CN111763758B - 一种提高植物耐盐性的基因及其相关应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高植物耐盐性的基因及其相关应用，具体的涉及基因LOC8061775和LOC8069118，LOC8061775在耐盐植物中表达上调，LOC8069118在耐盐植物中表达下调，通过检测LOC8061775和LOC8069118的水平可以鉴定植物的耐盐性，同时通过改变LOC8061775和LOC8069118的水平改良植物的耐盐性。

Description

一种提高植物耐盐性的基因及其相关应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，一种提高植物耐盐性的基因及其相关应用。
背景技术
盐害是指土壤中可溶性盐过多时对植物造成的伤害，严重影响着作物的生产和农业发展，是当前最重要的逆境危害之一(杨微.盐碱化土壤中四种常见盐分对碱地肤的胁迫作用比较[D].东北师范大学，2007)。盐渍化土壤主要包含的盐有NaCl，Na2SO4等，含量一般为0.6％～10％，而一般情况下含盐量在0.2％～0.5％时就已经对植物的生长产生了不好的影响。盐害的形成主要是由于干早及半干早地区不合理灌溉导致地下水位升高，土壤水分大量的蒸散引起土壤含盐量升高，相应的全球上亿存在不同程度盐渍化的土地均分布在土壤蒸发量大，降水量少的干早、半干早地区和滨海地区(赵可夫，李法曾，张福锁.中国盐生植物[M].科学出版社，2013.)，随着全球生态环境的不断恶化和人类不合理活动的加剧，土壤盐渍化的速度也在日渐增加。我国盐渍化土壤面积约有1.16×108hm2，占可利用土地面积的4.88％(文虎.绿洲农田盐碱斑土壤表层盐分和pH值的光谱特征研究[D].新疆农业大学，2016.)，土壤盐渍化会对植物的生长受到影响，尤其造成大多数地区作物产量减少，与人类的土地问题、资源问题以及粮食问题息息相关，如今已经成为一个不能忽视的问题。
盐胁迫对植物的伤害主要是因为土壤含盐量超过了植物的耐盐阈值时，土壤中的高盐分、高离子浓度通过各个方面对植物的生长和发育造成不同程度的影响。植物的生长进程对盐胁迫非常敏感，盐分对植物造成的胁迫会影响植物的正常生长，生物量是植物对盐胁迫反应的综合体现，也是植物耐盐性的直接指标之一(***，贾媛，崔继哲.盐胁迫对植物的影响及植物盐适应性研究进展[J].中国农学通报,2009,25(4):124-128.)。LP Yi等(Yi L P,Ma J,Li Y.Impact of salt stress on the features and activities ofroot system for three desert halophyte species in their seedling stage[J].Science in China,2007,50(S1):97-106.)研究表明盐浓度高的时候会对囊果碱蓬、猪毛菜等盐生植物根和茎的生长造成抑制，生物量降低；TahirMahmood等(Mahmood T,Iqbal N,Raza H,et al.Growth modulation and ion partitioning in salt stressed sorghum(Sorghum bicolor L.)by exogenous supply of salicylic acid.[J].PakistanJournal of Botany,2010,42(5):3047-3054)研究表明盐胁迫会使得植物的地上部和地下部鲜重和干重等生物量显著降低。
随着生物技术的发展以及相关领域技术手段的日新月异，更多的逆境基因被发现。在盐胁迫下对高粱生育期的耐盐生理机制进行研究，可以作为高粱逆境筛选过程中具有鉴定性意义的生理指标，为高粱优质品种的筛选、推广种植及劣质土地的利用及改良提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供高粱耐盐基因及其在植物耐盐鉴定以及育种中的应用，促进阐明高粱耐盐性的表达机制，利用耐盐基因确立新的耐盐性品种培育。
为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
本发明提供了调控高粱耐盐胁迫的基因标志物，所述基因标志物选自：LOC8061775和/或LOC8069118。
本发明提供培育或鉴定具有耐盐性的植物的方法，该方法包括：以LOC8061775和/或LOC8069118的含量为指标，筛选具有耐盐性的植物。
进一步，使用核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术来检测LOC8061775或LOC8069118的含量。
作为优选的实施方式，使用包含特异性扩增LOC8061775或LOC8069118的引物来检测LOC8061775或LOC8069118的含量。
作为另一优选的实施方式，使用包含特异性识别LOC8061775或LOC8069118的探针来检测LOC8061775或LOC8069118的含量。
