CN111770930A - 制备肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备肽的方法，该方法包括形成肽键的步骤，其中第一氨基酸或第一肽的羧基被活化，被活化的所述第一氨基酸或第一肽的氨基被具有水溶性增强基团的保护基团保护，且所述第一氨基酸或第一肽的被活化的羧基与第二氨基酸或第二肽的氨基反应，其中所述第一氨基酸或第一肽的羧基在不存在所述第二氨基酸或第二肽的情况下被活化。本发明还涉及包括保护基团的肽，其中该保护基团具有水溶性增强基团，所述水溶性增强基团键合到氨基和被活化或游离的羧基。
Description
技术领域
本发明涉及一种改进的制备肽的方法，并且涉及通过该方法获得的肽。
背景技术
肽是连接的氨基酸的链，代表蛋白质的前体。肽和蛋白质是所有生命***的基本组成部分，参与各种生命过程。它们在医学和生物科学中有许多应用。因此，合成肽和蛋白质的能力对人类生活具有重要意义。
所以，肽的合成生产意义重大。肽通常通过一个氨基酸的羧基(C-末端)与另一个氨基酸的氨基或N-末端偶联来合成。
一般来说，化学合成从链的C-末端氨基酸开始。此外，它还需要额外的化学基团，来保护第一个氨基酸的C-末端。各氨基酸的偶联过程可以通过使用不同的化学偶联试剂来完成，产生被活化的羧基。形成酰胺键后，去除Nα-保护基团；其条件取决于所使用的保护基团。然而，液相化学是耗时且劳动密集型的，因为必须在每一步骤之后，通过纯化步骤(萃取、洗涤或结晶)，手动从反应溶液中分离出产物。尽管该方法有缺点，但液相化学仍然是生产短肽例如二肽、三肽或四肽的可选择的方法，可以使用片段缩合法得到较长的序列。这是因为Boc或CBz保护的氨基酸是比Fmoc-氨基酸便宜的原料，而且液相化学具有几乎无限的合成能力。
Merrifield等人在1963年采用了固相肽合成(SPPS)，旨在克服与肽在溶液中组装相关的中间纯化问题(参见Stewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis(PierceChemical Co.,2d ed.,1984),Chan and White,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:APractical Approach(Oxford University Press,2000))。在固相合成中，C-末端锚定在不溶性聚合物载体(固相)上，同时氨基酸连续偶联以产生具有所需序列的肽段。一旦所需的序列组装完成，肽就从固相载体上裂解下来。
这种合成方案需要保护投入的氨基酸的α-氨基，以避免自聚合。α-氨基官能团的标准保护基团是酸不稳定性叔丁氧羰基(Boc)基团、碱不稳定性芴甲氧羰基(Fmoc)基团和烯丙氧羰基(Alloc)基团，其在中性条件，在作为烯丙基体系清除剂的PhSiH3的存在下，通过Pd催化被去除。
遵循上述三种α-氨基保护方案中任一种的固相肽合成方法，通常需要对组成氨基酸的反应性侧链进行额外的保护，以避免发生不希望的化学转化。因此，这些保护基团需要对偶联循环中使用的试剂具有抗性。此外，增长的肽链和固相载体之间的连接，必须对α-氨基脱保护和链组装的条件稳定。
在基于Fmoc的α-氨基保护情况中，侧链基团应该对，用于去除Fmoc部分的碱性试剂有抗性。通常在肽链组装后，通过弱酸性试剂去除侧链保护基团。通常在所需的肽链组装后，通过无水HF、三氟甲烷磺酸或三氟乙酸(TFA)，切除这些侧链保护基团。
由于α-氨基保护基团Fmoc和Boc(它们不溶于水，经常用于SPPS)具有强疏水性，所以肽组装过程通常在极性非质子有机溶剂，如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)和二氯甲烷(DCM)，或这些有机溶剂的混合物中进行。此外，SPPS中常用的侧链保护基团通常是疏水性的，致使氨基酸不溶于水。
应用Fmoc和Boc保护的SPPS方法已得到广泛应用，但因需要前述昂贵且有毒的有机溶剂而受到影响。例如，DMF伴随着相当大的健康和环境风险；它与人类癌症有关，并且被怀疑会导致出生缺陷。因此，使用这些有毒溶剂需要特殊的技术设备和预防措施，例如在通风柜下进行反应，由高级专业人员来处理。此外，处理使用过的溶剂是困难且昂贵的。因此，使用有机溶剂的SPPS价格昂贵，并且局限于具有有机化学合成专用设备的专业实验室。
作为克服这个问题的尝试，Hojo等人提出使用水溶性保护基团(Chem.Pharm.Bull.2004,52,422-427和Tetrahedron Lett.2004,45,9293.)。他们为此目的开发了几种保护基团，其中包括2-(苯基(甲基)磺酰基)乙氧羰基四硫代硼酸酯(Pms)、乙磺酰基乙氧羰基(Esc)和2-(4-磺苯基磺酰基)乙氧羰基(Sps)。在WO 2013115813 A1中，CEM公司要求保护α,β-不饱和砜在水或水性体系中的脱保护，及其在水基SPPS中的应用。
进一步地，WO 2016/050764 A1描述了水基肽的合成。
上述方法可用于合成肽。然而，改进这些方法是永久性的愿望。
发明内容
因此，本发明的目的一般来说是提供一种用于肽合成的改进的方法。该方法适用于液相和固相肽的合成。
根据本发明的特定目的，上述方法可提供高产率。进一步地，肽的合成可以低成本进行。本发明的另一个目的是一种在肽链中并入低外消旋的氨基酸单元的方法。此外，制备肽的方法可以低废物和高环境可持续性的方式进行。
进一步地，为了获得高的可接受性，本方法可使用已知的设备来实施。而且，这种方法对环境的影响可以很小。优选地，可以仅使用环境可接受的溶剂和化合物，和/或溶剂可易于回收，预期不会对环境造成重大影响。
通过具有权利要求1所有特征的，包括形成肽键的步骤的，制备肽的方法，来解决这些目的，以及未明确说明，但可通过引入，而从本文所述关联中可立即推论或识别到的其它目的。
因此，本发明提供了一种制备肽的方法，该方法包括形成肽键的步骤，其特征在于，第一氨基酸或第一肽的羧基被活化，并且被活化的所述第一氨基酸或第一肽的氨基被保护，优选通过具有水溶性增强基团的保护基团或通过固相被保护；所述第一氨基酸或第一肽的被活化的羧基，与第二氨基酸或第二肽的氨基反应；其中在所述第二氨基酸或第二肽不存在的情况下，活化所述第一氨基酸或第一肽的羧基。
因此，可以难以预测的方式，来改进上述制备肽的现有技术的方法。
可以非常廉价地获得肽。令人惊讶地是，所获得的肽仅含有非常少量的副产物，特别是通过本方法，可以实现并入肽链的氨基酸单元的低外消旋化。
此外，根据本发明的方法能够具体选择性地制备肽。进一步地，根据本发明的方法可以以简单且廉价的方式进行，可以获得高产量的产品，并且总体上看，具有低能耗。
此外，制备肽的方法可以以低废物和高环境可持续性的方式实施。
进一步地，为了获得高的可接受性，本方法可以使用已知的设备来实施。而且，所述方法对环境的影响小。优选地，仅使用环境可接受的溶剂和化合物，和/或溶剂可以易于回收，从而预期不会对环境造成重大影响。
根据本发明第一个实施方式，被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基被具有水溶性增强基团的保护基团保护。除此之外，第一氨基酸或第一肽优选地包括额外的保护基团。优选地，要被保护的官能团优选地选自胺、醇、巯基、羧基、膦酰基和/或硒基。
在优选的实施方式中，水溶性增强官能团选自带电荷的官能团SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和N(CH3)3 +。已证明，使用带电荷的官能团作为水溶性增强官能团，可用于提高在环境友好溶剂中的溶解度，例如水溶性比不带电荷的官能团更有效。
根据本发明的第二个实施方式，被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基通过固相来保护。固相保护优选通过被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基与固相的共价键合来实现。优选地，被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基与固相的共价键是可裂解的。因此，可以通过如下文更详细描述的裂解反应，从固相上释放本方法获得的肽或蛋白质。除此之外，第一氨基酸或第一肽优选地包括其它的保护基团。优选地，要被保护的官能团优选地选自胺、醇、巯基、羧基、膦酰基和/或硒基。
考虑到可持续性、成本和效率，与使用固相保护相比，更优选通过具有水溶性增强基团的保护基团，来保护被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基。另一方面，通过固相来保护被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基，提供了对生产具有大量氨基酸单元的肽的改进。
优选地，使用环境友好型溶剂来实现肽键的形成。肽键的形成包括所述第一氨基酸或第一肽的羧基的活化，所述第一氨基酸或第一肽的活化羧基与第二氨基酸或第二肽的氨基的反应，或这两个步骤。通常，肽的合成在溶剂中实现，其中溶剂对环境或健康至关重要。这些溶剂包括二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。尽管这些溶剂可用于实施本方法，但本发明并不限于此，也可使用环境友好型溶剂，这基于环境标准提供了进一步的成本优势和更少的预防措施。因此，本发明的优点之一是，利用可以受保护形式溶解在环境友好型溶剂中的氨基酸和/或肽。
如本文所使用的，术语“可以受保护形式溶解在环境友好型溶剂中”意指，组合物具有在溶剂***中，进行期望的反应所必需的溶解度。与任何组合物的情况一样，术语“可溶(解)”一词并不意味着以任何或所有量的无限溶解度。
优选地，溶剂的环境友好性，基于其对健康或环境的影响。被欧洲化学品管理局(ECHA)列为高度关注物质(SVHC)或列入高度关注物质候选清单中的物质，不属于环境友好型溶剂。为了避免使用可能对人类健康和环境产生严重且往往是不可逆影响的有害的有机溶剂，应避免使用被ECHA列为SVHC的所有溶剂(2017.11.14声明)。
根据一个优选的实施方式，环境友好型溶剂的DNEL值优选为至少5mg/m3，更优选至少10mg/m3，更优选至少20mg/m3，更优选至少40mg/m3，更优选至少45mg/m3，更优选至少60mg/m3，更优选至少100mg/m3，更优选至少120mg/m3，甚至更优选至少200mg/m3(吸入，全身性，如ECHA声明2017.11.14所提供的)。
在一个具体的实施方式中，所述环境友好型溶剂的致死剂量LD50优选为至少0.1g/kg、优选至少0.5g/kg、更优选至少1.0g/kg、更优选至少1.5g/kg、更优选至少2g/kg、甚至更优选至少2.5g/kg(口服、大鼠)。
优选的溶剂，更优选环境友好型溶剂包括：质子溶剂，例如水、伯醇、仲醇和/或叔醇；非质子溶剂，例如酮、腈、内酯、内酰胺、碳酸胺(carbon acid amide)、碳酸酯(carbonacidester)、醚、尿素衍生物、亚砜、砜、碳酸酯(carbonate ester)。非质子溶剂的优选实例是，例如，二甲基乙酰胺、乙基甲基酮、丙酮、甲基异丙基酮、甲基异丁基酮、甲基正丁基酮、甲基叔丁基酮、甲基异戊基酮、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷、二甘醇、二甲醚，乙酸乙酯、乙酸叔丁酯或其混合物。
质子溶剂是一种具有与氧(如在羟基中)或氮(如在胺基中)键合的氢原子的溶剂。非质子溶剂是不包括与氧(如在羟基中)或氮(如在胺基中)键合的氢原子的溶剂。因此，酮是非质子溶剂，但一些异构体(烯醇异构体)可能包含这样的氢原子。然而，基于所形成的这些异构体的百分比较低，本发明必须忽略这些异构体。
本发明可以使用例如水、伯醇、仲醇和/或叔醇等质子溶剂来实现。基于形成肽键的偶联反应，伯胺和仲胺不可被用作溶剂。优选的醇包括甲醇、乙醇、异丙醇、2-丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇或其混合物。质子溶剂提供了关于成本，和基于环境标准的较少预防措施的优势。对于质子溶剂，水是特别优选的。除了成本优势和高环境接受度外，水提供了安全性方面的改进，特别是通过含有水的溶剂，可以实现低可燃性和燃烧性。进一步地，与其他质子溶剂，如醇，特别是伯醇相比，水提供了更高的产率。
在本发明的一个实施方式中，基于所述溶剂，优选环境友好型溶剂的总重量，所述溶剂，优选环境友好型溶剂优选地包括至少5％重量，更优选至少10％重量，甚至更优选至少25％重量的质子溶剂，优选水。
在本发明的另一实施方式中，基于所述溶剂，优选环境友好型溶剂的总重量，所述溶剂，优选环境友好型溶剂优选地包括至少5％重量，更优选至少10％重量，甚至更优选至少25％重量的质子溶剂，优选水。
