CN111793723A

CN111793723A - 鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重rt-pcr检测引物

Info

Publication number: CN111793723A
Application number: CN202010882032.4A
Authority: CN
Inventors: 陈翠腾; 刘斌琼; 陈珍; 朱春华; 蔡国漳
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2040-08-28
Also published as: CN111793723B

Abstract

本发明涉及一种鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重RT‑PCR检测引物，所述引物如下：针对鸭丙型肝炎病毒的特异性引物序列如SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2所示，目的片段大小为502bp；针对鸭新型微核糖核酸病毒的特异性引物如SEQ.ID.No.3、SEQ.ID.No.4所示，目的片段大小为255bp。本发明利用所述引物能够建立对DuHCV和DuMV进行鉴别诊断的双重RT‑PCR检测方法，该方法能够同时对鸭群中DuHCV和DuMV感染进行检测，简化操作程序，避免了常规PCR的重复检测，具有低成本、高效率等优点。

Description

鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重RT-PCR检测引物

技术领域

本发明属于动物病毒学领域，具体涉及一种鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重RT-PCR检测引物。

背景技术

我国水禽养殖量居世界首位，是养禽业的重要组成部分，然而近年来在我国水禽当中陆续出现多种新发传染病，并不断流行，这些新发传染病的发生已给我国水禽业造成了巨大的经济损失，并已成为严重制约我国水禽产业健康稳定发展的关键因素。

根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy ofViruses) 的最新分类，黄病毒科(Flaviviridae Family)下设4个病毒属：黄病毒属(Flavivirus)，有53个病毒种，有些是人畜共患病原体，如流行性乙型脑炎病毒、登革热病毒；丙型肝病毒属(hepacivirus)，有14个病毒种；Pegivirus病毒属，有11个种；瘟病毒属(Pestivirus)，有11个种，常见的如猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是属于黄病毒科、丙型肝炎病毒属的单股正链RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直径约40-60nm，核衣壳呈二十四面体对称，核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。鸭丙型肝炎病毒(duck hepacivirus，DuHCV)是从患有产蛋异常现象的鸭群中新发现的一种丙型肝炎病毒，其基因组具有一般丙型肝炎的特征，为单股正链RNA，基因组长为11422bp，编码一个长度为10824bp的开放阅读框(open reading frame， ORF)，编码的多聚蛋白长为3607个氨基酸。

微核糖核酸科(Picornaviridae Family)病毒是重要的人畜共患病原体,它会导致人和动物出现亚临床感染或从轻度发热到心脏、肝脏和中枢神经***的严重疾病。微核糖核酸科病毒是一类二十面体对称、呈球形，直径约20-30nm、无囊膜的单股正链RNA病毒。微核糖核酸科病毒包含63个病毒属，常见的有***病毒属(Aphthovirus)、肠病毒属(Enterovirus)、心病毒属(Cardiovirus)、肝病毒属(Hepatovirus)等。微核糖核酸科病毒基因长度一般为6.6kb-9.8kb，基因组一般仅含有一个大的开放阅读框(open readingframe，ORF)，3’端为Poly A尾，5’端有VPg蛋白与之共价结合，基因组RNA有感染性。近年来，随着病毒宏基因组学研究的不断深入，归属于微核糖核酸科Megrivirus属的病原先后从火鸡、鸡、鸽子和鸭中发现。基因组学分析发现，鸭新型微核糖核酸病毒(duck megrivirus,DuMV)的基因组结构特征和火鸡源Megrivirus、鸡源Megrivirus相似，且其聚蛋白含有典型微核糖核酸科病毒的特征性基序。遗传进化分析表明，鸭新型微核糖核酸病毒(DuMV)与Megrivirus属的火鸡、鸡、鸽子源新型微核糖核酸病毒处于同一遗传进化分支。