作为另一种优选的实施方式，使用包含特异性结合LOC8061775或LOC8069118的抗体来检测LOC8061775或LOC8069118的含量。
进一步，LOC8061775在耐盐植物中含量增加，LOC8069118在耐盐植物中含量降低。
本发明提供了一种提高植物耐盐性的方法，所述方法包括：增加目的植物中LOC8061775的含量，或降低目的植物中LOC8069118的含量。
进一步，增加目的植物中LOC8061775的含量或降低目的植物中LOC8069118的含量均是通过对所述目的植物中的LOC8061775或LOC8069118进行基因编辑实现。
本发明提供了基因标志物在鉴定、筛选耐盐植物及耐盐植物育种中的应用，所述基因标志物选自：LOC8061775和/或LOC8069118。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了LOC8061775在耐盐高粱中高表达，LOC8069118在耐盐高粱中低表达，通过检测LOC8061775和LOC8069118的含量，可以鉴定耐盐性植物，同时通过改变上述基因的含量(增加LOC8061775的含量或降低LOC8069118的含量)可以增加高粱的耐盐性，在高粱的改良中具有重要的应用前景。
附图说明
图1是分子标志物LOC8061775和LOC8069118在敏盐株和耐盐株中的表达情况图；其中，A是LOC8061775；图B是LOC8069118；
图2是LOC8061775和LOC8069118在盐胁迫中的表达情况图；其中，图A是LOC8061775，图B是LOC8069118。
具体实施方式
本发明通过对敏盐高粱和耐盐高粱进行转录组测序，利用遗传学手段来寻找耐盐和敏盐基因表达谱的差异，并同时通过盐胁迫试验检测盐响应的基因，挖掘耐盐的功能基因，解析其复杂的分子机理奠定理论基础，同时为耐盐高粱的鉴定以及育种提供重要的手段。本发明首次发现了耐盐基因LOC8061775和LOC8069118，其中LOC8061775在耐盐植物中高表达，LOC8069118在耐盐植物中低表达。
本发明的基因标志物使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。
核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。
核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。
在本发明中，“引物”是可以检测LOC8061775或LOC8069118的引物，例如是可以扩增具有包含一部分LOC8061775或LOC8069118基因的序列的区的序列。引物是正向引物和反向引物的引物对。引物包含LOC8061775或LOC8069118基因的核苷酸序列或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列、或者由在严格条件下能够与这些序列杂交的序列构成的核苷酸片段(优选DNA片段)，核苷酸数为5～50、优选10～30、进一步优选为15～25。使用引物通过PCR可以检测是否存在***片段。
在本发明中，“探针”包含LOC8061775或LOC8069118基因的核苷酸序列或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列、或者包含由在严格条件下能够与这些序列杂交的序列构成的核苷酸片段(优选DNA片段)，核苷酸数为5～50、优选10～30、进一步优选为10～25。通过使用该探针与由作为被检体的植物获得的核酸样品杂交，可以检测基因的含量。
本发明包含用于检测LOC8061775或LOC8069118基因的含量的探针和引物(优选至少一对引物组)。另外，还包含固定有探针的DNA芯片。而且，还包含用于检测LOC8061775或LOC8069118基因的***片段的包含探针、DNA芯片、引物等的试剂盒。
在本发明中，“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。
本发明提供了提高植物耐盐性的方法，通过利用基因工程学方法将本发明的基因标志物DNA或抑制剂导入植物宿主中，可以制作出具有耐盐胁迫的转化植物。作为将本发明的基因导入植物宿主中的方法，可以列举：土壤杆菌感染法等间接导入法；或电穿孔法、基因枪法、聚乙二醇法、脂质体法、微量注射法等直接导入法等。本领域技术人员可以适当选择适当的导入方法。
例如，在采用土壤杆菌感染法时，如下操作，可以制作出导入了本发明的DNA或抑制剂的转化植物。
最初，制作转化用重组载体，然后通过土壤杆菌进行转化。
转化用重组载体可如下获得：用适当的限制酶剪切包含本发明的LOC8061775基因的DNA，之后根据需要连接适当的接头，再***植物细胞用的克隆载体中即得。作为克隆用载体，可以使用pBE2113Not、pBI2113Not、pBI2113、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH、pBIG等双元(binary)载体系质粒，或pLGV23Neo、pNCAT、pMON200等中间载体系质粒。
