CN111763747B - 一种适合于南部海区常见砗磲种类鉴定的通用单引物、试剂盒和鉴别方法 - Google Patents

一种适合于南部海区常见砗磲种类鉴定的通用单引物、试剂盒和鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适合于南部海区常见砗磲种类鉴定的通用单引物、试剂盒和鉴别方法。本发明建立了利用多条下游引物竞争性退火的通用单引物多重PCR检测和鉴别5种我国南部海区常见砗磲科物种(无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝)的方法，并经实际样本测试，具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。

Description

一种适合于南部海区常见砗磲种类鉴定的通用单引物、试剂 盒和鉴别方法
技术领域：
本发明属于水产生物中的分子鉴别技术领域，具体涉及一种利用通用单引物多重PCR技术快速鉴定我国南部海区常见砗磲种类的PCR试剂盒及其鉴别方法。
背景技术：
砗磲隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)，帘蛤目(Veneroida)，砗磲科(Tridacnidae)，是一类热带大型海洋珊瑚礁底栖贝类，也是海洋中最大的双壳贝类。砗磲与其他双壳贝类的最大区别是发育***到稚贝期阶段与虫黄藻建立了共生关系，其生长所需的大部分营养来自于虫黄藻的光合作用，这一特性使砗磲可以直接利用热带海域的无机营养盐，从而使砗磲具有较高的生态价值。另外砗磲也属于高经济价值物种，是热带海洋生物和渔业经济的物质基础，提供水族观赏、工艺材料、水产食品等资源。
不同砗磲的成体间主要通过比较壳上的放射肋、稜鳞的数量和分布以及外套膜的花纹等特征来进行鉴定，但贝壳具有较强的可塑性，在发育过程中存在中间形态和中间生境，造成砗磲科不同种难于区分。另外在砗磲幼体发育阶段，形态特征十分相似，更加难于区分。目前主要是基于COI、16S rDNA线粒体基因序列差异的分子生物学被用于砗磲种间鉴定，但这些基因序列之间差异比较小，难以用电泳等简单方法进行区分。急需一种简单高效的方法对我国南部海区常见砗磲种类个体进行大规模物种鉴定。
通用单引物多重PCR(common single primer multiplex polymerase chainreaction，CSP-M-PCR)是在一个PCR体系中加入一条通用性引物和多条特异性引物，只有含有与特异性引物配对的序列才能被扩增出来，通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后与标准片段大小作比较，从而对物种进行鉴定。通用单引物多重PCR具有高效、快速、节约、鉴定结果十分可靠的特点，在物种鉴定的方面广泛运用。
发明内容：
本发明目的是提供一种适合于我们南部海区常见砗磲科物种无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝鉴定的通用单引物、多重PCR试剂盒及其方法。本发明中利用该方法对无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝各40个个体进行了分析并发现鉴定效果显著。
本发明的适合于我们南部海区常见砗磲科物种无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝鉴定的通用单引物，具体如下：
上游引物F1:ATTGTAGAGCATCATTCAGG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
下游引物R1:TCCAACTGTAAATAAACCAAC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
下游引物R2:TAATGGAAATGGGCTACTACG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
下游引物R3:TAAGTGGCCCCTCAACTGAAG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
下游引物R4:CGTGGCATGCCTGACAGA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
下游引物R5:TATCTACGTCTAACCCTACC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二个目的是提供一种快速鉴定我们南部海区常见砗磲科物种无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝的试剂盒，其包括上述通用单引物和PCR反应试剂。
本发明的第三个目的是提供一种快速鉴定我们南部海区常见砗磲科物种无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝的鉴别方法，包括以下步骤：
提取待测样品的基因组DNA，用上述通用单引物进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，待检样品扩增出144bp条带的，判定为砗蚝；待检样品扩增出212bp条带的，判定为长砗磲；待检样品扩增出285bp条带的，判定为无鳞砗磲；待检样品扩增出367bp条带的，判定为鳞砗磲；待检样品扩增出545bp条带的，判定为诺瓦砗磲。
优选，所述的PCR反应体系的总体积为25μL，包含dNTP Mixture 4μl、10x buffer2.5μl、MgCl2 1μl、上游引物F1 2μl、下游引物R1-R2、R4-R5各0.5μl、下游引物R3 1μl、模板DNA 3.8μl、Taq酶0.5μl、ddH2O 8.2μl。各组分的终浓度为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，上游引物F1 0.2mM,下游引物R1-R2、R4-R5各0.05mM，下游引物R3 0.1mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。
所述的PCR反应程序为：
94℃预变性2min，94℃变性20s，56℃退火30s，68℃延伸45s，变性至延伸三个步骤重复30次，68℃延伸7min。
PCR扩增产物置于2％琼脂糖凝胶电泳进行分型。
结果判定，对待检样品与阳性对照品分析结果进行比对，待检样品与阳性对照同时扩增出144bp条带的，判定为砗蚝；待检样品与阳性对照同时扩增出212bp条带的，判定为长砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出285bp条带的，判定为无鳞砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出367bp条带的，判定为鳞砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出545bp条带的，判定为诺瓦砗磲。
本发明建立了利用多条下游引物竞争性退火的通用单引物多重PCR检测和鉴别5种我国南部海区常见砗磲科物种(无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝)的方法，并经实际样本测试，具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
附图说明
图1为本发明标准品阳性对照及砗磲样品的通用单引物多重PCR扩增产物电泳图，其中：1、砗蚝阳性对照(Hippopus hippopus)；2、长砗磲阳性对照(Tridacna maxima)；3、无鳞砗磲阳性对照(Tridacna derasa)；4、鳞砗磲阳性对照(Tridacna squamosa)；5、诺瓦砗磲阳性对照(Tridacna noae)；6、砗蚝和长砗磲混合样本；7、砗蚝和无鳞砗磲混合样本；8、砗蚝和鳞砗磲混合样本；9、砗蚝和诺瓦砗磲混合样本；10、长砗磲和诺瓦砗磲混合样本；11、长砗磲和无鳞砗磲混合样本；12、无鳞砗磲和鳞砗磲混合样本；13、长砗磲和鳞砗磲混合样本；14、无鳞砗磲和诺瓦砗磲混合样本；15、鳞砗磲和诺瓦砗磲混合样本；M、100bp Marker。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
参见图1，用消毒后的镊子和小剪刀分别从无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝外套膜上剪取少量组织。向装有外套膜组织的离心管中加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，在振荡器上混匀，55℃水浴消化，直至组织完全溶解得到第一溶液。加入等体积饱和酚(200μl)、氯仿/异戊醇(24:1)(200μl)混合液抽提三次，每次10000rpm离心10-15min，用移液器吸取上清液。将1mL预冷的无水乙醇加入装有上清液的离心管中，过夜沉淀。最后经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于200μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。由此分别得到无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝的基因组DNA。从五种砗磲提取DNA稀释液中各抽取部分进行两两混合作为模板进行物种鉴定。
以五种砗磲的基因组DNA，以及它们基因组两两混合模板进行PCR扩增反应。PCR反应体系的总体积为25μL，其中PCR体系中各种成分的含量如下表。
Figure BDA0002583777180000041
其中引物序列为：
上游引物F1:ATTGTAGAGCATCATTCAGG
下游引物R1(针对T.derasa):TCCAACTGTAAATAAACCAAC
下游引物R2(针对T.squamosa):TAATGGAAATGGGCTACTACG
下游引物R3(针对T.maxima):TAAGTGGCCCCTCAACTGAAG
下游引物R4(针对T.noae):CGTGGCATGCCTGACAGA
下游引物R5(针对H.hippopus):TATCTACGTCTAACCCTACC
反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性20s，56℃退火30s，68℃延伸45s，变性至延伸三个步骤重复30次，68℃延伸7min。PCR扩增产物置于2％琼脂糖凝胶电泳进行分型，以100bp Marker为标准分子参照。电压150v电泳10分钟，然后100v电泳20分钟。电泳结果用紫外凝胶成像***分析。根据电泳结果与阳性对照进行比对，如图1所示，从电泳检测结果可知：1、砗蚝阳性对照(H.hippopus)；2、长砗磲阳性对照(T.maxima)；3、无鳞砗磲阳性对照(T.derasa)；4、鳞砗磲阳性对照(T.squamosa)；5、诺瓦砗磲阳性对照(T.noae)；6、砗蚝和长砗磲样本；7、砗蚝和无鳞砗磲样本；8、砗蚝和鳞砗磲样本；9、砗蚝和诺瓦砗磲样本；10、长砗磲和诺瓦砗磲样本；11、长砗磲和无鳞砗磲样本；12、无鳞砗磲和鳞砗磲样本；13、长砗磲和鳞砗磲样本；14、无鳞砗磲和诺瓦砗磲样本；15、鳞砗磲和诺瓦砗磲样本；M、100bp Marker。
结果判定，对待检样品与阳性对照品分析结果进行比对，待检样品与阳性对照同时扩增出144bp左右条带的，判定为砗蚝；待检样品与阳性对照同时扩增出212bp左右条带的，判定为长砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出285bp左右条带的，判定为无鳞砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出367bp左右条带的，判定为鳞砗磲；待检样品与阳性对照同时扩增出545bp左右条带的，判定为诺瓦砗磲。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种适合于南部海区常见砗磲种类鉴定的通用单引物、试剂盒和鉴别方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attgtagagc atcattcagg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccaactgta aataaaccaa c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatggaaat gggctactac g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taagtggccc ctcaactgaa g 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtggcatgc ctgacaga 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatctacgtc taaccctacc 20

