CN111808774A - 一种可循环使用的氧气指示剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可循环使用的氧气指示剂及其制备方法与应用，将菌种Shewanella oneidensis MR‑1接种于LB培养基，30℃，200rpm摇床过夜培养获得种子液；向含有乳酸钠及亚甲基蓝的脱色培养基中加入种子液使其OD600值为0.05，然后装入厌氧瓶中；向厌氧瓶中通氮气置换空气后盖上瓶塞，静置，待亚甲基蓝染料脱色；将含有乳酸钠和1％琼脂的脱色培养基熔融后置于55℃条件下保存；将脱色后液体与含有1％琼脂的脱色培养基按体积比1:1混合，冷却后得到固体氧气指示剂。本发明利用产电微生物Shewanella oneidensis MR‑1以乳酸钠作为电子供体产生电子，还原具有双稳态的亚甲基蓝染液从蓝色变为无色，然后利用低浓度琼脂固化后制备氧气指示剂，检测厌氧环境。本发明制备的氧气指示剂灵敏度较高，可循环使用。

Description

一种可循环使用的氧气指示剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种可循环使用的氧气指示剂及其制备方法与应用，属于含氧量测定技术领域。
背景技术
氧气是很多生物化学反应过程中不可获取的元素，氧气也是食品及医药试剂变质的主要原因之一。同时厌氧环境是多个工业领域需要严格控制的生产环境，例如在污水处理厂、制药厂，酒厂，实验室等环境等中，对厌氧环境中氧气的检测是十分必要的。
目前已经应用的氧气指示剂包括电化学氧气指示剂、光学氧气指示剂和比色法氧气指示剂。电化学氧气指示剂中的Clark电极是较早使用的氧气传感器之一。然而，因其操作繁琐，灵敏度不高、反应时间长等问题，使其在实际应用过程中受到很大的限制。光学氧气指示剂中，比较受关注的是基于荧光显色的氧气指示方法。这种指示剂通过氧气与荧光物质动态碰撞使其淬灭，通过检测荧光的淬灭程度来表征氧气的含量。与电化学氧气指示剂相比，光学氧气指示剂无副产物生成，其稳定性较好，然而该方法需要专门的仪器设备来检测荧光的密度，使得其应用成本较高。比色法氧气指示剂克服了光学氧气指示剂的缺点，通过肉眼可见的颜色变化反映氧气含量，该方法快速简便，目前主要包括氧络合型、氧化还原型和光驱动氧化还原型。氧络合型是通过氧气参与络合反应发成颜色变化，但不足在于颜色变化不太明显。氧化还原型是通过染料的氧化态剂还原态的颜色变化来指示氧气是否存在。例如利用靛蓝和硫靛蓝作为染料的一种不可逆氧气指示剂。但这几种氧气指示剂的市场售价都较高，且不易保存。光驱动氧化还原型有UV激活比色法氧气指示剂油墨和用UVB激活二氧化钛光催化剂的指示剂。吴增强等人利用皂石的反射紫外线作用，在表面活性剂的作用下将亚甲蓝、抗坏血酸引入皂石的层间结构中,制成一种新型的氧气指示剂。但就国内而言，氧气指示剂产品并不多，尽管部分氧气指示剂已经实现商业化生产，但基本不能循环使用，造成资源浪费。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种可循环使用的氧气指示剂，可快速指示环境中是否存在氧气，且可重复多次使用。
本发明的目的之二是提供上述可循环使用的氧气指示剂的制备方法。
本发明的目的之三是提供上述可循环使用的氧气指示剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种可循环使用的氧气指示剂，包括希瓦氏菌株Shewanella oneidensis MR-1、乳酸钠、亚甲基蓝和固体脱色培养基，所述固体脱色培养基的组成为：Na2HPO4·12H2O 7.52g/L，NaH2PO4·2H2O7.13g/L，YE 2g/L，NH4Cl1g/L，NaCl 0.5g/L，琼脂1％。
所述氧气指示剂重生的方法是：将经氧气氧化显色后的氧气指示剂重新静置数小时，待颜色褪去，得到重生的氧气指示剂。
本发明还提供上述可循环使用的氧气指示剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将菌种Shewanella oneidensis MR-1接种于LB培养基，30℃，200rpm摇床过夜培养获得种子液；
步骤2、向含有乳酸钠及亚甲基蓝的脱色培养基中加入种子液使其OD600值为0.05，然后装入厌氧瓶中；
步骤3、向厌氧瓶中通N2 1min后盖上瓶塞以确保厌氧环境，静置，待亚甲基蓝染料脱色；
步骤4、将含有乳酸钠和1％琼脂的脱色培养基置于55℃条件下保存；
步骤5、将步骤3获得脱色后液体与步骤4获得的含有1％琼脂的脱色培养基按体积比1:1混合，冷却后得到固体氧气指示剂。
步骤2中，所述含有乳酸钠及亚甲基蓝的脱色培养基中乳酸钠的浓度为10mM，亚甲基蓝的浓度为20μM。
步骤4中，所述含有乳酸钠和1％琼脂的脱色培养基中乳酸钠的浓度为10mM。
本发明利用产电微生物Shewanella oneidensis MR-1(购自美国菌种保藏中心，编号ATCC 700550)以乳酸钠作为电子供体产生电子，还原具有双稳态的亚甲基蓝染液从蓝色变为无色，然后利用低浓度琼脂固化后制备氧气指示剂，检测厌氧环境。使用过程中，如果环境为严格的厌氧环境，指示剂为无色；当环境中有氧气时，次甲基蓝被氧化成蓝色；使用结束后再次密封，Shewanella oneidensis MR-1菌体消耗氧气，同时再次利用乳酸钠作为电子供体还原次甲基蓝再次变为无色，可以循环使用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明所用的菌株Shewanella oneidensis MR-1可在厌氧和好氧环境中都可以生长，菌种生长速度快，易培养。
2.本发明利用菌株使亚甲基蓝脱色，制备的氧气指示剂灵敏度较高，颜色变化明显。
3.本发明制备的氧气指示剂可循环使用，降低生产成本，经济环保。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：氧气指示剂的制备
步骤1、种子液制备：将菌株Shewanella oneidensis MR-1接种至LB培养基中，30℃，200rpm摇床过夜培养获得种子液；
步骤2、脱色：将含有乳酸钠及亚甲基蓝的脱色培养基分装入厌氧瓶中，加入种子液使其终OD600值为0.05；向厌氧瓶中通N2 1min后盖上瓶塞以确保厌氧环境；静置，待染料脱色；脱色培养基组分如下：Na2HPO4·12H2O 7.52g/L，NaH2PO4·2H2O 7.13g/L，YE 2g/L，NH4Cl 1g/L，NaCl 0.5g/L；其中乳酸钠的浓度为10mM，亚甲基蓝的浓度为20μM；
步骤3、制备厌氧环境指示剂：将含有乳酸钠和1％琼脂的脱色培养基融化后置于55℃烘箱中保温，其中乳酸钠浓度为10mM；将脱色后液体与融化的含有琼脂的脱色培养基按体积比1:1混合，冷却后获得产品，保存在厌氧瓶中。
实施例2：氧气指示剂的使用
打开厌氧瓶的瓶塞，将氧气指示剂置于待测环境中观察颜色的变化，如果检测环境中没有氧气，则指示剂一直保持无色，如果在检测环境中接触到氧气，琼脂上层迅速变蓝，随着接触氧气时间的延长，蓝色部分逐渐向下深入。
盖上瓶塞，静置数小时，菌体会迅速消耗氧气，菌体利用乳酸钠产生电子再次还原亚甲基蓝，蓝色迅速褪去后可循环使用10次以上。

