CN111751416A

CN111751416A - 一种新型的美洲大蠊多肽快速检测方法

Info

Publication number: CN111751416A
Application number: CN202010631713.3A
Authority: CN
Inventors: 余丽双; 齐烨迪; 许惠凤; 林露; 黄雪雪; 王静楠; 林晓; 褚克丹; 徐伟
Original assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2020-10-09

Abstract

本发明公开了一种新型的适用于美洲大蠊多肽快速检测的电化学信号放大方法。其步骤包括：(1)制备美洲大蠊多肽对照品溶液；(2)制备Ag‑TiO₂‑CS纳米复合物；(3)标记纳米Ag与抗体；(4)三明治双抗夹心免疫；(5)电化学检测美洲大蠊多肽溶液。本发明方法既有电化学传感器的高灵敏性，又有酶联免疫反应的高专属性；在96孔板中进行三明治双抗夹心免疫，避免了将抗体直接固定在电极上以及抗体和抗原在电极上进行结合，大大增加了方法的稳定性、专属性以及灵敏度；所构建的传感器可在较短的时间内完成测试，可用于含美洲大蠊多肽样品的分析。

Description

一种新型的美洲大蠊多肽快速检测方法

技术领域

本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种新型的基于96孔ELISA板及银离子媒介体的电化学信号放大技术，能对美洲大蠊多肽以及其中药制剂“康复新液”进行快速分析测定。

背景技术

恶性肿瘤对人类的健康危害极大，据全国肿瘤登记中心数据记载，肝癌、肺癌、胃癌等居于前列。目前肿瘤的主要治疗方式为手术、药物治疗、放射治疗等，肿瘤中、晚期时一般以放疗、化疗为主，但其对正常细胞都有一定的影响，伴随着严重的毒副反应。因此，研究对肿瘤细胞有抑制作用且毒副作用小的药物迫在眉睫。

动物类中药资源较为丰富，在疾病治疗中的应用较为广泛。美洲大蠊具有快速生长能力，变异蜕皮后的***能力，高繁殖力和显著的组织再生能力。在中国，美洲大蠊的乙醇提取物被用作治疗血瘀综合征、痤疮和腹部肿块的中药已经有百年历史。研究发现，美洲大蠊的粗提物在抗癌、抗炎和促进组织再生等方面有显著作用。目前对美洲大蠊的化学研究主要集中在生物活性肽和酶，而有关美洲大蠊多肽的检测相对较少，因此研究建立美洲大蠊多肽的检测新方法具有重要意义。

传统上对于多肽的分析测定方法多集中为薄层色谱法、HPLC法、质谱法以及相应的联用技术。这些传统的方法多存在仪器试剂贵、分析过程复杂、灵敏度低以及检测时间长等缺点，再加上美洲大蠊多肽存在容易降解、不稳定等缺点，所以目前适用于其的检测分析方法较少。因此发展适用于美洲大蠊多肽的高灵敏度、简便快速的检测方法变得尤为重要。

电化学免疫传感器由于具有较高的灵敏度，最小化的功率需求，操作简便以及仪器成本较低，在众多检测***中的现场免疫测定实践中拥有很大的前景。目前一些高灵敏度、高选择性的生物传感器已经被成功应用于定量检测生物样品，如ECL、电感耦合等离子质谱等。近年来一些电化学传感器与纳米技术相结合后进一步提升了自身的选择性和灵敏度，其检测可以达到单分子水平。但是直接的电化学免疫方法存在稳定性差、试剂多且特殊等缺点，最近研究指出，抗原浓度还可以被间接检测，应用较多的是通过合适的方式将作为标记物的纳米材料溶解，随后根据溶解液的性质选择适当的分析方法，从而提高方法的灵敏度。这种方法既有电化学分析的高灵敏性又有酶联免疫的高选择性，可以更好地实现抗原的专属痕量检测。在三明治双抗夹心实验过程中，修饰液制备简便，电极修饰过程简单，且银离子的浓度可以由电化学方法直接检测得到，达到了进一步提升灵敏度和稳定性的目的。