但是，当前尚未见可同时对两种新发鸭群病毒——鸭丙型肝炎病毒 (DuHCV)和鸭新型微核糖核酸病毒(DuMV)进行双重RT-PCR检测方法的引物的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。本发明建立的双重RT-PCR检测方法能够对鸭群中流行的DuHCV和DuMV的进行鉴别诊断，为鸭群中开展新发DuHCV和DuMV流行病学调查及后续科学防控相关疾病奠定基础，具有十分重要的研究意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重 RT-PCR检测引物及试剂盒，建立能够对鸭群中流行的DuHCV和DuMV进行鉴别诊断的双重RT-PCR检测方法，为鸭群中开展新发DuHCV和DuMV流行病学调查及后续科学防控相关疾病奠定基础，具有十分重要的研究意义。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重RT-PCR检测引物，所述引物如下：

针对鸭丙型肝炎病毒的特异性引物：

DuHCV-F：5’-GTTACTACCTATCTACGCAATT-3’；

DuHCV-R：5’-AGATGGCACTGGGATCGATGTA-3’；

目的片段大小为502bp；

针对鸭新型微核糖核酸病毒的特异性引物：

DuMV-F：5’-TGTCAGCGCTATGATGGAGA-3’；

DuMV-R：5’-AATCCTTCCACCATCATCCAGT-3’；

目的片段大小为255bp。

利用所述的引物检测鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒的双重 RT-PCR检测方法，其PCR反应体系为：在50μL体系中含有以下成分：

组分名称	体积(μL)
		2×Multiple PCR Buffer PCR扩增反应液	25
DuHCV-F(10μmol/L)	0.4
		DuHCV-R(10μmol/L)	0.4
DuMV-F(10μmol/L)	0.6
		DuMV-R(10μmol/L)	0.6
PCR扩增酶	0.25
		cDNA模板	1.0
灭菌去离子水	21.75

；

PCR反应条件为：94℃预变性120s后进入循环，94℃变性30s、57℃退火45s、72℃延伸45s，35个循环结束后，72℃终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。

若检测样品中仅含有DuHCV，则扩增目的片段仅有一条，大小为502bp；若检测样品中仅含有DuMV，则扩增目的片段仅有一条，大小为255bp；若检测样品中含有DuHCV和DuMV，则扩增目的片段大小有两条，分别为502bp和255bp；若检测样品中不存在DuHCV和DuMV，则未见扩增条带。

本发明还提供一种所述的引物在制备用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒检测试剂盒中的应用。

本发明还提供一种用于检测鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.同时检测：本发明利用所述引物能够建立对DuHCV和DuMV进行鉴别诊断的双重RT-PCR检测方法，该方法能够同时对鸭群中DuHCV和DuMV感染进行检测，简化操作程序，避免了常规PCR的重复检测，具有低成本、高效率等优点，而且在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便。若检测样品中仅含有DuHCV，则扩增目的片段仅有一条，大小为502bp；若检测样品中仅含有DuMV，则扩增目的片段仅有一条，大小为 255bp；若检测样品中含有DuHCV和DuMV，则扩增目的片段大小有两条，分别为502bp和255bp；若检测样品中不存在DuHCV和DuMV，则未见扩增条带。

2.灵敏度高：本发明建立的双重RT-PCR检测方法，DuHCV的最低检测限为 3.79×10¹pg(即37.9pg)，DuMV的最低检测限为7.12×10¹pg(即71.2pg)。

3.特异性强：本发明利用所述引物建立的双重RT-PCR检测方法，对鸭群中常见的传染病如DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV均无反应信号，仅对DuHCV和DuMV检测出现特异性扩增条带。

附图说明

图1是双重RT-PCR方法特异性试验结果电泳图；其中，M：DNA分子量 DL2000；1：DuHCV；2：DuMV；3：DuHCV和DuMV共感染；4：DHAV-1；5： DHAV-3；6：AIV；7：APMV-1；8：MDRV；9：N-DRV。

图2是针对DuHCV的特异性试验结果电泳图；其中，M：DNA分子量DL2000； 1：DuHCV；2：DuMV；3：DHAV-1；4：DHAV-3；5：AIV；6：APMV-1；7： MDRV；8：N-DRV。

图3是针对DuMV的特异性试验结果电泳图；其中，M：DNA分子量 DL2000；1：DuMV；2：DuHCV；3：DHAV-1；4：DHAV-3；5：AIV；6：APMV-1； 7：MDRV；8：N-DRV。

