CN111808161A - 一种对生物化合物进行放射性标记的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对生物化合物进行放射性标记的方法，包括将修饰有马来酰亚胺基团的双功能螯合剂与放射性核素进行螯合反应，然后直接加入生物化合物进行偶联反应，得到放射性标记的生物化合物。上述技术方案采用了具有优良热稳定性的马来酰亚胺基团，使得双功能螯合剂可在高温条件下与放射性金属离子进行螯合，显著缩短了螯合反应的时间，提高了标记效率；螯合反应的产物无需纯化即可进行生物化合物偶联，具有步骤简单、便捷高效、连接效率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及放射性药物及核医学技术领域，具体涉及一种在生物化合物上进行放射性核素标记的方法。
背景技术
蛋白质的放射性标记技术是当前靶向放疗技术、放射免疫疗法的关键性技术之一。目前的方法通常是使用双功能螯合剂在蛋白上连接如DOTA、NOTA、Dfo等具有螯合功能的官能团，实现蛋白的预修饰，再进行放射性金属核素标记反应。
但是对于许多治疗型核素，如β-辐射体和α-辐射体核素，其往往具有较大的离子半径，螯合反应难以发生。如经典α-辐射体Bi-213即需要在60℃条件下与DOTA进行反应，由于蛋白质对温度的敏感性，传统方法无法实现该标记过程。为解决上述问题，科学家提出两步标记反应，即使用双功能螯合配体先在较高的温度下(约60℃)与放射性金属离子发生螯合，并于纯化后，再在适宜条件下，基于异氰酸酯或琥珀酰亚胺与蛋白质进行偶联，以得到最终的放射性核素标记的蛋白质分子。
然而，虽然该两步法策略已经被广泛使用，但是其较低的标记产率是其主要缺点，例如，对于目前广泛使用的Ac-225以SNC-DOTA标记抗体两步偶联反应一般的标记产率为7～15％。这对众多昂贵的α-辐射体放射性核素将造成极大地浪费，同时对放射免疫疗法等对放射性药物有比活度要求的研究及临床使用带来极大影响。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明首先明确了经典的以异硫氰基(-SCN)为基础的标记策略存在偶联基团不稳定的问题，随后本发明的目的在于提供一种对生物化合物进行放射性标记的方法，通过选用耐热的马来酰亚胺代替不稳定的异硫氰酸酯，使反应可以在更高的温度下进行，并且显著提高了标记效率。
为此，本发明提供了一种对生物化合物进行放射性标记的方法，包括以下步骤：
S1：将双功能螯合剂与放射性核素进行螯合反应，得到产物I；所述双功能螯合剂修饰有马来酰亚胺基团；
S2：将步骤S1得到的产物I与生物化合物进行偶联反应，得到产物II，所述产物II即为放射性标记的生物化合物。
进一步，步骤S1中，所述螯合反应的温度为85-95℃，优选为88-95℃，例如88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃；反应时间为3-10min，优选为3-5min，例如3min、4min、5min。
本发明选用具有马来酰亚胺基团的双功能螯合剂与放射性核素进行螯合，由于马来酰亚胺基团具有良好的耐热性，该双功能螯合剂在高温下可保持稳定并且与放射性核素快速螯合。
进一步，步骤S1中，pH为4.7-5.3，例如4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3，优选为5.0。
进一步，步骤S2中，偶联反应的温度为25-40℃，优选为30-40℃，更优选为35-40℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃；偶联反应的时间为30-90min，优选为60min。
进一步，所述方法还包括以下步骤：在步骤S2之前，对所述生物化合物进行预处理，所述预处理包括：将所述生物化合物与二硫键还原剂进行反应，和/或使所述生物化合物适于与马来酰亚胺基团进行偶联。所述二硫键还原剂选自下组中的一种或两种以上：三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)，β-巯基乙醇(β-ME)；优选为TCEP。
大多数天然的蛋白质可以和异硫氰基反应，但是无法直接和马来酰亚胺基反应。因此，本发明在标记方法中引入预处理步骤，使待标记蛋白可以与马来酰亚胺基发生偶联反应。
在具体的实施方式中，所述方法由步骤S1和S2组成，即产物I无需纯化即可直接与生物化合物进行偶联反应。
进一步，所述方法还包括以下步骤：对产物II进行纯化。
进一步，所述方法还包括以下步骤：在步骤S2之前，对产物I进行纯化。本发明提供的生物化合物放射性标记方法为一锅法，无需对产物I进行纯化即可获得极高的标记效率；但在具体的实施方式中，不排除可以在中间加入额外的纯化步骤。
进一步，所述放射性核素选自下组中的一种或两种以上：锝-99m、镓-68、铜-60、铜-64、铟-111、锆-89、铼-186、铼-188、钇-90、镥-177、铋-213、镭-223、锕-225。
