CN111830109A - 一种高灵敏的检测黏蛋白的光电化学传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高灵敏的检测黏蛋白的光电化学传感器的制备方法。通过在修饰有金纳米粒子的氧化铟锡导电电极表面生长二氧化钛和硫铟锌的复合纳米材料,可以固定更多的发夹DNA链,提高检测的灵敏度;随后将适配体连接的修饰有二氧化锰颗粒的多枝杂交链负载在电极表面,其对过氧化氢具有良好的催化还原能力,将其作为模拟酶信号标签,消耗电子供体过氧化氢来实现分析信号的放大;通过核酸外切酶的识别和酶切作用,进一步实现对黏蛋白的信号放大,从而完成光电化学传感器的制备,实现对黏蛋白的超灵敏、准确检测。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤标志物检测技术、多枝杂交链信号放大技术及复合纳米材料技术领域,更具体地说是一种基于纳米材料的类酶催化性能构建的用于检测黏蛋白的光电化学传感器。
背景技术
近年来,全球癌症发病率急剧上升,极大地威胁着人类健康,癌症早期检测越来越引起人们的重视。黏蛋白是一类高分子量、高糖基化的蛋白质,存在于各种各样的恶性肿瘤中,常在乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌等多种癌症中高表达,是一种潜在的癌症生物标志物,因此在癌症早期诊断领域引起了科学家们的极大兴趣。到目前为止,一些检测方法像酶联免疫吸附测定、表面等离子共振、液相色谱-质谱以及电化学分析的方法已经被发展并用于黏蛋白的检测。但是这些方法需要复杂的样品前处理和昂贵的仪器,耗时、费力,因此发展一种操作简便的、成本低的可以实现黏蛋白超灵敏检测的分析方法具有重要意义。
二氧化钛(TiO2)作为一种n型光电材料,由于其无毒性、良好的催化活性、良好的生物相容性及独特的光和电性能在光电化学(PEC)传感器中被广泛地应用。提高PEC传感器灵敏度的关键是提高光电材料的PEC响应。通过将硫铟锌(ZnIn2S4)与TiO2复合形成的敏化结构可以降低电子和空穴的复合速率,更有效地增强光电信号。利用牛血清白蛋白合成的二氧化锰颗粒(MnO2/BSA)具有良好的类酶催化活性和生物相容性,我们利用其特性可以调节工作电极和电解质溶液之间的电子传播,从而调节光电信号,实现对目标物的定量检测。
近年来,多枝杂交链信号放大技术也引起了广泛的关注,通过多枝杂交链反应,可以获得更长的带有多条分枝的DNA双螺旋结构。有利于负载更多的MnO2/BSA,我们利用MnO2/BSA对H2O2表现出的良好的催化还原能力,将其标记在多枝杂交链上,作为新型的模拟酶信号标签,可以极大地增强光电材料的PEC响应,提高分析检测的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是通过制备具有大的比表面积、良好的生物相容性和光电性能的TiO2/ZnIn2S4光电材料,获得一个极大的PEC光电流响应,将发夹DNA链固定在其表面,其可以特异性结合黏蛋白的适配体链(Apt),将适配体链连接的修饰有MnO2/BSA颗粒的多枝杂交链负载在电极表面,因为MnO2/BSA的类酶催化作用,催化电子供体H2O2分解,获得一个衰减的PEC信号,当目标物靠近电极表面时,和适配体链结合,而修饰有MnO2/BSA的多枝杂交链脱落,催化作用削弱,PEC电流再次增强,通过PEC电流的变化值来实现对目标物定量检测,能有效地避免假阳性信号,降低背景信号。此外,通过核酸外切酶I(Exo I)的高选择的识别和酶切作用,实现对目标物的信号放大,实现对黏蛋白的超灵敏检测。
为了解决上述技术问题,本发明是通过以下措施来实现的:
(1)在ITO电极上沉积一层金(Au)纳米粒子:首先将ITO导电电极依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10 min,将清洗后的电极***含有1%-5%氯金酸的沉积液中,利用电位溶出分析法,在沉积电位为-0.2 V,沉积时间为30-60 s,将金纳米粒子沉积在ITO导电电极的表面,沉积完成后,用二次水清洗电极表面,并在室温下自然干燥,获得ITO/Au电极;
(2)利用原位生长法在步骤(1)中获得ITO/Au电极表面生长TiO2颗粒:将ITO/Au电极***含有10-15 mL氟钛酸铵和硼酸混合液的25 mL烧杯中,所述的氟钛酸铵浓度为75 mM,硼酸的浓度为0.2-0.4 M,在室温下反应6-12 h,反应完成后,用二次水洗涤电极表面并在60ºC干燥3 h,获得ITO/Au/TiO2电极;
(3)利用水热法在步骤(2)中获得ITO/Au/TiO2电极表面生长ZnIn2S4纳米花:将ITO/Au/TiO2电极***含有10-15 mL硫酸锌、氯化铟和硫代乙酰胺混合液的25 mL高压釜中,使ITO/Au/TiO2电极倾斜地靠在高压釜内壁上,且导电面向下,所述的硫酸锌、氯化铟和硫代乙酰胺的浓度均为25-100 mM且摩尔比为1:2:4,在90-120 ºC加热1-3 h,待冷却到室温后用二次水洗涤电极表面,并在60 ºC干燥3 h,获得ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极;
