CN111777669B - 一种抗肿瘤活性肽、合成方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种抗肿瘤活性肽、合成方法及应用，所述活性肽的结构为：环‑(Leu‑Pro‑Pro‑(D‑Phe)‑Ile‑Pro‑(D‑Phe)‑Val)。合成方法包括以下步骤：1)采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有直链肽；2)向树脂中加入切割液反应，收集反应后溶液，向所述溶液中滴加DIEA调节pH值呈中性，得到直链肽的粗品溶液；3)将直链肽粗品溶液滴加入环肽反应体系中，合成环肽。本发明通过两个D‑苯丙氨酸来替换原Samoamide A环肽中的两个苯丙氨酸，并通过合适的固相合成方法得到基于的Samoamide A的衍生物Samoamide C，制备的Samoamide C针对DPP‑4酶活抑制率以及对肿瘤细胞毒性均得到显著的提高，体现出更优异的抗肿瘤活性。

Description

一种抗肿瘤活性肽、合成方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种抗肿瘤活性肽、合成方法及应用。

背景技术

多肽类药物因其具有分子量小，特异性高，低副作用等，被认为是良好的治疗恶性肿瘤的药物而受到广泛关注。Samoamide A[-(Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-Val)-]是从海洋藻类中天然提取的一条环肽，并且对肿瘤细胞具有良好的毒性效果。但是天然提取的Samoamide A提取产率较低且活性较差，无法规模化生产及应用，因此需要发明一种固相合成的方法使提高产率，同时能够提高其活性，使其得到更广泛的应用。

经检索，针对Samoamide A的合成方法，现有技术已有相关的申请案公开，如中国专利申请号为201810931188.X，公开日期为2019年1月8日的申请案公开了一种藻青菌环八肽Samoamide A的制备方法，包括以下步骤：(1)在耦合试剂下，Fmoc-Val-OH与树脂固相载体偶联，得FmocVal-树脂；(2)利用脱保护剂脱除Fmoc基团；(3)在缩合剂和活化试剂作用下，将具有N端Fmoc保护的氨基酸偶联到树脂上；其中，所述具有N端Fmoc保护的氨基酸依次为Fmoc-Phe-OH、FmocPro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-ProOH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH；(4)重复(2)、(3)步骤，得到全肽树脂；(5)利用切割试剂将肽链从肽树脂上脱下，使之沉淀得直链肽粗品；(6)取直链肽，利用缩合剂环合直链肽(7)分离纯化，得Samoamide A。

在《环八肽Samoamide A及其衍生物的合成与抗肿瘤活性研究》中，张驰等为了提高Samoamide A的产量，采用Fmoc固相合成法，以2-氯三苯甲基氯(CTC)树脂为固相载体,Fmoc保护的苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸为原料，合成直链肽，将直链肽从树脂上切割下来之后,再利用液相法环合直链肽，合成环肽Samoamide A,并对其反应溶剂、缩合剂和切割条件以及pH等条件进行优化，结果证明以60％DCM/DMF为反应溶剂,TBTU为缩合剂，TFA/EDT/PhOH/H20/硫茴香醚体积比为80:2.5:7.5:5:5的溶液为切割试剂，环合体系pH为8.0时，其合成纯度和产率最高，SamoamideA总收率可达54.5％。并通过高效液相色谱-质谱联用仪(HRMS)、核磁共振氢谱(1H NMR)和核磁共振碳谱(13C NMR)对所合成的化合物Samoamide A进行结构确证，其分子量为910.40，与理论分子量相符，核磁共振谱图分析结果表明Samoamide A合成成功。为了提高Samoamide A的抗肿瘤活性其采用丙氨酸扫描法探究Samoamide A的非活性位点，用Fmoc保护的丙氨酸依次替换Samoamide A的8个氨基酸，得到了8条新的Samoamide A衍生物。通过HRMS、1H NMR和13C NMR对所合成的8条新的Samoamide A衍生物进行结构确证，结果证明衍生物分子量与理论分子量相符，核磁共振碳谱、氢谱分析结果也与理论一致。通过细胞毒性检测(MTT)和DPP4酶活抑制实验证明化学方法合成的Samoamide A具有良好的抗肿瘤活性,Samoamide A浓度为50μg/mL时，4T1细胞存活率为20.79％，浓度为100μg/mL时，DPP-4酶活抑制率为85.72％。然后对8条Samoamide A衍生物的抗肿瘤活性进行分析，实验结果表明Samoamide A-6的抗肿瘤效果最好,其4T1细胞存活率最低，仅25.35％，DPP-4酶活抑制率最高，为82.44％，与SamoamideA相比最为接近。

