CN111826438A - 一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物及其应用 - Google Patents

一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物及其应用 Download PDF

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CN111826438A CN201910320342.4A CN201910320342A CN111826438A CN 111826438 A CN111826438 A CN 111826438A CN 201910320342 A CN201910320342 A CN 201910320342A CN 111826438 A CN111826438 A CN 111826438A
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Abstract

本发明提供了一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物及其应用，所述miRNA标志物包括hsa‑miR‑493，并且还包括hsa‑miR‑93、hsa‑miR‑503、hsa‑miR‑375或hsa‑miR‑195中任意一种或两种以上的组合。通过本发明的辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物构建的食管鳞癌辅助诊断模型特异性好、准确率高，可为早期筛查食管鳞癌提供实验依据。

Description

一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤技术领域，涉及一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物及其应用。
背景技术
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤。全世界每年约有30万人死于食管癌。每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。食管癌典型的症状为进行性咽下困难。食管癌有两种主要的病理亚型，其中食管鳞状细胞癌(以下称食管鳞癌)约占90％。
microRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。许多研究表明，miRNA可作为肿瘤标志物进行早期筛查。
CN103173449A公开了与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物及其应用，筛选得到的has-miR-382可辅助判断食管癌患者的预后或死亡风险，推动了食管癌诊治方面的发展。
CN103160509A公开了与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物及其应用，筛选得到的has-miR-212可辅助判断食管癌患者的预后或死亡风险，推动了食管癌诊治方面的发展。
CN103173450A公开了与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物及其应用，筛选得到的has-miR-198可辅助判断食管癌患者的预后或死亡风险，推动了食管癌诊治方面的发展。
CN103114092A公开了与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物及其应用，筛选得到的has-miR-197可辅助判断食管癌患者的预后或死亡风险，推动了食管癌诊治方面的发展。
目前临床上通常所用的食管癌检测方法有纤维内窥镜检查、食管脱落细胞检查、X射线钡餐。纤维内窥镜检查虽然能够达到85％的检测准确率，但是由于内窥镜检过程可造成患者明显不适或需麻醉，病人的依从性差，且对医师的技术操作要求高，难以作为常规方法大范围推广应用。脱落细胞检查阳性率虽也能达到80％以上，但涂片操作的误差较大。而X射线钡餐显影则因敏感度差，且对身体有辐射伤害等缺陷，并不适用于食管癌的早期普查。
因此，为食管癌早期筛查提供一种新的、高效、准确、灵敏、特异的分子标志物具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物及其应用，通过对miRNA标志物的表达量进行检测可以辅助诊断食管鳞癌的发病与发展过程，为其早期筛查、治疗与预后判断提供实验依据。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物，所述miRNA标志物包括hsa-miR-493，并且还包括hsa-miR-93、hsa-miR-503、hsa-miR-375或hsa-miR-195中任意一种或两种以上的组合。例如，可以是hsa-miR-493和hsa-miR-93的组合，hsa-miR-493和hsa-miR-503的组合，hsa-miR-493和hsa-miR-375的组合，hsa-miR-493、hsa-miR-93和hsa-miR-503的组合，hsa-miR-493、hsa-miR-93、hsa-miR-503和hsa-miR-375的组合，hsa-miR-493、hsa-miR-93、hsa-miR-503和hsa-miR-195的组合，或hsa-miR-493、hsa-miR-93、hsa-miR-503、hsa-miR-375和hsa-miR-195的组合。
本发明中，首次发现hsa-miR-493与食管鳞癌相关，并通过该miRNA与hsa-miR-93、hsa-miR-503、hsa-miR-375或hsa-miR-195中的至少一种的组合实现对食管鳞癌的辅助诊断。
优选地，所述miRNA标志物包括hsa-miR-493、hsa-miR-93、hsa-miR-503、hsa-miR-375和hsa-miR-195的组合。
本发明中，通过对五种miRNA的表达量进行检测，可以辅助诊断食管鳞癌，且准确度、灵敏性和特异性均显著，具有重要的临床意义。
优选地，所述hsa-miR-493、hsa-miR-93、hsa-miR-503、hsa-miR-375和hsa-miR-195的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示。
hsa-miR-493的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-UUGUACAUGGUAGGCUUUCAUU-3’.
