CN111748627A - 膀胱癌耗竭型t细胞亚群、其特征基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明利用单细胞转录组测序分析技术，对浸润型膀胱癌患者外周血、正常膀胱组织和膀胱癌组织来源的T细胞进行了单细胞转录组测序，鉴定了膀胱癌特异性T细胞亚群，即CD8+耗竭型T细胞，并确定了CD8+耗竭型T细胞表达的特征基因，即基因LUC7L3、IKZF3、TRGC2。并且所述特征基因能够用于识别或鉴定来自膀胱癌的CD8+耗竭型T细胞，进一步用于膀胱癌的辅助诊断、预后判断及免疫治疗，以及提供相关的检测试剂或试剂盒。

Description

膀胱癌耗竭型T细胞亚群、其特征基因及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学领域和生物技术领域，具体涉及细胞亚群的鉴定，特别是源自膀胱癌组织的T细胞亚群的鉴定。
背景技术
膀胱癌是泌尿***最常见的恶性肿瘤之一。2018年CA杂志报道全球膀胱癌约有54.9万新发病例和20.0万死亡病例，男性约占总体疾病负担的75％。在美国，膀胱癌发病率位居第四，男性患者的数量为女性的四倍。在我国，膀胱癌的发病率为6.69/10万，而且发病率呈现出随着时间增加的趋势，极大威胁我国人民尤其是男性患者的健康。膀胱癌因性别、种族和地域的不同会产生较大的差异，它可以在所有年龄段发生，其高发年龄为50-70岁，并且患者的患病率与年龄呈正比。
在慢性炎症或癌症中，T细胞长期暴露于炎症信号或抗原中，就会导致T细胞的功能衰退，这种过程称为T细胞耗竭，耗竭的T细胞失去了原有的效应功能，表达多种抑制性受体，在抗肿瘤免疫反应中的作用降低。T细胞耗竭的描述第一次出现在慢性病毒感染的小鼠中，此外人类感染艾滋病病毒、丙型肝炎病毒，以及产生肿瘤等情况下也会出现T细胞耗竭现象。T细胞耗竭的主要特征是多种抑制型受体的过度表达，包括PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3等。尽管T细胞耗竭对肿瘤的治疗效果产生了负影响，但通过阻断抑制型受体的信号通路，可以部分逆转这种功能失调的状态，并重新激活免疫反应。例如，通过靶向PD1或CTLA4的抗体的应用，可以重新激活耗竭T细胞的免疫功能，达到抑制肿瘤发生发展的作用。这些现象表明，耗竭型T细胞免疫功能的重新激活，对治疗慢性感染和癌症等疾病具有重要意义。
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的概念由Rosenberg研究组在1986年首次提出，TILs是具有高度异质性的免疫细胞，其在肿瘤微生态内参与肿瘤免疫正向和负向调节作用，主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞和髄源性抑制细胞等。T淋巴细胞在TILs中占据主导地位，是机体免疫对抗肿瘤的主力。其主要包括以下亚型：CD8+细胞毒性T细胞(CTL)，CD4+辅助性T细胞(TH)，CD45RO+记忆性T细胞(TCM)和FOXP3+调节性T细胞(Treg)等。其中CD8+T淋巴细胞在抗肿瘤免疫中起到核心作用TIL中的CD4+/CD8+细胞的比值根据不同肿瘤来源、不同进程而显出差异。癌症免疫疗法已经在膀胱癌的治疗中初见成效，但疗效部分取决于肿瘤浸润淋巴细胞的数量和质量。想要了解当下体内免疫功能的状态，辅助疾病的诊断与治疗，探索疾病的发病机理，预测病程和预后，检测T细胞亚群是一个十分有效的方法。例如，在肿瘤的发展过程中，当发生转移时，CD3+、CD4+细胞的数量会显著减少，而CD8+细胞的数量则显著增多，CD4+/CD8+比值显著降低，这提示患者免疫细胞功能低下，预后较差。
