CN111826319B - 一种微生物促生剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及种植技术领域，具体涉及一种微生物促生剂及其应用。微生物促生剂包括节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌，两种细菌协同作用，可对澳洲坚果果树产生较好的促生作用。本方案的微生物促生剂可提高土壤中营养物质的利用率，从而达到提高植物养分吸收，促进植物生长，改良土壤生态环境的目的。本方案的微生物促生剂可应用于澳洲坚果的种植的实践操作中，进一步提高澳洲坚果的经济价值。

Description

一种微生物促生剂及其应用

技术领域

本发明涉及种植技术领域，具体涉及一种微生物促生剂及其应用。

背景技术

澳洲坚果的经济价值高，素来享有“干果之王”的誉称，现已在我国境内广泛种植。目前，对澳洲坚果的种植技术的研究局限在育苗、田间管理和病虫害防治等方面，尚无澳洲坚果专用肥料的研究，更缺少微生物菌肥在澳洲坚果种植上的应用研究。

广义的微生物肥料是指微生物在进行生命活动过程中，除了营养供给以外，还能刺激植物产生多种活性物质，比如生长激素，或者能拮抗土壤中某些病原微生物对植物的致病作用，抵消化学合成肥料产生的影响，降解有害污染物等等。利用微生物作为植物生长的促生剂已经广泛应用于农业生产中，含有微生物促生剂的肥料(微生物肥料)比化肥养分全面，能够产生专属的应用效应，种类较多，肥效温和且无污染，能够弥补在农业生产中的不足，在可持续农业土壤生态***中起着重要的作用。我国农业部登记的微生物肥料产品有9个菌剂类和2个菌肥类品种，主要的功能菌株有固氮菌、解磷菌和解钾菌等。现有的微生物肥料产品的品类尚不够丰富，不能满足实际应用的需求，并且尚无专门针对于澳洲坚果种植的菌剂或者菌肥。现阶段，澳洲坚果的种植还是依赖于化肥和普通有机肥，化肥的使用对生态环境有一定负面影响，普通有机肥并不能有效地促进澳洲坚果果树生长和结果。亟需开发一种转门针对于澳洲坚果的含有微生物促生剂的肥料，进一步提高澳洲坚果的经济价值。

发明内容

本发明意在提供一种微生物促生剂，以解决缺少专门针对于澳洲坚果的微生物菌肥的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种微生物促生剂，包括节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌。

本方案的原理及优点是：节杆菌(Arthrobacter defluvii)和解葡聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glycanilyticus)可产生协同作用，提高植物对土壤中磷和钾的利用率，从而达到提高植物养分吸收，促进植物生长，改良土壤生态环境的目的。本方案使用的节杆菌(Arthrobacter defluvii)可以为标准菌株Arthrobacter defluvii 4C1-a(KCTC19209，韩国典型菌种保藏中心)；本方案使用的解葡聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillusglycanilyticus)可以为标准菌株解葡聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus glycanilyticus(CRBIP编号：CIP107742T，巴斯德研究所菌种保藏中心)。

发明人从磷肥厂尾矿土壤和钾肥厂尾矿土壤等中分离获得多种功能菌株，对上述功能菌株进行了功能筛选、定量分析以及核酸鉴定。发现节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌之间存在较强的协同作用，可以协同促进澳洲坚果的生长。发明人进而使用了节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌的标准菌株来确认上述的协同作用，发现节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌单独使用对澳洲坚果小树苗的促生作用均不显著，但是发现两种细菌联合使用的时候，澳洲坚果的株高和胸径较空白对照有显著提高，说明了联合使用两种功能菌对澳洲坚果有较好的促生作用。

微生物促生剂在蔬菜和粮食作物等应用广泛，但因为微生物促生剂对果树等时间周期较长的树木的促生作用不太明显，导致其在澳洲坚果种植上的应用较少。本发明拓宽了澳洲坚果的供选的促生物质，为澳洲坚果的种植提供了一种新的方案。

进一步，节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌的细菌数量比为0.8:1-1.5:1。

采用上述技术方案，在上述比例下，节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌可以产生较强的协同作用。

进一步，节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌的细菌数量比为1:1。

采用上述技术方案，1:1的比例是节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌产生协同作用的最佳比例。

进一步，所述微生物菌肥由如下方法制备：获取节杆菌的菌悬液和解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液；将节杆菌的菌悬液和解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液混合，获得混合菌液，再用水稀释，获得微生物促生剂。

