CN111839800A - 一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与应用，所述癫痫持续状态疾病动物模型为小鼠脑内核团(模型一海马CA1区和丘脑腹前核VA区；模型二基底外侧杏仁核BLA区和丘脑腹前核VA区)脑立体定位病毒(化学遗传病毒rAAV‑CaMKIIa‑hM3D(Gq)‑mCherry‑WPREs‑pA)注射和小鼠海马CA3区电极阵列埋置，小鼠恢复1周后，腹腔注射氯氮平的代谢产物CNO，使得CNO与病毒表达的受体结合从而激活神经元诱导癫痫持续状态发作，经行为学观察和在体多通道局部场电位记录判断得到癫痫持续状态疾病动物模型。本发明所构建的癫痫持续状态疾病动物模型发作持续时间稳定、成功率高、死亡率低、重复性好，在研究癫痫持续状态的起源、形成机制、耐药性癫痫持续状态药物的筛选及机制方面具有重要意义。

Description

一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与应用。

背景技术

目前用于癫痫持续状态研究的动物模型几乎都是利用外来化学毒物或电刺激建立起来的，而这些毒物和极端的电刺激在人或动物体内并不存在，也不是癫痫持续状态已知的病因，参与活动的神经元、起始和终止的核团以及部位在这些动物模型中也不清楚，因而人们很难通过这种动物模型来了解人类癫痫持续状态的“真实世界”。

传统的癫痫持续状态动物模型主要通过腹腔或颅内注射化学药物，使得大量神经元过度兴奋，产生兴奋性毒性作用，从而诱发出癫痫持续状态。最为经典的模型是pilocarpine腹腔注射，此外，还有海人酸腹腔注射和颅内注射等。这些模型都能很好的诱导产生癫痫持续状态，但是在实际应用中很容易发现这些模型的成功率低、死亡率高，无法明确癫痫持续状态的病灶起源，而且由于诱导过程中产生的兴奋性毒性导致的大量神经元的死亡，使得这些模型小鼠无法重复使用，也无法在同一只小鼠身上进行前后的对照实验。随着现代科学研究对研究精度的要求的提高，我们急需能够明确知道病灶起源、能够重复利用、能够进行前后对照实验的癫痫持续状态疾病模型。

发明内容

本发第一目的在于提供一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型。

本发第二目的在于提供一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法。

本发第三目的在于提供一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法构建的动物模型在研究癫痫持续状态的起源、癫痫持续状态的形成机制、耐药性癫痫持续状态药物的筛选及机制中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，具体步骤如下：

1)对待建模型进行病毒注射；

2)对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列；

3)诱发步骤2)处理后的模型进入癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道局部场电位记录；

4)判定化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型是否构建成功。

进一步，步骤1)中所述对待建模型进行病毒注射的具体步骤如下：

1-1)术前常规处理：选取了24只6-8周龄C57小鼠，分为模型一和模型二各12只。其中模型一和模型二相互独立，C57小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体***上，并给C57小鼠垫上加热垫使小鼠体温保持在35-37℃，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面，暴露出前后囟及正中十字缝；

1-2)颅骨调平：将颅骨钻固定在脑立体***上，调节钻头至C57小鼠的前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面；

1-3)钻孔：将颅骨钻头调至坐标原点，用颅骨钻在定位目标团的表面钻孔至暴露脑膜无出血，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，并用细针挑破脑膜，暴露出脑组织；

1-4)注射病毒：取下颅骨钻，用微量注射泵吸取100nl病毒，病毒滴度：5.04E+12vg/mL，将微量注射泵装在立体***上，并调至原点后定位至目标核团颅骨表面并缓慢***至目标核团深度，微量注射泵注射速度为20nl/min，注射完成后留置10min，防止病毒倒流吸收不充分，最后缓慢退出注射泵，并以同样的方法注射其他核团。全部核团注射完毕后，缝合头皮，做好标记，放回原位代养3周。

进一步，步骤1-1)中模型一为海马CA1区(1.5，2.0，1.4)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)，模型二为基底外侧杏仁核BLA区(3.0，2.0，4.6)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)；

步骤1-3)中定位颅骨表面钻孔位置坐标为：模型一坐标为海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，0)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)，模型二为基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，0)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)；