令人惊奇的改进可以通过溶剂，优选环境友好型溶剂来实现，其中环境友好型溶剂包括非质子有机溶剂和/或仲醇和/或叔醇，优选非质子有机溶剂和/或叔醇，更优选非质子有机溶剂。非质子有机溶剂和/或仲醇和/或叔醇的使用，在产率上提供了惊人的改进。进一步地，非质子有机溶剂的使用提供了更高的转化率。因此，可以以可观的产率，获得更长的肽链。进一步地，上述和下述的氨基酸或肽的活化更容易，且被活化的氨基酸或肽更稳定。因此，可以使用更少量的活化剂。此外，如果所述方法在上述或下述的离子交换剂中进行，则可实现更大的优势。优选地，离子交换剂用于一方法，在该方法中，通过具有水溶性增强基团的保护基团，保护被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基。非质子有机溶剂和/或仲醇和/或叔醇，与离子交换剂结合使用，可以改进所制备的肽的产率。这些改进可以通过增加非质子有机溶剂的量来增加。这些改进通过使用溶剂，优选环境友好型溶剂来实现，其中环境友好型溶剂包括非质子有机溶剂和/或仲醇和/或叔醇，优选非质子有机溶剂和/或叔醇，更优选非质子有机溶剂，用于活化所述第一氨基酸或第一肽的羧基。进一步地，这些改进通过使用溶剂，优选环境友好型溶剂来实现，其中环境友好型溶剂包括非质子有机溶剂和/或仲醇和/或叔醇，优选非质子有机溶剂和/或叔醇，更优选非质子有机溶剂，用于使第一氨基酸或第一肽的被活化的羧基，与第二氨基酸或第二肽的氨基发生上述或下述的反应。在一个非常优选的实施方式中，所述第一氨基酸或第一肽的羧基的活化，以及第一氨基酸或第一肽的被活化的羧基，与第二氨基酸或第二肽键的氨基的上述或下述的反应，通过使用溶剂，优选环境友好型溶剂来实现，其中环境友好型溶剂包括非质子有机溶剂和/或仲醇和/或叔醇，优选非质子有机溶剂和/或叔醇，更优选非质子有机溶剂。
在本发明的一个实施方式中，基于所述溶剂，优选环境友好型溶剂的总重量，所述溶剂，优选环境友好型溶剂优选地包括至少5％重量，更优选至少10％重量，甚至更优选至少25％重量的非质子有机溶剂和/或仲醇和/或叔醇，优选非质子有机溶剂。
在一个特别合适的变体中，所述溶剂，优选所述环境友好型溶剂包括作为第一溶剂的非质子有机溶剂，和作为第二溶剂的水和/或醇，优选包括非质子有机溶剂和水。
在优选实施方式中，基于所述溶剂，优选环境友好型溶剂的总重量，所述溶剂，优选所述环境友好型溶剂包括5％重量至95％重量，优选10％重量至70％重量的所述第二溶剂。进一步地，基于所述溶剂，优选环境友好型溶剂的总重量，所述溶剂，优选所述环境友好型溶剂包括5％重量至95％重量，更优选10％重量至90％重量，甚至更优选30％重量至70％重量的所述第一溶剂。
令人惊讶地是，使用具有低极性的非质子有机溶剂，如二甲基乙酰胺、乙基甲基酮、丙酮、甲基异丙基酮、甲基异丁基酮、甲基正丁基酮、甲基叔丁基酮、甲基异戊基酮、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷、二甘醇、二甲醚、乙酸乙酯、乙酸叔丁酯或其混合物，和/或质子溶剂，例如水和醇，在所形成的肽的外消旋化方面提供了惊人改进。与此相比，使用极性非质子有机溶剂，如二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)可使形成的肽具有更高的外消旋化。优选地，极性被定义为分子的偶极矩。优选地，优选地在25℃和1023毫巴下，通过使用德拜(Debye)方程测量介电常数和/或测量斯塔克(Starr)效应，优选通过测量介电常数，非质子有机溶剂的偶极至多为12.6 10-30Cm，更优选地至多为12.5 10-30Cm。在一个优选实施方式中，可通过添加和/或使用质子溶剂，更优选水，来避免或降低所形成的肽的外消旋化。如果使用极性非质子有机溶剂，则添加质子溶剂，优选水，来降低所形成的肽的外消旋化。
优选地，在没有强碱条件的溶液中，优选在12以下的pH，更优选在10以下的pH，实现肽键的形成，其中pH根据已知的专业方法，例如pH电极，通过在25℃，向溶液中添加水来测量。被测样品优选包含至少80％重量的水。优选地，使用具有指定pH值的两种、三种或更多种缓冲溶液，来校准pH电极。在没有强碱条件的溶液中进行反应，在所形成的肽的外消旋化方面提供了惊人的改进。
根据本发明，第一氨基酸或第一肽的羧基被活化，并且第一氨基酸或第一肽的被活化的羧基与第二氨基酸或第二肽的氨基反应。
在一个优选实施方式中，第一氨基酸或第一肽的羧基被偶联剂活化。
优选地，所述偶联剂是碳二亚胺的组合，优选二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、2-((乙亚胺基)亚甲基)氨基)-2-甲基丙烷-1-磺酸酯(ESC)和2,2'-(甲烷基二亚基双(叠氮基亚基)二(2-甲基丙烷-1-磺酸盐)(DSC)，以及形成活性酯的化合物，优选1-羟基苯并***(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并***(HOAt)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、乙氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)、羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HOPO)。偶联剂也可以基于鏻-和胺-(亚胺-)型试剂，例如(苯并***-1-基氧)三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)，(苯并***-1-基氧)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)，溴三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBrOP)，乙氰基(羟基亚氨基)乙酸-O2)-三-(1-吡咯烷基)-鏻六氟磷酸盐(PyOxim)，(3-(二乙氧基磷酰氧)-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮)(DEPBT)，(1H-苯并***-1-基氧)-N,N-二甲基甲亚胺六氯锑酸盐(BOMI)，5-(1H-苯并***-1-基氧)-3,4-二氢-1-甲基2H-吡咯鎓六氯锑酸盐(BDMP)，5-(7-氮杂苯并***-1-基氧)-3,4-二氢-1-甲基-2H-吡咯鎓六氯锑酸盐(AOMP)，5-(五氟苯基氧)-3,4-二氢-1-甲基-2H-吡咯鎓六氯锑酸盐(FOMP)，5-(3',4'-二氢-4'-氧-1',2',3'-苯并三嗪-3'-基氧)-3,4-二氢-1-甲基2H吡咯鎓六氯锑酸盐(DOMP)，1-(1H-苯并***-1-基氧)苯基亚甲基吡咯烷鎓六氯锑酸盐(BPMP)，5-(琥珀酰亚胺基氧)-3,4-二氢-1-甲基-2H-吡咯鎓六氯锑酸盐(SOMP)，四甲基氟代甲酰胺六氟磷酸盐(TFFH)，O-(苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)，O-苯并***-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)，1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-***[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化六氟磷酸盐(HATU)，(2-(6-氯-1-H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基胺)六氟磷酸盐(HCTU)，O-(7-氮杂苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TATU)，2-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚氨基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TNTU)，1-((二甲氨基)(二甲亚氨基)甲氧基)-2-羟基吡啶鎓四氟硼酸盐(TPTU)，O-(氰基(乙氧基羰基)亚甲氨基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TOTU)，2-(3,4-二氢-4-氧-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TDBTU)，1-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧亚乙基氨基氧)-二甲氨基-吗啉]脲鎓六氟磷酸盐(COMU)，4-{[1,3-二甲基-2,4,6-三氧四氢嘧啶-5(6H)基亚叉氨基氧基](二甲氨基)-亚甲基}吗啉-4-鎓六氟磷酸盐(COMBU)，N-{[1,3-二甲基-2,4,6-三氧四氢嘧啶-5(6H)-基亚叉氨基氧基](二甲氨基)亚甲基}-N-甲基甲氨六氟磷酸盐(TOMBU)，2-琥珀酰亚胺-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TSTU)。还可以混杂偶联剂，如EEDQ(N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉)和DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐)，以及经取代的三聚氯氰与碱的其他缩合产物。
在一个优选实施方式中，第一氨基酸或第一肽的羧基被偶联剂活化。优选地，使用过量的偶联剂，相对于第一氨基酸或第一肽，优选使用至少两倍摩尔量的偶联剂，更优选使用至少三倍摩尔量的偶联剂。优选在向被活化的第一氨基酸或第一肽中添加第二氨基酸或第二肽之前，从反应混合物中除去过量的偶联剂。在可选的实施方式中，使用等摩尔量或以下的偶联剂，以实现所添加的偶联剂全部与第一氨基酸或第一肽反应。在这种情况中，在反应混合物中没有过量的偶联剂残留。
在本发明的一个实施方式中，可以提供，第一氨基酸或第一肽优选与离子交换剂离子接触。第一氨基酸或第一肽的接触可在上述和下述的本方法的任一步骤中实现。优选地，与离子交换剂离子接触的第一氨基酸或第一肽，包括至少一个具有水溶性增强基团，更优选离子水溶性增强基团的保护基团。
在一个优选实施方式中，优选在第一氨基酸或第一肽与离子交换剂离子键合的同时，第一氨基酸或第一肽的羧基被偶联剂活化。优选地，与离子交换剂离子键合的第一氨基酸或第一肽，包括至少一个具有水溶性增强基团，更优选离子水溶性增强基团的保护基团。在本方法的一个变体中，优选在将第二氨基酸或第二肽添加到离子交换剂中之前，从离子交换剂中除去过量的偶联剂。
在进一步优选的实施方式中，所述肽键的形成在氨基酸或肽与离子交换剂键合时实现。优选地，与离子交换剂离子键合的第一氨基酸或第一肽，包括至少一个具有水溶性增强基团，更优选离子水溶性增强基团的保护基团。与离子交换剂离子键合可包括形成肽键的任何步骤，其中形成肽键包括：氨基酸或肽的羧基的活化，氨基酸或肽的被活化的羧基与另一氨基酸或另一肽的氨基发生反应，或这两个步骤。优选地，在氨基酸或肽未共价键合到离子交换剂时实现所述肽键的形成。
根据本发明的第二个实施方式，被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基通过固相保护。固相(固体载体)优选是不溶性树脂，优选基于交联聚苯乙烯、聚丙烯、多酚、多糖、聚酰胺或聚赖氨酸。优选地，通过连接基团，实现被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基与固体载体的共价键合。连接基团优选提供了，生长的肽与固相的可裂解的连接。裂解优选使用下述裂解组合物来实现。固体载体在制备肽中的用途在合成中是众所周知的，其中第一氨基酸的C-末端经由N-末端锚定，其它氨基酸偶联至锚定在固体载体上的肽的N-末端。可在市场上购买具有反应基团的固体载体，其中反应基团可与被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基形成共价键。固相的反应基团可用于与被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基形成连接，这在本领域中是众所周知的。本领域技术人员将根据反应条件，以及键合所需的稳定性和裂解性，来选择基团。
优选地，与被活化的所述第一氨基酸或第一肽反应的，第二氨基酸或第二肽的羧基未被保护。在一个优选实施方式中，可以避免保护第二氨基酸或第二肽的羧基。这种实施方式提供了惊人的成本优势。保护可通过保护基团，或通过键合至固相来实现。
