CN111778177A - 一种牛支原体Mbov_0274基因突变株及其应用 - Google Patents

一种牛支原体Mbov_0274基因突变株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛支原体Mbov_0274基因突变株,属于动物传染病防治技术领域,所述突变株命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T9.202,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2020084,所述Mbov_0274基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。本发明通过qRT‑PCR检测T9.202株刺激BoMac细胞表达IL‑8的能力,结果显示牛支原体菌株T9.202诱导BoMac细胞表达细胞因子的能力下降,可望在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

Description

一种牛支原体Mbov_0274基因突变株及其应用
技术领域
本发明属于动物传染病防治技术领域,具体涉及到一株牛支原体Mbov_0274基因突变株,该突变株诱导巨噬细胞表达IL-8细胞因子的能力降低,在制备牛支原体疫苗方面具有应用潜力。
背景技术
牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes),支原体目(Mycoplasmatles),支原体科,支原体属,是一种危害养牛业发展的重要病原,在世界范围内广泛存在,可以感染任何年龄段的牛,其发病多与运输应激相关,多数情况下表现为慢性肺炎和关节炎等。泌乳奶牛主要表现为牛支原体乳腺炎,犊牛经乳汁感染患牛支原体肺炎和关节炎。随着临床上抗生素耐药性增加,牛支原体病的防治已经是规模化养牛场面临的迫切难题,而这一问题的解决依赖于新药和新疫苗的开发。但是牛支原体致病机制不清楚严重阻碍新药和新疫苗的开发,进而阻碍牛支原体病的有效防控和治疗。
利用转座子构建突变体库已经在多种支原体中得到应用,主要为Tn916和Tn4001及其衍生而来的转座子。在鸡毒支原体中,Tn916和mini-Tn4001转座子被成功用于构建分别含有424和738个菌株的突变体库,并用于生物被膜形成相关基因的筛选(Wang et al2017,Whetzel et al 2003)。含有mini-Tn4001转座子的pMT85载体被用于构建微小脲原体突变体库(Aboklaish et al 2014)。在无乳支原体中,利用mini-Tn4001转座子诱变***构建的突变体库被用于筛选细胞共培养生长相关基因及在宿主体内定植和扩散相关基因(Baranowski et al 2014,Baranowski et al 2010)。
本发明运用随机转座子突变技术构建了牛支原体Mbov_0274基因的突变株,并通过与牛巨噬细胞互作研究来鉴定诱导炎性细胞因子能力降低,从而提示该突变株可望作为疫苗开发,运用于牛支原体免疫防治领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一株突变Mbov_0274基因的牛支原体菌株,该菌株诱导巨噬细胞表达IL-8细胞因子的能力降低,因此可望作为疫苗株在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。
其技术思路是:申请人以牛支原体HB0801(GenBank上的登录号为CP002058)为亲本菌株,利用PEG介导的转化方法,将含有转座子的pMT85质粒转化到牛支原体中,利用庆大霉素做抗性筛选标记,成功构建了牛支原体突变体库。通过对突变菌株进行大量筛选,最终从突变体库中成功鉴定出一株Mbov_0274基因突变株,转座子***位点位于牛支原体HB0801基因组315328位点后,位于Mbov_0274基因的1664位点后。Western blot验证了该突变株的MbovP0274蛋白表达缺陷。申请人将该突变株命名为牛支原体T9.202,Mycoplasmabovis T9.202,于2020年4月27日保藏于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M2020084。最后,使用qRT-PCR技术检测了突变株感染牛巨噬细胞后细胞因子的表达量,结果显示T9.202菌株相比野生毒力株HB0801和致弱株HB0801-150.2诱导巨噬细胞表达IL-8的能力显著降低,提示是一种毒力致弱株,有作为疫苗株开发应用的潜力。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。
附图说明
图1:Mbov_0274基因序列中转座子***突变位点。图中:方框所示序列为转座子与HB0801基因组连接处测序序列,所示方向为转座子相对基因组的***方向。
图2:T9.202突变株刺激BoMac表达IL-8的检测结果。图中:****p<0.001;***p<0.005;**p<0.01;DS p>0.05。
具体实施方式
实施例1:牛支原体***突变体库的构建
申请人于2008年6月从病牛的病变肺组织中分离得到一株牛支原体HB0801,命名为牛支原体HB0801,Mycoplasma bovis HB0801,该毒株已在CN 102220263A的专利文献中公开。
pMT85质粒由法国法国农业科学院Eric Baranowski博士惠赠,它含有mini型Tn4001转座子(mini-Tn4001),该转座子中已导入了由aacA-aphD基因编码的庆大霉素抗性标记,它位于转座片段两端的两个反向重复序列(IR)之间,而转座酶基因(tnpA)位于重复序列外侧,可以防止再次发生转座(Baranowski et al 2010)。