hsa-miR-93的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3’.
hsa-miR-503的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG-3’.
hsa-miR-375的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3’.
hsa-miR-195的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3’.
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的miRNA标志物在构建食管鳞癌辅助诊断模型、食管鳞癌检测试剂盒、食管鳞癌检测芯片、制备诊断食管鳞癌的试剂或制备治疗食管鳞癌的药物中的应用。
第三方面，本发明提供一种食管鳞癌辅助诊断模型，所述模型的输入对象为第一方面所述miRNA标志物的表达量。
本发明中通过检测如第一方面所述miRNA标志物的表达量，结合模型运算即可得到食管鳞癌的患病风险预测值，该数值可辅助诊断食管鳞癌的发病和发展过程，为早期筛查食管鳞癌和疾病转归提供实验依据，以早发现早治疗，提高对预后的有效干预。
优选地，所述模型的表达公式为Logit P＝(0.102*hsa-miR-93的表达值)+(0.742*hsa-miR-503的表达值)-(0.278*hsa-miR-375的表达值)-(0.384*hsa-miR-195的表达值)+(0.3*hsa-miR-493的表达值)。
本发明中，所述miRNA标志物的表达值可通过多种相对定量检测手段进行检测，典型非限定的如：实时荧光定量PCR或基因组测序等。
第四方面，本发明提供一种构建如第三方面所述食管鳞癌辅助诊断模型的方法，包括以下步骤：
(1)选择在食管鳞癌组织和正常组织中差异表达的miRNA；
(2)将步骤(1)所得miRNA集合切分为训练集和测试集；
(3)通过机器学习算法构建食管鳞癌辅助诊断模型；
(4)优化步骤(3)所得食管鳞癌辅助诊断模型并保存。
优选地，步骤(1)所述miRNA的数据来源为GEO数据库的GSE55856数据集和肿瘤数据库TCGA。
本发明中使用的数据来源于全球最大的芯片数据库GEO(Gene ExpressionOmnibus)和权威肿瘤数据库TCGA(The Cancer Genomes Atlas)。通过检索发现数据集GSE55856是GEO数据库中唯一在较大食管鳞癌样本量上检测miRNA表达谱的集合，通过对两个数据集进行食管鳞癌组织和正常组织的比较差异分析，最终确认由101个差异miRNA。
优选地，步骤(3)所述机器学习算法包括基于L1正则化的广义线性模型逻辑回归算法、集成模型随机森林算法、非显示训练模型K近邻算法或间隔分类模型支持向量机算法中的任意一种或至少两种的组合，优选为基于L1正则化的广义线性模型逻辑回归算法。
本发明中，从一系列不同数量梯度的模型中按照最高准确率和最小模型复杂度的原则筛选出7个miRNA作为特征子集。再从不同原理和角度出发的多种机器学习算法构建多个食管鳞癌辅助诊断模型，并对模型的性能进行评估，通过对不同算法的结果分析，得出适合不同算法的最优模型。最后，根据模型的稳定性和泛化扩增能力进行预测性能的评估，发现基于L1正则化的广义线性模型逻辑回归算法构建的模型性能最佳，并进一步精简7个特征子集中miRNA的个数到5个。通过模型表达公式Logit P＝(0.102*hsa-miR-93的表达值)+(0.742*hsa-miR-503的表达值)-(0.278*hsa-miR-375的表达值)-(0.384*hsa-miR-195的表达值)+(0.3*hsa-miR-493的表达值)，对两个验证集合的测试准确率分别达到98.46％和96.29％，AUC分别高达0.998和0.983，敏感性和特异性均高于0.95。由此表明，所得模型综合性能优越，可用于辅助诊断食管鳞癌。
第五方面，本发明提供一种食管鳞癌检测试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的miRNA标志物的检测试剂。
优选地，所述检测试剂包括特异性引物或/和特异性探针。
优选地，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP、MgCl2、缓冲液和SYBR Green I染料。
第六方面，本发明提供一种芯片，所述芯片包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO.1-5所示的部分或全部序列。
第七方面，本发明提供一种药物，所述药物的靶点为第一方面所述的miRNA标志物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的食管鳞癌miRNA标志物可辅助指示食管鳞癌的发生和发展，且五种miRNA组合检测时准确度最高；
(2)本发明提供的食管鳞癌辅助诊断模型准确率高达96.29％以上，AUC高达0.983以上，灵敏度和特异性均高于0.95，具有显著的预测性能，能辅助诊断食管鳞癌的发生和发展，具有重要的临床意义；
(3)本发明提供的食管鳞癌辅助诊断模型表达公式简单，可以利用最低限度数量的miRNA的表达值预测食管鳞癌并实现较高的预测准确率，缩短检测周期，快速便捷。
附图说明
图1为GSE55856和TCGA数据样本中食管鳞癌差异miRNA的维恩图；
图2为不同特征数量的随机森林模型在食管鳞癌标本训练集准确率的柱状图；
图3为食管鳞癌特异性miRNA的相对系数权重；
图4为逻辑回归模型在食管鳞癌标本训练集上的单次十折交叉验证曲线；
图5为逻辑回归模型在食管鳞癌标本训练集合上的100次交叉验证曲线；
图6为基于不同K值的K-近邻模型的交叉验证食管鳞癌准确率的柱状图；
图7为基于不同核函数的支持向量机模型的交叉验证食管鳞癌准确率的柱状图；
图8A为hsa-miR-93在TCGA ESCC数据集上的生存曲线，图8B为hsa-miR-195在TCGAESCC数据集上的生存曲线，图8C为hsa-miR-375在TCGA ESCC数据集上的生存曲线，图8D为hsa-miR-493在TCGA ESCC数据集上的生存曲线，图8E为hsa-miR-503在TCGA ESCC数据集上的生存曲线，图8F为五种miRNA的组合在TCGA ESCC数据集上的生存曲线。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1 miRNA标志物的筛选
1、在食管鳞癌和食管正常组织的差异筛选