使用双元载体系质粒时，在上述双元载体的边界序列(LB、RB)间***LOC8061775基因，在大肠杆菌中扩增该重组载体。然后，通过电穿孔法等将所扩增的重组载体导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacience)EHA105、C58、LBA4404、EHA101、C58C1RifR等中，再将导入了LOC8061775基因的土壤杆菌用于植物的转化即可。此外，还可以通过三者接合法调制包含本发明的LOC8061775基因的用于转化的土壤杆菌。即，将保有包含本发明的qNaCl3基因的质粒的大肠杆菌或保有辅助质粒(例如pRK2013)的大肠杆菌和土壤杆菌混合培养，之后在包含利福平和卡那霉素的培养基上进行培养，从而可以获得转化用的接合体土壤杆菌。
为了使作为外来基因的本发明的LOC8061775基因在植物体内表达，优选在LOC8061775基因的前后连接植物用的启动子、增强子、终止子等。作为在本发明中可利用的启动子，例如可以列举：来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、玉米的泛素启动子、胭脂氨酸合成酶(NOS)基因启动子、章鱼碱(OCT)合成酶基因启动子等。作为增强子，可以使用病毒起源的翻译增强子或植物起源的翻译增强子。作为病毒起源的翻译增强子，例如可以列举：烟草花叶病毒、苜蓿花叶病毒RNA4、雀麦花叶病毒RNA3、马铃薯病毒X、烟草蚀纹病毒等的序列。另外，作为植物起源的翻译增强子，可以列举：来自大豆的β-1,3-葡聚糖酶(Glu)的序列、来自烟草的铁氧化还原蛋白结合性亚单位(PsaDb)的序列等。作为终止子，例如可以使用来自花菜花叶病毒或来自胭脂氨酸合成酶基因的终止子等。但是，启动子、增强子、终止子并不限于上述的这些，只要是已知在植物体内起作用的启动子、增强子、终止子均可使用。连接这些启动子、增强子、终止子，使得想要表达的本发明的LOC8061775基因能够起作用。
而且，为了有效选择目标转化植物，优选使用选择标志物基因。作为选择标志物，可以列举卡那霉素耐性基因(NPTII)、对植物赋予抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(htp)基因和赋予双丙氨磷(bialaphos)抗性的草铵膦乙酰转移酶(bar)基因等。本发明的基因和选择标志物基因可以一起***单一载体中，也可以使用将这两种基因分别***单个的载体中而获得的两种重组DNA。
本发明中的抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。其中核酸抑制物选自：以LOC8069118或其转录本为靶序列、且能够抑制LOC8069118基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。蛋白结合分子选自：与LOC8069118蛋白特异性结合的物质，如能够抑制LOC8069118蛋白活性的抗体或配体。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1耐盐基因的筛选
1、实验材料
苗期极耐盐品种圪红(GH，00000601，河北)和极敏盐品种褐高粱(HGL，00013200，贵州)。
2、实验方法
2.1材料的处理
选用苗期耐盐品种(00000601)及盐敏感品种(00013200)种子，将蛭石装入育苗盘中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盘，播种深度约1cm，放入光照培养箱中，在25℃恒温、昼夜光照周期为12h/12h、70％湿度、光照强度200μmol·m-2·s-1条件下培养，约7天种子发芽，用1/2Hoagland营养液浇灌，待幼苗长至四叶一心期，迅速剪下幼苗叶片，液氮速冻，随后放入-80℃冰箱保存备用，每组设三个重复。
2.2转录组测序
叶片总RNA的提取纯化与质量评估、cDNA文库的构建、转录组测序工作交由北京百迈客生物科技有限公司完成。转录组测序平台使用Oxford Nanopore Technologies的PromethION测序平台。
2.2.1 RNA的提取与质量评估
液氮研磨幼苗叶片，使用天根生化的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒按说明书提取总RNA，用Nanodrop2000、Caliper LabChip GX对样品纯度、浓度、RNA完整性等指标进行检测。
2.2.2文库的构建与转录组测序
整个文库构建与测序工作根据牛津纳米孔技术公司(ONT)提供的方案，用1ug的总RNA经过SQK-PCS109***进行cDNA文库制备。简而言之，使用SuperScript IV第一链合成***(Invitrogen)进行全长mRNA逆转录，然后对cDNA进行PCR扩增反应14个循环，DNA聚合酶使用LongAmp热启动Taq DNA聚合酶(NEB)。对PCR产物进行FFPE DNA损伤修复和末端修复(NEB)，使用T4 DNA连接酶(NEB)进行测序接头连接。随即用Agencourt XP对DNA进行磁珠纯化。将最终的cDNA文库添加到FLO-MIN109流通池中，在百迈客生物科技有限公司(北京)的PromethION平台上测序。
