CN111763701A - 一种天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,该方法包括步骤1,将天然富硒农产品粉碎、浸提、离心;步骤2,用超滤膜过滤浸提液,得硒核酸粗提物、硒多糖粗提物和硒多酚粗提液;将沉淀提取、离心,提取液调节pH,离心、分离,酸脱蛋白,涡旋和离心,沉淀加入Tris‑HCl缓冲液提取,间隔地加入胰蛋白酶和蛋白酶K,恒温震荡酶解,离心上清液得硒代氨基酸提取液;步骤4,在硒多酚粗提液加入环己烷、饱和氯化钠处理之后再处理得硒多酚的易挥发组分和不挥发组分;步骤5,硒核酸粗提物用NaCl溶液抽提、pH调节、静置、分离、清洗和干燥得硒核酸;硒多糖粗提物草酸溶液过滤,滤液合并加入乙醇,静置后分离沉淀,清洗得硒多糖。
Description
技术领域
本发明涉及有机硒提取技术领域,具体为一种天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法。
背景技术
硒元素为人体必需的14种微量元素之一,因其为红细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的组成物质且具有清除自由基、抗炎、抗肿瘤、抗脂质氧化、防癌抗癌、抗衰老、养肝护肝、延长寿命、提高机体免疫力等生理调节功能,同时能够预防心血管疾病和心肌梗塞的发生,并对重金属有一定解毒作用,故被世界卫生组织和中华医学会定为继碘、锌后的第三大微量营养保健元素。硒为典型的双功能元素,食品中硒的毒性和生物利用性不仅取决于硒的总浓度水平,而且在很大程度上取决于硒的化学形态。硒的不同化学形态对人体的吸收、生物效应、毒性及防癌作用不同。无机硒主要以四价和六价存在,具有含量高、生物活性与利用率较低,毒性大等特点,摄入过量会导致急性或慢性中毒,例如硒酸盐和***盐会导致生物体病变;与无机硒相比,有机硒通常为经生物转换而得的负二价产物,具有含量低、毒性小、生物利用度高等特点,此外,硒的所有生物学功能均是通过硒蛋白来调控和实现的,例如硒代蛋氨酸是人类摄取硒元素的主要来源。
天然富硒农产品在前处理过程中,受温度、样品浓度、pH、离子强度和贮存容器材质的影响会发生硒化物的化学形态转化、吸附、挥发等现象,采用现有的方法会导致待测样品中硒元素形态与含量测定不准确。二甲基硒、二甲基二硒为易挥发性成分,在总硒含量分析时,通常采用湿法消解,以回流加热、添加Cu2+、微波消解三种途径解决挥发性硒化物的损失。此外,如硒代蛋氨酸、硒半胱氨酸和三甲基硒等化合物具有耐酸解的特性,采用湿法消解技术可将其消解为无机硒,但转化率低,而采用紫外光辐射氧化消解法处理样品,硒代蛋氨酸、三甲基硒等化合物可完全转化为无机硒。所以,对于有机硒化合物,尚无一种普遍适用的消解方法。
硒多糖是硒与植物多糖结合在一起的有机化合物,通常采用超滤法、醇沉淀法和超声-微波提取法。为了避免共体蛋白中硒元素对硒多糖含量干扰,需要增加脱蛋白步骤,常选用Sevag法,利用蛋白质在有机溶剂中变性的特点,将硒多糖提取液与氯仿-正丁醇(5:1,v:v)溶剂混合,振荡离心后,变性后的蛋白质介于氯仿-正丁醇溶液的交界处,反应条件温和,硒多糖不损失。硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸以共价键形式构成硒蛋白,通常采用酶解法提取,可得到硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸等化合物。γ-谷氨酰硒甲基硒代半胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸等硒代氨基酸为水溶性,采用酶解法的话分解的过程慢且条件严格,操作繁琐,可用温水提取。