以M.bovis HB0801为亲本菌株构建突变体库,具体操作是:收集培养至对数后期的M.bovis,用冷DPBS缓冲液洗涤两次,重悬于0.1M CaCl2溶液中,冰上孵育30min;将制成的牛支原体感受态细胞与3μg pMT85质粒,10μg酵母tRNA和1mL 50%PEG8000混合。孵育1min后,将混合物稀释至5mL PPLO培养基中,并于37℃孵育3h。然后,洗涤牛支原体,将其重悬于1mL PPLO培养基中,并涂布到含庆大霉素的PPLO固体培养基上。在37℃下温育3~7d,挑选单个菌落于1mL含庆大霉素的PPLO肉汤中培养至对数期,-80℃保存菌株,建立牛支原体HB0801突变体库。
实施例2.牛支原体突变体库突变株基因组测序与鉴定
利用细菌基因组提取试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司),提取牛支原体突变体库中的牛支原体总DNA,对Tn4001转座子与牛支原体基因组连接处进行测序,将测序结果与牛支原体HB0801全基因组序列进行比对,结果显示,突变株T9.202所涉及的基因Mbov_0274中涵盖转座子***序列,大小为3438bp,位于基因组315328位点后,以及Mbov_0274基因1664位点后(图1)。
实施例3:T9.202突变体刺激BoMac细胞表达细胞因子能力验证
牛支原体培养和计数:取牛支原体强毒力株HB0801、牛支原体弱毒力株MbovHB0801-150.2、T9.202以1:1000的比例接种PPLO液体培养基,静置于37℃,5%CO2培养箱中培养36h即到达对数期后,进行CFU计数,方法如下:将培养好的菌液进行10倍递增稀释,取10μL适当稀释度的菌液涂布于PPLO固体培养基,37℃,倒置培养,5%CO2培养箱中培养3~7d后,在体视显微镜下进行菌落计数,菌落数计算公式为:CFU/mL=菌落数×稀释度×100。
将BoMac按照每孔2×106个细胞密度接种到6孔细胞板中,37℃,5%CO2培养至贴壁,按照感染比为1:1000加入牛支原体HB0801或牛支原体MbovHB0801-150.2或T9.202,同时设置细胞完全培养基为阴性对照组。每组各3孔重复。37℃,5%CO2分别孵育6h、12h、24h后收集细胞。
提取RNA
(1)加入0.2mL氯仿,剧烈震荡15s,室温孵育2-3min,12000g 4℃离心15min;
(2)转移水层到新的RNase-free EP管中,加入0.5mL异丙醇,轻轻混匀,室温孵育10min,12000g 4℃离心10min,弃上清,管底部可见到胶状的RNA沉淀;
(3)加入1mL 75%乙醇,轻轻混匀,7500g 4℃离心10min,弃上清;
(4)空气干燥RNA 5-10min,但勿使RNA完全干燥。再用50μL DEPC水溶解,混匀,60℃水浴10min;
(5)紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度,-80℃保存,备用。
反转录
按照
Figure BDA0002520738850000041
II qRT SuperMix反转录试剂盒(购自南京诺维赞生物科技有限公司)说明书进行操作。首先,去除基因组DNA,反应体系如下:4×gDNA wiper Mix(购自南京诺维赞生物科技有限公司)2μL,模板RNA500ng,RNase free去离子水(购自碧云天生物科技有限公司)To final 8μL,将各个试剂加到RNase free PCR管中,轻轻混匀,42℃作用2min。然后,进行逆转录:上述反应液8μL,
Figure BDA0002520738850000042
II qRT SuperMixII(购自南京诺维赞生物科技有限公司)2μL,混匀后按5℃10min,42℃30min,85℃5min的程序反应,将产物收于-20℃冰箱保存。
实时荧光定量PCR检测细胞因子的表达
用SYBR qPCR Mix(购自南京诺维赞生物科技有限公司)进行相对实时定量PCR反应,以β-actin为内参基因,检测各个基因mRNA的相对表达情况。每个样品均设置内参基因与目的基因进行扩增,每个反应均设置3个重复。反应体系见表1,而反应程序为:50℃2min,预变性95℃10min;变性95℃15s,复性60℃30s,延伸72℃30s,循环40。β-actin检测引物为:上游引物(5’-3’)AGCAAGCAGGAGTACGATGAG,下游引物(5’-3’)ATCCAACCGACTGCTGTCA;IL-8检测引物为:上游引物(5’-3’)GAAGAGAGCTGAGAAGCAAGATCC,下游引物(5’-3’)ACCCACACAGAACATGAGGC。
表1荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002520738850000043
实验结果显示,T9.202(Mut274组)相比于野生株HB0801(P1组)从感染后6h开始,其刺激BoMac细胞表达IL-8的能力就开始降低;而相比于传代致弱株MbovHB0801-150.2(P150组),其在感染后12h和24h刺激BoMac表达IL-8的能力降低(图2)。
说明书中名词术语说明:
牛支原体MbovP274蛋白的编码基因 以Mbov_0274表示;
牛支原体本地分离株 以牛支原体HB0801表示;
牛支原体传代致弱株 以牛支原体MbovHB0801-150.2表示。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种牛支原体Mbov_0274基因突变株及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1770
<212> DNA
<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)
<400> 1
atgaataaga aaaaattatt gtttggaatt attccattag cagtagctgc tccaatgatt 60
gcagcatcat gtcaaaaaaa tgacaaaaaa gtggtgtttc aatttgctca gtcaaattct 120
tggcctttgc ctaagatgct tgtaccttta gttaagtact acaatacaac atttagcaaa 180