2.2.3测序数据与质量控制
从原始下机序列中过滤序列中的低质量(长度小于500bp，Qscore小于7)序列和核糖体RNA序列，并根据识别序列两端是否存在引物得到全长序列。
全长序列用minimap2软件与参考基因组进行比对，通过比对信息进行聚类后，得到一致性序列。
合并每个样品的一致性序列，通过minimap2与参考基因组(Sorghum_bicolor_NCBIv3，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝sorghum)进行比对，对比对到参考基因组的读长序列进一步使用cDNA_Cupcake程序包(https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake)进一步去冗余，过滤identity小于0.9，coverage小于0.85的序列，合并仅5’端外显子有差异的比对。
2.2.4数据分析
1)新基因、SSR及转录因子的预测
使用TransDecoder软件(http://transdecoder.github.io/)预测转录本中编码区序列(Coding Sequence，CDS)，使用MISA软件鉴定转录组的简单重复序列(SimpleSequence Repeats，SSR)，用iTAK软件预测转录因子。
2)LncRNA预测
因长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)不编码蛋白，因此，通过对转录本进行编码潜能筛选，判断其是否具有编码潜能，从而可以判定该转录本是否为lncRNA。分别应用CPC分析、CNCI分析、CPAT、pfam蛋白结构域分析四种方法对新发现的转录本进行lncRNA的预测。CPC(Coding Potential Calculator)是基于序列比对的蛋白质编码潜能计算工具。CNCI(Coding-Non-Coding Index)分析是一种通过相邻核苷酸三联体特征区分编码-非编码转录本的方法。CPAT(Coding Potential Assessment Tool)分析是一种通过构建逻辑回归模型，基于ORF长度、ORF覆盖度，计算Fickett得分和Hexamer得分来判断转录本编码和非编码能力的分析方法。Pfam数据库是最全面的蛋白结域注释的分类***构。
3)基因功能的注释分类
主要利用NR(NCBI non-redundant protein sequences)数据库，该数据库是NCBI中的非冗余蛋白质数据库；Pfam(Protein family)数据库是最全面的蛋白结构域注释的分类***；COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)数据库是对基因产物进行同源分类的数据库；KOG(euKaryotic Ortholog Groups)数据库是针对真核生物，基于基因直系同源关系，结合进化关系将来自不同物种的同源基因分为不同的Ortholog簇；Swiss-Prot(Amanually annotated and reviewed protein sequence database)数据库是由EBI(欧洲生物信息学研究所)负责维护的数据库，包含了有相关参考文献且经过校对的蛋白质注释信息数据库，可信度很高；KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是***分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物功能的数据库；GO(Gene Ontology)数据库是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表来全面描述生物体中基因和基因产物的功能属性。
4)转录表达水平的定量与差异表达分析
转录组测序可以模拟成一个随机抽样的过程，为了让片段数目能真实地反映转录本表达水平，需要对样品中的Mapped Reads的数目进行归一化。采用CPM(counts permillion)作为衡量转录本或基因表达水平的指标，CPM计算公式如下(“reads mapped totranscript”表示比对到某一转录本上的reads数目；“total reads aligned in sample”表示比对到参考转录组的片段总数)：
Figure BDA0002590523700000101
使用DESeq R软件包(1.18.0)和EBSeq软件对盐胁迫下不同处理时间、不同品种幼苗叶片进行差异表达分析。在此过程中，Fold Change≥2且FDR<0.01作为筛选标准。符合筛选条件的基因为差异表达基因。差异倍数(Fold Change)表示两样品(组)间表达量的比值。FDR(False Discovery Rate)是通过对差异显著性p值(p-value)进行校正得到的。由于转录组测序的差异表达分析是对大量的转录本表达值进行独立的统计假设检验，会存在假阳性问题，因此在进行差异表达分析过程中，采用了公认的Benjamini-Hochberg校正方法对原有假设检验得到的显著性p值(p-value)进行校正，并最终采用FDR作为差异表达转录本筛选的关键指标。