上述文献中的方法虽然采用固相合成发合成Samoamide A，改善了收率，然而抗肿瘤效果最好的Samoamide A-6与SamoamideA相比比较接近，该申请案针对活性的改善效果不佳，亟需发明一种新的针对SamoamideA活性改善的方法，以提高抗肿瘤活性。

发明内容

1.要解决的问题

针对从海洋藻类中天然提取的环肽Samoamide A存在的抗肿瘤活性不佳的缺陷，本发明提供一种利用两个D-苯丙氨酸来替换原Samoamide A环肽中的两个苯丙氨酸，得到基于的Samoamide A的衍生物Samoamide C，在同等施用浓度条件下Samoamide C针对DPP-4酶活抑制率以及针对肿瘤细胞毒性均得到明显的提高，体现出更优异的抗肿瘤活性。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种抗肿瘤活性肽，所述活性肽的结构为：环-(Leu-Pro-Pro-(D-Phe)-Ile-Pro-(D-Phe)-Val)。

优选的方案，所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，包括以下步骤：

1)采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有所述活性肽的直链肽；

2)向步骤(1)反应后的树脂中加入切割液进行反应，收集反应后溶液，向所述溶液中缓慢滴加N,N-二异丙基乙胺调节pH值呈中性，得到直链肽NH₂-Leu-Pro-Pro-(D-Phe)-Ile-Pro-(D-Phe)-Val-OH的粗品溶液；

3)将所述直链肽粗品溶液滴加入环肽合成反应体系中，合成环肽；

4)减压蒸发除去溶剂，得到浓缩的活性肽产物。

优选的方案，所述树脂包括2-氯三苯甲基氯树脂，和/或所述的切割液为含有三氟乙酸的二氯甲烷溶液，所述三氟乙酸的质量分数为1％。

优选的方案，所述环肽合成反应体系为含有二氯甲烷(DCM)、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)，以及N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的混合液。

优选的方案，所述树脂与氨基酸的偶联反应中，包括以下步骤：

a)首先向树脂中投加第一个氨基酸Fmoc-Val-OH，以二氯甲烷作为反应试剂，以N,N-二异丙基乙胺作为缩合试剂反应一段时间进行第一个氨基酸的连接，连接完成后重新加入二氯甲烷，滴加无水甲醇和N,N-二异丙基乙胺鼓吹反应一段时间，对树脂未反应的位点进行封头处理；

b)将步骤a)反应完成的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合溶液，进行氨基酸脱Fmoc基团反应；

c)重复上述步骤，依次投入Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH进行反应，依次完成相应氨基酸的连接。

优选的方案，所述第一个氨基酸的投加质量按照M＝树脂的质量×0.3×氨基酸分子量×1.33计算，后续氨基酸投加质量按照N＝树脂的质量×0.3×氨基酸分子量×3计算。