(4)合成MnO2/BSA颗粒:称取250 mg BSA分散在7 mL二次水中,30-50 mg高锰酸钾溶于3 mL二次水中,将两种溶液混合搅拌均匀后转移至三口烧瓶中,水浴加热至37 ºC后保持2h,反应完成后透析24 h,冷冻干燥得到MnO2/BSA颗粒;
(5)适配体连接的杂交链反应:将适配体链Apt、引发链S1溶解在杂交链反应缓冲溶液(TM)中,获得的Apt和S1浓度均为5 µM,将发夹DNA分子1(H1)和发夹DNA分子2(H2)溶解在TM中,获得的H1和H2浓度均为20 µM,所述的TM为pH 8.0,浓度为20 mM且含有50 mM MgCl2的Tris缓冲溶液,然后用PTC-200热循环仪将上述链在95 ºC加热10 min,并在30 s 内冷却到4 ºC,随后,取100 µL Apt和S1的混合溶液加入到1 mL的H1和H2混合溶液中,使Apt、S1、H1和H2的最终浓度分别为0.5 µM、0.5 µM、10 µM和10 µM,将获得的杂交混合物在37 ºC下反应12 h,获得适配体连接的多枝杂交链;
(6)合成修饰有MnO2/BSA颗粒的多枝杂交链:取500 μL 1 μM的MnO2/BSA溶液、500 μL步骤(5)中合成的适配体连接的多枝杂交链、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,其中EDC和NHS的浓度分别为20 mM和10 mM,所述的PBS包含55 mM磷酸盐,150 mM氯化钠和20 mM乙二胺四乙酸,将上述混合溶液置于黑暗处震荡一夜后用pH 7.4 PBS离心洗涤,获得修饰有MnO2/BSA颗粒的多枝杂交链;
(7)光电化学传感器的构建:滴加20 μL 0.05 mg/mL的壳聚糖醋酸溶液于步骤(3)中获得的ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极表面,并在室温下孵化4 h,所述的醋酸溶液浓度为1%,用pH7.4 PBS洗涤除去多余的壳聚糖后,再将ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极***含有2.5%戊二醛的溶液中2 h,用pH 7.4 PBS洗涤后,将20 μL 0.5 μM的发夹链HP1滴涂到电极表面,并在室温下孵化1 h,用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的HP1后,继续滴涂20 μL 1%的牛血清白蛋白用于封堵非特异性结合位点,用pH 7.4 PBS洗涤后,在工作电极表面滴加20 μL含有30 U ExoI的不同浓度的目标检测物溶液,在37 ºC条件下孵育1 h,随后用pH 7.4 PBS洗涤电极表面,完成光电化学免疫传感器的构建;
(8)采用时间-电流曲线法在由修饰后的ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极组成的三电极体系中在电压0.0V下进行光电化学信号检测,所用的检测溶液为5 mL含有0.01 M H2O2的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液,通过绘制光电信号强度与黏蛋白浓度的标准曲线,实现对黏蛋白的检测。
本发明的有益效果:
(1)通过简单的原位合成和水热法合成的二氧化钛/硫铟锌敏化材料能够有效地增强光电信号,具有大的表面积,为固定大量的发夹DNA链提供了一个良好的平台,有利于放大检测信号,增强分析的灵敏度。
(2)利用适配体技术,能够实现目标物MUC1的特异性识别;利用核酸外切酶可以高选择性的识别和酶切适配体/蛋白质中的适配体,实现对目标黏蛋白的循环利用,进一步实现对信号的放大。
(3)利用多枝杂交链反应获得的较长的多枝杂交链,众多的分枝为负载MnO2/BSA颗粒提供大量的活性位点,其可以催化分解更多的电子供体H2O2产生O2,降低阳极光电流。
(4)利用多重信号放大技术,构建用于检测黏蛋白的超灵敏的光电化学传感器,可以实现简单、快速、准确地检测黏蛋白,在临床癌症的早期检测、转移及治疗中具有重大的意义。
具体实施方式:
为了更好地理解本发明,下面结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1:超灵敏的光电化学传感器在检测黏蛋白1(MUC1)中的应用
(1)在ITO电极上沉积一层Au纳米粒子:首先将ITO导电电极依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10 min,将清洗后的电极***含有1%氯金酸的沉积液中,利用电位溶出分析法,在沉积电位为-0.2 V,沉积时间为60 s,将Au纳米粒子沉积在ITO导电电极的表面,沉积完成后,用二次水清洗电极表面,并在室温下自然干燥,获得ITO/Au电极;