目前未见通过电化学免疫传感器检测美洲大蠊多肽的方法。

发明内容

本发明提供了一种新型的适用于美洲大蠊多肽快速检测的电化学信号放大方法，其特征在于包括如下操作步骤：

1)取待检美洲大蠊多肽，制备供试品溶液；

2)制备Ag-TiO₂-CS纳米复合物；

3)标记纳米Ag与抗体；

4)三明治双抗夹心免疫；

5)电化学检测。

进一步的，步骤1)中，所述的美洲大蠊多肽用PBS溶解。

进一步的，步骤2)中，的制备方法为：取的TiO₂溶液、的AgNO₃溶液和的CS溶液混匀，逐滴滴加NaBH₄溶液，等烧杯内溶液的颜色变为咖啡色时，搅拌30min，离心、洗涤，即得Ag-TiO₂-CS纳米复合物；TiO₂溶液、AgNO₃溶液、CS溶液与NaBH₄溶液的体积比为4：8：4：1。

进一步的，其特征在于：所述TiO₂溶液、AgNO₃溶液、CS溶液和NaBH₄溶液的浓度分别为5％、0.05mol·L^-1、0.1％和0.01mol·L^-1。

进一步的，其特征在于：步骤3)的具体方法如下：取Ag-TiO₂-CS分散在PBS中，加入多抗，放置在摇床上振荡，振荡结束后将其离心，弃去上清液后用PBS溶液洗涤；标记抗体的Ag沉淀重悬于0.1％BSA中，吸附后再次将其洗涤，最后分散在PBS溶液，即得标记纳米Ag标记的多抗；Ag-TiO₂-CS与多抗的重量比是1：0.005。

进一步的，步骤4)的具体方法如下：取待检多肽单抗，吸附，加入步骤1)中制备的供试品溶液，再加入步骤3)制备的纳米Ag标记的多抗，加入氨水，得到Ag⁺溶液；优选所述氨水的浓度为2.5mmol·L^-1。

进一步的，其特征在于：步骤5)的具体方法如下：取，金电极，将步骤4)得到的Ag⁺溶液滴加到金电极表面，，采用三电极***进行循环伏安法(CV)扫描、活化。

进一步的，其特征在于：所述Ag⁺溶液中，添加有终浓度为0.1mol·L^-1HCl和1mol·L^-1NaCl，溶液的pH值为2.5。

进一步的，其特征在于：采用三电极***进行循环伏安法(CV)扫描时扫描范围为-1V～0.8V。

本发明采用新型的银纳米标记技术，通过共价结合标记抗体，最后经溶解后转化成Ag⁺，通过电化学检测Ag+间接实现对美洲大蠊多肽的浓度检测，实验条件经过优化后，构建了简便、快速、高灵敏、高选择性的电化学免疫传感器。研究表明Ag⁺的峰电流响应与美洲大蠊多肽浓度在一定浓度范围内有直接关系，此方法简单易行，且成本低，可用于美洲大蠊多肽的定量分析。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是三明治双抗夹心原理图

图2是Ag-TiO₂-CS纳米复合物TEM图

图3是循环伏安法不同扫描速度考察结果

图4是1mmol·L^-1Ag⁺修饰的金电极在不同电介质溶液中的CV曲线(a为0.1mol·L^- ¹HCl+1mol·L^-1NaCl，b为0.1mol·L^-1HCl，c为0.1mol·L^-1HCl+0.1mol·L^-1PBS，d为0.1mol·L^-1PBS)

图5是Ag⁺修饰电极在不同pH溶液中的CV图

图6是Ag⁺电化学检测标准曲线

图7是不同多肽浓度下对应的DPV曲线(非线性)

图8是不同多肽浓度下对应的DPV曲线(线性)

图9是峰电流值与多肽浓度的多项式曲线

图10是峰电流值与多肽的线性曲线

图11是生物传感器的选择性图

具体实施方式

仪器与试剂

1、仪器CHI660C型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；舒美KQ116超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；雷磁PHS-3C型精密度酸计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；XS105电子分析天平(Mettler Toledo公司)；CJJ79-1磁力加热搅拌器(金坛市白塔新宝仪器厂)；HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；DZF-6020真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；TECNAI G2F20场发射透射电子显微镜(美国FEI公司)。三电极体系：工作电极是Ag-TiO₂-CS纳米复合物修饰电极，参比电极选择饱和甘汞电极，辅助电极选择铂丝电极。