在一个优选实施方式中，肽的合成经由氨基酸或肽的羧基来建立，与被活化的所述第一氨基酸或第一肽反应的第二氨基酸或第二肽的羧基未被保护，其中的方法包括以下步骤：活化第一氨基酸或第一肽，除去过量的偶联剂，将第二氨基酸或第二肽添加到被活化的第一氨基酸或第一肽中，使第二氨基酸或第二肽与被活化的第一氨基酸或第一肽反应并形成肽键，通过洗涤步骤除去反应残留物。可以重复这些步骤，以获得所需的肽。
在可选的实施方式中，肽的合成经由氨基酸或肽的羧基来建立，与被活化的所述第一氨基酸或第一肽反应的第二氨基酸或第二肽的羧基被保护，其中的方法包括以下步骤：活化第一氨基酸或第一肽，将具有被保护的羧基的第二氨基酸或第二肽添加到被活化的第一氨基酸或第一肽中，使第二氨基酸或第二肽与被活化的第一氨基酸或第一肽反应并形成肽键，任选地封端第一氨基酸或第一肽的未反应羧基，将第二氨基酸或第二肽的羧基去保护。任选地，通过在上述步骤之间实施的洗涤步骤，来除去反应残留物。可以重复这些步骤，以获得所需的肽。
优选地，所述第二氨基酸或第二肽优选是具有至少两个氨基酸单元的肽，更优选是具有至少四个氨基酸单元的肽，甚至更优选是具有至少六个氨基酸单元的肽。这种实施方式了为制备的肽的产量提供了不可预见的改进，并提供了成本改进。
根据一个优选实施方式，被活化的第一氨基酸或第一肽的氨基受到保护基团的保护，其中保护基团具有与离子交换剂离子键合的水溶性增强基团，优选地，水溶性增强基团包括与离子交换剂离子键合的离子基团。
用于实现与离子交换剂离子键合的保护基团的类型并不关键。
优选地，离子交换剂是离子交换树脂，优选是基于交联的聚苯乙烯、聚丙烯、多酚或多糖且具有官能团，或者离子交换剂是矿物离子交换剂，优选基于硅石(silica)。
优选地，上述离子交换树脂的官能团为四烷基铵基(-NR3 +)，伯胺基、仲胺基或叔胺基(-NH2、-NHR、-NR2)，羧基(-COO-)，磺酸基(-SO3 -)，其中R是具有1到10个碳原子的烷基。
在本说明书中，使用描述离子交换剂的常规术语。因此，碱性离子交换剂是具有交换阴离子能力的固体。酸性离子交换剂是具有交换阳离子能力的固体。
在一个具体的实施方式中，使用碱***换树脂，且氨基酸或肽包含阴离子水溶性增强基团，优选使用包含伯胺基、仲胺基和/或叔胺基的弱碱***换树脂。优选地，使用阴离子交换剂。
在本发明的另一实施方式中，使用阳离子离子交换剂。优选使用酸交换树脂，且氨基酸或肽包含阳离子水溶性增强基团。
本发明的氨基酸或肽优选包括，具有水溶性增强基团的保护基团。表述“水溶性增强基团”描述了向保护基团提供改进的水溶性的基团。原则上，可以使用在肽合成中使用的每一常规保护基团，其具有提供改进的水溶性的基团或改性。这些具有水溶性增强基团的保护基团，包括如Hojo等人(Chem.Pharm.Bull.2004,52,422-427和TetrahedronLett.2004,45,9293.)和WO 2013 115813A1中提到的化合物，例如2-(苯基(甲基)磺酰基)乙氧基羰基四硫代硼酸酯(Pms)、乙磺酰基乙氧基羰基(Esc)和2-(4-磺苯基磺酰基)乙氧基羰基(Sps)。
在一个优选实施方式中，具有水溶性增强基团的保护基团，包括主链结构和衍生自反应基团的连接基团。
在一个具体的实施方式中，所述氨基酸或肽的保护，优选通过氨基酸或肽与保护剂反应来实现，其中保护剂包括
I.主链结构，
II.至少一个水溶性增强基团，和
III.至少一个反应基团，
其中，主链结构包含选自由9-甲基芴、叔丁烷和/或单苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷组成的组中的部分，
其中，水溶性增强基团选自由SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、CN、OSO3 -酯、OPO3 2-酯及其组合组成的组，和
其中，水溶性增强基团和反应基团，经由至少一个共价键附接到主链结构上。
所述保护剂可包含一个或多个水溶性增强官能团，在优选实施方式中，所述保护剂包含一个以上的水溶性增强官能团。在进一步优选的实施方式中，所述保护剂包含至少两个水溶性增强官能团。在其它优选实施例中，所述保护剂包含1至8，2至7，或3至4个水溶性增强官能团。发明人发现，在保护剂分子中含有一个以上的水溶性增强官能团可能是有用的，因为使水溶性增加到更大的程度。在主链结构为叔丁烷或苯基甲烷的实施方式中，一个水溶性增强官能团可能是足够的。
在本发明的优选实施方式中，所述保护剂包括全部是同一种类，特别是全部为SO3 -类型的水溶性增强官能团。在可选实施方式中，所述保护剂包括不同种类的水溶性增强官能团。只要水溶性增强官能团是SO3 -，则所述保护剂优选包含至少两个此类官能团。如果水溶性增强官能团全部为同一种类，则所述保护剂的合成可以更高效且更容易。
所述主链结构包含选自由9-甲基芴、叔丁烷和/或单苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷组成的组中的部分。在优选实施方式中，所述主链结构选自9-甲基芴和叔丁烷。
所述反应基团是适当的，即具有所需的化学反应性，以与待保护的官能团发生化学反应。优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基氧基酯(oxycarbonylOxyma ester)、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、氢氧化物和巯基基团组成的组。当所述主链结构为9-甲基芴时，所述反应基团优选选自氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯和氧羰基O-琥珀酰亚胺。当所述主链结构为叔丁烷时，所述反应基团优选选自氢氧化物、卤化物、巯基、氧羰基O-琥珀酰亚胺和氧羰基酸酐。当所述主链结构选自单苯基甲烷、二苯基甲烷和三苯基甲烷时，所述反应基团优选选自卤化物、氧甲基卤化物和氧羰基卤化物。
在本发明中，具有9-甲基芴主链结构的优选保护剂，可以例示为以下通式1：
通式1
其中，R1至R8独立地选自氢、SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和CN，条件是，R1至R8中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和CN。在优选的实施方式中，R1至R8中不是SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯或CN的，全部是氢。
R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基氧基酯、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、氢氧化物和巯基基团组成的组，其中R99优选选自氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯和氧羰基O-琥珀酰亚胺。
在优选实施方式中，R2和R7选自SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和CN，特别地，R2和R7是SO3 -。优选地，R1、R3至R6和R8是氢。
在优选实施方式中，R3和R6选自SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和CN，特别地，R3和R6是SO3 -。优选地，R1、R2、R4、R5、R7和R8是氢。
在优选实施方式中，R2和R6选自SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和CN，特别地，R2和R6是SO3 -。优选地，R1、R3、R4、R5、R7和R8是氢。
在本发明中，优选的具有9-甲基芴主链结构的保护剂如下表1所示。表中列出的化合物不以任何方式限制本发明的范围。根据本发明，它们构成了例示性和优选的保护剂。
表1
在本发明中，优选的具有叔丁烷主链结构的保护剂可以例示为以下通式2：
通式2
其中R1选自SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和CN。在优选实施方式中，R1是SO3 -。R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、氢氧化物和巯基基团组成的组，其中更优选地，R99选自氢氧化物、卤化物、巯基、氧羰基O-琥珀酰亚胺和氧羰基酸酐。
在本发明中，优选的具有叔丁烷主链结构的保护剂如下表2所示。表中列出的化合物不以任何方式限制本发明的范围。根据本发明，它们构成例示性和优选的保护剂。
表2
在本发明中，优选的具有单苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷主链结构的保护剂可以分别例示为以下通式3、4或5：
通式3
其中，R1至R5独立地选自氢、SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和CN。在优选的实施例中，R1至R5中不是SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯或CN的，全部都是氢。
R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、氢氧化物和巯基组成的组，其中更优选地，R99选自卤化物、氧甲基卤化物和氧羰基卤化物。
在优选的实施方式中，R3选自SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、OSO3 -酯、OPO3 2-酯和CN，特别地，R3是SO3 -。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。
通式4
其中，R1至R10独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R10中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R10中不是SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、氢氧化物和巯基基团组成的组，其中更优选地，R99选自卤化物、氧甲基卤化物和氧羰基卤化物。
在优选的实施方式中，R3和R8选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3和R8选自SO3 -。优选地，R1、R2、R4至R7、R9和R10是氢。
通式5
其中，R1至R15独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选至少三个，选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R15中不是SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、卤化物、氧甲基卤化物、氢氧化物和巯基基团组成的组，其中更优选地，R99选自卤化物、氧甲基卤化物和氧羰基卤化物。在一个特别优选的实施方式中，当R3、R8和R13是SO3 -时，R99不是卤化物。在另一个特别优选的实施方式中，当R3、R8和R13是SO3 -时，R99不是氯化物。在优选的实施方式中，R99优选选自由氧羰基卤化物、氧羰基氧基酯、氧羰基O-琥珀酰亚胺、氧羰基酸酐、氧甲基卤化物、氢氧化物和巯基基团组成的组。在特别优选的实施方式中，R99不是卤化物，尤其不是氯化物。
在优选的实施方式中，R3、R8和R13选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3 -。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。
在本发明中，优选的具有单苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷主链结构的保护剂如下表3所示。表中列出的化合物不以任何方式限制本发明的范围。根据本发明，它们构成例示性和优选的保护剂。
表3
优选地，官能团存在于氨基酸、肽或蛋白质上，并且化学反应是在上述或下述的溶剂仲发生的肽或蛋白质合成。
上述或下述的保护剂为氨基酸或肽提供了保护基团。在优选实施方式中，α-胺保护基团是下式6至10中的至少一种。在每种情况下，以下通式所示的氮属于被保护的氨基：
通式6
其中，R1至R15独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选至少三个，选自SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R15中不是SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3、R8和R13选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3 -。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。