图4是双重PCR鸭丙型肝炎病毒敏感性试验结果电泳图；其中，M：DNA分子量DL2000；1：3.79×10⁵pg；2：3.79×10⁴pg；3：3.79×10³pg；4：3.79×10²pg； 5：3.79×10¹pg；6：3.79×10⁰pg；7：试验阴性对照。

图5是双重PCR鸭新型微核糖核酸病毒敏感性试验结果电泳图；其中，M： DNA分子量DL2000；1：7.12×10⁵pg；2：7.12×10⁴pg；3：7.12×10³pg；4：7.12×10²pg； 5：7.12×10¹pg；6：7.12×10⁰pg；7：试验阴性对照。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.材料与方法

1.1毒株和菌株

试验用病原鸭丙型肝炎病毒(DuHCV，H36a8株)、鸭新型微核糖核酸病毒 (DuMV，M19g24株)、鸭1型肝炎病毒(DHAV-1)、鸭3型肝炎病毒(DHAV-3)、鸭源禽流感病毒(AIV)、鸭源禽1型副粘病毒(APMV-1)、番鸭呼肠孤病毒 (MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(N-DRV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

1.2引物的设计

根据美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation，NCBI)数据库GenBank上DuHCV和DuMV编码的基因组特点，应用引物设计软件Oligo(v7.0)分别针对DuHCV和DuMV的特异性引物，引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

针对DuHCV的特异性引物：

DuHCV-F：5’-GTTACTACCTATCTACGCAATT-3’；

DuHCV-R：5’-AGATGGCACTGGGATCGATGTA-3’；

目的片段大小为502bp。

针对DuMV的特异性引物：

DuMV-F：5’-TGTCAGCGCTATGATGGAGA-3’；

DuMV-R：5’-AATCCTTCCACCATCATCCAGT-3’；

目的片段大小为255bp。

1.3核酸的提取及cDNA的制备

按照病毒核酸提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)提取DuHCV、 DuMV、DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV的核酸RNA。利用反转录试剂盒(

One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)将提取的RNA反转录为cDNA备用。

1.4双重RT-PCR方法建立

根据多重PCR试剂盒(Multiplex PCR Assay Kit Ver.2)推荐的50μL体系进行扩增，其中2×Multiple PCR Buffer PCR扩增反应液25μL、针对DuHCV的引物 (DuHCV-F和DuHCV-R)(引物浓度均为10μmol/L)各0.4μL、针对DuMV的引物(DuMV-F和DuMV-R)(引物浓度均为10μmol/L)各0.6μL、PCR扩增酶0.25μL，制备的cDNA模板各1.0μL、补充灭菌去离子水至终体积50μL，混匀后进行PCR 扩增。经优化的扩增条件为：94℃预变性120s后进入循环，94℃变性30s、57℃退火45s、72℃延伸45s，35个循环结束后，72℃终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。

结果见图1：DuHCV目的片段大小为502bp(第1泳道)；DuMV目的片段大小为255bp(第2泳道)；而DuHCV和DuMV双阳性的扩增目的片段大小有两条，分别为502bp和255bp(第3泳道)。

1.5特异性试验

1.5.1针对鸭丙型肝炎病毒的特异性试验

利用针对鸭丙型肝炎病毒的特异性引物(DuHCV-F和DuHCV-R)对DuHCV、 DuMV、DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV提取RNA后反转录的cDNA模板进行PCR扩增；根据PCR试剂盒(2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye))推荐的50μL体系进行扩增，其中2×EasyTaq PCR SuperMix Buffer PCR 扩增反应液25μL、10μM针对鸭丙型肝炎病毒的特异性引物(DuHCV-F和 DuHCV-R)各1μL、cDNA模板1.0μL、补充灭菌去离子水至终体积50μL，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、 57℃退火30s、72℃延伸40s，35个循环结束后，72℃终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果见图2：DuHCV的目的片段大小为502bp； DuMV、DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV均未见特异性扩增条带。

