CN111821518B - 一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法 - Google Patents

一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法，包括以下步骤：S1、胶原基质的制备；S2、间充质干细胞的制备；S3、骨髓的制备；S4、半成品组织工程骨的培养制备；S5、具有再生能力的组织工程骨的培养制备。该方法成骨诱导时间短，安全性高、成本低，不仅适用于简单的骨组织制作，制备出的组织工程骨在嵌入体内后可以完全和体内组织进行融合，进而生长成自身的一部分，达到组织再生的目的，完全避免了固定性的组织材料与机体生长和退化不能同步的问题，组织工程骨也可进行塑形、拼合和体内成熟，是较理想的再生医学终产品和材料性产品。

Description

一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法。
背景技术
由于某种因素如创伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等而使骨丧失了一些骨质，形成较大的间隙，称为骨缺损。骨缺损在临床上比较常见，其治疗一直是临床治疗的难点。骨移植为解决上述问题提供了可能，目前自体骨仍是骨移植来源的首选，但是其供给有限，应用时容易出现“拆东墙补西墙”的困境，难以满足临床需求。因此，找寻一种合适的骨移植替代物已成为研究和修复骨缺损的首要问题。
组织工程骨技术是将种子细胞接种于各种支架材料上，细胞外基质的分泌和材料的吸收协调进行，最终形成由细胞和细胞外基质组成的与材料形状相同的新生组织，达到结构与功能的良好修复。随着技术的发展，可吸收和组织兼容性较好的材料也被用于骨缺损的治疗，但目前组织工程材料和组织工程骨难以形成血管，并形成骨生成和吸收的平衡状态，再生组织与正常组织在结构和功能上仍存在很大的区别，在骨缺失治疗中难以完成血管的生成和骨髓的重建，不能完全替代缺失的功能。
发明内容
为了解决上述背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法，该方法制备出具有血管形成和骨髓生成能力的再生组织工程骨，在体内某些骨质完全缺失的情况下进行重建，植入体内后在一定条件下生长为功能性的具有骨髓和血管的骨质。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法，包括以下步骤：
S1、胶原基质的制备：将无菌、具有生物活性且未变性的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原或复合型胶原加入至无菌管中，向其中加入在4℃下预冷的低糖DMEM培养基，在4℃温度下经充分混合后，静置备用；
S2、间充质干细胞的制备：选取状态良好的人间充质干细胞按1×107个细胞/cm2的浓度悬浮至诱导培养基中得到细胞悬液；
S3、骨髓的制备：将新鲜骨髓用5倍量的生理盐水悬浮，离心弃去上清液，将下层骨髓沉淀用生理盐水充分悬浮，即得骨髓悬液备用；
S4、半成品组织工程骨的培养制备：向步骤S2中得到的细胞悬液中加入步骤S1中得到的胶原基质，充分混合后，将其移入至透析袋中，固定透析袋，用注射针头纵向穿透，在穿孔处***管式半透膜进行组装；组装完毕后将透析袋放入培养器皿中，加入足量的低糖DMEM诱导培养基，经培养得到半成品组织工程骨；
S5、具有再生能力的组织工程骨的培养制备：将步骤S4中的培养器皿中的透析袋去除，将透析袋中的管式半透膜抽出，并加步骤S3中得到的骨髓悬液注入至管式半透膜抽出后留下的孔洞处，然后将透析袋置于培养器皿中，加入含有10％血清替代品的低糖DMEM诱导培养基浸没组织，并于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中继续培养24小时，随后去除外侧透析袋，即得可移植使用的具有再生能力的组织工程骨。
进一步地，所述步骤S4中，具体培养过程为：组装完毕后将透析袋放入培养器皿中，加入足量的低糖DMEM诱导培养基，浸没所有组织，向培养器皿中注入管式半透膜，并吸取诱导培养基，以驱赶气泡；随后将培养器皿置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中培养，48小时后缓慢吸去培养上清液，然后加入新鲜的低糖DMEM诱导培养基继续培养，每48小时更换一次新鲜的诱导培养液，连续培养10天，得到半成品组织工程骨。