(2)利用原位生长法在步骤(1)中获得ITO/Au电极表面生长TiO2颗粒:将ITO/Au电极***含有15 mL氟钛酸铵和硼酸混合液的25 mL烧杯中,所述的氟钛酸铵浓度为75 mM,硼酸的浓度为0.3 M,在室温下反应9 h,反应完成后,用二次水洗涤电极表面并在60 ºC干燥3 h,获得ITO/Au/TiO2电极;
(3)利用水热法在步骤(2)中获得ITO/Au/TiO2电极表面生长ZnIn2S4纳米花:将ITO/Au/TiO2电极***含有12 mL硫酸锌、氯化铟和硫代乙酰胺混合液的25 mL高压釜中,使ITO/Au/TiO2电极倾斜地靠在高压釜内壁上,且导电面向下,所述的硫酸锌、氯化铟和硫代乙酰胺的浓度分别为25 mM,50 mM和100 mM,在120 ºC加热1.5 h,待冷却到室温后用二次水洗涤电极表面,并在60 ºC干燥3 h,获得ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极;
(4)合成MnO2/BSA颗粒:称取250 mg BSA分散在7 mL二次水中,40 mg高锰酸钾溶于3mL二次水中,将两种溶液混合搅拌均匀后转移至三口烧瓶中,水浴加热至37 ºC后保持2 h,反应完成后透析24 h,冷冻干燥得到棕色的MnO2/BSA颗粒;
(5)适配体连接的杂交链反应:将适配体链Apt、引发链S1溶解在TM中,获得的Apt和S1浓度均为5 µM,将H1和H2溶解在TM中,获得的H1和H2浓度均为20 µM,然后用PTC-200热循环仪将上述链在95 ºC加热10 min,并在30 s 内冷却到4 ºC,随后,取100 µL Apt和S1的混合溶液加入到1 mL的H1和H2混合溶液中,使Apt、S1、H1和H2的最终浓度分别为0.5 µM、0.5 µM、10 µM和10 µM,将获得的杂交混合物在37 ºC下反应12 h,获得适配体连接的多枝杂交链;
(6)合成修饰有MnO2/BSA颗粒的多枝杂交链:取500 μL 1 μM的MnO2/BSA溶液、500 μL步骤(5)中合成的适配体连接的多枝杂交链、EDC、NHS溶于pH 7.4 PBS中,其中EDC和NHS的浓度分别为20 mM和10 mM,将上述混合溶液置于黑暗处摇动一夜后用PBS离心洗涤,获得修饰有MnO2/BSA 颗粒的多枝杂交链;
(7)光电化学传感器的构建:滴加10 μL 0.05 mg/mL的壳聚糖醋酸溶液于步骤(3)中获得的ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极表面,并在室温下孵化4 h,所述的醋酸溶液浓度为1%,用pH7.4 PBS洗涤除去多余的壳聚糖,然后再将ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4***含有2.5%戊二醛的溶液中2 h,用pH 7.4 PBS洗涤后,将20 μL 0.5 μM的HP1滴涂到电极表面,并在室温下孵化1h,用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的HP1后,继续滴涂20 μL 1%的牛血清白蛋白用于封堵非特异性结合位点,用pH 7.4 PBS洗涤后,在工作电极表面滴加20 μL含有30 U Exo I的不同浓度的MUC1溶液,在37 ºC条件下孵育1 h,随后用pH 7.4 PBS洗涤电极表面,完成光电化学免疫传感器的构建;
(8)采用时间-电流曲线法在由修饰后的ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极组成的三电极体系中在电压0.0 V下进行光电化学信号检测,所用的检测溶液为5 mL含有0.01 M H2O2的pH 7.4 PBS,通过绘制光电信号强度与MUC1浓度的标准曲线,实现对MUC1的检测。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种高灵敏的检测黏蛋白的光电化学传感器的制备方法
<141> 2020-07-29
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 42
<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 63
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttttttttt ttctagagca caatcacagg agccagttac ctgtgattgt gctctagcga 60
tgt 63
Claims (1)
1.一种高灵敏的检测黏蛋白的光电化学传感器的制备方法,其特征是包括以下步骤:
