴中60℃回流12h；冷却至室温，将反应液倒入冰水中，用质量分数为20％的NaOH溶液中和，再用二氯甲烷萃取收集有机相，收集得到的有机相用饱和食盐水水洗三次，然后用无水硫酸镁干燥一夜；以乙酸乙酯/石油醚(1∶8，v/v)为洗脱剂，通过硅胶柱柱层析法分离得到最终产物，产率55％。
(2)1-(2-羟乙基)-2-甲基喹啉-1-吲哚碘盐的合成：将1.43g 4-甲基吡啶和0.936mL 1-碘乙醇加入100mL烧瓶中，105℃油浴加热回流12h；反应结束后，将产物加入二氯甲烷中至产物完全溶解，然后将其倒入500mL石油醚中，生成棕色固体，产率85％。
(3)SQ的合成：将1mmol 1-(2-羟乙基)-2-甲基喹啉-1-吲哚碘盐(0.310g)和1mmol4-(二苯胺)苯甲醛(0.273g)加入100mL三颈烧瓶中，加入20mL无水乙醇使其完全溶解，然后滴加0.4mL哌啶，回流反应12小时，以二氯甲烷/甲醇(15∶1，v/v)为洗脱剂，通过硅胶柱柱层析法分离得到红色固体，产率70％。
对上述制备的红色固体进行核磁检测，结果为：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：8.99(d，J＝8.0Hz，1H)，8.59(d，J＝12Hz，1H)，8.54(d，J＝8.0Hz，1H)，8.33(d，J＝8.0Hz，1H)，8.20(d，J＝16.0Hz，1H)，8.13(t，J＝10.0Hz，1H)，7.92(t，J＝8.0Hz，1H)，7.845(d，J＝4.0Hz，2H)，7.81(s，1H)，7.42(t，J＝8.0Hz，4H)，6.97(d，2H)，5.24(t，J＝12.0Hz，2H)，5.20(d，J＝8.0Hz，1H)，4.01-4.05(m，2H)；
13C NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ(ppm)：157.23，150.92，147.46，146.35，144.05，139.33，134.98，131.41，130.63，130.40，129.07，128.25，128.10，126.19，125.40，121.34，120.46，119.91，116.85，59.88，52.90.HRMS(m/z)：calculated443.12；found：443.46.C31H27INO2 +，证明成功制备SQ(SQ的核磁氢谱图和核磁碳谱图见图1～2)。
实施例2细胞(HeLa)培养和染色
将人***细胞株(HeLa)置于在37℃5％CO2的饱和湿度孵箱中培养。人***细胞株培养于内含10％胎牛血清(FBS)和1％的青霉素和链霉素(青霉素浓度为100U/mL，链霉素浓度为100μg/mL)的细胞培养基中。将SQ溶解在DMSO溶液中配成浓度为1mM的储存液。制备MTDR(商业化线粒体追踪红探针)和LTDR(商业化溶酶体追踪红探针)(MTDR和LTDR均购自分子探针公司)为1mM水溶液。活细胞染色实验，37℃下，在培养基中将生长于玻璃盖玻片中的培养细胞用1μM SQ染色10分钟，然后用荧光显微镜成像。对于死细胞的研究：将HeLa细胞分别用1μM SQ和200nM MTDR预培育10min。PBS洗涤2次，在PBS溶液中用4％多聚甲醛预孵育30min，FV-1200显微镜下直接成像。
实施例3 SQ和MTDR对活的/经CCCP处理的/固定的HeLa细胞的复染实验
用共聚焦激光扫描显微镜研究了SQ在活细胞中的生物成像特性。将活HeLa细胞用SQ染色10分钟，观察细胞质中的丝状结构。根据我们之前的工作和其他文献，这是典型的线粒体形态。为了验证这一推测，我们进行了共染实验，并选择共染试剂(MTDR，一种商业化的线粒体探针)检测SQ的选择性。从图3可以看出，SQ和MTDR的平均共定位系数为0.86，表明转子靶向线粒体。