2、试剂壳聚糖、硼氢化钠、铁***、亚铁***、氢氧化钠、氨水均购自国药集团化学试剂有限公司；PBS(Hyclone公司)；纳米二氧化钛(上海麦克林生化科技有限公司)；硝酸银(西陇科学股份有限公司)；牛血清白蛋白(Sigma公司)；吐温20(碧云天生物技术研究所)；α-Al₂O₃粉末(武汉高仕睿联科技有限公司)；美洲大蠊多肽1(序列IPMTAPGI-NH₂)、多肽2(序列SLHTAPGL-NH₂)、多肽3(序列DPSFNSWG-NH₂)、多肽3的兔抗多克隆美洲大蠊多肽抗体、多肽3的鼠抗单克隆美洲大蠊多肽抗体均购自吉尔生化上海有限公司；96孔高键合ELISA板(Corning公司)。实验中所用水均为二次蒸馏水，经Milli-Q超纯水***(美国Millipore公司)处理。

实施例1美洲大蠊多肽的快速检测方法

1、对照品溶液制备：精密称取3号多肽1mg，用PBS溶解。

2、Ag-TiO₂-CS纳米复合物的制备：在烧杯中依次加入0.5mL TiO₂(5％)、1mLAgNO₃(0.05mol·L^-1)和0.5mL CS(0.1％)，接着将0.125mLNaBH₄(0.01mol·L^-1)溶液逐滴滴加到烧杯中，等烧杯内溶液的颜色变为咖啡色时，再继续搅拌30min。将制得的纳米复合物离心、洗涤，即得。

3、纳米Ag与抗体的标记：取1mg的Ag-TiO₂-CS分散在1mL PBS中，超声5min后加入50μL 0.1mg·mL^-1的多抗，随后将其放置在摇床上轻微振荡3h，振荡结束后将其离心，弃去上清液后用PBS溶液洗涤3遍。标记抗体的Ag沉淀重悬于200μL 0.1％BSA中，吸附3h后再次将其洗涤，最后分散在1mL PBS溶液中，放置在4℃环境中保存。

4、三明治双抗夹心免疫：三明治双抗夹心免疫在96孔ELISA板上进行，其详细的操作步骤和原理示意图如附图1所示。首先在多肽单抗和相应基团的物理吸附作用下，将50μL10μg·mL^-1的多肽单抗固定在96孔板的底部进行吸附，在常温条件下反应一小时后对其进行洗涤，其目的主要是洗去未结合的多肽单抗。向孔里滴加30μL 0.1％BSA溶液，封闭ELISA板裸露的活性部分，此操作减少了非特异性吸附，具体的操作步骤和上述保持一致。随后在孔里继续加入80μL的多肽溶液，放置在37℃环境中孵育1h，孵育结束后依旧用PBS将未结合的抗原洗去。再向板内加入40μL制备好的纳米银多抗溶液，置于37℃环境中孵育1h。上述步骤完成后三明治双抗夹心结构成功形成，分别用PBST溶液和超纯水将没有结合上的纳米银多抗洗去。最后通过向孔内加入20μL 2.5mmol·L^-1氨水将已经吸附的Ag溶解，从而得到Ag⁺溶液，后续用电化学方法进行分析测定。

5、电化学检测方法：金电极在乙醇中超声好后，在抛光布上选择合适的α-Al₂O₃粉末将金电极抛光成镜面，在抛光过程中及时用超纯水对电极进行清洗。抛光好的电极采用三电极***进行循环伏安法(CV)扫描，此测试过程的溶液含0.1mol·L^-1HCl和1mol·L^- ¹NaCl，扫描范围为-1V～0.8V。电极是否抛光合格根据氧化还原峰电位差进行判断，抛光合格之后就进行活化。活化过程的溶液是0.5mol·L^-1的硫酸溶液，扫描范围是0～1.7V，活化过程的判定标准为峰电流趋于稳定、不再变大。