cacaaagact tcttacctat agaactacaa tttagtgaca aaacaaaaac cactagagag 240
tttgaattaa ttaaaaaggt aaaaaatgac attgaaacaa acaatgaagc agcattgcca 300
aaccttattc taggagcaca atctggtgct tatgtactta atcaacacaa aagattaatg 360
gatctttctg actatggaat aactaagtca atatttaata aaaatattgc cgacttacac 420
tcaaaactac caggtcaaaa aggtaatgac aaaatttata gcattccatt tgataattta 480
gacgtagatg ctgttgttta taatcttgaa gttttagatt atatgtttaa aatgattaaa 540
aagaacggcg gaaatgttga cgagaaggca acaattgttc aaaaagctac cgaagcaggc 600
agagagggtg ttggttcaaa attaccggaa aatactattt gaaaagcatt agaggcgaaa 660
agcaatgaag tctttaaggg acttactgta aacgatgaaa catttaagtc tgttgaaagt 720
atcaaggaat ttgctaaaaa attctatgaa ggcactaagc taaatgaatc aaaagttaat 780
gatgagacat taactggaga agttatttca gtagattatg ccaatgactt attatttaaa 840
gaacttcact cgcaaattga taaagacaag cttgtatatg atttagaaga gactggcaat 900
cctgaaaagc ctgttaatgt taaatataac atagttcaag atcaagacat aaagagcaag 960
tttaagtcat tgttaagcgg ttataaagaa gcaataaaaa gacatgcata caaagtaggt 1020
gctaacaaca aggttttcca aacgataaat tttggtaaca agggcgaaaa ctctagcata 1080
aatatcgcta gattcaaaag cgctataggt tttgcagcaa gcgttggcgt taattcaaca 1140
atgtacagta gtagactaaa agaaaattat ggcaaaaatg accctgattt tgctaaaaaa 1200
gttgcttcat atgaagatgt ttatatggat ccacaattaa caacaattaa aaaagattcg 1260
caaaaaatat ttactgaagg cggttctagc ttactagtgt taaaatctaa agacagttca 1320
atgaataaag ctgttgcaaa gttcgttaaa tgactatttg aaggaaccaa taatgcctat 1380
aatcaagggg tagaagaaaa ctgaaaaacc tttgctaaat attctggcta cattatgcca 1440
ctagcctcag ttgtaaatga tgagagtcta aaatgatttg aaactgaagc tgataagcta 1500
aaacaaaaaa gagcaaataa atctatcagt gatgaagaat ttagaatttt aaactttcta 1560
agatcggctt atgtttctat taaatcaatt agagattttg aaaaagatag ttcaataatt 1620
gctaaaaaca atgttcagga tgataaaacc ggacaaatat atggttcaat tcaatcagct 1680
gcagtaacat gaactgatca taattctcca tcagaaataa aagaagatga cttaattaaa 1740
tcaattgaga acgaagtaaa tcataaataa 1770
<210> 2
<211> 589
<212> PRT
<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)
<400> 2
Met Asn Lys Lys Lys Leu Leu Phe Gly Ile Ile Pro Leu Ala Val Ala
1 5 10 15
Ala Pro Met Ile Ala Ala Ser Cys Gln Lys Asn Asp Lys Lys Val Val
20 25 30
Phe Gln Phe Ala Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Pro Lys Met Leu Val
35 40 45
Pro Leu Val Lys Tyr Tyr Asn Thr Thr Phe Ser Lys His Lys Asp Phe
50 55 60
Leu Pro Ile Glu Leu Gln Phe Ser Asp Lys Thr Lys Thr Thr Arg Glu
65 70 75 80
Phe Glu Leu Ile Lys Lys Val Lys Asn Asp Ile Glu Thr Asn Asn Glu
85 90 95
Ala Ala Leu Pro Asn Leu Ile Leu Gly Ala Gln Ser Gly Ala Tyr Val
100 105 110
Leu Asn Gln His Lys Arg Leu Met Asp Leu Ser Asp Tyr Gly Ile Thr
115 120 125
Lys Ser Ile Phe Asn Lys Asn Ile Ala Asp Leu His Ser Lys Leu Pro
130 135 140