进一步，本发明所述的双功能螯合剂，是指具有螯合金属离子和共价结合生物化合物的能力的化合物。因此，本发明所述的双功能螯合剂可以是能够与生物分子反应的任何合适的双功能螯合剂，在具体的实施方式中，所述双功能螯合剂选自下组中的一种或两种以上：二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷内-1,4,7-三乙酸(DO3A)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(2-丙酸)(DOTMA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N’,N”-三乙酸(NOTA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(TETA)、三乙烯四胺六乙酸(TTNA)、反式-1，2-二氨基己烷四乙酸(CYDTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-(2-羟丙基)-4,7,10-三乙酸(HP-DO3A)、反式-环己烷-二胺四乙酸(CDTA)、反式(1,2)-环己烷二亚乙基三胺五乙酸(CDTPA)、1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-N,N’,N”-三乙酸(OTTA)及其衍生物。
进一步，所述生物化合物为蛋白质、多肽；所述蛋白质或多肽可为天然的或经过人工改造的。在具体的实施方式中，所述生物化合物选自下组中的一种或两种以上：抗体、球蛋白、白蛋白、酶；所述抗体包括单克隆抗体、半抗体、抗原结合片段(Fab)、可变区片段(FV)、单域抗体(SdAb)和纳米抗体等。
本发明在研究过程中发现，本领域常用的偶联基团普遍存在稳定性较差的缺陷，本发明首次通过实验直接证明了异硫氰基的热不稳定性、马来酰亚胺基具有良好热稳定性。在此基础上，本发明采用热稳定性良好的马来酰亚胺作为偶联基团，且本发明的技术方案不仅仅是用马来酰亚胺基代替异硫氰基，如前所述，由于大多数天然蛋白质无法直接偶联马来酰亚胺，在本发明优选的实施方式中对待标记蛋白进行预处理等步骤；另外，本发明的具体反应条件经过综合优化，以达到最优的标记效果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明通过马来酰亚胺基团与生物化合物进行偶联，与现有技术广泛使用的基于异氰酸酯或琥珀酰亚胺不同，马来酰亚胺基团具有良好的热稳定性，使得双功能螯合剂可以在高达90℃的温度条件下与放射性金属离子进行螯合，不仅显著缩短了螯合反应的时间(现有技术为1h左右，本发明仅需5min)，而且由于偶联基团的良好稳定性，有效提高了标记产率。
(2)本发明提供的方法中，包括对天然(非人工设计的)蛋白质/抗体的预处理步骤，使预处理后的蛋白质/抗体可以与马来酰亚胺基发生偶联。
(3)在本发明提供的方法中，双功能螯合剂与放射性核素螯合后，无需纯化，直接加入的待偶联的生物化合物即可进行偶联反应。本发明采用“一锅法”的方式实现了两步反应，步骤简单、便捷高效；由于马来酰亚胺基团的热稳定性的保持，使得偶联反应的连接效率较现有技术的～10％提高至～80％。
(4)本发明提供的方法显著提高了标记产率和偶联效率，从而减少了放射性核素的用量，降低了反应成本；另外，本发明提供的方法可提高放射性标记生物化合物的比活度，优化放射性药物整体质量，具有优良的临床实用性。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为不同的双功能螯合剂DOTA-Mal与DOTA-SCN稳定性的高效液相色谱图；
图2为Ac-225标记单克隆抗体(225Ac-DOTA-mAb)的合成线路；
图3为放射性薄层色谱结果；
图4为225Ac-抗PD-L1靶向治疗中的肿瘤生长曲线；
图5为225Ac-抗PD-L1靶向治疗过程中诱发的荷瘤小鼠肿瘤坏死。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1 DOTA-Mal与DOTA-SCN稳定性的高效液相色谱分析
将1mg DOTA-Mal与DOTA-SCN分别溶解于50ul DMSO中，再溶解于1ml PBS中，分别在0时刻及60℃加热30min，使用高效液相色谱分析其成分(液相条件：40％乙腈/水，1ml/min)，结果如图1所示，可见DOTA-Mal可以保持稳定，而DOTA-SCN在加热过程中稳定性较差。
实施例2Ac-225标记抗PD-L1单抗
本实施例以DOTA-马来酰亚胺化合物(Maleimido-mono-amide-DOTA，DOTA-Mal)作为双功能螯合物，其可以承受高温反应并保持稳定，其中DOTA可以和大多数常见的放射性核素进行螯合。
所述抗PD-L1单抗(Adagene(Suzhou)Limited)经以下预处理：取1.5mg抗PD-L1单抗，于0.1mL PBS溶液中，加入100eq.TCEP，37℃处理1h。
(1)将4eq.的DOTA-Mal置于1.5ml离心管中，加入10μCi[225Ac]AcCl3溶液，并使用2M醋酸钠溶液调pH至5，90℃加热5min。
(2)随后向步骤(1)的产物中直接加入经预处理的抗PD-L1单抗，于37℃反应1h。
(3)步骤(2)结束后，使用PD-10尺寸排阻树脂(Sephadex G-25M)根据其说明书进行纯化，制备的得到目标产物。
实验例1放射性薄层色谱放射性显影
为确定实施例2中的放射性标记产率，本实施例提供了一种放射性薄层色谱放射性显影方法。
实验方法：分别取对应实验组样品5ul点样于薄层色谱纸上，使用对应的展开剂进行展开。