采用上述技术方案，采用直接混合和水稀释的办法可制得本方案的微生物促生剂，简单易行。

进一步，节杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值为0.8-1.5,解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值为1。

采用上述技术方案，吸光光度代表细菌浓度(单位体积中的数量)，采用吸光光度的方法来计量细菌的用量是现有技术中常规的定量方法。

进一步，节杆菌的菌悬液和解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液以1:1的体积比混合，获得混合菌液。

采用上述技术方案，节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌的比例为1:1，可以较好的发挥两者的协同加强作用。

进一步，每10ml混合菌液，使用100ml水稀释。

采用上述技术方案，采用10:100的稀释梯度可保证施加在植物上的菌不会太浓或太稀，太浓的菌液会影响植物根际的渗透压平衡，太稀会导致菌对植物的作用不明显。

进一步，一种微生物促生剂在澳洲坚果种植中的应用。

采用上述技术方案，节杆菌和解葡聚糖类芽孢杆菌组成的促生剂可以促进澳洲坚果果树的生长，可以应用于澳洲坚果的种植的实践中。

进一步，每月向澳洲坚果的幼苗施加所述微生物促生剂一次。

采用上述技术方案，每月向澳洲坚果的幼苗施加本方案的微生物促生剂，可以使得幼苗的株高和胸径明显增加，有着非常明显的协同促生作用。

进一步，将混合菌液与有机肥混合，厌氧发酵后获得微生物有机肥。

采用上述技术方案，使用本方案的微生物促生剂发酵有机肥，将获得的微生物有机肥配合本微生物促生剂使用，可以在增强澳洲坚果营养的同时发挥促生作用，有望成为新的可广泛推广应用的菌肥类微生物肥料产品。

附图说明

图1为本发明实验例1的盆栽促生效果图(节杆菌)。

图2为本发明实验例1的盆栽促生效果图(解葡聚糖类芽孢杆)。

图3为本发明实验例1的盆栽促生效果图(微生物促生剂B)。

图4为本发明实验例1的叶绿素含量测量统计结果图。

图5为本发明实验例2的澳洲坚果株高统计结果。

图6为本发明实验例2的澳洲坚果胸径统计结果。

具体实施方式

实施例1：菌种获取以及鉴定

取含菌株A(经鉴定为节杆菌Arthrobacter defluvii)的营养琼脂斜面以及含菌株B(经鉴定为解葡聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus glycanilyticus)进行菌株形态和生理性质鉴定(细菌的斜面划线培养为现有技术中的惯用手段，在此不做赘述)。菌株A和菌株B都是从土壤中分离得到的优势菌种，获取过程详见实验例4。

菌株的形态鉴定：将斜面上的单菌落接种到营养琼脂(NA)平板上，37℃培养24h，观察单菌落大小、形状、透明度等表面形态。菌落形态的观察是利用在培养基平板上三区划线的方法，将菌株在平板上划线培养，于37℃恒温培养箱中恒温培养24h，观察其菌落形态。菌体形态的观察，分离得到的菌株在37℃恒温培养箱中培养了24h，经过革兰氏染色，利用光学显微镜观察菌体的形态。实验结果如表1所示，节杆菌的菌落形态为圆形、表面干燥、菌落不透明；解葡聚糖类芽孢杆菌为圆形、表面光滑、菌落透明。菌株A的菌落形态和标准菌株Arthrobacter defluvii 4C1-a一致；菌株B的菌落形态和标准菌株解葡聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus glycanilyticus一致。

菌株生理生化指标鉴定：革兰氏染色、接触酶、甲基红、乙酞甲基甲醇(V-P)、淀粉解、明胶水解、硝酸盐还原等试验的方法均参照《伯杰细菌鉴定手册》。实验结果如表2所示，节杆菌为革兰氏阳性菌，解葡聚糖类芽孢杆菌为革兰氏阴性菌。菌株A的鉴定结果和标准菌株Arthrobacter defluvii 4C1-a一致；菌株B的鉴定结果和标准菌株解葡聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus glycanilyticus一致。