Claims (5)

1.一种适合于我国南部海区常见砗磲科物种无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝鉴定的引物组，其特征在于，具体如下：
上游引物F1: ATTGTAGAGCATCATTCAGG；
下游引物R1: TCCAACTGTAAATAAACCAAC；
下游引物R2: TAATGGAAATGGGCTACTACG；
下游引物R3: TAAGTGGCCCCTCAACTGAAG；
下游引物R4: CGTGGCATGCCTGACAGA；
下游引物R5: TATCTACGTCTAACCCTACC。
2.一种快速鉴定我国南部海区常见砗磲科物种无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的引物组和PCR反应试剂。
3.一种快速鉴定我国南部海区常见砗磲科物种无磷砗磲、鳞砗磲、长砗磲、诺瓦砗磲和砗蚝的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测砗磲样品的基因组DNA，用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增，得到扩增产物，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，待检样品扩增出144bp条带的，判定为砗蚝；待检样品扩增出212bp条带的，判定为长砗磲；待检样品扩增出285bp条带的，判定为无鳞砗磲；待检样品扩增出367bp条带的，判定为鳞砗磲；待检样品扩增出545bp条带的，判定为诺瓦砗磲。
4. 根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR反应体系的总体积为25μL，包含DNA模板50ng，Buffer 10 mM，上游引物F1 0.2mM, 下游引物R1-R2、R4-R5各0.05mM，下游引物R3 0.1mM，dNTP 0.2 mM，Mg2+ 2.0 mM，Taq DNA聚合酶 1U，用灭菌水补足25μL。
5.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性20s，56℃退火30s，68℃延伸45s，变性至延伸三个步骤重复30次，68℃延伸7min。
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