癌症的早期诊断与筛查、疗效与预后的判断，以及潜在的治疗靶点，都对加强癌症治疗效果、提高患者的生存率有着重要的意义。近年TILs在肿瘤微生态中的作用越来越受到重视，大量研究表明TILs的浸润密度、类型和所处的肿瘤位置在多种肿瘤如结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤等的预后判断中占主导地位。且在这些实体瘤中T细胞具有非常强的预后价值。对于膀胱癌的研究，有学者发现TILs尤其是CD8+T细胞是预示MIBC患者临床结局的重要指标，其浸润与良好的DFS显著相关。尽管免疫***与癌组织的之间的作用机制在免疫疗法的开发与改善中，以及肿瘤发生发展的检测中有着重要的作用，但是TIL的种类以及抑制途径还没有被理解透彻。人体T细胞的种类多而复杂，对每一种T细胞亚群的识别与鉴定，可以为癌症免疫治疗提供新的免疫靶点，以及预后的分子标志物。因此，需要我们更深地了解并探索膀胱癌浸润T亚群的异质性和功能，向膀胱癌的精确治疗迈进。
发明内容
本发明利用单细胞转录组测序分析技术，对浸润型膀胱癌患者外周血、正常膀胱组织和膀胱癌组织来源的T细胞进行了单细胞转录组测序，鉴定了膀胱癌特异性T细胞亚群，即CD8+耗竭型T细胞，并确定了CD8+耗竭型T细胞表达的特征基因。
本发明公开的特征基因，能够识别或鉴定来自膀胱癌的CD8+耗竭型T细胞，进一步用于肿瘤的辅助诊断、预后判断及免疫治疗，以及提供相关的检测试剂或试剂盒。
本发明的第一方面提供一种用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组及其制药用途。
一种用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组，所述生物标志物组包含基因LUC7L3、IKZF3、TRGC2中的一种或几种，或者所述基因编码表达的蛋白或蛋白片段。
一种上述生物标志物组在制备用于肿瘤的辅助诊断、预后判断、免疫治疗的药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤为膀胱癌。
本发明的第二方面提供一种能够检测本发明第一方面所述生物标志物组的检测试剂、检测试剂盒及其制药用途。
一种检测试剂，用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组，所述检测试剂包含能与目标基因或其编码表达的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，所述目标基因选自LUC7L3、IKZF3、TRGC2中的一种或几种。
进一步地，所述结合剂包括核酸、配体、酶、底物，和/或抗体。
进一步地，所述结合剂是能与所述目标基因特异性结合的核酸探针或配体。
进一步地，所述结合剂是能特异性扩增所述目标基因的引物。
进一步地，所述结合剂是能与所述目标基因编码表达的蛋白或蛋白片段特异性结合的抗体。
进一步地，所述结合剂能进一步结合指示分子，所述指示分子包括：荧光物质、放射性物质、和/或酶。
一种检测试剂盒，用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组，所述检测试剂盒包含上述任一种检测试剂。
一种上述任一种检测试剂或检测试剂盒在制备用于肿瘤的辅助诊断、预后判断、免疫治疗的药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤为膀胱癌。
有益效果：
本发明利用单细胞转录组测序分析技术，通过对浸润型膀胱癌患者外周血、正常膀胱组织和膀胱癌组织来源的T细胞进行单细胞转录组测序，分离并筛选了能表征机体肿瘤免疫状态的CD8+耗竭型T细胞亚群，并筛选出3种特异性表达在CD8+耗竭型T细胞中的特征基因。
本发明展示了可以用来鉴定或表征该CD8+耗竭型T细胞亚群的特征基因。更具体地，根据该特征基因，可以引申出一系列与该基因或该基因表达的蛋白产物相结合的核酸、配体、酶、底物，和/或抗体，能够鉴定肿瘤中的CD8+耗竭型T细胞亚群。该CD8+耗竭型T细胞亚群可以反应肿瘤的免疫状态，可以用于肿瘤辅助诊断、预后判断、抗肿瘤药物制备。
附图说明
图1A是实施例2中，膀胱癌临床样本外周血单细胞测序的t-SNE图。