本发明中使用的数据来源于全球最大的芯片数据库GEO(Gene ExpressionOmnibus)和权威肿瘤数据库TCGA(The Cancer Genomes Atlas)。通过检索发现数据集GSE55856是GEO数据库中唯一的、在较大食管鳞癌样本量上检测miRNA表达谱的集合。对两个数据集进行食管鳞癌组织和正常组织的比较差异分析发现，从GSE55856数据集108对食管鳞癌组织与食管正常组织的芯片结果比较中筛选出786个差异表达的miRNAs，和从TCGA的食管癌与食管正常组织的95个癌组织样本与13个食管正常组织的miRNA-seq数据比较中筛选出262个差异表达的miRNAs，通过对这两个数据集筛选出的差异表达miRNAs再进行并集比较验证，发现有101个共同的差异miRNAs(图1)。
2、食管鳞癌特征miRNA组合的筛选
模型训练通常将原始集合按照一定比例切分成训练集与测试集，方便对模型性能进行验证。本发明中的训练样本是从GSE55856中随机切分出的151个样本(占总样本70％)，使用随机森林算法对差异miRNA的疾病贡献权重进行建模打分，通过每次移除最不重要20％的特征属性，梯度性构建出一系列候选模型(图2)，并使用袋外样本预测准确率作为指标进行评估。最终从一系列不同数量梯度的模型中按照最高准确率和最小模型复杂度的原则筛选出包含7个miRNA组合(hsa-miR-93，hsa-miR-503，hsa-miR-23a，hsa-miR-493，hsa-miR-375，has-miR-99a和hsa-miR-195)的组合作为特征子集(图3)，用于后续进一步的食管鳞癌辅助诊断模型的构建。
实施例2食管鳞癌辅助诊断模型的构建
1、不同模型的筛选比较：为了对食管鳞癌诊断模型的构建进行较为全面的探索，本发明使用从不同原理和角度出发的多种机器学***均准确率。如图4所示，基于L1正则化的广义线性模型逻辑回归算法，得到的模型的准确率在0.01～0.2区间范围内急剧增加并趋向稳定。然后使用100次十折交叉验证法对此区间进行精细筛选得到最佳参数值0.11(图5)。对于K近邻算法，其参数只要是近邻样本K的值，本发明中比较了当K分别为3，5，7，9时模型的性能指标，结果发现K＝3时有最高的诊断准确率(图6)。对于支持向量机来说，主要是核函数的选择，在线性核函数、高斯核函数与sigmoid核函数中，使用线性核函数构建的分类模型拥有最佳的预测性能(图7)。
2、最佳模型的构建：为了验证上述所得模型的稳定性和泛化扩展能力，本研究还在另外两个验证集合上对其进行了预测性能的评估，这两个验证集合分别是从GSE55856中随机选取的65个样本和TCGA中108个样本。使用多种模型评估参数，如准确率、AUC、敏感性、特异性和精确性来对模型进行综合性比较。最终发现基于L1正则化的逻辑回归算法构建的模型性能最佳。由于L1正则化能够导致稀疏解，故最优模型仅使用了七个特征miRNA中的五种(hsa-miR-93，hsa-miR-503，hsa-miR-375，hsa-miR-195，hsa-miR-493)，在两个验证集合中的准确率分别为98.46％和96.29％，且AUC高达0.998和0.983，敏感性和特异度也均高于0.95(表1)。其模型表达公式为Logit P＝(0.102*hsa-miR-93的表达值)+(0.742*hsa-miR-503的表达值)-(0.278*hsa-miR-375的表达值)-(0.384*hsa-miR-195的表达值)+(0.3*hsa-miR-493的表达值)。
表1两个数据库所选食管鳞癌特征miRNA组合分析数据
Figure BDA0002034431660000091
Figure BDA0002034431660000101
生存分析实验
实施例2的最佳模型中五种miRNA分子(hsa-miR-93，hsa-miR-503，hsa-miR-375，hsa-miR-195和hsa-miR-493)在TCGA数据集中的表达值以及食管鳞癌患者的生存信息，通过生存分析探究每个miRNA作为单独因素时和作为组合因素时对患者生存时间的指示作用。患者按照单个分子或组合因子的表达值中位数为阈值分为高、低表达两组。生存时间的差异比较使用Log-rank检验，显著性差异阈值设置为p<0.05，并使用Kaplan-Meier生存曲线描述生存时间特点分布，结果如图8A-F所示。
由图8A-F可知，五种miRNA分别作为单个因素时与食管鳞癌患者的生存并无显著关联，不具有预后指示作用。而当这五种miRNA分子按照本发明中的诊断模型规则((0.102*hsa-miR-93的表达值)+(0.742*hsa-miR-503的表达值)-(0.278*hsa-miR-375的表达值)-(0.384*hsa-miR-195的表达值)+(0.3*hsa-miR-493的表达值))进行组合时具有统计学显著性(P＝0.018)，可以作为一种新型的食管鳞癌患者预后标志物。
综上，本发明只需检测五种miRNA(hsa-miR-93，hsa-miR-503，hsa-miR-375，hsa-miR-195和hsa-miR-493)在人体中的表达情况，就在验证集样本中能稳定达到96％以上的检测准确率，敏感性和特异也高达0.95，具有重要的临床指导意义。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学；深圳华因康基因科技有限公司
<120> 一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物及其应用
<130> 2019
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
uuguacaugg uaggcuuuca uu 22
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
caaagugcug uucgugcagg uag 23
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
uagcagcggg aacaguucug cag 23
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<212> RNA
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<400> 4
uuuguucguu cggcucgcgu ga 22
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
uagcagcaca gaaauauugg c 21