通式7
其中，R1至R8独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R8中的至少一个，优选至少两个选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 -、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R8中不是SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R2和R7选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R2和R7是SO3 -。优选地，R1、R3至R6和R8是氢。
在优选的实施方式中，R3和R6选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3和R6是SO3 -。优选地，R1、R2、R4、R5、R7和R8是氢。
在优选的实施方式中，R2和R6选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R2和R6是SO3 -。优选地，R1、R3、R4、R5、R7和R8是氢。
通式8
其中，R1至R5独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R5中不是SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3是SO3 -。优选地，R1、R2、R 4和R5是氢。
通式9
其中，R1至R10独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R10中的至少一个，优选至少两个选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R10中不是SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3和R8选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3和R8选自SO3 -。优选地，R1、R2、R4至R7、R9和R10是氢。
通式10
其中，R1选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1是SO3 -。
在特别优选的实施方式中，α-胺保护基团是9-(2-磺基)芴甲氧基羰基(Sulfmoc)、9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基或叔丁基-(2-磺酸)氧羰基(Sboc)。如本文所使用的，术语“Smoc”表示9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基或9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基。
在本发明的一个优选实施方式中，所述第一氨基酸或第一肽和/或第二氨基酸或第二肽的任何反应性侧链官能团均被侧链保护基团保护，其中侧链保护基团优选包括至少一个水溶性增强官能团。侧链保护基团可包括磺酸基或磺酸酯。该方法优选包括，除去侧链保护基团的步骤。侧链保护基团的水溶性增强官能团，为侧链被保护的氨基酸或肽提供了溶解性。合适的侧链保护基团是，上述保护剂之一与氨基酸或肽的各侧链官能团的反应产物。
关于侧链保护基团，优选的胺保护基团是下式11至15所示的那些，其中的氮属于被保护的氨基。
通式11
其中，R1至R15独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选至少三个，选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R15中不是SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3、R8和R13选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3 -。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。
通式12
其中，R1至R8独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R8中的至少一个，优选至少两个选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R8中不是SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R2和R7选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R2和R7是SO3 -。优选地，R1、R3至R6和R8是氢。
在优选的实施方式中，R3和R6选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3和R6是SO3 -。优选地，R1、R2、R4、R5、R7和R8是氢。
在优选的实施方式中，R2和R6选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R2和R6是SO3 -。优选地，R1、R3、R4、R5、R7和R8是氢。
通式13
其中，R1至R5独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R5中不是SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3是SO3 -。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。
通式14
其中，R1至R10独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R10中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R10中不是SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3和R8选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3和R8选自SO3 -。优选地，R1、R2、R4至R7、R9和R10是氢。
通式15
其中，R1选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1是SO3 -。
在特别优选的实施方式中，侧链胺保护基团选自9-(2-磺基)芴甲氧基羰基(Sulfmoc)、9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基、三(4-磺苯基)甲基(Sulfo Trt)、叔丁基-(2-磺酸)氧羰基(Sboc)和4-磺基-苄氧羰基(SulfoCBz)。
优选的醇保护基团如下式16至19所示。在每种情况中，以下通式示出的氧是被保护的醇基：
通式16
其中，R1至R5独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R5中不是SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3是SO3 -。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。
通式17
其中，R1至R5独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R5中不是SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3是SO3 -。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。
通式18
其中，R1选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1是SO3 -。
通式19
其中，R1至R15独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选至少三个，选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R15中不是SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3、R8和R13选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3 -。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。
在特别优选的实施方式中，醇保护基团选自4-磺苄基(BzS)、4-磺基-苄氧基甲基(BOMS)、三(4-磺苯基)甲基(Sulfo Trt)和叔丁基-1-磺酸酯基(tBuS)。
优选的巯基保护基团如下式20和21所示。在每种情况中，以下通式示出的硫属于被保护的巯基：
通式20
其中，R1至R15独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选至少三个，选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R15中不是SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3、R8和R13选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3 -。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。
通式21
其中，R1选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1是SO3 -。
在特别优选的实施方式中，巯基保护基选自三(4-磺苯基)甲基(Sulfo Trt)和1-磺基-2-甲基-2-丙硫醇基(StBuS)。
优选的羧基保护基团是如下式22至25所示的那些。在每种情况中，以下通式示出的氧是被保护的羧基：
通式22
其中，R1至R15独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R15中的至少一个，优选至少两个，最优选至少三个，选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R15中不是SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3、R8和R13选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3、R8和R13是SO3 -。优选地，R1、R2、R4至R7、R9至R12、R14和R15是氢。
通式23
其中，R1选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1是SO3 -。
通式24
其中，R1至R5独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R5中不是SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3是SO3 -。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。
通式25
其中，R1至R5独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、PO3 2-、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R5中不是SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3是SO3 -。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。
在特别优选的实施方式中，羧基保护基团选自4-磺苄基(BzS)、4-磺基-苄氧基甲基(BOMS)、三(4-磺苯基)甲基(Sulfo Trt)和叔丁基-1-磺酸酯基(tBuS)。
优选的硒基保护基团是如下式26所示的那些。在每种情况中，以下通式示出的硒属于被保护的硒基：