表1细菌的菌落特征与培养形状

菌株编号

形状

表面

透明度

***

边缘

颜色

菌株A

圆形

干燥

不透明

稍凸起

整齐

白灰色

菌株B

圆形

光滑

透明

有凸起

整齐

无色

表2部分功能菌株生理生化特征

注：“+”表阳性，“-”表阴性。

实施例2：微生物促生剂的配制

将实施例1中的单菌落(菌株A和菌株B)接种到液体营养琼脂培养基中，37℃摇床160rpm培养24h。将培养好的菌株用分光光度计调两种菌液(使用液体营养琼脂培养基悬浮细菌形成的菌悬液)的OD₆₀₀值。OD₆₀₀值反映的是菌悬液中悬浮细菌的密度，在菌悬液体积一定的情况下，OD₆₀₀值可反映细菌数量。节杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值调整为0.8，解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1，将5ml的节杆菌的菌悬液与5ml的解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液混合，再加入100ml自来水稀释，获得微生物促生剂A。

采用相同的方法制备微生物促生剂B，不同点在于，节杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1，解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1，将5ml的节杆菌的菌悬液与5ml的解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液混合，再加入100ml自来水稀释，获得微生物促生剂B。

采用相同的方法制备微生物促生剂C，不同点在于，节杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1.5，解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1，将5ml的节杆菌的菌悬液与5ml的解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液混合，再加入100ml自来水稀释，获得微生物促生剂C。

实施例3：有机肥的配制

本实施例使用微生物菌剂制作有机肥，使用了直接购置的标准菌种节杆菌Arthrobacter defluvii(KCTC 19209，代表菌株A)以及解葡聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus glycanilyticus(CIP107742T，代表菌株B)。节杆菌(Arthrobacterdefluvii，KCTC 19209)和解葡聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glycanilyticus，CIP107742T)均为模式菌种，详见实验例4中的记录。需要将干粉状的两种冻干菌(干粉)进行复苏，在无菌条件下，将营养琼脂(NA)液体培养基加入冻干菌中，再将菌液接种到营养琼脂(NA)斜面上进行培养，待斜面上长出菌落。再挑取聚落在营养琼脂(NA)斜面上进行划线培养，培养以获得单菌落。两种菌的复苏方法一致。

有机肥的配制的具体的方案为：

按照实施例2的方法制备两种菌悬液，并将两种均悬液混合(混合菌液)后加入有机肥中拌匀。混合菌液的具体制备方法为：节杆菌(使用KCTC 19209替代菌株A)的菌悬液的OD₆₀₀值调整为0.8，解葡聚糖类芽孢杆菌(使用CIP107742T替代菌株B)的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1，将5ml的节杆菌的菌悬液与5ml的解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液混合，获得混合菌液。有机肥(采用符合NY525-2012标准的商业化肥料，有机质的质量分数为60％，氮磷钾的质量分数为15％)和混合菌液的使用比例为：有机肥:菌液＝12g:50ml(可在(8-12)g:50ml之间变动)，装袋密封好之后进行堆肥13天(可在10-15天之间变动)，获得微生物有机肥A。

节杆菌(使用KCTC 19209替代菌株A)的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1，解葡聚糖类芽孢杆菌(使用CIP107742T替代菌株B)的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1，将5ml的节杆菌的菌悬液与5ml的解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液混合，获得混合菌液。将混合菌液与有机肥混合均匀，有机肥和混合菌液的使用比例为：有机肥:菌液＝10g:50ml，装袋密封好之后进行堆肥15天，获得微生物有机肥B。

节杆菌(使用KCTC 19209替代菌株A)的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1.5，解葡聚糖类芽孢杆菌(使用CIP107742T替代菌株B)的菌悬液的OD₆₀₀值调整为1，将5ml的节杆菌的菌悬液与5ml的解葡聚糖类芽孢杆菌的菌悬液混合，获得混合菌液。有机肥和混合菌液的使用比例为：有机肥:菌液＝8g:50ml，装袋密封好之后进行堆肥10天，获得微生物有机肥C。

实验例1：苤蓝盆栽促生实验

(1)土壤采集：供试土壤为某某大学荒废的大棚土，土壤类型为黄壤土，采集地表0-20cm的耕层土供盆栽试验，将所有采集的土壤过2mm筛，除去土壤中的杂质，混合均匀后取一部分用养分速测仪测定土壤理化性质，测定结果为有机质10.31g/kg，速效磷30.32mg/kg，速效钾68.19mg/kg，铵态氮16.78mg/kg，全氮1.77g/kg，pH为7.59，土壤保存在常温阴凉处备用。