图1B是实施例2中，膀胱癌临床样本癌旁正常组织单细胞测序的t-SNE图。
图1C是实施例2中，膀胱癌临床样本肿瘤组织单细胞测序的t-SNE图。
图1D是实施例2中，外周血、癌旁正常组织、肿瘤组织中细胞亚群的汇总。
图2A是实施例2中，膀胱癌临床样本2中的LUC7L3在CD8+耗竭型T细胞以及其他细胞亚群中的表达量。
图2B是实施例2中，膀胱癌临床样本2、3中的IKZF3在CD8+耗竭型T细胞以及其他细胞亚群中的表达量。
图2C是实施例2中，膀胱癌临床样本2、3中的TRGC2在CD8+耗竭型T细胞以及其他细胞亚群中的表达量。
图2D是实施例2中，膀胱癌临床样本2、3中的LAG3在CD8+耗竭型T细胞以及其他细胞亚群中的表达量，用于阳性对照。
图3A是实施例3中，膀胱癌临床样本2中的CD8+耗竭型T细胞亚群差异表达基因的通路富集情况。
图3B是实施例3中，膀胱癌临床样本3中的CD8+耗竭型T细胞亚群差异表达基因的通路富集情况。
图4A是实施例4中，膀胱癌临床样本2中的CD8+耗竭型T细胞亚群中细胞表面受体相关蛋白的互作情况。
图4B是实施例4中，膀胱癌临床样本2中的CD8+耗竭型T细胞亚群中细胞表面受体与抗原及加工提呈相关蛋白的互作情况。
图4C是实施例4中，膀胱癌临床样本2中的CD8+耗竭型T细胞亚群中蛋白酶体相关蛋白的互作情况。
图4D是实施例4中，膀胱癌临床样本2中的CD8+耗竭型T细胞亚群中NADH相关蛋白的互作情况。
图4E是实施例4中，膀胱癌临床样本2中的CD8+耗竭型T细胞亚群中电子传递链相关蛋白的互作情况。
图5是实施例5中，TRGC2高表达的CD8+耗竭型T细胞与膀胱癌患者总生存期Kaplan-Meier生存曲线图。
图6、7是实施例6中，CD8+耗竭型T细胞的代表性流式分选结果图。
图8是实施例6中，qPCR检测CD8+耗竭型T细胞及非耗竭型T细胞中特征基因的表达量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例是以膀胱癌患者为例，示例说明T细胞的单细胞转录组测序及测序结果分析方法
实施例1单细胞转录组测序
1、临床样本收集
本研究选取了3例膀胱尿路上皮癌患者的外周血、膀胱癌组织和癌旁正常组织，由首都医科大学宣武医院负责采集和提供。所有患者均已提供书面的知情同意书。收集患者手术切除的膀胱癌组织、癌旁正常组织和外周血。要求患者均无自身免疫疾病或其他癌症病史，术前未接受过新辅助化疗或其他抗肿瘤治疗的膀胱癌，且肿瘤直径大于1cm。样本采集应在手术结束后立即将新鲜样本4℃平稳运输回实验室，在2h内进行细胞分离实验，保证细胞最大活性。
2、外周血中T细胞的分离
(1)患者禁食过夜，用含EDTA抗凝的紫色采血管采集6mL新鲜血液。
(2)取采集后新鲜血液3mL，加入3mL PBS稀释，混匀。
(3)在一支新试管中加入6mL人外周血淋巴分离液。将混匀后的6mL血液谨慎加于分离液上面，注意不能打破两层之间的界面。
(4)用水平转子的离心机以500g的离心力在室温离心30分钟。
(5)离心后明显分为4层，最上层为血浆层，底层为比重较大的红细胞和粒细胞，血浆和分离液之间狭窄层面即为PBMC，转移白膜层至新的离心管中即收集到新鲜的PBMC。
(6)向PBMC中加入2-3mL红细胞裂解液混匀，置于4℃雪柜冷藏约10分钟后，400g转速离心10分钟，弃上清。
(7)收集沉积物，向其中加入10mL的培养液清洗细胞2次，移液器枪头吸打混合。离心后收集细胞沉淀，计数。
(8)磁珠标记。每1×107细胞用80μL缓冲液重悬，加入20μL磁珠，充分混匀后于4℃孵育15min。孵育完成后用1-2mL预冷缓冲液稀释，300g离心10min，弃上清，加入500μL缓冲液混匀。
(9)T细胞分离。将步骤(8)中所得的细胞悬液加入MS柱上部，收集流通液，其中包含未标记的细胞，即CD3-细胞。使用500μL缓冲液清洗MS柱3次，收集流通液。将MS柱从MACS分离器上移开，放在收集管中，加1mL缓冲液，推动活塞，收集流通液，即CD3+T细胞。CD3+T细胞3000rpm离心5min，弃上清，用含10％血清的RPMI 1640培养基(不含钙离子和镁离子)重悬，使细胞量达7×105-1.2×106cells/mL，置于冰上用于单细胞测序。