通式26
其中，R1至R5独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R5中不是SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3是SO3 -。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。
优选的膦酰基保护基团是如下式27和28所示的那些。在每种情况中，以下通式示出的氧属于被保护的膦酰基：
通式27
其中，R1选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1是SO3 -。
通式28
其中，R1至R5独立地选自氢、SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，条件是，R1至R5中的至少一个，优选至少两个，选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN。在优选的实施方式中，R1至R5中不是SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +或CN的，全部都是氢。
在优选的实施方式中，R3选自SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +和CN，特别地，R3是SO3 -。优选地，R1、R2、R4和R5是氢。
以下是最优选的保护基团的概述。
胺保护基团
醇保护基团
巯基保护基团
羧基保护基团
膦酰基保护基团
优选地，如果使用离子交换剂，则上述胺保护基团用于保护主链氨基，并为氨基酸或肽提供到固相的锚定点。
在特定实施方式中，具有水溶性增强基的所述保护基团优选包括至少两个水溶性增强基团，优选离子基团。本实施方式提供了可以实现与离子交换剂的更高键合的优点。
在另一实施方式中，具有水溶性增强基的所述保护基团优选精确地包括一个水溶性增强基团，优选离子基团。本实施方式提供的优点是，可以实现保护基团的较低的水解，这样在水或其它质子溶剂中的反应提供更高的产率。
优选地，具有水溶性增强基团的所述保护基团包括经水溶性增强基团(优选离子基团)改性的芴甲氧羰基残基(Fmoc)。
根据本发明的一个实施方式，优选提供所述氨基酸或肽，优选第一氨基酸或第一肽，和/或所述第二氨基酸或第二肽的任何反应性侧链官能团，被侧链保护基团保护。通过本实施方式，可以实现在第一氨基酸或第一肽和/或所述第二氨基酸或第二肽的溶解性方面的惊人改进。除此之外，优选改进第一氨基酸或第一肽与离子交换剂的键合。
在一个具体实施方式中，所述侧链保护基团包括至少一个水溶性增强官能团，优选离子基团。
在另一实施方式中，所述侧链保护基团不包括任何水溶性增强官能团。
在根据本发明的方法中，还可以提供，所述第一氨基酸或第一肽和所述第二氨基酸或第二肽的被保护的官能团选自α-氨基、侧链氨基、巯基、羧基、羟基、膦酰基和硒基。
在本发明的一个优选实施方式中，除了保护伯胺基的基团和保护羧基的基团之外，第二氨基酸或第二肽优选不包括任何保护基团。更优选地，除了保护伯胺基的基团之外，第二氨基酸或第二肽优选不包括任何保护基团。本实施方式提供了惊人的成本改进和更容易的处理。为了获得与生长的肽链偶联的氨基酸的更高溶解度，在某些情况下可以使用保护基团。
进一步地，第二氨基酸或第二肽的溶解度，优选地通过使用第二氨基酸或第二肽的盐来改进，并且该盐包含可溶性有机离子，例如季胺阳离子。进一步地，优选采用赋予盐在有机溶剂中的溶解性的化合物，例如冠醚。另外，可将第二氨基酸或第二肽添加到固相的反应混合物中，并且经由溶剂，使添加的第二氨基酸或第二肽传转移至第一氨基酸或第一肽。本实施方式包括成本优势。然而，反应时间比其他实施方式长。
第二氨基酸或第二肽的溶解度优选足以在混合物和/或要获得的生长的链中，获得足够浓度的第二氨基酸或第二肽，其中该混合物被添加到被活化的第一氨基酸或第一肽中。如上所述，如果有用，可以提高第二氨基酸或第二肽的溶解度。然而，在许多情况下，没有必要提高第二氨基酸或第二肽的溶解度。
优选地，在没有任何保护基团的情况下，使用以下氨基酸作为第二氨基酸或第二肽：丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、甲硫氨酸(Met)，更优选Ala、Gly、Ile、Leu、Pro、Val、Phe。这些氨基酸通常具有足够的溶解度，以在被添加到被活化的第一氨基酸或第一肽中的混合物中，和/或在要获得的生长的链中，获得足够浓度的第二氨基酸或第二肽。
氨基酸谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、赖氨酸(Lys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)优选包含保护基团，更优选如上述或下述的侧链保护基团。
优选地，将包括保护基团的所述氨基酸或肽，以离子交换剂容量的至少10％，更优选至少80％的量，添加到所述离子交换剂中；其中保护基团具有水溶性增强基团。
优选地，将键合至固相的所述氨基酸或肽以固相容量的至少10％，更优选至少80％的量添加到所述固相。
根据本发明，优选提供了，使用第二氨基酸或肽的溶液来实现所述肽键的形成，其中基于溶液的总重量，第二氨基酸或第二肽的浓度在以0.01％重量至90％重量的范围内，优选在0.1％重量至50％重量的范围内，更优选在0.5％重量至20％重量的范围内。
在本发明的一个实施方式中，肽键的形成优选地在-20至100℃、更优选0至50℃、甚至更优选10至30℃的温度范围内实现。
在本发明的另一个实施方式中，肽键的形成优选地在pH值4至12的范围内、优选地在6至10的范围内、更优选地在7至9.5的范围内、甚至更优选地在7至9.0的范围内、甚至更优选地在7至8.5的范围内实现。
根据本发明，优选地提供了，通过肽键形成所获得的肽包含2至150个氨基酸单元，更优选2到6个氨基酸单元，甚至更优选2到4个氨基酸单元。
根据本发明的另一个实施方式，优选地提供了，通过肽键形成所获得的肽包含4至300个氨基酸单元，更优选10至100个氨基酸单元，甚至更优选15至45个氨基酸单元。具有大量氨基酸单元的肽优选通过一方法获得，在该方法中，第一氨基酸或第一肽共价键合到固相。
如上和如下所述，本发明的一些实施方式包括脱保护的步骤。传统上，应用脱保护溶液，来实现肽或肽的特定氨基酸单元的脱保护。
适用于本发明的脱保护溶液优选包括酸或碱，优选水性酸或碱，即酸和/或碱优选是水溶性的。优选的酸为磷酸、盐酸或三氟乙酸。优选的碱是胺和氨(ammonia)。优选的脱保护溶液是胺和/或氨溶液。碱以达到使官能团脱保护所必需的量和程度来使用。某些有机碱的溶解度可能会限制可以溶解于水、醇，或水与醇的混合物中的量。合适的碱是那些具有一溶解度，允许溶解足够的量，以在所选溶剂中进行脱保护。
用于脱保护Sboc基团的脱保护溶液，优选包括水性酸，例如磷酸、盐酸或三氟乙酸。
用于脱保护Smoc基团、Sulfmoc基团和/或类似基团，例如衍生自式1、7、12等的化合物或基团的芴甲氧基-羰基，的脱保护溶液优选包括水溶性碱，例如胺、氨或无机氢氧化物。水溶性碱以达到使肽脱保护所必需的量和程度来使用。某些有机碱的溶解度可能会限制可以溶解于水、醇，或水与醇的混合物中的量。合适的碱是那些具有一溶解度，允许溶解足够的量，以在所选溶剂中进行脱保护。
通过在水中，或在水和环境友好型溶剂(包括质子溶剂，如水、伯醇、仲醇和/或叔醇，非质子溶剂，如酮、腈、内酯、内酰胺、碳酸酰胺、碳酸酯、醚、脲衍生物、亚砜、砜，碳酸酯)的混合物中，使用至少5％的有机碱(例如伯胺、仲胺和/或叔胺，优选哌嗪、哌啶、乙醇胺和/乙二胺)，可以实现对Smoc基团、Sulfmoc基团和/或类似基团脱保护的惊人改进。非质子溶剂的优选实例是例如二甲基乙酰胺、乙基甲基酮、丙酮、甲基异丙基酮、甲基异丁基酮、甲基正丁基酮、甲基叔丁基酮、甲基异戊基酮、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷、二甘醇、二甲醚、乙酸乙酯、乙酸叔丁酯，或其混合物。与使用氨或无机氢氧化物相比，这减少了在Smoc基团、Sulfmoc基团和/或类似基团的脱保护过程中，碱催化的副反应(例如，基于OtBu的侧链保护基团的脱保护、酯与SPPS连接分子的裂解)。这产生更高的纯度和产品收率。
应当理解地是，在脱保护后，可以使用其它氨基酸或其它肽，重复反应和脱保护步骤，直到获得所需的靶肽，其中所述其它氨基酸和/或其它肽的α-氨基或羧基优选被根据本发明的保护基团，尤其是Smoc基团或Sboc基团保护。
在一个实施方式中，所述方法还包括，当肽完成时，使用释放组合物从聚合物载体上释放所得肽的步骤。
在肽通过具有水溶性增强基团的保护基团，离子键合到离子交换剂的情况中，释放组合物优选为将肽从相应的保护基团中脱保护的组合物，或者为能够将肽从离子交换剂上释放出来并保持对肽的保护的组合物。用于将肽从固体载体上释放出来的脱保护剂，取决于所使用的保护基团。Sboc基团常规通过酸性组合物释放，而使用碱性试剂来去除Smoc部分。
在本发明的特定实施方式中，优选当氨基酸或肽离子键合到离子交换剂时，实现肽键的形成，并且在形成肽键之后，通过脱保护所获得的肽，从离子交换剂上去除所获得的肽。在优选的实施方式中，通过释放组合物，去除至少一种优选至少50％，更优选至少90％的附接到靶肽中的氨基酸的侧链保护基团。
在本发明的另一个实施方式中，优选当氨基酸或肽离子键合到离子交换剂时，实现肽键的形成，并且在形成肽键之后，通过添加离子溶液从离子交换剂上移除所获得的肽，并保持对所获得肽的保护。
优选地，在清除剂组合物，例如水、苯酚、DTT、三乙基硅烷和苯甲醚的存在下进行释放，所述清除剂组合物保护肽在裂解步骤期间和之后免于发生不期望的副反应。技术人员可以根据存在的保护基团，选择合适的清除剂。
释放的肽可以通过过滤与离子交换剂分离开，然后通过常规步骤，例如蒸发或溶剂驱动沉淀，从滤液中回收肽。
在肽共价键合到固体载体的情况中，优选使用适当的裂解组合物。适当的裂解组合物和方法是技术人员所熟知的。通常，使用酸，如三氟乙酸和氢氟酸(HF)，来进行裂解步骤。优选地，适于从聚合物载体上裂解所需肽的酸，同时移除附接到靶肽中的氨基酸的侧链保护基团。
优选地，在清除剂组合物(例如水、苯酚、DTT、三乙基硅烷和苯甲醚)的存在下，进行裂解或释放，所述清除剂组合物保护肽在裂解步骤期间和之后免于发生不期望的副反应。技术人员可以根据存在的保护基团选择合适的清除剂。
通过过滤，可将裂解或释放的肽与裂解的载体(例如树脂)分离开，然后通过常规步骤(如蒸发或溶剂驱动沉淀)从滤液中回收肽。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述方法还包括以下步骤：使用溶剂洗涤至少一次，其中溶剂包括上文或下文关于肽键形成所述的质子和/或非质子溶剂；和，收集在洗涤步骤中获得的废液，将废液与亲和层析柱，优选固体阴离子和/或阳离子交换载体接触，从而保留废弃化合物，该废弃化合物含有水溶性增强官能团，特别是诸如SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-和N(CH3)3 +等带电荷的官能团。使用阴离子交换载体，去除含有至少一个磺酸基的化合物特别有效。随后，可通过亲和层析柱，优选固体阴离子和/或阳离子交换载体的再生，来收集废弃化合物，并进行处理。或者，可以对含有废弃化合物的亲和层析柱，优选阴离子和/或阳离子交换载体材料进行处理。
洗涤步骤通常在偶联步骤之后和脱保护步骤之后进行。阴离子和/或阳离子交换步骤允许从洗涤溶液中去除所有含磺基的化合物(例如未反应或裂解的保护基团)和试剂(如本文所述的偶联剂和封端剂)。废弃化合物保留在阴阳离子交换柱上，并且得到纯化的溶剂。保留的化合物可与阴离子或阳离子交换材料一起处理，或在洗脱后处理，且只需处理最少量的化学废物。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述方法还包括在释放步骤之后的纯化步骤，其中，包含经脱保护且被释放的靶蛋白或肽的溶液，与亲和层析柱，优选固体阴离子和/或阳离子交换载体接触，从而保留诸如含磺酸基的废弃化合物，并收集纯化的靶蛋白。在优选实施方式中，所述废弃化合物包括至少一个作为保护基团和其他试剂一部分的磺酸基团。由于含磺基保护基团和含磺基试剂，可以通过亲和层析柱，优选离子交换方法，基本上除去，在上述或下述质子和/或非质子溶剂中的偶联、脱保护和裂解反应期间，产生的过量的化学物质和副产物。当然，这也适用于其它带电荷的官能团。只有靶肽才能够穿过离子交换柱，而肽副产物、保护基团残留物和过量试剂则保留在柱子上。在柱子再生后，仅需处理最少量的化学废弃物。这是使用带电荷的官能团，例如SO3 -、OSO3 -酯、OPO3 2-酯、PO3 2-和N(CH3)3 +的有益效果。但是，即使使用一种或多种不带电荷的官能团，该方法仍然可以在水中或另一环境友好型溶剂中进行，从而与现有技术的方法相比，减少了废弃化学物的量。