(2)种子萌发：实验对象是苤蓝幼苗，苤蓝品种为邢台市邢壮种业有限公司提供的品种“甜脆大苤蓝”。将过筛的土壤装入育苗盘里，挑选大小和形态一致的种子，每盆撒种子1-2粒，然后在种子上再覆盖一层薄薄的土，均匀浇透，定时浇水等待种子萌发，幼苗长出3-4片后移栽到口径为200mm，高为170mm的育苗花盆中，将幼苗生长一致的作为平行，每个处理5个重复。

(3)菌液接种：缓苗7天后接菌，将实施例2制备的微生物促生剂B(实验组)浇于苤蓝根部(110ml)，同时对照组(CK)使用等量自来水(110ml)。同时设置两个单菌对比组，分别为：

对比组1：将实施例1中的节杆菌单菌落接种到液体营养琼脂培养基中，37℃摇床160rpm培养24h。将培养好的菌株用分光光度计调菌液(使用液体营养琼脂培养基悬浮细菌形成的菌悬液)的OD₆₀₀值，调节该值为1，获得节杆菌的菌悬液。在10ml的节杆菌的菌悬液加入100ml自来水稀释，获得节杆菌促生剂(110ml)。

对比组2：将对比组1中的节杆菌替换为解葡聚糖类芽孢杆菌，获得解葡聚糖类芽孢杆菌促生剂(110ml)。

每个处理5个重复，定期浇水，定期观察记录其生长状况。

(4)植株生理指标测量

种植40天后，测定苤蓝幼苗的植株生理指标，植物生长指标包括株高和植株叶片叶绿素含量等。

叶绿素含量的测定采用如下方法：

取新鲜苤蓝的叶片，去除苤蓝叶片的主脉，将其余部分剪碎。称取剪碎的新鲜叶片0.2g，放到研钵中备用，研磨过程中避光，加少量的CaCO₃粉和石英砂，再加入少量95％乙醇研磨，研磨成匀浆，再加10mL 95％乙醇，继续研磨到变白。再用3mL 95％乙醇冲洗研钵和研棒周边残留，最后把冲洗液全部倒入10ml离心管，4000r/min离心20min，然后转移到50mL的棕色容量瓶摇匀、定容，该溶液即为叶片叶绿素提取液。

计算苤蓝叶片中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。以加95％乙醇为空白对照，利用紫外分光光度计在波长665nm、649nm和470m下测定吸光度。

按公式计算叶绿素a、b含量(mg/L)和叶绿素总浓度(mg/g)。

(1)叶绿素a浓度：C_a＝13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉ 公式(1)

(2)叶绿素b浓度：C_b＝24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅ 公式(2)

(3)叶绿素含量(mg/g)＝CVN/1000m 公式(3)

式中，C为色素含量(mg/L)；V为提取液体积(mL)；N为稀释倍数；m为样品质量(g)；1000是表示1000ml。

(5)实验结果

只施加支节杆菌促生剂的盆栽促生效果图见图1；只施加解葡聚糖类芽孢杆菌促生剂的盆栽促生效果图见图2；施加微生物促生剂B盆栽促生效果图见图3。由实验结果可知，通过表面观察，对比组1、对比组2和实验组的菌剂，在株高、根系密度和叶片大小等方面都能明显看出菌株对苤蓝的促生长作用。

叶绿素含量测量统计结果如图4所示(*表示与CK相比，p＜0.05，图中数据形式为mean±SD)，施加菌液的苤蓝叶绿素含量跟CK相比，对比组1、对比组2和实验组在叶绿素含量上有显著提高，其中，对比组1在植物叶绿素含量上显著高于CK,使苤蓝的叶绿素含量增加了约29％；实验组在植物叶绿素含量上显著高于CK，使苤蓝的叶绿素含量增加了约54％。

实验例2：澳洲坚果促生实验

试验于2019年12月开始，地点为云南省江城县澳洲坚果苗圃，选择苗圃中嫁接一年的澳洲坚果小树苗作为试验材料。对照组加入等同体积的自来水，每个处理设置10个平行每个月施菌液(四种供式试剂，详见实验分组)一次，连续施加4个月，定期观察记录其生长状况。