Claims (6)

1.一种可循环使用的氧气指示剂，其特征在于，包括希瓦氏菌株Shewanellaoneidensis MR-1、乳酸钠、亚甲基蓝和固体脱色培养基，所述固体脱色培养基的组成为：Na2HPO4·12H2O 7.52g/L，NaH2PO4·2H2O 7.13g/L，YE 2g/L，NH4Cl 1g/L，NaCl 0.5g/L，琼脂1％。
2.根据权利要求1所述的一种可循环使用的氧气指示剂，其特征在于，所述氧气指示剂重生的方法是：将经氧气氧化显色后的氧气指示剂重新静置数小时，待颜色褪去，得到重生的氧气指示剂。
3.一种权利要求1所述的可循环使用的氧气指示剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将菌种Shewanella oneidensis MR-1接种于LB培养基，30℃，200rpm摇床过夜培养获得种子液；
步骤2、向含有乳酸钠及亚甲基蓝的脱色培养基中加入种子液使其OD600值为0.05，然后装入厌氧瓶中；
步骤3、向厌氧瓶中通氮气置换空气后，盖上瓶塞以确保厌氧环境，静置，待亚甲基蓝染料脱色；
步骤4、将含有乳酸钠和1％琼脂的脱色培养基熔融后置于55℃条件下保存；
步骤5、将步骤3获得脱色后液体与步骤4获得的含有1％琼脂的脱色培养基按体积比1:1混合，冷却后得到固体氧气指示剂。
4.根据权利要求3所述的可循环使用的氧气指示剂的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述含有乳酸钠及亚甲基蓝的脱色培养基中乳酸钠的浓度为10mM，亚甲基蓝的浓度为20μM。
5.根据权利要求3所述的可循环使用的氧气指示剂的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述含有乳酸钠和1％琼脂的脱色培养基中乳酸钠的浓度为10mM。
6.权利要求1所述的可循环使用的氧气指示剂在厌氧环境监测中的应用。
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