5)差异表达基因的功能富集分析
差异表达基因的功能富集分析主要包括GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析是通过GOseq R程序包完成，KEGG通路富集分析由KOBAS软件进行分析。
6)数据的统计与图形绘制
差异表达基因的韦恩图统计、GO注释分类、KEGG富集分析图形绘制使用百迈客云分析平台完成，GO富集分析图使用ggplot2 R程序包完成，样本表达量相关性分析聚类热图、盐胁迫响应基因差异表达热图绘制使用pheatmap R程序包完成，差异表达基因统计、转录因子统计柱形图使用origin 8.5完成，使用EXCEL 2016进行数据统计，其他图形绘制由百迈客生物科技公司提供完成。
2.3 qRT-PCR验证
使用金百特生物的RT Kit With gDNA Eraser试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA,反转录体系以及步骤如下：
Figure BDA0002590523700000111
依次加入，在加入5×RT MasterMix之前，轻轻混匀，42℃孵育2min，全部加入后，轻轻混匀，42℃孵育20min,85℃加热5s。置冰上，合成的cDNA用于qRT-PCR，使用前加180μLddH2O稀释至终浓度约为5ng/μL。
随机选取6个差异表达基因，使用ABI 7300Real-Time PCR System(USA)进行qRT-PCR，验证转录组测序数据的准确性，使用金百特生物2×Sybr Green qPCR Mix(High ROX)试剂，反应液配制在冰上进行，PCR反应液体系如下：
Figure BDA0002590523700000112
qRT-PCR反应程序设置如下：
反应条件 循环数
94℃3min 1
94℃10s，60℃34s 40
Dissociation Stage
qRT-PCR引物设计使用NCBI Primer Blast工具完成，具体引物信息见表1，引物序列由北京擎科生物公司合成。使用Sorbi.3007G140700(GAPDH)基因作为内参基因，使用2-ΔΔCt相对定量方法以耐盐品种和敏盐品种非处理样本为对照进行表达定量，每个样本三个重复。
表1 qRT-PCR选用基因及引物序列
Figure BDA0002590523700000113
Figure BDA0002590523700000121
2.4结果与分析
2.4.1 RNA质量检测
转录组测序对于RNA的质量要求很高，良好的RNA质量是获得可靠测序数据的前提，经Nanodrop2000、Caliper LabChip GX对总样品进行检测，结果显示8.2<RIN<8.6，2.11<OD260/OD280<2.16，28S/18S在1.3到1.6之间，说明总RNA质量较高，完整性较好，能够满足构建cDNA文库需求。
2.4.2测序数据质量
对总样品进行全长转录组测序，每个样品测序产出clean data均达到6.38GB,过滤短片度和低质量的reads后的信息见表2得到的clean read数从6319936到10297642不等，N50在1134-1282之间，平均质量值在Q9以上，总的clean data去除核糖体RNA(ribosomeRNA，rRNA)并通过reads两端的引物序列鉴定全长(full length)序列详见表3，每个样品得到的全长,率均在80％以上。将clean reads与参考基因组进行比对，比对统计结果见表3，比对上的序列为99.47％以上。
表2总样品的clean data数据统计
Figure BDA0002590523700000122
Figure BDA0002590523700000131
表3总样品全长序列数据统计表
Figure BDA0002590523700000132
2.4.3两个品种的基因表达情况分析
对耐盐品种圪红(GH)和敏盐品种(HGL)全部样本进行全长转录组测序分析，与敏盐品种相比，呈现显著性差异的有604个基因，其中，显著上调的有212个，显著下调的有392个。
LOC8061775在耐盐高粱中显著上调(图1A)，LOC8069118在耐盐高粱中显著下调(图1B)，说明LOC8061775和LOC8069118作为可能的耐盐基因在植物的耐盐中起着重要的作用。
2.4.5 qRT-PCR验证分析
随机挑选6个差异表达基因进行定时荧光定量PCR以验证转录组数据的准确性，结果显示，6个差异表达基因与转录组测序结果中的表达量变化倍数趋势基本一致，说明转录组测序数据准确可靠。
实施例2耐盐基因对盐胁迫的响应
1、材料处理