实验分组情况为：

实验组：实施例2制备的微生物促生剂B，每株澳洲坚果小树苗每次施加400ml。

对比组1：将实施例1中的支节杆菌单菌落接种到液体营养琼脂培养基中，37℃摇床160rpm培养24h。将培养好的菌株用分光光度计调菌液(使用液体营养琼脂培养基悬浮细菌形成的菌悬液)的OD₆₀₀值，调节该值为1，获得节杆菌的菌悬液。在10ml的节杆菌的菌悬液加入100ml自来水稀释，获得节杆菌促生剂。每株澳洲坚果小树苗(幼苗)每次施加400ml。

对比组2：将对比组1中的节杆菌替换为解葡聚糖类芽孢杆菌，获得解葡聚糖类芽孢杆菌促生剂。每株澳洲坚果小树苗每次施加400ml。

CK组：自来水，每株澳洲坚果小树苗每次施加400ml。

用养分速测仪测定土壤理化性质，测定结果为有机质7.85g/kg，速效磷28.39mg/kg，速效钾50.79mg/kg，铵态氮17.81mg/kg，全氮0.43g/kg。测定得到的数据用SPSS 20.0软件进行单因素方差显著性检验，用GraphPad Prism 8.0.2.作柱状图。

实验结果如图5和图6所示(*表示与CK相比，p＜0.05；**表示与CK相比，p＜0.01，图中数据形式为mean±SD)，图5展示了澳洲坚果株高对比情况，图6展示了澳洲坚果胸径对比情况。由实验结果可知，单独使用节杆菌或者单独使用解葡聚糖类芽孢杆菌都未显著促进澳洲坚果的株高和胸径的增加，但是在施加本方案的菌剂之后，可以显著地提高澳洲坚果幼苗的株高和胸径，说明两种菌可通过协同作用促进澳洲坚果果树的生长。

除了使用菌株A和菌株B进行实验，本方案中还用标准菌株KCTC 19209和KCTC19209配置了微生物促生剂B’(实验组’)，配置方法参照微生物促生剂B，只是用KCTC 19209替代菌株A，用CIP107742T替代菌株B。并按照对比组1的方法配置了节杆菌促生剂(用KCTC19209替代菌株A，对比组1’)，按照对比组2的方法配置了解葡聚糖类芽孢杆菌促生剂(用CIP107742T替代菌株B，对比组2’)，并设置空白对照CK’(同CK)。按照本实验例的方法是重复上述的澳洲坚果促生实验，即实验过程相同，只是将待测的促生剂进行了更换，以证明菌株A和菌株B同两者的标准菌株的功效的一致。虽然已经通过实验例4证实了菌株A与KCTC19209，菌株B与CIP107742T在遗传物质上的一致性，本实验证明了他们在功能上的一致性。实验结果如表3所示(*表示与CK’相比，p＜0.05)，实验证明使用标准菌株也具有协同增效的实验现象，两种菌株共同作用，促进澳洲坚果幼苗生长。

表3：澳洲坚果促生实验结果

实验例3

本实验例的实验方案基本同实验例2，不同点是使用微生物有机肥A-C替换微生物菌剂(分别为实验组A、实验组B和实验组C；还设置了一个CK组，施加实施例3中的普通有机肥和浇水；对比组的试剂为实验例2中的实验组使用的试剂)。由于肥料形态是固态，所以施肥方法不同于实施例2，在澳洲坚果小树苗种植的土壤周围挖出环形坑，进行坑施(在坑中放入微生物有机肥，再回填土壤)，完成施肥后浇适量水。肥料施加量为每株澳洲坚果小树苗每次施加100g，每个处理设置10个平行，施肥情况如表3所示。实验组A、实验组B和实验组C于2019年12月施加一次微生物有机肥，然后连续3个月分别施加实施例1中的微生物促生剂A-C(施加量400ml)，每月一次，定期观察记录其生长状况。测量小树苗的株高和胸径情况，实验结果如表4所示，本方案制备的微生物有机肥对澳洲坚果小树苗具有较好的促生作用，优于单独使用实施例1中的微生物促生剂。

表4：微生物有机肥对株高和胸径的促进作用(mean±SD)