优选的方案，所述方法还包括步骤5)分离纯化：用乙腈和纯水溶解之后过滤，将过滤溶液采用高效液相色谱进行分离纯化，接取目标峰、冷冻干燥得到产物。

优选的方案，本发明提供了一种药物组合物，包括所述的抗肿瘤活性肽或其可药用盐，和药学可接受的载体或赋形剂。

优选的方案，抗肿瘤活性肽或其可药用盐在制备抗肿瘤药物中的用途。

优选的方案，所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，具体包括以下步骤：

(1)树脂与氨基酸偶联反应

称量2-氯三苯甲基氯树脂2.00g投入到多肽合成砂芯管内。加入DMF用旋片式真空泵通入空气鼓吹洗涤5～10s，再用循环水式多用真空泵抽滤干净液体，加入DCM浸泡树脂鼓吹2～3min使其充分膨胀后抽滤。称取Fmoc-Val-OH 451.4mg投入到砂芯管内，加入DCM作为反应溶剂，滴加1mL DIEA作为缩合试剂，室温下鼓吹反应30min后抽干净液体，加入DMF洗涤4遍并抽滤。重新加入DCM，滴加4mL无水甲醇和4mL DIEA鼓吹反应30min，对树脂未反应的位点进行封头处理。待反应结束后抽滤，加入DMF洗涤4遍。

(2)直链肽合成

在砂芯管内加入哌啶和DMF混合溶液(哌啶：DMF＝1：4，体积比)，鼓吹反应15min后抽滤，进行氨基酸脱Fmoc基团反应。反应结束后先加入DMF洗涤5～10s，再加入甲醇洗涤5～10s，重复2便，最后加入DMF洗涤2遍。

印三酮显色反应检测：用干净的细铁丝从砂芯管内蘸取一点树脂放入检测管内，滴加Kaiser试剂(6％印三酮乙醇溶液：80％苯酚乙醇溶液：吡啶＝2:1:1，体积比)，将检测管放入100℃温浴仪中加热反应2min后观察颜色，该步骤显示树脂呈深蓝色。若检测管内的树脂呈深蓝色，则说明氨基酸脱Fmoc成功，可继续进行过反应。因此，称取Fmoc-D-Phe-OH1162.2mg，HBTU405.0mg投入砂芯管内，加入DMF作为反应溶剂，滴加1mL DIEA作为缩合试剂鼓吹反应30min。反应结束后，加入DMF洗涤4遍。

印三酮显色反应检测，方法同上。观察反应之后的颜色，若检测管内的树脂无颜色变化，则说明缩合反应成功。加入哌啶溶液进行脱Fmoc保护反应，操作同上，得到化合物4。若检测管内能看到呈现蓝色的树脂，说明反应没有完全进行，重新称取反应所需的氨基酸投入砂芯管内反应，直至树脂检测没有颜色变化，反应完全进行后，进行下一步反应。

重复以上的操作步骤，依次投入Fmoc-Pro-OH1012.2mg，Fmoc-Ile-OH 1060.2mg，Fmoc-D-Phe-OH 1162.2mg，Fmoc-Pro-OH 1012.2mg，Fmoc-Pro-OH 1012.2mg，Fmoc-Leu-OH1060.2mg进行反应。最后加入哌啶进行脱保护反应，并洗涤干净。滴加Kaiser试剂检测颜色变化，检测管内树脂呈深蓝色，证明脱保护成功，加入甲醇洗涤两遍，用空气泵抽至树脂呈干燥颗粒状。

(3)酸裂解

称量抽干后的树脂重量，并将其移至到U型砂芯管内。加入树脂重量数值10倍的切割液(DCM：TFA＝99％：1％)，例如1g树脂加入10mL切割液。将U型砂芯管放在摇床上反应10min。反应结束以后，用洗耳球挤压，过滤切割液并用洗干净的小烧杯收集。重新加入切割液反应10min，如此重复操作3次。收集过滤后的切割液于小烧杯内，缓缓滴加DIEA调至pH呈中性，即为直链肽NH₂-Leu-Pro-Pro-(D-Phe)-Ile-Pro-(D-Phe)-Val-OH粗品溶液。

(4)环肽合成

另取干净的圆底烧瓶，加入足量的DCM，810mg HOBT，2mL DIEA作为环肽合成的反应体系。把圆底烧瓶放到磁力搅拌器上固定好，加入陶瓷转子，转速为800rpm。将NH₂-Leu-Pro-Pro-(D-Phe)-Ile-Pro-(D-Phe)-Val-OH粗品溶液倒入滴液漏斗中，控制好滴液的速度，将粗肽溶液一滴一滴滴加到反应体系中，控制滴加时间久一点，一般为4个小时，室温反应过夜。