(1)在氧化铟锡(ITO)导电电极上沉积一层金(Au)纳米粒子:首先将ITO导电电极依次在丙酮、乙醇、二次水中各清洗10 min,将清洗后的电极***含有1%-5%氯金酸的沉积液中,利用电位溶出分析法,在沉积电位为-0.2 V,沉积时间为30-60 s,将金纳米粒子沉积在ITO导电电极的表面,沉积完成后,用二次水清洗电极表面,并在室温下自然干燥,获得ITO/Au电极;
(2)利用原位生长法在步骤(1)中获得的电极表面生长TiO2颗粒:将ITO/Au电极***含有10-15 mL氟钛酸铵和硼酸混合液的25 mL烧杯中,所述的氟钛酸铵浓度为75 mM,硼酸的浓度为0.2-0.4 M,在室温下反应6-12 h,反应完成后,用二次水洗涤电极表面并在60 ºC干燥3 h,获得ITO/Au/TiO2电极;
(3)利用水热法在步骤(2)中获得ITO/Au/TiO2电极表面生长ZnIn2S4纳米花:将ITO/Au/TiO2电极***含有10-15 mL硫酸锌、氯化铟和硫代乙酰胺混合液的25 mL高压釜中,使ITO/Au/TiO2电极倾斜地靠在高压釜内壁上,且导电面向下,所述的硫酸锌、氯化铟和硫代乙酰胺的浓度均为25-100 mM且摩尔比为1:2:4,在90-120 ºC加热1-3 h,待冷却到室温后用二次水洗涤电极表面,并在60 ºC干燥3 h,获得ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极;
(4)合成二氧化锰/牛血清白蛋白(MnO2/BSA)颗粒:称取250 mg BSA分散在7 mL二次水中,30-50 mg高锰酸钾溶于3 mL二次水中,将两种溶液混合搅拌均匀后转移至三口烧瓶中,水浴加热至37 ºC后保持2 h,反应完成后透析24 h,冷冻干燥得到MnO2/BSA颗粒;
(5)适配体连接的杂交链反应:将适配体链(Apt)、引发链(S1)溶解在杂交链反应缓冲溶液(TM)中,获得的Apt和S1浓度均为5 µM,将发夹DNA分子1(H1)和发夹DNA分子2(H2)溶解在TM中,获得的H1和H2浓度均为20 µM,所述的TM为pH 8.0,浓度为20 mM且含有50 mMMgCl2的Tris缓冲溶液,然后用PTC-200热循环仪将上述链在95 ºC加热10 min,并在30 s内冷却到4 ºC,随后,取100 µL Apt和S1的混合溶液加入到1 mL的H1和H2混合溶液中,使Apt、S1、H1和H2的最终浓度分别为0.5 µM、0.5 µM、10 µM和10 µM,将获得的杂交混合物在37 ºC下反应12 h,获得适配体连接的多枝杂交链;
(6)合成修饰有MnO2/BSA颗粒的多枝杂交链:取500 μL 1 μM的MnO2/BSA溶液、500 μL步骤(5)中合成的适配体连接的多枝杂交链、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,其中EDC和NHS的浓度分别为20 mM和10 mM,所述的PBS包含55 mM 磷酸盐,150 mM氯化钠和20 mM乙二胺四乙酸,将上述混合溶液置于黑暗处震荡一夜后用pH 7.4 PBS离心洗涤,获得修饰有MnO2/BSA颗粒的多枝杂交链;
(7)光电化学传感器的构建:滴加20 μL 0.05 mg/mL的壳聚糖醋酸溶液于步骤(3)中获得的ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极表面,并在室温下孵化4 h,所述的醋酸溶液浓度为1%,用pH7.4 PBS洗涤除去多余的壳聚糖后,再将ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极***含有2.5%戊二醛的溶液中2 h,用pH 7.4 PBS洗涤后,将20 μL 0.5 μM 的发夹链HP1滴涂到电极表面,并在室温下孵化1 h,用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的HP1后,继续滴涂20 μL 1%的牛血清白蛋白用于封堵非特异性结合位点,用pH 7.4 PBS洗涤后,在工作电极表面滴加20 μL含有30 U核酸外切酶 I的不同浓度的目标检测物溶液,在37 ºC条件下孵育1 h,随后用pH 7.4 PBS洗涤电极表面,完成光电化学免疫传感器的构建;
(8)采用时间-电流曲线法在由修饰后的ITO/Au/TiO2/ZnIn2S4电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极组成的三电极体系中在电压0.0 V下进行光电化学信号检测,所用的检测溶液为5 mL含有0.01 M H2O2的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液,通过绘制光电信号强度与黏蛋白浓度的标准曲线,实现对黏蛋白的检测。
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