实验例4：土壤菌株分离试验

本研究从各类型土壤中分离得到该土壤的优势菌种，本研究分析了磷肥厂尾矿土壤、钾肥厂尾矿土壤、澳洲坚果种植地土壤等多个土壤样品。从土壤样本中分离菌种的方法具体为：取土壤样品10g，放入到盛有90mL生理盐水的锥形瓶中，160rpm摇床摇30min，使土壤样品完全与无菌生理盐水混匀后，静置10min备用。接着在超净工作台上用移液器吸取1mL的土壤上清悬液，加入到盛有9mL0.85％生理盐水的玻璃试管中，充分混匀制成稀释度为10-2的溶液，按同样方法将土样依次梯度稀释，将土样溶液分别稀释到10^-4，10^-5，10^-6，用涂布器涂布于选择性培养基平板上(每一梯度涂3皿)，封膜，倒置放入37℃的恒温培养箱中培养，待平板中长出菌落(大约5-7d可获得)，即获得单菌落。对分离得到的数百个单菌落进行的解磷解钾、生防作用以及协同作用等多个方面进行筛选，最终获得两株具有协同作用的菌株(A和B)，分别对菌株A和B进行种属鉴定，进而对两菌株的促生作用进行研究。

将分离得到的菌株在营养琼脂平板上活化。接种至营养琼脂液体培养基扩大培养至对数生长期，离心；收集菌体作为DNA提取材料，利用生工生物试剂盒提取DNA，提取细菌各株基因组DNA。经1.0％琼脂糖检测，合格后备用。将其作为PCR扩增模板，参照PCR扩增体系，条件扩增16S rDNA片段。PCR反应体系如表5所示。

表5：PCR反应体系(50μL)

试剂	体积
		2×Taq PCR Master Mix	25μL
27F(10μmol/L)(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQ ID NO:1)	1μL
		1492R(10μmol/L)(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQ ID NO:2)	1μL
DNA模板	3μL
		ddH<sub>2</sub>O	20μL

PCR扩增条件：94℃3min；94℃30s、52℃30s、72℃45s(35个循环)；72℃10min。将PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶检测，合格后，送至上海生工测序。测序结果用DNAMAN6.0拼接后在NCBI网站上进行同源序列比对，从中选取与测序菌株同源性比对结果最高的序列。经鉴定菌株A与标准菌株Arthrobacter defluvii 4C1-a的同源性达到99％以上，该标准菌株的信息为：Korean Collection for Type Cultures(韩国典型菌种保藏中心)保藏号：KCTC 19209，参考文献：Kim,K.K.；Arthrobacter defluvii sp.nov.,4-chlorophenol-degrading bacteria isolated from sewage；JOURNAL Int.J.Syst.Evol.Microbiol.58(PT 8),1916-1921(2008)；16S rRNA序列Genebank号：AM409361.1。菌株B与标准菌株解葡聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus glycanilyticus的同源性达到了99％以上，该标准菌株的信息为：CRBIP编号为CIP107742T(巴斯德研究所菌种保藏中心)。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南林业大学

<120> 一种微生物促生剂及其应用

<130> 2020.7.28

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一种微生物促生剂，其特征在于，包括节杆菌（Arthrobacterdefluvii）和解聚糖类芽孢杆菌（Paenibacillusglycanilyticus）；所述节杆菌的保藏号为KCTC 19209；所述解聚糖类芽孢杆菌的保藏号为CIP 107742T。

2.根据权利要求1所述的一种微生物促生剂，其特征在于：节杆菌和解聚糖类芽孢杆菌的细菌数量比为0.8:1-1.5:1。

3.根据权利要求2所述的一种微生物促生剂，其特征在于：节杆菌和解聚糖类芽孢杆菌的细菌数量比为1:1。

4.根据权利要求3所述的一种微生物促生剂，其特征在于：所述微生物促生剂由如下方法制备：获取节杆菌的菌悬液和解聚糖类芽孢杆菌的菌悬液；将节杆菌的菌悬液和解聚糖类芽孢杆菌的菌悬液混合，获得混合菌液，再用水稀释，获得微生物促生剂。

5.根据权利要求4中所述的一种微生物促生剂，其特征在于：节杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值为0.8-1.5,解聚糖类芽孢杆菌的菌悬液的OD₆₀₀值为1。

6.根据权利要求5中所述的一种微生物促生剂，其特征在于：节杆菌的菌悬液和解聚糖类芽孢杆菌的菌悬液以1:1的体积比混合，获得混合菌液。

7.根据权利要求6所述的一种微生物促生剂，其特征在于：每10ml混合菌液，使用100ml水稀释。

8.根据权利要求7所述的一种微生物促生剂在促进澳洲坚果果树生长中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：每月向澳洲坚果的幼苗施加所述微生物促生剂一次。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将混合菌液与有机肥混合，厌氧发酵后获得微生物有机肥。

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