3、膀胱癌组织和癌旁正常组织中T细胞的分离
(1)单细胞悬液的制备
无菌环境下，用镊子取出膀胱癌组织/癌旁正常组织，用清洁培养基淋洗一次后置于6孔板内，加入少量无血清培养基保持组织湿润，然后用剪刀剪至匀浆状。用胶原酶混合液(12mL 0.15％胶原酶+200μL双抗+2mL FBS)重悬剪碎的组织，37℃消化2-4h。消化完成后，用70um或300目细胞筛网过滤，收集滤液，1000-2000rpm离心10min，弃上清。加入适量红细胞裂解液裂解红细胞，2000rpm离心10min。用PBS洗涤，1000-2000rpm离心10min收集细胞沉淀，计数。
(2)单细胞悬液中T细胞的分离
磁珠标记。每1×107细胞用80μL缓冲液重悬，加入20μL磁珠，充分混匀后于4℃孵育15min。孵育完成后用1-2mL预冷缓冲液稀释，300g离心10min，弃上清，加入500μL缓冲液混匀。
T细胞分离。将以上磁珠标记所得的细胞悬液加入MS柱上部，收集流通液，其中包含未标记的细胞，即CD3-细胞。使用500μL缓冲液清洗MS柱3次，收集流通液。将MS柱从MACS分离器上移开，放在收集管中，加1mL缓冲液，推动活塞，收集流通液，即CD3+T细胞。CD3+T细胞3000rpm离心5min，弃上清，用含10％血清的RPMI 1640培养基(不含钙离子和镁离子)重悬，使细胞量达7×105-1.2×106cells/mL，置于冰上用于单细胞测序。
4、利用10X Genomics测序平台对单细胞转录组测序
为了保持T细胞最大限度的活性，一旦分离得到合格的T细胞，需立即进行单细胞分离、文库构建及测序分析。
(1)将上述分离得到的T细胞样本制备成浓度为700～1200cells/μL的细胞悬液。
(2)将细胞悬液与含有Barcode序列的Gelbeads混合，加载到10X Genomics单细胞液滴生成平台，Gel beads中Barcode用来标记细胞(一个beads上只有一种barcode)，UMI用来标记基因并记录基因的表达量，细胞悬液通过第一个进样口与酶等反应物混合。
(3)混合物进入第二个进样口时被油滴包裹，形成GEMs。GEMs形成后细胞立即裂解。Gelbeads随即溶解释放反转录随机引物进行反转录。
(4)反转录后，油滴破裂，将释放的cDNA产物收集起来，并在与3’末端模板转换引物互补的引物作用下进行PCR扩增。
(5)扩增后的cDNA经过打断，加A，加Illumina P5和P7接头，完成文库制备后在Illumina HiSeq 2000平台上进行PE150测序。
实施例2不同细胞亚群的基因表达量分析
通过单细胞转录组测序，根据Cellranger数据统计，Seurat标准化、降维、聚类等对测序结果进行分析，根据细胞间基因表达情况进行聚类。聚类分析用于识别细胞亚型。根据聚类结果，采用t-SNE降维算法，在二维空间上展示细胞的分布情况，具体分析方法如下：
⑴数据标准化和降噪
Seurat默认采用全局归一化方法“LogNormalize”对基因表达矩阵进行标准化，对于每个细胞，分别将每个基因的表达量除以该细胞的整体表达量，即转换为相对丰度，然后乘以归一化因子(默认10000)，再进行log转化。数据标准化之后，再运用Seurat提取出在细胞间变异系数较大的基因，并基于这些基因进行下游分析。在进行下游的降维和聚类分析之前，为进一步降低因技术噪音、批次效应或细胞周期等造成的***误差，我们需要通过Seurat构建线性模型来消除这些变异来源。
⑵聚类分析
聚类分析用于识别细胞亚型。在Seurat中，首先进行PCA主成分分析，然后评估最显著的主成分，挑选贡献最大的几个主成分进行聚类分析。聚类时采用graph-based聚类算法，其通过欧几里得距离构建K近邻(KNN)图，默认采用Louvain算法对细胞进行分组和模块优化。根据聚类结果，采用t-SNE降维算法，在二维空间上展示细胞的分布情况，结果参见图1。