将反应后的液体倒入茄型瓶内，用旋转蒸发仪减压蒸发除去溶剂，温度为50℃，得到浓缩的淡黄色油状物。用乙腈和纯水溶解之后过滤，用过高效液相色谱进行分离纯化，接取目标峰冷冻干燥得到衍生物Samoamide C。

Samoamide C活性肽的结构为：环-(Leu-Pro-Pro-(D-Phe)-Ile-Pro-(D-Phe)-Val)。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的抗肿瘤活性肽Samoamide C，在DPP-4酶的抑制率实验中，相比同等浓度的Samoamide A(100μg/mL)，酶活抑制率由68.71％提高至84.71％。在4T1和MCF-7的细胞毒性实验中，同等浓度条件下，投加Samoamide A时，4T1和MCF-7的细胞存活率分别为45.90％和48.07％；投加Samoamide C时，4T1和MCF-7的细胞存活率分别为36.04％和33.97％，表明Samoamide C的对肿瘤细胞毒性得到明显的提高，相比改造前的多肽具有更优异的抗肿瘤活性。

(2)本发明的抗肿瘤活性肽Samoamide C的合成方法，与现有技术中Samoamide A环肽合成不同的是，Samoamide A环肽合成过程中选取的环化位点在苯丙氨酸(Phe)和缬氨酸(Val)之间，本发明针对Samoamide C的合成，根据各氨基酸的结构，选取的环化位点在缬氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)之间，可以有效减少环化过程中各氨基酸之间的空间位阻，提高环化效率。

(3)本发明的抗肿瘤活性肽Samoamide C的合成方法，在环化反应中，未采用切割沉降出直链肽粗品，而是采用含有1％的TFA的DCM作为切割液来切割树脂，得到粗品肽的溶液，并调节pH值为中性直接进行环化反应，相比沉降出固体之后再进行环化更有效节约试剂，简化操作步骤。

附图说明

图1为实施例1制备的抗肿瘤活性肽Samoamide C的过程中形成的直链肽质谱图；

图2为实施例1制备的抗肿瘤活性肽Samoamide C的环肽质谱图；

图3为实施例1制备的抗肿瘤活性肽Samoamide C的核磁分析图；

图4为针对抑制剂、Samoamide A和Samoamide C的DPP-4酶活抑制对比图；

图5为针对Samoamide A和Samoamide C的细胞毒性实验对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。

浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本实施例的肿瘤抑制活性肽C的合成具体包括以下步骤：

(1)树脂与氨基酸偶联反应

称量2-氯三苯甲基氯树脂2.00g投入到多肽合成砂芯管内。加入DMF用旋片式真空泵通入空气鼓吹洗涤5～10s，再用循环水式多用真空泵抽滤干净液体，加入DCM浸泡树脂鼓吹2～3min使其充分膨胀后抽滤。称取Fmoc-Val-OH 451.4mg投入到砂芯管内，加入DCM作为反应溶剂，滴加1mL DIEA作为缩合试剂，室温下鼓吹反应30min后抽干净液体，加入DMF洗涤4遍并抽滤。重新加入DCM，滴加4mL无水甲醇和4mL DIEA鼓吹反应30min，对树脂未反应的位点进行封头处理。待反应结束后抽滤，加入DMF洗涤4遍。

(2)直链肽合成

在砂芯管内加入哌啶和DMF混合溶液(哌啶：DMF＝1：4，体积比)，鼓吹反应15min后抽滤，进行氨基酸脱Fmoc基团反应。反应结束后先加入DMF洗涤5～10s，再加入甲醇洗涤5～10s，重复2便，最后加入DMF洗涤2遍。

印三酮显色反应检测：用干净的细铁丝从砂芯管内蘸取一点树脂放入检测管内，滴加Kaiser试剂(6％印三酮乙醇溶液：80％苯酚乙醇溶液：吡啶＝2:1:1，体积比)，将检测管放入100℃温浴仪中加热反应2min后观察颜色，该步骤显示树脂呈深蓝色。若检测管内的树脂呈深蓝色，则说明氨基酸脱Fmoc成功，可继续进行过反应。因此，称取Fmoc-D-Phe-OH1162.2mg，HBTU405.0mg投入砂芯管内，加入DMF作为反应溶剂，滴加1mL DIEA作为缩合试剂鼓吹反应30min。反应结束后，加入DMF洗涤4遍。