进一步地，所述步骤S4中，透析袋的长度与所需组织工程骨的长度相匹配，透析袋直径为8mm，透析袋截流分子量为1000KD，管式半透膜直径为5mm。
进一步地，所述步骤S2中，诱导培养基为含有谷氨酰胺、抗坏血酸、丙酮酸钠、***、β-甘油磷酸钠、血清替代品的低糖DMEM培养基。
进一步地，所述步骤S2中人间充质干细胞选自于骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、脐带或羊膜。
进一步地，所述步骤S3中新鲜骨髓为采用EDTA抗凝抽取人、大鼠或小鼠的骨髓。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明使用具有生物活性的胶原作为工程支架材料，该材料经过特殊处理，即可被组织吸收重建，又不会诱发免疫反应；组织工程细胞选择间充质干细胞，该类型细胞来源广泛，且不具有免疫原性，同时又可使用自身细胞，进一步降低了免疫及其他生物风险；使用骨髓直接移植入半成品的组织工程骨中，使得其产品具有成骨细胞、破骨细胞、又能重建骨髓造血能力和使其有血管生成，同时在制备组织工程骨过程中内外使用透性膜***，保障了骨生成过程中的营养供应，避免细胞凋亡和死亡。
该方法成骨诱导时间短，安全性高、成本低，不仅适用于简单的骨组织制作，可根据实际需要制作分支更多和更复杂的内管道***；该方法制备出的组织工程骨在嵌入体内后可以完全和体内组织进行融合，进而生长成自身的一部分，达到组织再生的目的，完全避免了固定性的组织材料与机体生长和退化不能同步的问题，组织工程骨也可进行塑形、拼合和体内成熟，是较理想的再生医学终产品和材料性产品。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明的实施例公开一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法，包括以下步骤：
S1、胶原基质的制备：将200毫克无菌、具有生物活性且未变性的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原或复合型胶原加入至5mL无菌管中，向其中加入在4℃下预冷的低糖DMEM培养基1mL，在4℃温度下经充分混合后，静置备用；
S2、间充质干细胞的制备：选取状态良好的取自患者脂肪的人间充质干细胞按1×107个细胞/cm2的浓度悬浮至诱导培养基中得到细胞悬液；
S3、骨髓的制备：采用EDTA抗凝抽取人骨髓即得新鲜骨髓，将新鲜骨髓用5倍量的生理盐水悬浮，300g离心5分钟，弃去上清液，将下层骨髓沉淀用生理盐水充分悬浮，即得骨髓悬液备用；
S4、半成品组织工程骨的培养制备：向步骤S2中得到的细胞悬液中加入步骤S1中得到的胶原基质，充分混合后，将其移入至直径为8mm，截流分子量为1000KD的透析袋中，固定透析袋，用注射针头纵向穿透，在穿孔处***直径为5mm的管式半透膜进行组装；组装完毕后将透析袋放入培养器皿中，加入足量的低糖DMEM诱导培养基，浸没所有组织，向培养器皿中注入管式半透膜，并吸取诱导培养基，以驱赶气泡；随后将培养器皿置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中培养，48小时后缓慢吸去培养上清液，然后加入新鲜的低糖DMEM诱导培养基继续培养，每48小时更换一次新鲜的诱导培养液，连续培养10天，得到半成品组织工程骨。
S5、具有再生能力的组织工程骨的培养制备：将步骤S4中的培养器皿中的透析袋去除，将透析袋中的管式半透膜抽出，并加步骤S3中得到的骨髓悬液注入至管式半透膜抽出后留下的孔洞处，注满为止，然后将透析袋置于培养器皿中，加入含有10％血清替代品的低糖DMEM诱导培养基浸没组织，并于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中继续培养24小时，随后去除外侧透析袋，即得可移植使用的具有再生能力的组织工程骨；
S6、组织工程骨的使用：获得的组织工程骨可根据实际需要修整大小和形状，直接移植到体内骨缺损部位；或配合其他组织工程骨等制作成目标形状后移植。经过临床实验验证，也可将此组织工程骨移植入骨缺损动物模型的缺损骨处，或移植入血供丰富的肌肉、肾脏等部位，移植入体内后30天左右可形成功能性的骨组织。