MMP作为线粒体功能的主要参数，与许多生理过程相关。它的减少或消失会引起细胞功能障碍甚至死亡。但是根据我们之前的工作和其他文献，发现带阳离子盐的探针高度依赖于MMP。因此在本发明中，我们评估了MMP降低时SQ对线粒体的靶向能力。活HeLa细胞首先用MTDR(MMP发生了变化时仍可被固定在线粒体中)和SQ预处理，然后用质子载体CCCP预处理，它可以使MMP下降，导致线粒体快速酸化。如图3所示，使用CCCP处理后，探针与MTDR有很好的重叠，共定位系数为0.89。这一现象表明，SQ可以牢固地定位于线粒体中，而与MMP的减少无关。
当细胞被固定时，MMP会消失。因此，我们研究了SQ在固定细胞中的染色能力，以验证探针在MMP消失后是否能在线粒体中固定。首先用SQ和MTDR染色活HeLa细胞，然后用4％多聚甲醛固定上述细胞(30min)。如图3所示，SQ的染色模式与MTDR重叠良好，并且SQ与MTDR的共定位系数为0.89，这表明当MMP消失时，SQ仍然可以单独固定在线粒体中。
实施例4SQ高分辨率可视化线粒体内膜的实验
通常情况下，阳离子线粒体探针富集于线粒体内膜，因此我们研究了SQ是否可以定位于线粒体内膜。将HeLa细胞用SQ染色后，得到了放大的线粒体图像(图4)。图4a中，单个线粒体形态呈椭圆形，空心结构清晰可见。放大图中的空心球显示为SQ可以靶向线粒体内膜。从固定肌纤维的SEM图中，我们可以看到线粒体内膜的嵴。同样，线粒体内膜的这种特征结构也被模糊地观察到(通过图4b和4c中用箭头标记)。以上结果进一步证明SQ确实靶向线粒体内膜。
实施例5SQ在骨骼肌组织中高保真成像的实验
由于SQ具有转子特性，该探针还可以高保真地在组织中可视化线粒体。因此，我们尝试对组织中线粒体的形态进行成像。用SQ和Hoechst33342对威斯塔鼠(购自山东大学实验动物中心)的骨骼肌组织进行染色，无需清洗，用共聚焦显微镜观察线粒体形态。如图5a和5b中放大的肌肉组织所示，我们可以清楚地识别出细微而规则的线粒体网状结构。实际的肌原纤维(IMF)线粒体形态呈管状，与SEM观察到的形态一致。此外，交叉纤维连接线粒体(CFCM)、I带线粒体(IBM)、血管周线粒体(PVM)和纤维平行线粒体(FPM)也可以很容易的观察到(图5c和5d)，它们通过传导通路影响骨骼肌内的能量分布。通过对组织进行光学切片，可以获得z轴方向的荧光图像(图6)，清晰地显示了细胞内线粒体网络和不同的线粒体，根据图6(a)、图6(h)进一步表明，SQ可以在66μm的深度观察到线粒体。
实施例6 SQ染色HeLa细胞追踪线粒体自噬过程的实验
自噬是一种被调节的溶酶体途径，应用于细胞器和长寿命蛋白质的降解和循环。在自噬过程中，部分线粒体被隔离在双膜自噬小泡中。因此，线粒体自噬过程与线粒体和溶酶体密切相关。本发明进行了SQ生物成像实验，以测试其跟踪线粒体自噬的能力。首先分别用SQ和LTDR染色HeLa细胞，然后用CCCP和胃蛋白酶抑制剂孵育细胞，开始自噬过程。得到上述细胞在不同时间点(0h、0.25h、0.5h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h)的荧光图像，并获得相应的共定位系数。利用共定位系数检测SQ和LTDR的重叠情况，实时观察线粒体自噬过程。随着时间的增加，SQ的荧光信号逐渐与LTDR的荧光信号重叠(图7a)。SQ与LTDR对应的共定位系数从22％增加到82％(图7b)。高重叠度数据可以成功地证明发生了线粒体自噬现象。值得注意的是，与其他线粒体自噬探针相比，该探针监测线粒体自噬不受MMP变化的影响。因此，根据上述结果，SQ可以长期原位实时跟踪活细胞中的线粒体自噬。
实施例7 SQ染色HeLa细胞的细胞毒性实验