步骤1-4)中病毒为化学遗传病毒(rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)，目标核团颅骨表面及***深度的坐标为：模型一的海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，1.4)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)，模型二的基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，4.6)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)。

进一步，步骤2)中所述对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列的具体步骤如下：

2-1)术前常规处理：取步骤1-4)处理后的小鼠模型用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体***上，并给小鼠模型垫上加热垫使小鼠模型体温保持在35-37℃，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面，暴露出前后囟及正中十字缝；

2-2)颅骨调平：将颅骨钻固定在脑立体***上，调节钻头至小鼠模型的前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面；

2-3)钻孔：将颅骨钻头调至坐标原点，先用颅骨钻在小鼠模型的待检测局部场电位的核团钻孔至暴露脑膜无出血，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，并用细针挑破脑膜，暴露出脑组织，然后在颅骨适当位置钻一个不钻穿颅骨的小孔I，在额叶两侧颅骨表面分别钻开同样大小的小孔II和小孔III；

2-4)电极埋置：取下颅骨钻，将微电极安装在脑立体***上，重新调回原点后定位至小鼠模型的待检测局部场电位的核团坐标位置并缓慢***至目标核团所在深度，然后将一个1.4×2.6mm规格的小螺丝钉拧入小孔I作为固定螺丝，防止后续实验过程中电极脱落，将两颗1.4×6mm规格的小螺丝钉分别拧入小孔II和小孔III作为参考电极，在电极周围和螺丝周围涂上牙科水泥固定好电极和螺丝，待牙科水泥凝固后取下小鼠模型，做好标记，放回原位代养1周。

进一步，步骤2-4)中待检测局部场电位的核团坐标位置及目标核团所在深度的坐标为海马CA3(AP，2.3；ML，2.0；DV，2.1)。

进一步，步骤3)中所述诱发步骤2)处理后的模型进入癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道局部场电位记录的具体步骤如下：取步骤2-4)中病毒表达完成，埋

步骤1-4)中病毒为化学遗传病毒(rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)，目标核团颅骨表面及***深度的坐标为：模型一的海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，1.4)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)，模型二的基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，4.6)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)。

进一步，步骤2)中所述对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列的具体步骤如下：

2-1)术前常规处理：取步骤1-4)处理后的小鼠模型用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体***上，并给小鼠模型垫上加热垫使小鼠模型体温保持在35-37℃，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面，暴露出前后囟及正中十字缝；

2-2)颅骨调平：将颅骨钻固定在脑立体***上，调节钻头至小鼠模型的前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面；

2-3)钻孔：将颅骨钻头调至坐标原点，先用颅骨钻在小鼠模型的待检测局部场电位的核团钻孔至暴露脑膜无出血，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，并用细针挑破脑膜，暴露出脑组织，然后在颅骨适当位置钻一个不钻穿颅骨的小孔I，在额叶两侧颅骨表面分别钻开同样大小的小孔II和小孔III；

2-4)电极埋置：取下颅骨钻，将微电极安装在脑立体***上，重新调回原点后定位至小鼠模型的待检测局部场电位的核团坐标位置并缓慢***至目标核团所在深度，然后将一个1.4×2.6mm规格的小螺丝钉拧入小孔I作为固定螺丝，防止后续实验过程中电极脱落，将两颗1.4×6mm规格的小螺丝钉分别拧入小孔II和小孔III作为参考电极，在电极周围和螺丝周围涂上牙科水泥固定好电极和螺丝，待牙科水泥凝固后取下小鼠模型，做好标记，放回原位代养1周。

进一步，步骤2-4)中待检测局部场电位的核团坐标位置及目标核团所在深度的坐标为海马CA3(AP，2.3；ML，2.0；DV，2.1)。

进一步，步骤3)中所述诱发步骤2)处理后的模型进入癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道局部场电位记录的具体步骤如下：取步骤2-4)中病毒表达完成，埋置电极并恢复1周的C57小鼠，将在体多通道场电位记录***导线与小鼠脑上电极阵列连接，腹腔注射2mg/kg氯氮平的代谢产物CNO，反应12-51分钟，激活神经元诱发癫痫持续状态，然后同时进行视频行为学观察和在体多通道局部场电位记录。