将5μL上述Ag⁺溶液滴加到金电极表面，室温干燥后进行检测。电极修饰过程不同阶段的表征主要是通过差分脉冲伏安法(DPV)进行，选用的仪器是CHI660C电化学工作站。依旧采用三电极***，此处的工作电极为构建好的修饰电极。

实施例2美洲大蠊多肽的快速检测学法学考察及结果

一、实验方法

1溶液配制

对照品溶液制备：精密称取3号多肽1mg，用PBS溶解。

2Ag-TiO₂-CS纳米复合物的制备

查阅文献制备Ag-TiO₂-CS纳米复合物。一开始在烧杯中依次加入0.5mL TiO₂(5％)、1mLAgNO₃(0.05mol·L^-1)和0.5mL CS(0.1％)，接着将0.125mLNaBH₄(0.01mol·L^-1)溶液逐滴滴加到烧杯中，等烧杯内溶液的颜色变为咖啡色时，再继续搅拌30min。将制得的纳米复合物离心、洗涤，即得。

3纳米Ag与抗体的标记

取1mg的Ag-TiO₂-CS分散在1mL PBS中，超声5分钟后加入50μL 0.1mg·mL^-1的多抗，随后将其放置在摇床上轻微振荡3小时，振荡结束后将其离心，弃去上清液后用PBS溶液洗涤3遍。标记抗体的Ag沉淀重悬于200μL 0.1％BSA中，吸附3小时后再次将其洗涤，最后分散在1mL PBS溶液中，放置在4℃环境中保存。

4三明治双抗夹心免疫

三明治双抗夹心免疫在96孔ELISA板上进行。首先在多肽单抗和相应基团的物理吸附作用下，将50μL 10μg·mL^-1的多肽单抗固定在96孔板的底部进行吸附，在常温条件下反应一小时后对其进行洗涤，其目的主要是洗去未结合的多肽单抗。向孔里滴加30μL0.1％BSA溶液，封闭ELISA板裸露的活性部分，此操作减少了非特异性吸附，具体的操作步骤和上述保持一致。随后在孔里继续加入80μL的多肽溶液，放置在37℃环境中孵育1小时，孵育结束后依旧用PBS将未结合的抗原洗去。再向板内加入40μL“2.3”项下制备好的纳米银多抗溶液，置于37℃环境中孵育1小时。上述步骤完成后三明治双抗夹心结构成功形成，分别用PBST溶液和超纯水将没有结合上的纳米银多抗洗去。最后通过向孔内加入20μL2.5mmol·L^-1氨水将已经吸附的Ag溶解，从而得到Ag⁺溶液，后续用电化学方法进行分析测定。

5电化学检测方法

金电极在乙醇中超声好后，在抛光布上选择合适的α-Al₂O₃粉末将金电极抛光成镜面，在抛光过程中及时用超纯水对电极进行清洗。抛光好的电极采用三电极***进行循环伏安法(CV)扫描，此测试过程的溶液是含有5mmol·L^-1的铁***的0.5mol·L^-1氯化钾溶液，扫描范围为-1V～0.8V。电极是否抛光合格根据氧化还原峰电位差进行判断，抛光合格之后就进行活化。活化过程的溶液是0.5mol·L^-1的硫酸溶液，扫描范围是0～1.7V，活化过程的判定标准为峰电流趋于稳定、不再变大。

二、实验结果

1、Ag-TiO₂-CS纳米复合物的表征：本发明对制备好的Ag-TiO₂-CS进行表征，其透射电镜图(TEM)如附图2所示，图中的TiO₂呈现为均匀球形，Ag均匀地复合在TiO₂纳米材料的表面。

2、免疫传感器的条件优化考察

(1)循环伏安法不同扫描速度考察：用循环伏安法考察不同扫描速度对电极电化学性能的影响，结果如附图3所示。在一定扫描速度范围内，随着扫描速度的增大，还原峰电流值随之增大。当扫描速度达到100mV/s时，峰电流值变化相对较小。但是当扫描速度过于快时，充电电流增大，基线噪音也会变大，所以本发明选择100mV/s作为最佳扫描速度。