本发明的另一主题是可通过本发明的方法获得的肽。
本发明的又一主题是一种氨基酸或肽，该氨基酸或肽包括具有水溶性增强基团的保护基团，其中水溶性增强基团键合到氨基和被活化或游离的羧基，优选被活化的羧基。优选地，所述肽与离子交换剂离子键合。
优选提供了，本发明的氨基酸或肽优选具有1至150个氨基酸单元、优选1至50个氨基酸单元、更优选1或2个氨基酸单元。
本发明的另一方面涉及经修饰的氨基酸、肽及其盐，其包含保护基团，该保护基团选自由上述通式6至通式25所示的那些保护基团组成的组，更优地，选自由上述通式6至通式10所示的那些保护基团组成的组。在特别优选的实施方式中，这些保护基团包括9-(2-磺基)芴甲氧基羰基(Sulfmoc)、9-(3,6-二磺基)芴甲氧基-羰基、9-(2,7-二磺基)芴甲氧基-羰基、三(4-磺苯基)甲基(Sulfo Trt)、叔丁基-(2-磺酸)氧羰基(Sboc)、4-磺基-苄氧羰基(SulfoCBz)、叔丁基-1-磺酸酯基(tBuS)、1-磺基-2-甲基-2-丙硫醇基(StBuS)、4-磺苄基(BzS)和4-磺基-苄氧基甲基(BOMS)。
具体实施方式
本发明采用以下实施例进行说明，但不受限于此。
实施例
实施例1：9-(3,6-二磺基)芴甲氧基羰基氯(Smoc-Cl)的合成
采用20mL浓硫酸处理2g(7.73mmol)的Fmoc-氯。反应混合物停止反应后，得到2.96g(7.07mmol，91.4％)浅黄色固体状的粗Smoc-氯。
Smoc-氯的分析数据：
1H NMR(500MHz,D2O)δ＝7.80(s,2H),7.69(d,J＝7.9Hz,2H),7.48(d,J＝7.8Hz,2H),3.84(d,J＝4.8Hz,2H),3.45(t,J＝4.7Hz,1H).
13C NMR(126MHz,D2O)δ＝145.57,142.54,141.65,125.16,121.61,120.90,62.54,49.65.
实施例2：9-(2,7-二磺基)芴甲氧基羰基氯(Smoc-Cl)的合成
采用20mL浓硫酸处理2g(7.73mmol)的Fmoc-氯，并加热至100℃。用NaOH(pH9.5)中和硫酸，减压除去溶剂，采用NMR分析确认了目标中间体的形成。将中间体再次溶解于20％的硫酸水溶液中，搅拌6小时，形成9-(2,7-二磺基)芴基甲醇。用NaOH(pH6.7)中和硫酸，减压除去溶剂。将1.2eq.光气(phosgene)在25ml DCM中的溶液冷却至0℃，并在搅拌下缓慢加入9-(2,7-二磺基)芴基甲醇(Carpino and Han,The Journal of Organic Chemistry1972,37,(22),3404-3409)。将溶液在冰浴中搅拌1小时，然后在冰浴温度下静置4小时。减压除去溶剂和过量的光气，得到相应的产物。
NMR中间体：
1H NMR(300MHz,D2O)δ:6.09(s,2H),7.23–7.40(m,2H),7.72(s,2H),7.95(d,J＝6.2Hz,2H).
13C NMR(75MHz,D2O)δ:142.61,132.99,131.74,130.23,129.28,127.22,125.57,124.69.
9-(2,7-二磺基)芴甲氧基羰基氯的LC-APCI-MS：
LC-APCI-MS计算的C15H9ClO22·m/z:256.03.测量的m/z:256.94[M-H-2xSO3]-.
实施例3：Smoc-βAla-OH(Smoc-β-丙氨酸)的合成
采用30mL浓硫酸处理8.41mmol的Fmoc-β-丙氨酸。反应混合物停止反应后，得到8.09mmol(96.2％)的粗Smoc-β-丙氨酸。
实施例4：L-肌肽的合成
将Smoc-β-丙氨酸以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在水中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-β-丙氨酸。
之后，将负载有活化的Smoc-β-丙氨酸的离子交换剂，用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水中的1.5当量L-组氨酸，加入到活化的Smoc-β-丙氨酸中，在4℃、pH7.5下搅动反应12分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-组氨酸和释放的NHS。
通过使用0.25mM NaOH(pH 10，20分钟)或Na2CO3(pH 10，20分钟)进行脱保护，释放形成的L-肌肽。
实施例5：L-肌肽的合成
将Smoc-β-丙氨酸以最大负载量，添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。以与上文所公开的关于Smoc-β-丙氨酸类似的方式(参见实施例3)，获得Smoc-脯氨酸。在比例为4:1(体积)的水和乙腈(MeCN)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-β-丙氨酸。活化度远高于实施例4。
之后，将负载有活化的Smoc-β-丙氨酸的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量L-组氨酸，加入到活化的Smoc-β-丙氨酸中，在4℃、pH7.5下搅动反应12分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-组氨酸和释放的NHS。
实施例5的产率高于实施例4的产率。
通过使用0.25mM NaOH(pH 10，20分钟)或Na2CO3(pH 10，20分钟)进行脱保护，释放形成的L-肌肽。
实施例6：Pro-Tyr-OMe的合成
将Smoc-脯氨酸以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在比例为3:1(体积)的水和四氢呋喃(THF)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-脯氨酸。
之后，将负载有活化的Smoc-脯氨酸的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量L-酪氨酸甲酯，加入到活化的Smoc-脯氨酸中，在24℃、pH 8下搅动反应12分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-酪氨酸甲酯和释放的NHS。
通过使用0.5M NaOH(pH 9，25分钟)或Na2CO3(pH 10，20分钟)进行脱保护，释放形成的Pro-Tyr-OMe。
实施例7：Pro-Tyr-OMe的合成
将Smoc-脯氨酸以最大负载量添加到离子交换树脂(Amberlite IRA-900；SigmaAldrich)中。在比例为3:1(体积)的水和四氢呋喃(THF)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-脯氨酸。
之后，将负载有活化的Smoc-脯氨酸的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量L-酪氨酸甲酯，加入到活化的Smoc-脯氨酸中，在24℃、pH 8下搅动反应12分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-酪氨酸甲酯和释放的NHS。
实施例7的产率低于实施例6的产率。
通过使用0.5mM NaOH(pH 10，15分钟)或Na2CO3(pH 10，20分钟)进行脱保护，释放形成的Pro-Tyr-OMe。
实施例8：Pro-Tyr-OMe的合成
将Smoc-脯氨酸以最大负载量添加到离子交换树脂(Amberlite IRA-96；SigmaAldrich)中。在比例为4:1(体积)的水和四氢呋喃(THF)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-脯氨酸。
之后，将负载有活化的Smoc-脯氨酸的离子交换剂用水冲洗三次。洗涤步骤后，将溶于水的2当量L-酪氨酸甲酯，加入到活化的Smoc-脯氨酸中，在15℃、pH 8.2下搅动反应25分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-酪氨酸甲酯和释放的NHS。
实施例8的产率与实施例7的产率相似。
通过使用0.25M CaOH2(pH 10，15分钟)或CaCO3(pH 10，30分钟)进行脱保护，释放形成的Pro-Tyr-OMe。
实施例9：Pro-Tyr-OMe的合成
将Smoc-脯氨酸以最大负载量添加到离子交换树脂(Amberlite IRA-410；SigmaAldrich)中。在比例为4:1(体积)的水和四氢呋喃(THF)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-脯氨酸。
之后，将负载有活化的Smoc-脯氨酸的离子交换剂用水冲洗三次。洗涤步骤后，将溶于水的2当量L-酪氨酸甲酯，加入到活化的Smoc-脯氨酸中，在15℃、pH 8.2下搅动反应25分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-酪氨酸甲酯和释放的NHS。
实施例9的产率低于实施例6的产率。
通过使用1M NaOH(pH 10，10分钟)或Na2CO3(pH 10，20分钟)进行脱保护，释放形成的Pro-Tyr-OMe。
实施例10：Pro-Tyr-OMe的合成
将Smoc-脯氨酸以最大负载量添加到离子交换树脂(Amberlite IRA-958；SigmaAldrich)中。在比例为4:1(体积)的水和四氢呋喃(THF)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-脯氨酸。
之后，将负载有活化的Smoc-脯氨酸的离子交换剂用水冲洗三次。洗涤步骤后，将溶于水的2当量L-酪氨酸甲酯，加入到活化的Smoc-脯氨酸中，在15℃、pH 8.2下搅动反应25分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-酪氨酸甲酯和释放的NHS。
实施例10的产率高于实施例10的产率。
通过使用25％NH3(aq)(pH 10，20分钟)或(NH4)2CO3(pH 10，20分钟)进行脱保护，释放形成的Pro-Tyr-OMe。
实施例11：L-肌肽的合成
将Smoc-β-丙氨酸以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在比例为3:1(体积)的水和异丙醇的混合物中，通过2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)，活化Smoc-β-丙氨酸。
之后，将负载有活化的Smoc-β-丙氨酸的离子交换剂用水冲洗一次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量L-组氨酸，加入到活化的Smoc-β-丙氨酸中，在24℃、pH 7.8下搅动反应15分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-组氨酸和释放的NHS。
实施例11的产率与实施例4的产率类似。
通过使用0.5M KOH(pH 9.8，12分钟)或K2CO3(pH 10，20分钟)进行脱保护，释放形成的L-肌肽。
实施例12：Smoc-Gly-His-OH的合成
将Smoc-甘氨酸以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。以与上文关于Smoc-β-丙氨酸所公开的类似的方式(参见实施例3)，获得Smoc-甘氨酸。在比例为3:1(体积)的水和四氢呋喃(THF)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-甘氨酸。
之后，将负载有活化的Smoc-甘氨酸的离子交换剂用水冲洗三次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量L-组氨酸，加入到活化的Smoc-甘氨酸中，在18℃、pH 8.5下搅动反应20分钟。通过用水洗涤，去除过量的L–组氨酸和释放的NHS。
通过使用1M NaCl溶液洗脱，释放形成的Smoc-Gly-His-OH。
实施例13：Asn-Asn-OH的合成
将Smoc-Asn以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。以与上文关于Smoc-β-丙氨酸所公开的类似的方式(参见实施例3)，获得Smoc-Asn。在比例为4:1(体积)的水和异丙醇的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Asn。