印三酮显色反应检测，方法同上。观察反应之后的颜色，若检测管内的树脂无颜色变化，则说明缩合反应成功。加入哌啶溶液进行脱Fmoc保护反应，操作同上，得到化合物4。若检测管内能看到呈现蓝色的树脂，说明反应没有完全进行，重新称取反应所需的氨基酸投入砂芯管内反应，直至树脂检测没有颜色变化，反应完全进行后，进行下一步反应。

重复以上的操作步骤，依次投入Fmoc-Pro-OH1012.2mg，Fmoc-Ile-OH 1060.2mg，Fmoc-D-Phe-OH 1162.2mg，Fmoc-Pro-OH 1012.2mg，Fmoc-Pro-OH 1012.2mg，Fmoc-Leu-OH1060.2mg进行反应。最后加入哌啶进行脱保护反应，并洗涤干净。滴加Kaiser试剂检测颜色变化，检测管内树脂呈深蓝色，证明脱保护成功，加入甲醇洗涤两遍，用空气泵抽至树脂呈干燥颗粒状。

(3)酸裂解

称量抽干后的树脂重量，并将其移至到U型砂芯管内。加入树脂重量数值10倍的切割液(DCM：TFA＝99％：1％)，例如1g树脂加入10mL切割液。将U型砂芯管放在摇床上反应10min。反应结束以后，用洗耳球挤压，过滤切割液并用洗干净的小烧杯收集。重新加入切割液反应10min，如此重复操作3次。收集过滤后的切割液于小烧杯内，缓缓滴加DIEA调至pH呈中性，即为直链肽NH₂-Leu-Pro-Pro-(D-Phe)-Ile-Pro-(D-Phe)-Val-OH粗品溶液。

(4)环肽合成

另取干净的圆底烧瓶，加入足量的DCM，810mg HOBT，2mL DIEA作为环肽合成的反应体系。把圆底烧瓶放到磁力搅拌器上固定好，加入陶瓷转子，转速为800rpm。将NH₂-Leu-Pro-Pro-(D-Phe)-Ile-Pro-(D-Phe)-Val-OH粗品溶液倒入滴液漏斗中，控制好滴液的速度，将粗肽溶液一滴一滴滴加到反应体系中，控制滴加时间久一点，一般为4个小时，室温反应过夜。

将反应后的液体倒入茄型瓶内，用旋转蒸发仪减压蒸发除去溶剂，温度为50℃，得到浓缩的淡黄色油状物。用乙腈和纯水溶解之后过滤，用过高效液相色谱进行分离纯化，接取目标峰冷冻干燥得到衍生物Samoamide C，本实施例1所用试剂信息如表1所示。

表1实施例1所用试剂信息

将上述方法制备出的多肽分别进行质谱、核磁的结构表征，结果如下：

(1)质谱分析

衍生物Samoamide C的直链肽的质谱分析如图1所示，根据结果，衍生物SamoamideC直链肽中的主峰为[M+2H]²⁺＝465.55，次峰为[M+H]⁺＝929.75，与衍生物Samoamide C的直链肽的理论分子量929.128相符合；

衍生物Samoamide C的环肽的质谱分析如图2所示，环肽中的主峰为[M+2H]²⁺＝456.55，次峰为[M+H]⁺＝911.65，与衍生物Samoamide C的环肽的理论分子量911.128相符合。