细胞毒性对于合格的生物探针是必要的，特别是用于长程跟踪和成像的探针。本发明用MTT试剂检测SQ和MTDR的细胞毒性。如图8a所示，用1.5μM SQ培养12h后，HeLa细胞的生存能力高于80％。然而用1.5μM MTDR培养12h后，HeLa细胞的生存能力下降到40％。同时，本发明研究了常用浓度MTDR和SQ染色的HeLa细胞的生存能力。随着孵育时间的增长，用SQ染色的HeLa细胞存活率不低于80％，远高于用MTDR培养的存活率(图8b)。结果表明，SQ比MTDR具有更低的细胞毒性和更好的生物相容性。因此，SQ几乎是无毒的，适用于活细胞线粒体的成像和跟踪。
此外，SQ的Stokes位移为84nm，避免了光散射对组织和细胞成像的干扰，可以高分辨率成像细胞或组织中的线粒体。本发明的SQ在生理pH范围(pH＝4.0-9.0)的荧光强度变化不明显，说明SQ对pH变化不敏感，有利于其在高保真可视化线粒体中的应用。
综上可知，与MTDR相比，分子转子型红光线粒体探针SQ具有高信噪比、高选择性、良好的生物兼容性和较低的细胞毒性，适合成像和跟踪活细胞中的线粒体。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.分子转子型红光线粒体探针，其特征在于，其化学结构式如式(I)所示：
Figure FDA0002631129010000011
化学名称为(E)-2-(4-(二苯胺)苯乙烯基)-1-(2-羟乙基)喹啉-1-吲哚碘盐，命名为SQ。
2.权利要求1所述的分子转子型红光线粒体探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)冰浴中，向DMF中滴加POCl3，搅拌后得DMF和POCl3混合溶液；将三苯胺溶于CHCl3得三苯胺溶液，将DMF和POCl3混合溶液与三苯胺溶液混合后得到反应液，反应液于60℃油浴加热回流12h，冷却至室温后将反应液倒入冰水中，用NaOH溶液中和，再用二氯甲烷萃取，收集有机相，用饱和食盐水水洗有机相，然后用无水硫酸镁干燥；干燥后通过柱层析法分离得到4-(二苯胺)苯甲醛；
(2)将4-甲基吡啶和1-碘乙醇混合，油浴加热回流；反应结束后将得到的产物加入二氯甲烷中至产物完全溶解，再倒入石油醚中，生成棕色固体即为1-(2-羟乙基)-2-甲基喹啉-1-吲哚碘盐；
(3)将1mmol步骤(1)得到的1-(2-羟乙基)-2-甲基喹啉-1-吲哚碘盐和1mmol步骤(2)得到的4-(二苯胺)苯甲醛混合，再加入无水乙醇使其完全溶解，然后滴加哌啶，回流反应，反应结束后通过柱层析法分离得到SQ。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，DMF与POCl3的体积比为30∶5.7；三苯胺与CHCl3的加入量之比为5g∶30mL；DMF与CHCl3的体积比为1∶1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述油浴的温度为60℃，时间为12h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，4-甲基吡啶与1-碘乙醇的加入量之比为1.43g∶0.936mL。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述油浴的温度为105℃，时间为12h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述无水乙醇与哌啶的体积比为50∶1。
8.权利要求1所述的分子转子型红光线粒体探针在标记或显示线粒体中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，标记或显示线粒体在活细胞和组织中分布。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的分子转子型红光线粒体探针以在高粘度溶剂甘油中荧光增强的方式，使得SQ高选择性地靶向高粘度环境的线粒体内膜。
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