进一步，步骤4)中所述判定化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型是否构建成功的具体步骤如下：所述行为学观察方法为：取CNO注射后的C57小鼠，观察时间为3小时，根据Racine评分观察小鼠的癫痫发作情况，将一次3级以上发作持续超过5min、反复多次发作持续时间大于5min，且发作间期不能恢复如常的认定为癫痫持续状态，结合所述在体多通道局部场电位记录，得到构建成功的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型，并统计小鼠癫痫持续状态的发作持续时间、生存率和死亡率。

进一步，所述的任一项方法构建的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型。

进一步，所述的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型在研究癫痫持续状态的起源、癫痫持续状态的形成机制、耐药性癫痫持续状态药物的筛选及机制中的应用。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：

本发明通过腹腔注射CNO对病毒表达完成的小鼠进行神经元诱导，检测癫痫相关指标进而建立了能够明确病灶起源、相关神经元、可重复利用、稳定性好、成功率高、死亡率低的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型。本发明通过脑内注射的化学遗传病毒(rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)，由于使其只接受外源性配体(氯氮平N-氧化物，CNO)的信号，并激活相应的GPCR信号通路，引发不同神经元的功能变化。这种特异性受体最常用的有两种：hM3Gq和hM4Gi受体，CNO激活hM3Gq后可使大量钙离子内流，引起神经元兴奋；激活hM4Gi受体则可通过降低cAMP活性引起膜超极化，从而抑制神经元活动。我们利用化学(光)遗传学技术精确的针对特异性脑区的特异性神经元进行特异性调控，将所需要的受体转入到神经***中特定核团或细胞中，从而达到调控该类神经细胞活动的目的。本发明提供一种化学遗传(Designer Receptors Exclusively Activated by DesignerDrugs，DREADDS)技术诱导的癫痫持续状态(status epilepticus，SE)疾病动物模型不仅更接近于人类癫痫持续状态的本质，而且具有可靠、稳定、精确的特征。

附图说明

图1是CNO诱导化学遗传癫痫持续状态模型行为学及在体局部场电位的情况

图2是CNO诱导化学遗传癫痫持续状态模型与Pilocarpine癫痫持续状态动物模型的发作时间、成功率和死亡率的比较

图3是第2次重复诱导实验，化学遗传癫痫持续状态模型与Pilocarpine癫痫持续状态动物模型的发作时间、成功率和死亡率的比较

图4是连续观察4周的4次重复实验中化学遗传癫痫持续状态模型的持续时间、成功率和死亡率

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法

1、实验动物

本次实验共选取了24只6-8周龄C57小鼠，模型一和模型二各12只。其中模型一和模型二相互独立，模型一通过化学遗传同时激活海马CA1区(1.5，2.0，1.4)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)的兴奋性神经元诱导出癫痫持续状态；模型二则通过同时激活杏仁核BLA区(3.0，2.0，4.6)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)的兴奋性神经元诱导出癫痫持续状态。

2、实验方法

2.1病毒注射

2.1.1术前常规处理

C57小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体***(瑞沃德生命科技有限公司，中国)上，在小鼠底下垫上加热垫(使小鼠体温保持在35-37℃)，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面暴露出前后囟及正中十字缝。

2.1.2颅骨调平

将颅骨钻(瑞沃德生命科技有限公司，中国)固定在***上，调节钻头至前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面。

2.1.3钻孔

将颅骨钻钻头重新调回至原点，根据《The Mouse Brain in StereotaxicCoordinates，3rd Edition》定位目标核团的颅骨表面，即模型一坐标为CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，0)和VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)，模型二为BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，0)和VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)。用颅骨钻小心钻孔(以暴露脑膜无出血为宜)，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，用细针小心挑破脑膜，暴露出脑组织。

2.1.4注射病毒

取下颅骨钻，根据目标核团大小用微量注射泵吸取100nl病毒，病毒滴度：5.04E+12vg/mL，将微量注射泵装在立体***上，重新调至原点后定位至目标核团颅骨表面并缓慢***至目标核团深度，即模型一的CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，1.4)和VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)，模型二的BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，4.6)和VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)。设置微量注射泵注射速度为20nl/min，注射完成后留置10min，防止病毒倒流吸收不充分，最后缓慢退出注射泵，并以同样的方法注射其他核团。全部核团注射完毕后，缝合头皮，做好标记后放回原位代养。