依据已发表的文献或细胞标志物数据库，利用亚群上调表达的基因进行细胞亚群定义，将T细胞定义为不同细胞亚群。经外周血、癌旁正常组织与肿瘤组织中细胞亚群聚类的对比，我们发现CD8+耗竭型T细胞亚群特异性分布在肿瘤组织中，或可作为膀胱癌治疗的靶点。我们进一步分析CD8+耗竭型T细胞亚群与其他T细胞亚群的基因表达差异情况(表1)，以及这些差异表达基因在样本的所有细胞亚群中的表达量(表2)，筛选出特异性表达在CD8+耗竭型T细胞中的基因。具体方法为，通过将该亚群与样品中其他所有细胞亚群进行比较，得到该亚群与其他亚群之间的差异基因列表，利用差异分析算法(默认采用Wilcoxon ranksun test)，寻找该亚群的差异高表达基因，为进一步筛选特征基因提供依据。进一步地，特征基因仅在该亚群中高表达(ave_logFC值＞0.25)，在其他亚群中表达量较低(P值<0.05)，且其对T细胞的免疫功能有一定抑制作用。
表1膀胱癌组织浸润的CD8+耗竭型T细胞亚群差异表达基因
Figure BDA0002567120740000071
Figure BDA0002567120740000081
Figure BDA0002567120740000091
Figure BDA0002567120740000101
Figure BDA0002567120740000111
*所述基因表达量为ave_logFC，与该样品中其他细胞亚群表达量差异的log值
表2膀胱癌浸润T细胞亚群中的基因表达量
Figure BDA0002567120740000112
Figure BDA0002567120740000121
Figure BDA0002567120740000131
Figure BDA0002567120740000141
Figure BDA0002567120740000151
Figure BDA0002567120740000161
Figure BDA0002567120740000171
经筛选，CD8+耗竭型T细胞特征基因为LUC7L3、IKZF3、TRGC2。
对临床取得的膀胱癌样本2号或3号中的基因LUC7L3、IKZF3、TRGC2、LAG3在CD8+耗竭型T细胞以及其他细胞亚群中的表达进行基因表达量分析，绘制柱形图，结果参见图2。
LUC7L3(LUC7Like 3Pre-MRNA Splicing Factor)是一种mRNA剪接因子，已有研究表明，LUC7L3在脑膜瘤组织中特异性高表达，在正常脑组织中低表达，且LUC7L3的阳性率随肿瘤组织的恶性程度增加而升高。目前未见LUC7L3在免疫细胞中的功能研究。LUC7L3主要在细胞核中呈斑点状分布，在细胞膜、胞外基质、细胞骨架中也有分布。与LUC7L3有关的疾病包括I型糖尿病。
IKZF3(IKAROS Family Zinc Finger 3)编码了zinc finger蛋白家族的一个成员，该蛋白家族是造血特异性转录因子，参与调节淋巴细胞的发育。主要分布在细胞膜及细胞核中，细胞基质及胞外基质也有分布。与IKZF3有关的疾病包括白血病，慢性淋巴细胞性和原发性胆汁性肝硬化。
TRGC2(T Cell Receptor Gamma Constant 2)编码参与抗原识别的T细胞受体，识别多种在上皮边界处常见的自身和外来的非肽抗原，包括内源性脂质以及磷抗原等。主要分布在T细胞表面。
LAG3(Lymphocyte-activation gene 3)是一种T细胞的抑制性受体，在与配体结合时传递抑制信号，负调控CD8+和CD4+T细胞的增殖、激活、效应器功能和稳态。同样作为浆细胞样树突状细胞(pDCs)激活的负调控因子。LAG3在耗竭型T细胞上表达，表现为增殖能力的缺陷或者无法通过TCR的刺激发挥效应功能(产生细胞毒作用，分泌细胞因子)。LAG3在此作为CD8+耗竭型T细胞亚群的阳性对照基因。