展开剂I：10mM EDTA/水，游离的放射性金属离子及放射性离子-螯合物处于溶剂前沿，被标记抗体处于原点。
展开剂II：100mM NaOH/9％NaCl，放射性离子-螯合物处于溶剂前沿，游离的放射性金属离子及被标记抗体处于原点。
实施例2共进行5次试验(分别记为试验1-5)，并根据不同物质在不同展开剂中的分布情况计算的物质含量。
图3所示为试验1中各步骤产物的薄层色谱展开结果，根据结果可计算试验各步骤的各组分比例，如表1所示，最终产率可达81％，纯度99.7％。
表1
| Ac<sup>3+</sup> | Ac-DOTA-Mal | Ac-DOTA-mAb | |
| 步骤(1)产物 | 5％ | 95％ | / |
| 步骤(2)产物 | 1％ | 34％ | 65％ |
| 步骤(3)产物 | 0％ | 0％ | 99.7％ |
表2所示为试验1-5的各步骤反应混合物主要成分比例。
表2
由表2可知，本发明提供的标记方法的最终放射化学产率可达到81％，纯度可达99.6～99.9％。与现有技术相比，不仅反应条件简单，而且具有极高的标记效率。
实验例2225Ac-抗PD-L1的靶向治疗
取实施例2制备得到的标记有放射性核素的化合物[225Ac]Ac-抗PD-L1(化学剂量10mg/kg)通过尾静脉注射进入肩部接种有MC38(PD-L1阳性)的小鼠体内，并定期测量小鼠的肿瘤体积，绘制肿瘤体积-时间曲线，如图4所示。
可见，实施例2制备得到的Ac-225标记的抗PD-L1抗体具有极佳的肿瘤治疗效果，仅400nCi的标记化合物就可以完全抑制肿瘤生长，这较常用的Lu-177治疗剂量小3个数量级。治疗过程中诱发的肿瘤坏死如图5所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种对生物化合物进行放射性标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将双功能螯合剂与放射性核素进行螯合反应，得到产物I；所述双功能螯合剂修饰有马来酰亚胺基团；
S2：将步骤S1得到的产物I与生物化合物进行偶联反应，得到放射性标记的生物化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：在步骤S2之前，对所述生物化合物进行预处理；所述预处理包括：将所述生物化合物与二硫键还原剂进行反应，和/或使所述生物化合物适于与马来酰亚胺基团进行偶联。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述螯合反应的温度为85-95℃，pH为4.7-5.3。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，偶联反应的温度为25-40℃；偶联反应的时间为30-90min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：对制备得到的放射性标记的生物化合物进行纯化。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：在步骤S2之前，对产物I进行纯化。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述放射性核素选自下组中的一种或两种以上：锝-99m、镓-68、铜-60、铜-64、铟-111、锆-89、铼-186、铼-188、钇-90、镥-177、铋-213、镭-223、锕-225。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双功能螯合剂选自下组中的一种或两种以上：二亚乙基三胺五乙酸、乙二胺四乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷内-1,4,7-三乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(2-丙酸)、1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N’,N”-三乙酸、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸、三乙烯四胺六乙酸、反式-1，2-二氨基己烷四乙酸、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-(2-羟丙基)-4,7,10-三乙酸、反式-环己烷-二胺四乙酸、反式(1,2)-环己烷二亚乙基三胺五乙酸、1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-N,N’,N”-三乙酸及其衍生物。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物化合物为蛋白质或多肽。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述生物化合物选自下组中的一种或两种以上：抗体、球蛋白、白蛋白、酶；所述抗体为单克隆抗体、半抗体、抗原结合片段、可变区片段、单域抗体或纳米抗体。
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