2.2电极埋置

2.2.1术前常规处理：取步骤2.1.4中代养病毒表达3周后的小鼠，用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体***上，并给病毒表达3周后的小鼠垫上加热垫使病毒表达3周后的小鼠体温保持在35-37℃，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面，暴露出前后囟及正中十字缝；

2.2.2颅骨调平：将颅骨钻固定在脑立体***上，调节钻头至病毒表达3周后的小鼠的前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面；

2.2.3钻孔

将颅骨钻头调至坐标原点，先用颅骨钻在待检测局部场电位的核团，即海马CA3(AP，2.3；ML，2.0；DV，2.1)，钻孔至暴露脑膜无出血，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，并用细针挑破脑膜，暴露出脑组织，然后在颅骨适当位置钻一个不钻穿颅骨的小孔I，在额叶两侧颅骨表面分别钻开同样大小的小孔II和小孔III；

2.2.4电极埋置

取下颅骨钻，将微电极安装在脑立体***上，重新调回原点后定位至海马CA3区颅骨表面并缓慢***至目标核团所在深度，然后将一个1.4×2.6mm规格的小螺丝钉拧入小孔I作为固定螺丝，防止后续实验过程中电极脱落，将两颗1.4×6mm规格的小螺丝钉分别拧入小孔II和小孔III作为参考电极，在电极周围和螺丝周围涂上牙科水泥固定好电极和螺丝，待牙科水泥凝固后取下病毒表达3周后的小鼠，做好标记，放回原位代养恢复1周。

2.3诱发癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道场电位记录

取2.2.4步骤中恢复1周的C57小鼠，将在体多通道场电位记录***导线与小鼠脑上电极阵列连接，腹腔注射2mg/kg氯氮平的代谢产物CNO，反应潜伏期为12-51分钟，激活神经元诱发癫痫持续状态，然后同时进行视频行为学观察和在体多通道局部场电位记录。

2.4判定化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型是否构建成功

将在体多通道场电位记录***上的微型信号放大器连接至小鼠头上的电极接口上，并连好固定在额叶颅骨上的参考电极，采用

***(Plexon，USA)进行电信号采集，先打开桌面上的OmniPlex server软件布置好***运行环境，再打开PlexControl软件进行电信号记录。待电信号基线稳定后对2.3步骤中得到癫痫持续状态疾病动物模型开始记录电信号。记录完成后用

v4软件分析统计并导出场电位图制作对应的频谱图，同时，在CNO注射后，进行视频行为学观察，观察时间3小时，根据Racine评分观察小鼠的癫痫发作情况，将一次3级以上发作持续超过5min或反复多次发作持续时间大于5min，且发作间期不能恢复如常的认定为癫痫持续状态，结合所述在体多通道局部场电位记录，得到构建成功的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型，统计小鼠癫痫持续状态的发作持续时间、生存率和死亡率，实验结果如图1所示。

实施例2：

化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型与Pilocarpine癫痫持续状态动物模型的比较

1、实验动物

本次实验共选取了36只6-8周龄C57小鼠，分为3组，每组12只、实施例1中的步骤2.5中的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型。

2、实验方法

Pilocarpine癫痫持续状态动物模型的构建：选用常用的Pilocarpine剂量：280mg/kg，300mg/kg，320mg/kg，每组12只小鼠，进行腹腔注射Pilocarpine诱导出癫痫持续状态，然后分别统计各组的自发作开始30分钟(min)内的发作持续时间，以及最终的总的模型建立成功率和死亡率，将Pilocarpine癫痫还需状态动物模型与实施例1中的步骤2.5的条件构建的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型进行比较。

表1 Pilocarpine癫痫持续状态动物模型与化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的成功率、死亡率比较

表2 Pilocarpine癫痫持续状态动物模型与化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型持续时间比较

3、实验结果

实验结果表明，由表1和表2可知，实施例1中的步骤2.5的条件构建化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型与Pilocarpine癫痫持续状态动物模型比较，化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型12只实验小鼠中仅有1只死亡，发作持续时间更稳定，成功率更高，死亡率也非常低，实验结果如图2所示。

实施例3

重复诱导实验

1、实验动物

实施例1中的步骤2.5的条件构建的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型、实施例2中构建的Pilocarpine癫痫持续状态动物模型