(2)核磁分析

如图3所示，衍生物Samoamide C的核磁：¹H NMR(400MHz，MeOD)δ7.50(m,J＝7.0Hz,1H),4.40(t,J＝2.75Hz,1H),3.51-3.41(m,6H),2.33-2.08(m,6H),2.02-1.92(m,6H),7.14(m,J＝7.2Hz,1H),7.19(d,J＝7.2Hz,1H),4.34(d,J＝1.5Hz,1H),4.44(s,J＝1.5Hz,1H),3.33-3.18(m,4H),2.48(s,J＝1.5Hz,1H),2.73(s,J＝1.5Hz,1H),1.76(s,J＝1.3Hz,1H),1.49(s,J＝1.5Hz,1H),1.55(s,J＝1.3Hz,2H),1.11(s,J＝0.8Hz,3H),0.96(d,J＝0.8Hz,6H),0.90(d,J＝0.8Hz,6H),0.99(s,J＝0.8Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz，MeOD)δ65.5,67.8,67.8,49.5,49.5,49.5,29.8,29.8,29.5,24.1,24.1,24.1,136.6,136.6,127.7,127.7,127.7,127.7,128.6,128.6,128.6,128.6,125.9,125.9,172.7,171.2,171.2,172.3,172.3,171.9,171.9,171.2,58.9,53.8,58.3,58.3,63.6,37.4,37.4,37.2,31.1,41.5,24.4,24,7,14.6,118.5,18.5,22.5,22.5,10.9。

实施例2

本实施例为针对Samoamide A与Samoamide C的抗肿瘤活性验证实验，包括以下步骤：

(1)DPP-4酶活抑制实验

使用进口DPP-4酶抑制剂西他列汀与其提供的实验方法验证几种衍生物对DPP-4酶活的抑制效果。取不透光的96孔黑色酶标板，并在每个控中滴加1μL的DPP-4酶液和49μL测试缓冲液。然后设置各组实验：

组1-空白组：不添加任何物质；

组2-待测样品组：加入25μL以DMSO为溶剂的多肽溶液，浓度为100μg/mL，分别进行Samoamide A与Samoamide C的多肽溶液的实验组进行测试；

组3-抑制剂对比组：吸取2μL试剂盒所提供的西他列汀抑制剂母液，加入缓冲液将其稀释100倍，吸取25μL稀释后的酶液滴加到酶标板的孔中。

将组1-组3处理后的酶标板放到37℃的培养箱中培养10min后，再在每个孔中滴加2μL DPP-4底物和23μL缓冲液，用移液器吹打使其充分混匀，再次放到37℃的培养箱中培养10min。

取出酶标板在避光条件下放入37℃的全功能酶标仪中，设定机器的激发波长为360nm，吸收波长为460nm。读取样品的OD值，控制读数在15min内完成。其酶活抑制率公式：

空白组的OD测试结果表示为空白组OD值，实验组和对比组的OD测试结果表示为样品组OD值。根据上述公式分别计算Samoamide A、Samoamide C以及抑制剂对比组的酶活抑制率。

(2)细胞毒性实验

选用4T1细胞来验证衍生物的细胞毒性，并通过CKK-8比色法对其进行检测。将复苏后的4T1细胞培养至贴壁状态后，加入质量浓度为0.25％的胰蛋白酶1mL放入培养箱中进行消化2min。然后将其转移到低速离心机内离心5min，控制转速为800rpm。加入完全培养基制成细胞重悬液，并通过血球计数板计算得到4T1细胞重悬液的浓度为8×10⁴/mL。在96孔的酶标板的每个孔中加入100μL细胞悬液，即每个孔大约含有8000个细胞。将酶标板放入含有5％CO₂的恒温培养箱内培养1～2天，当细胞呈现出贴壁状态时设置不同的组别进行试验：

组1-对照组：将对照组不做任何处理，培养1天之后将酶标板取出；

组2-实验组：向实验组中加入25μL的50μg/mL的多肽溶液(以DMSO为溶剂)，该组分别进行Samoamide A与Samoamide C的多肽溶液的实验组进行测试；继续培养1天之后将酶标板取出；