综上所述,目前还没有将天然富硒农产品中的有机硒,即硒多糖、硒代氨基酸以及硒核酸、硒多酚逐级提取的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的不足,本发明提供了一种天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,操作简便,提取成本低,最大限度降低了不同性质的物质相互干扰以及基质对硒代化合物分析的影响,对天然富硒农产品中硒代氨基酸、硒蛋白、硒核酸以及硒多糖等多种硒代结构实现广谱提取。
本发明是通过以下技术方案来实现:
一种天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,包括以下步骤:
步骤1,先将待提取的天然富硒农产品粉碎后,得到粉末,使用超纯水对粉末进行浸提,得到混合体系a,再将混合体系a离心后分离沉淀,得到沉淀物a和浸提液a;
步骤2,将沉淀物a使用超纯水进行浸提,得到混合体系b,再将混合体系b离心后分离沉淀,得到沉淀物b和浸提液b,将浸提液b与浸提液a合并后得到浸提液A;
步骤3,用两种不同孔径的超滤膜对浸提液A进行过滤,依次得到硒核酸粗提物、硒多糖粗提物和硒多酚粗提液;
按以下步骤对沉淀物b进行处理,得到硒代氨基酸提取液;
步骤3a,先将沉淀物b用NaOH溶液超声提取,得到混合体系c,再将混合体系c离心后分离沉淀,得到沉淀物c和提取液a,将沉淀物c用NaOH溶液超声提取,得到混合体系d,再将混合体系d离心后分离沉淀,得到提取液b,将提取液a和提取液b合并后得到提取液A;
步骤3b,调节提取液A的pH至硒蛋白的等电点,得到调节液;
步骤3c,将调节液离心后分离得到沉淀物d,再对沉淀物d进行酸脱蛋白处理,得到酸处理液;
步骤3d,将酸处理液依次涡旋和离心,得到沉淀物e;
步骤3e,在沉淀物e中加入Tris-HCl缓冲液进行超声提取,之后间隔性地加入胰蛋白酶和蛋白酶K,在恒温下震荡酶解,最后离心上清液得到硒代氨基酸提取液;
步骤4,依次采用步骤41a和步骤41b将硒多酚粗提液进行处理,得到硒多酚的易挥发组分和硒多酚的不挥发组分;采用步骤42将硒核酸粗提物进行处理,得到硒核酸;采用步骤43将硒多糖粗提物进行处理,得到硒多糖,完成天然富硒农产品中有机硒的逐级提取;
步骤41a,在硒多酚粗提液中加入环己烷进行涡旋混合,之后加入饱和氯化钠水溶液,振荡后在0~4度下离心,得到环己烷层和饱和NaCl层;
步骤41b,将环己烷层用环己烷-乙酸乙酯定容,得到硒多酚的易挥发组分;在饱和NaCl层中加入乙腈振荡提取后离心,将得到的混合液中的杂质去除,得到硒多酚的不挥发组分;
步骤42,先在硒核酸粗提物中加入NaCl溶液,将得到的混合体系e抽提后过滤,得到沉淀物f和滤液a,将沉淀物f按照硒核酸粗提物的处理方式重复2~4次,将得到的滤液与滤液a合并,得到滤液A,再将滤液A的pH调节至2~4,之后将调节pH后的滤液A在0~6℃下静置后分离沉淀,最后将该沉淀依次清洗和干燥,得到硒核酸;
步骤43,先在硒多糖粗提物中加入草酸溶液,将得到的混合体系f提取后过滤,得到沉淀物g和滤液b,将沉淀物g按照硒多糖粗提物的处理方式重复2~4次,将得到的滤液与滤液b合并,得到滤液B,再在滤液B中加入乙醇,之后将得到的混合液在0~6℃下静置后分离沉淀,最后将该沉淀清洗得到硒多糖。
优选的,步骤1中粉末与超纯水的比例为5g:25mL;步骤2中的超纯水用量与步骤1的超纯水用量相同。
优选的,步骤3先用50kDa孔径的超滤膜过滤浸提液A,将所述超滤膜上得到的固体冷冻干燥得到硒核酸粗提物,将得到的过滤液a用10kDa孔径的超滤膜过滤,将10kDa孔径的超滤膜上得到的固体冷冻干燥得到硒多糖粗提物,得到的过滤液b为硒多酚粗提液。
优选的,步骤3a中所述NaOH溶液中NaOH与步骤1中所述的粉末的比例为0.45mmol:5g;步骤3a中超声提取沉淀物b的NaOH用量与超声提取沉淀物c的NaOH用量相同。
优选的,步骤3b中用0.1mol/L的盐酸将提取液A的pH调节至4.0。