2、实验方法

以实施例1中的步骤2.5的条件构建的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型、以实施例2中的试验条件构建的Pilocarpine癫痫持续状态动物模型，每隔一周对同一批小鼠进行一次相同的重复诱导实验，一共进行4次实验。

表3 Pilocarpine癫痫持续状态动物模型与化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型重复诱导持续时间比较

表4 Pilocarpine癫痫持续状态动物模型与化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型重复诱导成功率、死亡率比较

表5化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型4次重复诱导的持续时间、成功率、死亡率

	发作持续时间(min)	成功率(％)	死亡率(％)
				第一周	19.98	91.67	8.33
第二周	18.62	100	0
				第三周	19.1	100	0
第四周	18.82	90.91	9.09

3、实验结果

由表3和表4可知，第二次Pilocarpine重复诱导后280mg/kg，300mg/kg和320mg/kg的小组分别只剩下2只，3只和1只小鼠，实验结果表面：Pilocarpine癫痫持续状态动物模型第二次重复诱导虽然发作持续时间有所提高，但是死亡率也迅速增加，成功率也并不显著，无法进行更多的重复诱导实验。而化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型没有出现死亡，并且成功率和发作持续时间与第一次相比很稳定，并对四次重复诱导化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的持续时间，成功率和死亡率进行了比较，由表5可知，化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型在多次的重复诱导过程中均有很好的稳定性和可重复性，实验结果如图3和图4所示。

实施例5：

本发明化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型在癫痫持续状态的起源、形成机制、耐药性癫痫持续状态药物的筛选及机制中的应用。

1、按照本发明实施例1的方法构建化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型；

2、利用本发明构建的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型研究癫痫持续状态的起源、癫痫持续状态的形成机制、耐药性癫痫持续状态药物的筛选及机制。

综上，本发明通过对模型一CA1区(1.5，2.0，1.4)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)和模型二杏仁核BLA区(3.0，2.0，4.6)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)的小鼠进行脑立体定位病毒注射(化学遗传病毒rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)和电极阵列埋置，小鼠恢复1周后，将在体多通道场电位记录***导线与小鼠脑上电极阵列连接，然后腹腔注射氯氮平的代谢产物CNO，使得CNO与病毒表达的受体结合从而激活神经元，通过视频行为学观察和在体多通道局部场电位记录，判断得到化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型。为验证本发明构建的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型在稳定性、重复率、成功率和死亡率上相比传统Pilocarpine癫痫持续状态动物模型的优越性，选用常用的Pilocarpine剂量：280mg/kg，300mg/kg，320mg/kg每组12只小鼠，构建Pilocarpine癫痫持续状态动物模型，设计实验使本发明构建的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型与Pilocarpine癫痫持续状态动物模型进行比较，实验结果表明，与Pilocarpine癫痫持续状态动物模型比较，本发明构建的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型发作持续时间更稳定，成功率更高，死亡率也非常低，重复性更好。本发明构建的癫痫持续状态动物癫痫持续状态疾病动物模型可用于研究癫痫持续状态的起源、癫痫持续状态的形成机制、耐药性癫痫持续状态药物的筛选及机制等。

最后应当说明：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (9)

1.一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)对待建模型进行病毒注射；

2)对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列；

3)诱发步骤2)处理后的模型进入癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道局部场电位记录；

4)判定化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型是否构建成功。

2.如权利要求1所述的一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述对待建模型进行病毒注射的具体步骤如下：

1-1)术前常规处理：选取了24只6-8周龄C57小鼠，分为模型一和模型二各12只。其中模型一和模型二相互独立，C57小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体***上，并给C57小鼠垫上加热垫使小鼠体温保持在35-37℃，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面，暴露出前后囟及正中十字缝；

1-2)颅骨调平：将颅骨钻固定在脑立体***上，调节钻头至C57小鼠的前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面；

1-3)钻孔：将颅骨钻头调至坐标原点，用颅骨钻在定位目标团的表面钻孔至暴露脑膜无出血，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，并用细针挑破脑膜，暴露出脑组织；

1-4)注射病毒：取下颅骨钻，用微量注射泵吸取100nl病毒，病毒滴度：5.04E+12vg/mL，将微量注射泵装在立体***上，并调至原点后定位至目标核团颅骨表面并缓慢***至目标核团深度，微量注射泵注射速度为20nl/min，注射完成后留置10min，防止病毒倒流吸收不充分，最后缓慢退出注射泵，并以同样的方法注射其他核团。全部核团注射完毕后，缝合头皮，做好标记，放回原位代养3周。