选用盐敏感品种(00013200)种子，将蛭石装入育苗盘中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盘，播种深度约1cm，放入光照培养箱中，在25℃恒温、昼夜光照周期为12h/12h、70％湿度、光照强度200μmol·m-2·s-1条件下培养，约7天种子发芽，用1/2Hoagland营养液浇灌，待幼苗长至四叶一心期，开始用含有150mmol·L-1NaCl溶液胁迫处理幼苗，分别设胁迫处理时间梯度为0h(CK)、6h、24h、48h，每个处理三个重复。为保持盐胁迫浓度，处理NaCl溶液每24h更新一次。胁迫处理结束，迅速剪下幼苗叶片，液氮速冻，随后放入-80℃冰箱保存备用。
2、转录组测序及数据分析方法同实施例1。
3、结果
结果显示，敏盐株在适应盐胁迫的过程中，随着时间的推移，LOC8061775基因的水平逐渐增加(48h>24h>6h>0h)，接近LOC8061775在耐盐株的表达水平(图2A)，LOC8069118基因的水平逐渐降低(0h>6h>24h>48h)，接近LOC8069118在耐盐株中的表达水平(图2B)；同耐盐株与敏盐株的基因表达趋势一致，说明LOC8061775和LOC8069118是耐盐基因。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种提高植物耐盐性的基因及其相关应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtgatgtcg cttcacctca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctttgctccg tgtgtctcct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcatcacta cgcaggaggc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgctagattc ttcagctgct cc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtacggccgg tcgtcattat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tattgcatag ccccctgctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actacgctgt gatacgcctg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggatcggagg agcaaaggac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaaaacggga tgggggacat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacgttcgct ccggaatcta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccactggaca gagacagagc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atacgcatac acggcacgat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taaacctgcc gtcaccatcc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtacaggcag agctgaggtg 20

Claims (6)

1.鉴定具有耐盐性的高粱的方法，其特征在于，该方法包括：以LOC8061775和/或LOC8069118的表达水平为指标，筛选具有耐盐性的高粱，LOC8061775在耐盐高粱中表达水平增加，LOC8069118在耐盐高粱中表达水平降低。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术来检测LOC8061775或LOC8069118的表达水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，使用特异性扩增LOC8061775或LOC8069118的引物来检测LOC8061775或LOC8069118的表达水平。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，使用特异性识别LOC8061775或LOC8069118的探针来检测LOC8061775或LOC8069118的表达水平。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，使用特异性结合LOC8061775或LOC8069118表达产物的抗体来检测LOC8061775或LOC8069118的表达水平。
6.基因标志物LOC8061775或LOC8069118在鉴定、筛选耐盐高粱中的应用，LOC8061775在耐盐高粱中表达水平增加，LOC8069118在耐盐高粱中表达水平降低。
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