优选的,步骤3c中采用质量分数为5%的硝酸对沉淀物d进行酸脱蛋白,所述的硝酸与沉淀物d的比例为4mL:1g。
优选的,步骤3e中,所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.1mmol/L,pH为7.5,该Tris-HCl缓冲液与沉淀物d的比例为10mL:1g。
进一步,步骤3e对沉淀物e超声提取后,每隔8h依次加入胰蛋白酶和蛋白酶K,胰蛋白酶、蛋白酶K和Tris-HCl缓冲液的比例为4mg:3mg:10mL;
步骤3e所述的恒温为37℃,在该温度下震荡酶解24h。
优选的,步骤42中,NaCl溶液中NaCl与硒核酸粗提物的比例为0.05mol:1g;混合体系e在抽提时在沸水浴中进行。
优选的,步骤43中所述的草酸溶液中草酸的质量分数为3%,该草酸溶液与硒多糖粗提物的比例为5mL:1g,乙醇与草酸溶液的体积比为:3:1。
相对于现有技术,本发明具有以下有益的技术效果:
本发明一种天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,根据天然富硒农产品中有机硒的组成,按照蛋白质—核酸—多糖—小分子化合物的性质选择溶剂提取体系中的提取溶剂和提取方式,建立了有机硒***化溶剂的逐级提取方法;先将待提取的天然富硒农产品粉碎后通过浸提处理成浸提液和沉淀,该浸提液可通过两种不同孔径的超滤膜进一步分离成硒核酸粗提物、硒多糖粗提物和硒多酚粗提液,而沉淀可通过预处理和酶解处理得到硒代氨基酸提取液,之后可将硒多酚粗提液进行处理,得到硒多酚的易挥发组分和硒多酚的不挥发组分;可将硒核酸粗提物进行处理,得到硒核酸;可将硒多糖粗提物进行处理,得到硒多糖,操作简便,提取成本低,能够准确分离提取出硒代氨基酸、硒蛋白、硒核酸以及硒多糖等多种化合物结合形式的农产品有机硒,且实用性广泛,对不同类型农作物或农产品均有高效的提取效果。本发明建立的天然富硒农产品有机硒提取方法可反映出富硒农产品中硒元素的生物效价及其毒性信息,不仅对评价和鉴别天然富硒农产品的安全性和质量有重大意义,还对开发新型富硒食品起到一定促进作用。
附图说明
图1为本发明所述的***化逐级提取流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明原理及优势进行解释和说明,以便本领域技术人员更好的理解本发明。下述说明仅是示例性的,并不对其内容进行限定。
本发明一种天然富硒农产品中有机硒的***化逐级提取方法,如图1所示,包括以下步骤:
步骤1,对粉碎后富硒农产品样品进行浸提,农产品包括植物产品和动物产品;
具体地,富硒农产品冷冻干燥后打碎成粉过筛,称取一定量的粉末于离心管中,加入超纯水后超声浸提,浸提完成后离心,取其上清液,沉淀重复上述操作,合并上清液,即浸提液,该浸提液用于分离硒多糖与硒核酸、硒多酚,沉淀用于硒代氨基酸的提取。
步骤2,运用超滤法,选用不同孔径的超滤膜对浸提液进行处理,有效分离大分子目标物(即硒多糖、硒核酸)与小分子目标物(即硒多酚);
具体地,先选用50kDa孔径的超滤膜过滤浸提液,将超滤膜上得到的固体冷冻干燥得到硒核酸粗提物,硒核酸得以分离,之后将过滤液用10kDa孔径的超滤膜过滤,将超滤膜上得到的固体冷冻干燥得到硒多糖粗提物,硒多糖得以分离,而过滤液则为硒多酚粗提液。
步骤3,对小分子目标化合物采用液液萃取,得到易挥发组分和不挥发组分;
具体地,一般仅移取一部分硒多酚粗提液于离心管中,加入环己烷进行溶解,涡旋混合,再加入饱和氯化钠水溶液,振荡后在0~4度的低温条件下离心,以防止硒多酚氧化,离心后将上清液分离为环己烷层和饱和NaCl层。
取环己烷层转移至容量瓶中,用环己烷-乙酸乙酯定容,此为小分子目标化合物部分的易挥发组分。
取饱和NaCl层,在其中加入乙腈,振荡提取后离心,取乙腈萃取液过0.22μm滤膜,除去杂质后的滤液为小分子目标化合物部分的不挥发组分。