S7、组织工程骨的存放：该组织工程骨组织制作完成后宜立即使用，不宜存储过长时间，4℃条件下可存放12小时。
其中，诱导培养基为含有谷氨酰胺、抗坏血酸、丙酮酸钠、***、β-甘油磷酸钠、血清替代品的低糖DMEM培养基。
本发明使用具有生物活性的胶原作为工程支架材料，该材料经过特殊处理，即可被组织吸收重建，又不会诱发免疫反应；组织工程细胞选择间充质干细胞，该类型细胞来源广泛，且不具有免疫原性，同时又可使用自身细胞，进一步降低了免疫及其他生物风险；使用骨髓直接移植入半成品的组织工程骨中，使得其产品具有成骨细胞、破骨细胞、又能重建骨髓造血能力和使其有血管生成，同时在制备组织工程骨过程中内外使用透性膜***，保障了骨生成过程中的营养供应，避免细胞凋亡和死亡。
该方法成骨诱导时间短，安全性高、成本低，不仅适用于简单的骨组织制作，可根据实际需要制作分支更多和更复杂的内管道***；该方法制备出的组织工程骨在嵌入体内后可以完全和体内组织进行融合，进而生长成自身的一部分，达到组织再生的目的，完全避免了固定性的组织材料与机体生长和退化不能同步的问题，组织工程骨也可进行塑形、拼合和体内成熟，是较理想的再生医学终产品和材料性产品。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (5)

1.一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、胶原基质的制备：将无菌、具有生物活性且未变性的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原或复合型胶原加入至无菌管中，向其中加入在4℃下预冷的低糖DMEM培养基，在4℃温度下经充分混合后，静置备用；
S2、间充质干细胞的制备：选取状态良好的人间充质干细胞按1×107个细胞/cm2的浓度悬浮至诱导培养基中得到细胞悬液；
S3、骨髓的制备：将新鲜骨髓用5倍量的生理盐水悬浮，离心弃去上清液，将下层骨髓沉淀用生理盐水充分悬浮，即得骨髓悬液备用；
S4、半成品组织工程骨的培养制备：向步骤S2中得到的细胞悬液中加入步骤S1中得到的胶原基质，充分混合后，将其移入至透析袋中，固定透析袋，用注射针头纵向穿透，在穿孔处***管式半透膜进行组装；组装完毕后将透析袋放入培养器皿中，加入足量的低糖DMEM诱导培养基，浸没所有组织，向培养器皿中注入管式半透膜，并吸取诱导培养基，以驱赶气泡；随后将培养器皿置于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中培养，48小时后缓慢吸去培养上清液，然后加入新鲜的低糖DMEM诱导培养基继续培养，每48小时更换一次新鲜的诱导培养液，连续培养10天，得到半成品组织工程骨；
S5、具有再生能力的组织工程骨的培养制备：将步骤S4中的培养器皿中的透析袋去除，将透析袋中的管式半透膜抽出，并加步骤S3中得到的骨髓悬液注入至管式半透膜抽出后留下的孔洞处，然后将透析袋置于培养器皿中，加入含有10％血清替代品的低糖DMEM诱导培养基浸没组织，并于37℃、二氧化碳含量为5％的培养箱中继续培养24小时，随后去除外侧透析袋，即得可移植使用的具有再生能力的组织工程骨。
2.根据权利要求1所述的具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，透析袋的长度与所需组织工程骨的长度相匹配，透析袋直径为8mm，透析袋截流分子量为1000KD，管式半透膜直径为5mm。
3.根据权利要求1所述的具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，诱导培养基为含有谷氨酰胺、抗坏血酸、丙酮酸钠、***、β-甘油磷酸钠、血清替代品的低糖DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中人间充质干细胞选自于骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、脐带或羊膜。
5.根据权利要求1所述的具有再生能力的组织工程骨的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中新鲜骨髓为采用EDTA抗凝抽取人、大鼠或小鼠的骨髓。
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