之后，将负载有活化的Smoc-Asn的离子交换剂用水冲洗三次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量L-Asn，加入到活化的Smoc-Asn中，在8℃、pH 8.7下搅动反应25分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Asn和释放的NHS。
通过使用0.5M NaOH(pH 9.5，12分钟)或K2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的Asn-Asn-OH。
实施例14：Asn-Gln-OH的合成
将Smoc-Asn以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在比例为4:1(体积)的水和异丙醇的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Asn。
之后，将负载有活化的Smoc-Asn的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量L-Gln，加入到活化的Smoc-Asn中，在24℃、pH 9下搅动反应20分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Gln和释放的NHS。
通过使用1M NaOH(pH 9.5，12分钟)或K2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的Asn-Gln-OH。
实施例15：Asp(OtBu)-Glu-OH的合成
将Smoc-Asp(OtBu)-OH以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。以与上文关于Smoc-β-丙氨酸所公开的类似的方式(参见实施例3)，获得Smoc-Asp(OtBu)-OH。在比例为4:1(体积)的水和2-甲基四氢呋喃的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Asp(OtBu)-OH。
之后，将负载有活化的Smoc-Asp(OtBu)的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量L-Glu溶于水，加入到活化的Smoc-Asp(OtBu)中，在24℃、pH 9下搅动反应20分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Glu和释放的NHS。
通过使用1M NaOH(pH 9.5，12分钟)或K2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的Asp(OtBu)-Glu-OH。
实施例16：Ile-D-Val-OH的合成
将Smoc-Ile-OH以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。以与上文关于Smoc-β-丙氨酸所公开的类似的方式(参见实施例3)，获得Smoc-Ile-OH。在比例为3:1(体积)的水和二甲基亚砜(DMSO)的混合物中，通过4当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Ile-OH。
之后，将负载有活化的Smoc-Ile的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量D-Val，加入到活化的Smoc-Ile中，在25℃、pH 8.5下搅动反应17分钟。通过用水洗涤，去除过量的D-Val和释放的NHS。
通过使用1M NaOH(pH 9.5，12分钟)或Na2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的Ile-D-Val-OH。
实施例17：Sulfmoc-Gly-Val-OH的合成
以与上文关于Smoc-β-丙氨酸所公开的类似的方式(参见实施例3)，获得9-(2-磺基)芴甲氧基羰基甘氨酸(Sulfmoc-Gly-OH)。在水中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化9-(2-磺基)芴甲氧基羰基甘氨酸(Sulfmoc-Gly-OH)。然后，将预活化的Sulfmoc-Gly负载到离子交换树脂(DEAESephadex A-25；GE Healthcare)。
之后，将负载有活化的Sulfmoc-Gly的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的L-Val，加入到活化的Sulfmoc-Gly中，在25℃、pH 9下搅动反应30分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Val和释放的NHS。
通过使用1M NaCl溶液洗脱，释放形成的Sulfmoc-Gly-Val-OH。
实施例18：Ile-Pro-Phe-OH的合成
将Smoc-Ile-OH以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在比例为3:1(体积)的水和乙腈(MeCN)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Ile-OH。
之后，将负载有活化的Smoc-Ile的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的L-Pro，加入到活化的Smoc-Ile中，在25℃、pH 8.5下搅动反应12分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Pro和释放的NHS。在比例为3:1(体积)的水和乙腈(MeCN)的混合物中，通过2.5当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和1.2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Ile-Pro-OH。之后，将负载有活化的Smoc-Ile-Pro的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的L-Phe，加入到活化的Smoc-Ile-Pro中，在25℃、pH 8.6下搅动反应12分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Phe和释放的NHS。通过使用1M NaOH(pH 9.5，12分钟)或Na2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的Ile-Pro-Phe-OH。
实施例19：Ile-Val-Phe-OH的合成
将Smoc-Ile-OH以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在比例为3:1(体积)的水和乙腈(MeCN)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Ile-OH。
之后，将负载有活化的Smoc-Ile的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的L-Val，加入到活化的Smoc-Ile中，在25℃、pH 8.5下搅动反应12分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Val和释放的NHS。在比例为3:1(体积)的水和乙腈(MeCN)的混合物中，通过2.5当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和1.2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Ile-Val-OH。之后，将负载有活化的Smoc-Ile-Val的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的L-Phe，加入到活化的Smoc-Ile-Val中，在25℃、pH 8.6下搅动反应12分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Phe和释放的NHS。通过使用1M NaOH(pH 9.5，12分钟)或Na2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的Ile-Val-Phe-OH。
实施例20：Ile-His-Ile-OH的合成
将Smoc-Ile-OH以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在比例为3:1(体积)的水和乙腈(MeCN)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Ile-OH。
之后，将负载有活化的Smoc-Ile的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的L-His，加入到活化的Smoc-Ile中，在25℃、pH 8.2下搅动反应10分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-His和释放的NHS。在比例为3:1(体积)的水和乙腈(MeCN)的混合物中，通过2.5当量的2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉，活化Smoc-Ile-His-OH。之后，将负载有活化的Smoc-Ile-His的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的L-Ile，加入到活化的Smoc-Ile-His中，在25℃、pH 8.5下搅动反应10分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Ile和释放的1,2-二氢喹啉和乙醇。通过使用1M NaOH(pH 9.5，12分钟)或Na2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的Ile-His-Ile-OH。
实施例21：Leu-Ile-His-OH的合成
将Smoc-Ile-OH以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在比例为3:1(体积)的水和乙腈(MeCN)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Ile-OH。
通过使用有机碱，如乙醇胺、N,N-二异丙基乙胺、三乙胺或5％N-甲基-吗啉(aq)进行脱保护，释放形成的Ile-His–OH。通过加入非质子溶剂使Ile-His沉淀，并洗涤，直至去除碱残留物。
之后，离子交换剂用1M NaCl溶液再生，并用水洗涤两次。将Smoc-Ile-OH以最大负载量添加到离子交换树脂中，并在比例为3:1(体积)的水和乙腈(MeCN)的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化。之后，将负载有活化的Smoc-Leu的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1当量的L-Ile-His，加入到活化的Smoc-Leu中，在25℃、pH 8.5下搅动反应10分钟。通过用水洗涤，去除释放的NHS。通过使用1M NaOH(pH 9.5，12分钟)或Na2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的Leu-Ile-His-OH。
实施例22：LAGV-OH的合成
将Smoc-Ile-OH以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在比例为2:1(体积)的水和异丙醇的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Leu-OH。