组3-0浓度实验组：向0浓度实验组中添加25μL的溶剂DMSO溶液，继续培养1天之后将酶标板取出；

将组1-组3的处理组通过显微镜观察细胞形态。最后，除去培养液，在每个孔中加入含质量浓度为0.09％CCK-8的培养液100μL，放入培养箱中培养2h。

取出酶标板放入全功能酶标仪内，在吸收波长为450nm处测定各孔的吸光度。并计算细胞存活率，其计算公式如下：

其中OD值去平均值。

其中，实验孔OD值为实验组的OD值测定结果，0浓度实验孔OD值为组3的OD值测定结果，对照孔OD值为对照组的测定结果。

此外，将所用的4T1细胞换成MCF-7细胞按照上述方法进行实验，进一步研究Samoamide A及衍生物Samoamide C对人源肿瘤细胞的毒性作用。

该实施例所用的试剂信息如表2所示。

表2实施例2所用试剂信息

(3)酶活抑制

酶活抑制结果表明：Samoamide A(浓度为100μg/mL)对DPP-4酶的抑制率为68.71％，抑制剂对比组(浓度为100μg/mL)对DPP-4酶的抑制率为76.58％，经过改造后的Samoamide C(浓度为100μg/mL)对DPP-4酶的酶活抑制率为84.71％，由此可知，经过改造后，Samoamide C对DPP-4酶的酶活抑制率得到显著提高。图4为抑制剂、Samoamide A和Samoamide C的DPP-4酶活抑制对比图。

(4)细胞毒性实验

结果表明：在4T1和MCF-7的细胞毒性实验中，同等浓度条件下，加入Samoamide A时，4T1和MCF-7的细胞存活率分别为45.90％和48.07％；加入投加Samoamide C时，4T1和MCF-7的细胞存活率分别为36.04％和33.97％，表明Samoamide C的对肿瘤细胞毒性得到明显的提高。图5为针对Samoamide A和Samoamide C的细胞毒性实验对比图。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤活性肽，其特征在于：所述活性肽的结构为：环-(Leu-Pro-Pro-(D-Phe)-Ile-Pro-(D-Phe)-Val)。

2.权利要求1所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有直链肽；

2)向步骤1)反应后的树脂中加入切割液进行反应，收集反应后溶液，向所述溶液中滴加N,N-二异丙基乙胺调节pH值呈中性，得到直链肽NH₂-Leu-Pro-Pro-(D-Phe)-Ile-Pro-(D-Phe)-Val-OH的溶液；

3)将步骤2)得到的溶液滴加入环肽合成反应体系中，合成环肽；

4)减压蒸发除去溶剂，得到浓缩的活性肽产物。

3.根据权利要求2所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，其特征在于：所述树脂包括2-氯三苯甲基氯树脂。

4.根据权利要求2或3所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，其特征在于：所述的切割液为含有三氟乙酸的二氯甲烷溶液，所述三氟乙酸的质量分数为1％。

5.根据权利要求4所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，其特征在于：所述环肽合成反应体系为含有二氯甲烷、1-羟基苯并三氮唑以及N,N-二异丙基乙胺的混合液。

6.根据权利要求5所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，其特征在于：所述树脂与氨基酸的偶联反应中，包括以下步骤：

a)首先向树脂中投加第一个氨基酸Fmoc-Val-OH，以二氯甲烷作为反应试剂，以N,N-二异丙基乙胺作为缩合试剂反应一段时间进行第一个氨基酸的连接，连接完成后重新加入二氯甲烷，滴加无水甲醇和N,N-二异丙基乙胺鼓吹反应一段时间，对树脂未反应的位点进行封头处理；

b)向步骤a)反应完成的树脂中加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合溶液，进行氨基酸脱Fmoc基团反应；

c)重复上述步骤，依次投入Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH进行反应，依次完成相应氨基酸的连接。

7.根据权利要求6所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，其特征在于：所述第一个氨基酸的投加质量按照M＝树脂的质量×0.3×氨基酸分子量×1.33计算。

8.根据权利要求7所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，其特征在于：所述方法还包括步骤5)分离纯化：用乙腈和纯水溶解之后过滤，将过滤溶液采用高效液相色谱进行分离纯化，接取目标峰、冷冻干燥得到产物。

9.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1中所述的抗肿瘤活性肽或其可药用盐，和药学可接受的载体或赋形剂。

10.权利要求1的抗肿瘤活性肽或其可药用盐在制备抗肿瘤药物中的用途。

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