Gly Gln Lys Gly Asn Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Pro Phe Asp Asn Leu
145 150 155 160
Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Asn Leu Glu Val Leu Asp Tyr Met Phe
165 170 175
Lys Met Ile Lys Lys Asn Gly Gly Asn Val Asp Glu Lys Ala Thr Ile
180 185 190
Val Gln Lys Ala Thr Glu Ala Gly Arg Glu Gly Val Gly Ser Lys Leu
195 200 205
Pro Glu Asn Thr Ile Trp Lys Ala Leu Glu Ala Lys Ser Asn Glu Val
210 215 220
Phe Lys Gly Leu Thr Val Asn Asp Glu Thr Phe Lys Ser Val Glu Ser
225 230 235 240
Ile Lys Glu Phe Ala Lys Lys Phe Tyr Glu Gly Thr Lys Leu Asn Glu
245 250 255
Ser Lys Val Asn Asp Glu Thr Leu Thr Gly Glu Val Ile Ser Val Asp
260 265 270
Tyr Ala Asn Asp Leu Leu Phe Lys Glu Leu His Ser Gln Ile Asp Lys
275 280 285
Asp Lys Leu Val Tyr Asp Leu Glu Glu Thr Gly Asn Pro Glu Lys Pro
290 295 300
Val Asn Val Lys Tyr Asn Ile Val Gln Asp Gln Asp Ile Lys Ser Lys
305 310 315 320
Phe Lys Ser Leu Leu Ser Gly Tyr Lys Glu Ala Ile Lys Arg His Ala
325 330 335
Tyr Lys Val Gly Ala Asn Asn Lys Val Phe Gln Thr Ile Asn Phe Gly
340 345 350
Asn Lys Gly Glu Asn Ser Ser Ile Asn Ile Ala Arg Phe Lys Ser Ala
355 360 365
Ile Gly Phe Ala Ala Ser Val Gly Val Asn Ser Thr Met Tyr Ser Ser
370 375 380
Arg Leu Lys Glu Asn Tyr Gly Lys Asn Asp Pro Asp Phe Ala Lys Lys
385 390 395 400
Val Ala Ser Tyr Glu Asp Val Tyr Met Asp Pro Gln Leu Thr Thr Ile
405 410 415
Lys Lys Asp Ser Gln Lys Ile Phe Thr Glu Gly Gly Ser Ser Leu Leu
420 425 430
Val Leu Lys Ser Lys Asp Ser Ser Met Asn Lys Ala Val Ala Lys Phe
435 440 445
Val Lys Trp Leu Phe Glu Gly Thr Asn Asn Ala Tyr Asn Gln Gly Val
450 455 460
Glu Glu Asn Trp Lys Thr Phe Ala Lys Tyr Ser Gly Tyr Ile Met Pro
465 470 475 480
Leu Ala Ser Val Val Asn Asp Glu Ser Leu Lys Trp Phe Glu Thr Glu
485 490 495
Ala Asp Lys Leu Lys Gln Lys Arg Ala Asn Lys Ser Ile Ser Asp Glu
500 505 510
Glu Phe Arg Ile Leu Asn Phe Leu Arg Ser Ala Tyr Val Ser Ile Lys
515 520 525
Ser Ile Arg Asp Phe Glu Lys Asp Ser Ser Ile Ile Ala Lys Asn Asn
530 535 540
Val Gln Asp Asp Lys Thr Gly Gln Ile Tyr Gly Ser Ile Gln Ser Ala
545 550 555 560
Ala Val Thr Trp Thr Asp His Asn Ser Pro Ser Glu Ile Lys Glu Asp
565 570 575
Asp Leu Ile Lys Ser Ile Glu Asn Glu Val Asn His Lys
580 585

Claims (4)

1.一种牛支原体Mbov_0274基因突变株,命名为牛支原体(Mycoplasma bovis)T9.202,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2020084,所述Mbov_0274基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的牛支原体Mbov_0274基因突变株,其特征在于:所述突变株牛支原体基因组315328位点后、即Mbov_0274基因1664位点后被***了mini-Tn4001转座子。
3.权利要求1或2所述的牛支原体Mbov_0274基因突变株在制备牛支原体疫苗中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于:所述牛支原体Mbov_0274基因突变株诱导宿主巨噬细胞表达IL-8细胞因子的能力降低。
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