之后，将负载有活化的Smoc-Ile的离子交换剂用水冲洗。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的L-Ala，加入到活化的Smoc-Leu中，在25℃、pH 7下搅动反应10分钟。通过用水洗涤，去除过量的L-Ala和释放的NHS。在比例为2:1(体积)的水和异丙醇的混合物中，通过2.5当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺，活化Smoc-Leu-Ala-OH。之后，将负载有活化的Smoc-Leu-Ala的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的Gly，加入到活化的Smoc-Leu-Ala中，在25℃、pH 7下搅动反应10分钟。通过用水洗涤，去除过量的Gly和释放的NHS。在比例为2:1(体积)的水和异丙醇的混合物中，通过2.5当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺，活化Smoc-LAG-OH。之后，将负载有活化的Smoc-LAG的离子交换剂用水冲洗两次。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的Val，加入到活化的Smoc-LAG中，在25℃、pH 7下搅动反应15分钟。通过用水洗涤，去除过量的Val和释放的NHS。
通过使用NaOH(pH 10，20分钟)或Na2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的LAGV-OH。产率：20％。
实施例23：Leu-脑啡肽(YGGFL)的合成
以与上文关于Smoc-β-丙氨酸所公开的类似的方式(参见实施例3)，获得Smoc-Tyr-OH。将Smoc-Tyr-OH以最大负载量添加到离子交换树脂(DEAE Sephadex A-25；GEHealthcare)中。在比例为2:1(体积)的水和MeCN的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-Tyr-OH。
之后，将负载有活化的Smoc-Tyr的离子交换剂用水冲洗。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的Gly，加入到活化的Smoc-Tyr中，在25℃、pH 7下搅动反应10分钟。通过用水洗涤，去除过量的Gly和释放的NHS。在比例为2:1(体积)的水和MeCN的混合物中，通过2.5当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺，活化Smoc-YG-OH。之后，将负载有活化的Smoc-YG的离子交换剂用水冲洗。洗涤步骤后，将溶于水的1.5当量的Gly，加入到活化的Smoc-YG中，在25℃、pH 7下搅动反应10分钟。通过用水洗涤，去除过量的Gly和释放的NHS。对每个步骤重复此过程，直至合成Smoc-YGGFL-OH的完整序列。
通过使用NaOH(pH 10，20分钟)或Na2CO3(pH 10，25分钟)进行脱保护，释放形成的YGGFL-OH。产率：19％。
实施例24：Leu-脑啡肽(YGGFL)在SPPS上的合成
Tyr(tBu)-OH经由胺官能团，以最大负载量添加到固相肽树脂(
S TRTCl树脂；0.2～0.3mmol/g)中。在比例为2:1(体积)的水和MeCN的混合物中，通过4当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和3当量的氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)，活化SolidS-Tyr(tBu)-OH。
之后，将负载有活化的Tyr(tBu)的固体载体用水冲洗。洗涤步骤后，将溶于水的3当量的Gly，加入到活化的SolidS-Tyr(tBu)中，在25℃、pH 8下搅动反应30分钟。通过用水洗涤，去除过量的Gly和释放的Oxyma。在比例为2:1(体积)的水和MeCN的混合物中，通过4当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和3当量的氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)，活化SolidS-YG-OH。之后，将负载有活化的Smoc-YG的固体载体用水冲洗。洗涤步骤后，将溶于水的3当量的Gly，加入到活化的SolidS-YG中，在25℃、pH 8下搅动反应30分钟。通过用水洗涤，去除过量的Gly和释放的Oxyma。对每个步骤重复此过程，直至合成SolidS-YGGFL-OH的完整序列。
通过使用95％的三氟乙酸(TFA)保持1.5h，从固体载体上裂解形成的YGGFL-OH。产率：30.5％。
实施例25：乙酰六肽-3(EEMQRR-OH)在SPPS上的合成
Glu(OtBu)-OH经由胺官能团，以最大负载量添加到固相肽树脂(
S TRTCl树脂；0.2-0.3mmol/g)中。在比例为2:1(体积)的水和MeCN的混合物中，通过4当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和3当量的氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)，活化SolidS-Glu(OtBu)-OH。
之后，将负载有活化的Glu(OtBu)的固体载体用水冲洗。洗涤步骤后，将溶于水的3当量的Glu(OtBu)，加入到活化的SolidS-Glu(OtBu)中，在25℃、pH 8下搅动反应30分钟。通过用水洗涤，去除过量的Glu(OtBu)和释放的Oxyma。在比例为2:1(体积)的水和MeCN的混合物中，通过4当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和3当量的氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)，活化SolidS-EE-OH。之后，将负载有活化的SolidS-EE的固体载体用水冲洗。洗涤步骤后，将溶于水的3当量的Met，加入到活化的SolidS-EE中，在25℃、pH 8下搅动反应30分钟。通过用水洗涤，去除过量的Met和释放的Oxyma。对每个步骤重复此过程，直至合成SolidS-EEMQRR-OH的完整序列。使用的精氨酸没有侧链保护基团。
通过使用95％的三氟乙酸(TFA)保持1.5h，从固体载体上裂解形成的EEMQRR-OH，并且对侧链脱保护。产率：32％。
实施例26：十(deca)-Ala在SPPS上的合成
Ala-OH通过胺官能团，以最大负载量添加到固相肽树脂(
S TRT Cl树脂；0.2-0.3mmol/g)中。在比例为2:1(体积)的水和MeCN的混合物中，通过4当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和3当量的氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)，活化SolidS-Ala-OH。
之后，将负载有活化的SolidS-Al的固体载体用水冲洗。洗涤步骤后，将溶于水的3当量的Ala，加入到活化的SolidS-Ala-OH中，在25℃、pH 8下搅动反应30分钟。通过用水洗涤，去除过量的Ala和释放的Oxyma。在比例为2:1(体积)的水和MeCN的混合物中，通过4当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和3当量的氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)，活化SolidS-AA-OH。之后，将负载有活化的SolidS-AA的固体载体用水冲洗。洗涤步骤后，将溶于水的3当量的Ala，加入到活化的SolidS-AA中，在25℃、pH 8下搅动反应30分钟。通过用水洗涤，去除过量的Ala和释放的Oxyma。对每个步骤重复此过程，直至合成SolidS-decaAla-OH的完整序列。
通过使用95％的三氟乙酸(TFA)保持1.5h，从固体载体上裂解形成的Deca-Ala-OH。产率：17％。
实施例27：L-肌肽的合成
4-(((L-组氨酰)氧)甲基)-N,N,N-三甲基苯甲胺以最大负载量添加到离子交换树脂(SPSephadex C-25；GE Healthcare)中。在比例为4:1(体积)的水和异丙醇的混合物中，通过3当量的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和2当量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化Smoc-β-丙氨酸。之后，将活化的Smoc-β-丙氨酸-NHS酯加入到离子交换柱上的组氨酸。使混合物在pH 7.5下搅动反应15分钟。之后，将负载有Smoc-β-Ala-His的离子交换剂用水冲洗两次，以去除过量的Smoc-β-丙氨酸和释放的NHS。之后，在水中，通过5％哌嗪除去Smoc-保护基团，并用水洗涤两次。通过使用98％的TFA进行脱保护，释放形成的L-肌肽。
Claims (17)
1.一种制备肽的方法，包括形成肽键的步骤，其特征在于，第一氨基酸或第一肽的羧基被活化，并且被活化的所述第一氨基酸或第一肽的氨基被保护；所述第一氨基酸或第一肽的被活化的羧基，与第二氨基酸或第二肽的氨基反应；其中，在所述第二氨基酸或第二肽不存在的情况下，活化所述第一氨基酸或第一肽的羧基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，被活化的所述第一氨基酸或第一肽的氨基被具有水溶性增强基团的保护基团保护。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，被活化的所述第一氨基酸或第一肽的氨基被固相保护。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其特征在于，与被活化的所述第一氨基酸或第一肽反应的所述第二氨基酸或第二肽的羧基未被保护。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其特征在于，使用环境友好型溶剂，实现所述第一氨基或第一肽的羧基的活化，和/或所述第一氨基酸或第一肽的被活化的羧基与第二氨基酸或第二肽的氨基反应。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述环境友好型溶剂包括非质子有机溶剂和/或仲醇和/或叔醇，优选非质子有机溶剂。
7.根据权利要求1至6所述的方法，其特征在于，在没有强碱性条件的溶液中，优选在12以下的pH，更优选在10以下的pH下，来实现所述肽键的形成，其中pH通过在25℃向溶液中添加水来测量；优选地，在4至12范围内、优选在6至10范围内、更优选在7至9.5范围内、甚至更优选在7至9.0范围内、甚至更优选在7至8.5范围内的pH值下，来实现所述肽键的形成。
8.根据权利要求1至7所述的方法，其特征在于，所述第一氨基酸或第一肽的羧基被偶联剂活化。
9.根据权利要求1、2和4至8中至少一项所述的方法，其特征在于，所述第一氨基酸或第一肽，与离子交换剂离子接触。
10.根据权利要求1至9中至少一项所述的方法，其特征在于，当氨基酸或肽，离子结合到离子交换剂或共价结合到固相时，实现肽键的形成。
11.根据权利要求1至10中至少一项所述的方法，其特征在于，当第一氨基酸或第一肽，离子结合到离子交换剂或共价结合到固相时，所述第一氨基酸或第一肽的羧基被偶联剂活化，而。
12.根据权利要求1至11中至少一项所述的方法，其特征在于，通过使氨基酸或肽与保护剂反应，来实现所述氨基酸或肽的保护，所述保护剂包括：
I.主链结构，
II.至少一个水溶性增强基团，和
III.至少一个反应基团，
其中，所述主链结构包括选自由9-甲基芴，叔丁烷，和/或单苯基甲烷、二苯基甲烷或三苯基甲烷组成的组中的部分，
其中，所述水溶性增强基团选自由SO3 -、PO3 2-、N(CH3)2、N(CH3)3 +、CN、OSO3 -酯、OPO3 2-酯及其组合组成的组，和
其中，所述水溶性增强基团和所述反应基团，通过至少一个共价键附接到所述主链结构。
13.根据权利要求1至12中至少一项所述的方法，其特征在于，具有水溶性增强基团的所述保护基团包括至少两个水溶性增强基团，优选离子基团。
14.根据权利要求1至12中至少一项所述的方法，其特征在于，具有水溶性增强基团的所述保护基团精确地包括一个水溶性增强基团，优选离子基团。
15.根据权利要求1至14中至少一项所述的方法，其中，除保护伯胺基的基团之外，所述第二氨基酸或第二肽不包括任何保护基团。
16.一种肽，所述肽包括：具有水溶性增强基团的保护基团，所述保护基团与氨基结合；和，被活化或游离的羧基，优选被活化的羧基。
17.根据权利要求16所述的肽，离子结合到离子交换剂。
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