(2)电介质溶液的考察：在不同的电介质环境中，Ag⁺性能表现出了较大差异，附图4为不同电介质环境下1mmol·L^-1Ag⁺修饰的金电极的CV图，在PBS的环境下，电极检测出的氧化还原峰峰值较小(曲线d)。在PBS中加入HCl后，氧化还原峰有轻微增加(曲线c)。Ag⁺在HCl环境中表现出了较好的氧化还原特性(曲线b)，上述结果说明HCl在一定程度上可提高Ag⁺的氧化还原活性。在酸性环境的基础上进一步添加NaCl后，由曲线a中的强氧化还原峰可看出，此电介质溶液在很大程度上增强了Ag⁺的氧化还原能力。为了提高检测方法的灵敏度，最优的电介质溶液选择0.1mol·L^-1HCl和1mol·L^-1NaCl的混合电介质溶液。

(3)电介质溶液的pH：本发明选取不同pH值的电介质溶液，在1mol·L^-1NaCl为电介质的情况下考察其对峰电流值的影响。结果如附图5所示，电介质溶液的pH值在一定程度上影响了峰电流值的大小，当pH值偏低或者偏高时，峰电流值都较小，Ag⁺的电化学活性较弱。由附图5可知当电介质溶液的pH值选为2.5时，其峰电流值最高，因此选择2.5作为最优的电介质溶液pH值。

经过上述条件优化后，选择的最佳条件是扫描速度为100mV/s，电介质溶液选择0.1mol·L^-1HCl和1mol·L^-1NaCl的混合电介质溶液，电介质溶液的pH值为2.5。

3、Ag⁺标准曲线的构建：用2.5mmol·L^-1氨水配制标准Ag⁺溶液，后续操作步骤按照实施例1中的电化学检测方法进行。结果如附图6所示，在0.03mmol·L^-1～8mmol·L^-1范围内Ag⁺表现出了良好的线性关系，相关系数r为0.9993，此结果说明前期建立的电化学分析方法适用于Ag⁺的检测，而且此方法具有较高的灵敏度。

4、电化学免疫传感器对美洲大蠊多肽定量分析方法学考察

(1)线性关系：附图7和附图8分别是不同多肽浓度下对应的Ag⁺修饰金电极的DPV曲线，平行实验3次，取平均值。图中峰电流值的变化与美洲大蠊多肽的浓度有直接关系，如附图9所示，电化学信号强度与美洲大蠊多肽浓度在1.0×10^-2～10ng·mL^-1范围内呈多项式曲线关系，方程为y＝0.5833x³-10.883x²+67.082x+163.1(r＝0.9979)，这一结果表明，所构建的电化学免疫传感器可用于美洲大蠊多肽的定量分析。

如附图10所示，美洲大蠊多肽浓度在1.0×10^-4～1.0×10^-2ng·mL^-1范围内时，峰电流值与其浓度呈线性关系，线性回归方程为y＝7272x+83.133(r＝0.9988)，检测限为6.0×10^-5ng·mL^-1(S/N＝3)。

(2)精密度试验：取一定浓度的样品溶液，在最优的实验条件下用同一根电极连续测定5次，测得相对标准偏差RSD为1.56％，RSD值在5％以内，表明此方法的精密度良好。

(3)重复性试验：称取6份同一样品制备样品溶液，按照优化的实验条件下进行检测，测得其相对标准偏差RSD为2.95％，RSD小于5％，说明方法的重复性良好。

(4)稳定性试验：将电化学免疫传感器悬挂在缓冲溶液的上方，放置在4℃冰箱中，在第5天、10天以及15天时对多肽溶液进行检测，相应的峰电流值与初始峰电流值相比，分别保持96.68％，88.00％以及86.37％。

(5)加样回收率试验：配制已知含量的康复新液，按照低、中、高三个浓度，分别精密加入80％、100％、120％的多肽1溶液，计算加样回收率和RSD。测得加样回收率平均值为97.36％，RSD为4.82％(n＝9)，测试结果如表1所示。