步骤4,在硒核酸粗提物中加入NaCl溶液,沸水浴中抽提后过滤,重复2~4次合并滤液,运用醋酸调节pH至2~4,在0~6℃下静置后离心分离沉淀,运用乙醇冲洗后,真空冷冻干燥得到硒核酸。
在硒多糖粗提物中加入草酸溶液后沸水浴提取和过滤,重复提取2~4次,合并滤液后,加入乙醇,在0~6℃下静置,离心分析沉淀,运用乙醇洗涤后,得到硒多糖。
步骤5,硒蛋白位于沉淀部分,运用NaOH溶液超声提取,离心移除取上清液,沉淀再提取,合并2次的提取液,用盐酸溶液调节提取液的pH至硒蛋白的等电点,离心后,沉淀部分为硒蛋白。在硒蛋白中先加入硝酸溶液进行酸脱蛋白,涡旋、离心之后在沉淀部分加入Tris-HCl缓冲液、胰蛋白酶和蛋白酶K,在恒温条件下震荡酶解后,加入甲酸终止酶解,离心后上清液即为硒代氨基酸提取液。
下面以富硒黑蒜为例进行具体说明。
实施例
一种天然富硒农产品中有机硒的***化逐级提取方法中,样品提取包括以下步骤:
步骤1,将富硒黑蒜冷冻干燥后打碎成粉,过100目筛后,称取5g于50mL锥形瓶中,加入25mL超纯水超声浸提60min后,离心取上清液,将沉淀重复上述操作,合并2次浸提的上清液用于分离硒多糖与硒核酸、硒多酚,沉淀用于硒代氨基酸的提取;
步骤2,使用50kDa孔径的超滤膜过滤浸提液,4000r/min条件下离心25min,冷冻干燥滤膜上的固体得到硒核酸粗提物,滤液中的硒多糖与硒多酚可通过10kDa孔径的超滤膜分离,4000r/min条件下离心25min得到硒多酚粗提液,冷冻干燥滤膜上的固体得到硒多糖粗提物;
步骤3,取5mL硒多酚粗提物于50mL具塞离心管中,加入20mL环己烷进行溶解,100rpm速度条件下涡旋混合90s,再加入10mL饱和氯化钠水溶液,振荡30min,以10000r/min在3度下离心10min,取有机层转移至25mL容量瓶中,用环己烷-乙酸乙酯(1:1,v:v)定容至25mL,此为硒多酚中的易挥发组分;
在饱和氯化钠层中加入5mL乙腈,振荡提取10min,10000r/min常温离心10min后,乙腈萃取液过0.22μm滤膜的滤液为硒多酚中不挥发组分;
步骤4,取硒核酸粗提物1g,加入20mL 2.5mol/L的氯化钠水溶液,沸水浴中抽提后过滤,重复2次合并滤液,运用醋酸调节pH至2,在冰箱中于4℃下静置12h,离心分离沉淀,运用95%乙醇冲洗3次后,真空冷冻干燥得到硒核酸;
取硒多糖粗提物1g,加入5mL 3%草酸溶液,沸水浴提取30min,过滤,重复提取3次,合并滤液后,加入15mL 95%乙醇,在冰箱中于4℃下静置12h,6000r/min离心10min后分析沉淀,运用20mL 85%乙醇洗涤2次后,得到硒多糖;
步骤5,在步骤1的沉淀中加入5mL 0.09mol/L的NaOH溶液超声提取25min,离心后取其上清液,沉淀再次提取,合并2次提取液,用0.1mol/L盐酸调节pH至4.0,6000r/min条件下离心10min后,沉淀部分为硒蛋白。称取硒蛋白1g于10mL的离心管中,加入4mL质量分数为5%的硝酸进行酸脱蛋白,涡旋60s后,离心,6000r/min条件下离心10min去除上清液,沉淀部分转移至250mL烧杯中,加入10mL Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液(0.1mmol/L,pH7.5),室温超声提取5min,每隔8h依次加入4mg胰蛋白酶、3mg蛋白酶K,在37℃下振荡酶解24h后加入0.1%(v:v)甲酸终止酶解,10000r/min条件下离心15min,上清液即为硒代氨基酸提取液。
使用葡萄糖作为标准品,用ELISA法在酶标仪上对硒多糖进行测定。检测波长为625nm,温度为室温,多糖测定的标准曲线为y=5.4893x-0.0071,相关系数为R2=0.9994,线性范围为0.01~0.08mg/mL。