1.5.2针对鸭新型微核糖核酸病毒的特异性试验

利用针对鸭新型微核糖核酸病毒的特异性引物(DuMV-F和DuMV-R)对 DuHCV、DuMV、DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV提取RNA 后反转录的cDNA模板进行PCR扩增；根据PCR试剂盒(2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye))推荐的50μL体系进行扩增，其中2×EasyTaq PCR SuperMix Buffer PCR 扩增反应液25μL、10μM针对鸭新型微核糖核酸病毒的特异性引物(DuMV-F和 DuMV-R)各1μL、cDNA模板1.0μL、补充灭菌去离子水至终体积50μL，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸40s，35个循环结束后，72℃终延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果见图3：DuMV的目的片段大小为255bp； DuHCV、DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV均未见特异性扩增条带。

1.5.3双重RT-PCR方法的特异性

根据1.4优化后的多重PCR条件，对DuHCV、DuMV、DHAV-1、DHAV-3、 AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV提取RNA后反转录的cDNA模板进行PCR扩增，结果见图1，DuHCV目的片段大小为502bp(第1泳道)；DuMV目的片段大小为 255bp(第2泳道)；DuHCV和DuMV双阳性的扩增目的片段大小有两条，分别为502bp和255bp(第3泳道)，而DHAV-1(第4泳道)、DHAV-3(第5泳道)、AIV (第6泳道)、APMV-1(第7泳道)、MDRV(第8泳道)和N-DRV(第9泳道)均未见条带扩增，表明本发明建立的方法特异性强。

1.6双重RT-PCR方法的敏感性

根据1.4优化后的多重PCR条件，对DuHCV和DuMV提取的RNA经连续10倍稀释后(DuHCV浓度分别为3.79×10⁵pg-3.79×10⁰pg、DuMV浓度分别为 7.12×10⁵pg-7.12×10⁰pg)进行反转录后进行扩增。

结果可见图4、图5：DuHCV的最低检测限为3.79×10¹pg(即37.9pg)(图4 第5泳道)；DuMV的最低检测限为7.12×10¹pg(即71.2pg)(图5第5泳道)。

1.7临床应用

根据对145份临床送检鸭源病料按照常规方法处理后，利用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的核酸RNA后反转录为cDNA，利用建立的双重RT-PCR方法进行DuHCV和DuMV感染的检测。结果可见，检测到21份DuHCV感染阳性，阳性率为14.45％；检测到9份DuMV感染阳性，阳性率为6.21％；检测到2份DuHCV和DuMV共感染阳性，阳性率为1.38％。

将双重RT-PCR反应结束后的阳性目的片段利用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将扩增基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用双重RT-PCR扩增时的引物和条件对提取的质粒进行PCR 鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的DuHCV和DuMV基因片段，相关基因序列的核苷酸同源性分别为98.3％(DuHCV)和98.8％(DuMV) 以上，表明建立的方法符合实验预期。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重RT-PCR检测引物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gttactacct atctacgcaa tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

agatggcact gggatcgatg ta 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tgtcagcgct atgatggaga 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

aatccttcca ccatcatcca gt 22

Claims

1.一种鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重RT-PCR检测引物，其特征在于：所述引物如下：

针对鸭丙型肝炎病毒的特异性引物：

DuHCV-F：5’-GTTACTACCTATCTACGCAATT-3’；

DuHCV-R：5’-AGATGGCACTGGGATCGATGTA-3’；

目的片段大小为502bp；

针对鸭新型微核糖核酸病毒的特异性引物：

DuMV-F：5’-TGTCAGCGCTATGATGGAGA-3’；

DuMV-R：5’-AATCCTTCCACCATCATCCAGT-3’；

目的片段大小为255bp。

2.利用权利要求1所述的引物检测鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒的双重RT-PCR检测方法，其特征在于：PCR反应体系为：在50μL体系中含有以下成分：

组分名称体积(μL) 2×Multiple PCR Buffer PCR扩增反应液 25 DuHCV-F(10μmol/L) 0.4 DuHCV-R(10μmol/L) 0.4 DuMV-F(10μmol/L) 0.6 DuMV-R(10μmol/L) 0.6 PCR扩增酶 0.25 cDNA模板 1.0 灭菌去离子水 21.75

；

PCR反应条件为：94℃预变性120s后进入循环，94℃变性30s、57℃退火45s、72℃延伸45s，35个循环结束后，72℃终延伸10min。

3.一种如权利要求1所述的引物在制备用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒检测试剂盒中的应用。

4.一种用于检测鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。