表1加样回收率试验结果(n＝9)

(6)样品分析测定：

在最佳条件下，对康复新液中的多肽含量进行测定，每份样品测定3次，求出康复新液中多肽的平均含量为1.79μg·mL^-1，RSD为5.05％(n＝3)，结果见表2。

表2传感器测定康复新液中多肽含量(n＝3)

5、生物传感器选择性考察

选择美洲大蠊中的多肽2(序列SLHTAPGL-NH2)以及多肽3(序列DPSFNSWG-NH2)作为对照试验。附图11显示了多肽1、多肽2以及多肽3在所构建的电化学免疫传感器中测定时产生的峰电流值，由图可以得出，目标1号肽在此免疫传感器中有较大的峰电流值，而干扰多肽(多肽2、多肽3)的峰电流值较小，对比之下，目标1号肽表现出了特异性吸附，其电信号强度明显高于多肽2和多肽3。

结果证实此免疫传感器在抗原抗体的特异识别作用下对目标1号肽产生了特异性识别能力，降低了其它多肽的非特异性干扰。本发明采用三明治双抗夹心技术，使得此方法的专属性增加，也减少了其它序列多肽的非特异性干扰。

综上，本发明构建了一种新型的适用于美洲大蠊多肽快速检测的电化学信号放大方法。此方法基于银离子媒介体和96孔ELISA板，其既有电化学传感器的高灵敏性，又有酶联免疫反应的高专属性。此发明方法在96孔板中进行三明治双抗夹心免疫，避免了将抗体直接固定在电极上以及抗体和抗原在电极上进行结合等，大大增加了方法的稳定性、专属性以及灵敏度。结果表明所构建的传感器可在较短的时间内完成测试，同时该方法可用于含美洲大蠊多肽样品的分析，结果满意。

Claims

1.一种新型的适用于美洲大蠊多肽快速检测的电化学信号定量检测方法，其特征在于：包括如下操作步骤：

1)取待检美洲大蠊多肽，制备供试品溶液；

2)制备Ag-TiO₂-CS纳米复合物；

3)标记纳米Ag与抗体；

4)三明治双抗夹心免疫；

5)电化学检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述的美洲大蠊多肽用PBS溶解。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，的制备方法为：取的TiO₂溶液、的AgNO₃溶液和的CS溶液混匀，逐滴滴加NaBH₄溶液，等烧杯内溶液的颜色变为咖啡色时，搅拌30min，离心、洗涤，即得Ag-TiO₂-CS纳米复合物；TiO₂溶液、AgNO₃溶液、CS溶液与NaBH₄溶液的体积比为4：8：4：1。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述TiO₂溶液、AgNO₃溶液、CS溶液和NaBH₄溶液的浓度分别为5％、0.05mol·L^-1、0.1％和0.01mol·L^-1。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：步骤3)的具体方法如下：取Ag-TiO₂-CS分散在PBS中，加入多抗，放置在摇床上振荡，振荡结束后将其离心，弃去上清液后用PBS溶液洗涤；标记抗体的Ag沉淀重悬于0.1％BSA中，吸附后再次将其洗涤，最后分散在PBS溶液，即得标记纳米Ag标记的多抗；Ag-TiO₂-CS与多抗的重量比是1：0.005。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：步骤4)的具体方法如下：取待检多肽单抗，吸附，加入步骤1)中制备的供试品溶液，再加入步骤3)制备的纳米Ag标记的多抗，加入氨水，得到Ag⁺溶液；优选所述氨水的浓度为2.5mmol·L^-1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)的具体方法如下：取，金电极，将步骤4)得到的Ag⁺溶液滴加到金电极表面，采用三电极***进行循环伏安法(CV)扫描、活化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述Ag⁺溶液中，添加有终浓度为0.1mol·L^-1HCl和1mol·L^-1NaCl，溶液的pH值为2.5。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：采用三电极***进行循环伏安法(CV)扫描时扫描范围为-1V～0.8V。