使用比色法对核苷酸水解后的RNA、DNA进行分析测定。通过1cm石英比色杯,温度为室温,以260nm波长处吸光值(A1和A2)计算RNA、DNA含量。硒核酸含量=[(A1-A2)/0.022]/样品浓度×100%。
采用全自动氨基酸分析仪测定硒代氨基酸的含量,分离柱选用4.6mm×60mm,3μm的磺酸型阳离子交换树脂;柱温57.0℃,反应器温度130℃,泵A(洗脱溶液)流速为0.40mL/min,泵B(茚三酮溶液)流速为0.35mL/min;反应柱:4.6mm ID×40mmL(柱后衍生);输液泵压力:0~30MPa;进样量:20μL;凹面衍射光栅,检测波长为570nm和440nm。将蛋氨酸,半胱氨酸标准混合溶液用样品稀释液进行适当稀释,使其摩尔浓度分别为10、20、50、100、150nmol/mL分别进样,以色谱峰峰面积为纵坐标、氨基酸摩尔浓度为横坐标绘制标准,拟合蛋氨酸、半胱氨酸线性回归方程分别为y=-5.01×104x+1.00×104和y=-4.60×104x+6.82×104,相关系数R2分别为0.9998和0.9994。
使用高效液相色谱法测定提取到的硒多酚含量。在色谱柱为Kromasil C18;流动相为乙酸:甲醇:N,N-二甲基甲酰胺:水=l:1:40:58(v:v);色谱柱温30℃;进样量10μL;检测器为紫外检测器,检测波长280nm,拟合线性回归方程为y=1×107x-0.0036(R2=0.9995)。
该实施例所得的各物质的硒含量通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定。将ICP-MS标准溶液用3%硝酸逐级进行稀释,配制浓度(μg/L)分别为0、5、20、50、100、200的硒标准溶液绘制标准曲线,拟合线性回归方程为y=118.5423x-50.4265,线性范围为1~100μg/L(R2=0.9997),检出限为0.1349ng/L,并对应之前各个物质,分别得到硒多糖、硒代氨基酸、硒核酸、硒多酚易挥发组分和硒多酚不易挥发组分中硒的提取率。样品溶液检测前均经0.22μm滤膜过滤。富硒黑蒜经逐级提取后检测结果参见表1。
表1富硒黑蒜经逐级提取后检测数据
Claims (10)
1.一种天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1,先将待提取的天然富硒农产品粉碎后,得到粉末,使用超纯水对粉末进行浸提,得到混合体系a,再将混合体系a离心后分离沉淀,得到沉淀物a和浸提液a;
步骤2,将沉淀物a使用超纯水进行浸提,得到混合体系b,再将混合体系b离心后分离沉淀,得到沉淀物b和浸提液b,将浸提液b与浸提液a合并后得到浸提液A;
步骤3,用两种不同孔径的超滤膜对浸提液A进行过滤,依次得到硒核酸粗提物、硒多糖粗提物和硒多酚粗提液;
按以下步骤对沉淀物b进行处理,得到硒代氨基酸提取液;
步骤3a,先将沉淀物b用NaOH溶液超声提取,得到混合体系c,再将混合体系c离心后分离沉淀,得到沉淀物c和提取液a,将沉淀物c用NaOH溶液超声提取,得到混合体系d,再将混合体系d离心后分离沉淀,得到提取液b,将提取液a和提取液b合并后得到提取液A;
步骤3b,调节提取液A的pH至硒蛋白的等电点,得到调节液;
步骤3c,将调节液离心后分离得到沉淀物d,再对沉淀物d进行酸脱蛋白处理,得到酸处理液;
步骤3d,将酸处理液依次涡旋和离心,得到沉淀物e;
步骤3e,在沉淀物e中加入Tris-HCl缓冲液进行超声提取,之后间隔性地加入胰蛋白酶和蛋白酶K,在恒温下震荡酶解,最后离心上清液得到硒代氨基酸提取液;
步骤4,依次采用步骤41a和步骤41b将硒多酚粗提液进行处理,得到硒多酚的易挥发组分和硒多酚的不挥发组分;采用步骤42将硒核酸粗提物进行处理,得到硒核酸;采用步骤43将硒多糖粗提物进行处理,得到硒多糖,完成天然富硒农产品中有机硒的逐级提取;