3.如权利要求2所述的一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，

步骤1-1)中模型一为海马CA1区(1.5，2.0，1.4)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)，模型二为基底外侧杏仁核BLA区(3.0，2.0，4.6)和丘脑腹前核VA区(1.25，0.94，3.75)：

步骤1-3)中定位颅骨表面钻孔位置坐标为：模型一坐标为海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，0)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)，模型二为基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，0)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，0)；

步骤1-4)中病毒为化学遗传病毒(rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)，目标核团颅骨表面及***深度的坐标为：模型一的海马CA1区(AP，1.5；ML，2.0；DV，1.4)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)，模型二的基底外侧杏仁核BLA区(AP，3.0；ML，2.0；DV，4.6)和丘脑腹前核VA区(AP，1.25；ML，0.94；DV，3.75)。

4.如权利要求2所述的一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述对步骤1)处理后的模型埋置电极阵列的具体步骤如下：

2-1)术前常规处理：取步骤1-4)处理后的小鼠模型用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定在脑立体***上，并给小鼠模型垫上加热垫使小鼠模型体温保持在35-37℃，用眼药膏涂抹眼睛，剪去头顶毛发，在体式显微镜下剪开头皮，用棉签擦拭颅骨表面，暴露出前后囟及正中十字缝；

2-2)颅骨调平：将颅骨钻固定在脑立体***上，调节钻头至小鼠模型的前囟并以此为坐标原点，然后以原点左右±2.0mm，原点与后4.2mm为参考点调平颅骨平面；

2-3)钻孔：将颅骨钻头调至坐标原点，先用颅骨钻在小鼠模型的待检测局部场电位的核团钻孔至暴露脑膜无出血，再用洗耳球吹走颅骨碎屑，并用细针挑破脑膜，暴露出脑组织，然后在颅骨适当位置钻一个不钻穿颅骨的小孔I，在额叶两侧颅骨表面分别钻开同样大小的小孔II和小孔III；

2-4)电极埋置：取下颅骨钻，将微电极安装在脑立体***上，重新调回原点后定位至小鼠模型的待检测局部场电位的核团坐标位置并缓慢***至目标核团所在深度，然后将一个1.4×2.6mm规格的小螺丝钉拧入小孔I作为固定螺丝，防止后续实验过程中电极脱落，将两颗1.4×6mm规格的小螺丝钉分别拧入小孔II和小孔III作为参考电极，在电极周围和螺丝周围涂上牙科水泥固定好电极和螺丝，待牙科水泥凝固后取下小鼠模型，做好标记，放回原位代养1周。

5.如权利要求4所述的一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，步骤2-4)中待检测局部场电位的核团坐标位置及目标核团所在深度的坐标为海马CA3(AP，2.3；ML，2.0；DV，2.1)。

6.如权利要求5所述的一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，步骤3)中所述诱发步骤2)处理后的模型进入癫痫持续状态，并进行行为学观察与在体多通道局部场电位记录的具体步骤如下：取步骤2-4)中病毒表达完成，埋置电极并恢复1周的C57小鼠，将在体多通道场电位记录***导线与小鼠脑上电极阵列连接，腹腔注射2mg/kg氯氮平的代谢产物CNO，反应12-51分钟，激活神经元诱发癫痫持续状态，然后同时进行视频行为学观察和在体多通道局部场电位记录。

7.如权利要求6所述的一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型的构建方法，其特征在于，步骤4)中所述判定化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型是否构建成功的具体步骤如下：所述行为学观察方法为：取CNO注射后的C57小鼠，观察时间为3小时，根据Racine评分观察小鼠的癫痫发作情况，将一次3级以上发作持续超过5min、反复多次发作持续时间大于5min，且发作间期不能恢复如常的认定为癫痫持续状态，结合所述在体多通道局部场电位记录，得到构建成功的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型，并统计小鼠癫痫持续状态的发作持续时间、生存率和死亡率。

8.如权利要求7所述的任一项方法构建的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型。

9.一种如权利要求8所述的化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型在研究癫痫持续状态的起源、癫痫持续状态的形成机制、耐药性癫痫持续状态药物的筛选及机制中的应用。

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