Claims (10)

1.一组辅助诊断食管鳞癌的miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物包括hsa-miR-493，并且还包括hsa-miR-93、hsa-miR-503、hsa-miR-375或hsa-miR-195中任意一种或两种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物包括hsa-miR-493、hsa-miR-93、hsa-miR-503、hsa-miR-375和hsa-miR-195的组合；
优选地，所述hsa-miR-493、hsa-miR-93、hsa-miR-503、hsa-miR-375和hsa-miR-195的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
3.一种如权利要求1或2所述的miRNA标志物在构建食管鳞癌辅助诊断模型、食管鳞癌检测试剂盒、食管鳞癌检测芯片、制备诊断食管鳞癌的试剂或制备治疗食管鳞癌的药物中的应用。
4.一种食管鳞癌辅助诊断模型，其特征在于，所述模型的输入对象为权利要求2所述miRNA标志物的表达量；
优选地，所述模型的表达公式为Logit P＝(0.102*hsa-miR-93的表达值)+(0.742*hsa-miR-503的表达值)-(0.278*hsa-miR-375的表达值)-(0.384*hsa-miR-195的表达值)+(0.3*hsa-miR-493的表达值)。
5.一种构建如权利要求4所述食管鳞癌辅助诊断模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择在食管鳞癌组织和正常组织中差异表达的miRNA；
(2)将步骤(1)所得miRNA集合切分为训练集和测试集；
(3)通过机器学习算法构建食管鳞癌辅助诊断模型；
(4)优化步骤(3)所得食管鳞癌辅助诊断模型并保存。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述miRNA的数据来源为GEO数据库的GSE55856数据集和肿瘤数据库TCGA；
优选地，步骤(3)所述机器学习算法包括基于L1正则化的广义线性模型逻辑回归算法、集成模型随机森林算法、非显示训练模型K近邻算法或间隔分类模型支持向量机算法中的任意一种或两种以上的组合，优选为基于L1正则化的广义线性模型逻辑回归算法。
7.一种食管鳞癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的miRNA标志物的检测试剂；
优选地，所述检测试剂包括特异性引物或/和特异性探针。
8.根据权利要求7所述的食管鳞癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTP、MgCl2、缓冲液和SYBR Green I染料。
9.一种芯片，其特征在于，所述芯片包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO.1-5所示的部分或全部序列。
10.一种药物，其特征在于，所述药物的靶点为权利要求1或2所述的miRNA标志物。
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WO2021162065A1 (ja) * 2020-02-10 2021-08-19 国立大学法人広島大学 食道扁平上皮癌の検出を補助する方法

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