步骤41a,在硒多酚粗提液中加入环己烷进行涡旋混合,之后加入饱和氯化钠水溶液,振荡后在0~4度下离心,得到环己烷层和饱和NaCl层;
步骤41b,将环己烷层用环己烷-乙酸乙酯定容,得到硒多酚的易挥发组分;在饱和NaCl层中加入乙腈振荡提取后离心,将得到的混合液中的杂质去除,得到硒多酚的不挥发组分;
步骤42,先在硒核酸粗提物中加入NaCl溶液,将得到的混合体系e抽提后过滤,得到沉淀物f和滤液a,将沉淀物f按照硒核酸粗提物的处理方式重复2~4次,将得到的滤液与滤液a合并,得到滤液A,再将滤液A的pH调节至2~4,之后将调节pH后的滤液A在0~6℃下静置后分离沉淀,最后将该沉淀依次清洗和干燥,得到硒核酸;
步骤43,先在硒多糖粗提物中加入草酸溶液,将得到的混合体系f提取后过滤,得到沉淀物g和滤液b,将沉淀物g按照硒多糖粗提物的处理方式重复2~4次,将得到的滤液与滤液b合并,得到滤液B,再在滤液B中加入乙醇,之后将得到的混合液在0~6℃下静置后分离沉淀,最后将该沉淀清洗得到硒多糖。
2.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,步骤1中粉末与超纯水的比例为5g:25mL;步骤2中的超纯水用量与步骤1的超纯水用量相同。
3.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,步骤3先用50kDa孔径的超滤膜过滤浸提液A,将所述超滤膜上得到的固体冷冻干燥得到硒核酸粗提物,将得到的过滤液a用10kDa孔径的超滤膜过滤,将10kDa孔径的超滤膜上得到的固体冷冻干燥得到硒多糖粗提物,得到的过滤液b为硒多酚粗提液。
4.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,步骤3a中所述NaOH溶液中NaOH与步骤1中所述的粉末的比例为0.45mmol:5g;步骤3a中超声提取沉淀物b的NaOH用量与超声提取沉淀物c的NaOH用量相同。
5.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,步骤3b中用0.1mol/L的盐酸将提取液A的pH调节至4.0。
6.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,步骤3c中采用质量分数为5%的硝酸对沉淀物d进行酸脱蛋白,所述的硝酸与沉淀物d的比例为4mL:1g。
7.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,步骤3e中,所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.1mmol/L,pH为7.5,该Tris-HCl缓冲液与沉淀物d的比例为10mL:1g。
8.根据权利要求7所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,步骤3e对沉淀物e超声提取后,每隔8h依次加入胰蛋白酶和蛋白酶K,胰蛋白酶、蛋白酶K和Tris-HCl缓冲液的比例为4mg:3mg:10mL;
步骤3e所述的恒温为37℃,在该温度下震荡酶解24h。
9.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,步骤42中,NaCl溶液中NaCl与硒核酸粗提物的比例为0.05mol:1g;混合体系e在抽提时在沸水浴中进行。
10.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法,其特征在于,步骤43中所述的草酸溶液中草酸的质量分数为3%,该草酸溶液与硒多糖粗提物的比例为5mL:1g,乙醇与草酸溶液的体积比为:3:1。
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