实施例3CD8+耗竭型T细胞差异表达基因的通路富集分析
基因通路富集分析是分析基因在细胞中的代谢途径以及其功能的过程，本发明中，利用Matescape对差异表达基因进行通路富集分析。Metascape是提供基因注释和分析资源的门户网站，网址为http://metascape.org，集成了四十多个生物信息数据库，例如GO/KEGG terms，canonical pathways，hall mark gene sets，UniProt和DrugBank等常用数据库都包括在内。我们可以方便地运用此网站进行生物通路功能富集分析，蛋白质互作用网络结构分析。我们通过在网站首页提交需要分析的cluster的差异基因列表，选择物种信息为H.sapiens，再点击分析选项即可得到可视化功能富集分析和蛋白质互作分析结果，所有的数据和通过一个Zip文件包下载保存。以临床取得的膀胱癌样本2、3为例，对CD8+耗竭型T细胞亚群差异表达基因的通路富集情况进行分析，结果参见图3。分析结果表明，CD8+耗竭型T细胞差异表达基因多富集在获得性免疫***、淋巴细胞激活与分化、免疫突触形成以及细胞因子依赖的信号通路等。
实施例4CD8+耗竭型T细胞差异表达基因的蛋白质互作分析
蛋白质互作网络分析的内容包括直接的物理互作和间接的功能相关。结合差异表达分析结果和数据库收录的互作关系对，构建差异表达蛋白互作网络。我们以临床取得的膀胱癌样本2、3为例，同样通过Matescape对差异表达基因的蛋白质互作进行分析，结果参见图4。结果表明，CD8+耗竭型T细胞蛋白质互作集中于细胞表面受体、抗原加工提呈、细胞因子相关的信号通路等。
实施例5特征基因与预后的相关性
对于上述筛选的CD8+耗竭型T细胞的特征基因，运用Gene expression ProfilingInteractive Analysis(GEPIA2)在线分析工具(http://www.oncolnc.org/)对预后进行分析，使用的数据库为膀胱尿路上皮癌(BLCA)数据。GEPIA是基于TCGA和GTEx数据库中的肿瘤和正常样本进行基因表达分析的工具。GEPIA2是GEPIA的增强和更新版本，具有更高的分辨率和更多的功能。GEPIA2涵盖了84种癌症亚型，将基因表达定量从基因水平扩展到转录本水平，并支持特定癌症亚型的分析以及亚型之间的比较。此外随着单细胞测序的广泛应用，GEPIA2还采用新的基因特征量化分析技术，从而让用户得到不同癌症类型细胞亚群特征基因的分布，是强大的癌症基因组学数据工具。
TCGA(The Cancer Genome Atlas)是由美国在2005年发起的癌症和肿瘤基因图谱计划，旨在应用基因组分析技术研究癌症中的基因组变化，做了大规模的基因组测序，样本量过万，包含了三十多种癌症。GTEx(Genotype-Tissue Expression是正常组织转录组测序的数据库。通常，我们使用TCGA进行数据分析时，会发现该项目纳入的正常组织转录组测序数据非常少，这个时候我们需要加入GTEx数据库数据，二者结合进行分析，数据分析结果如图5所示。
分析结果表明，TRGC2高表达的CD8+耗竭型T细胞亚群与膀胱癌患者更短的总生存期相关(P＝0.042)。以上结果表明，膀胱癌中TRGC2高表达的CD8+耗竭型T细胞亚群显著影响膀胱癌患者的临床结局，提示了更差的预后。这一发现可帮助临床医生认识疾病发展规律，提前对患者进行干预治疗，改善不良的治疗预后。
实施例6CD8+耗竭型T细胞的富集及特征基因测定
1、分选CD8+耗竭型T细胞
收集5例新鲜膀胱癌组织，按照上述实施例1的方法，对组织进行剪碎和消化，制备单细胞悬液。PBS洗涤2次，2ml无血清DMEM/F12重悬，计数备用。
①分出100μL细胞悬液作不染色对照，加培养基至200μL。
②分出100μL细胞悬液作CD3单阳对照，加入CD3抗体5μL，加培养基至200μL。
③分出100μL细胞悬液作CD8单阳对照，加入CD8抗体5μL，加培养基至200μL。
④分出100μL细胞悬液作PD1单阳对照，加入PD1抗体5μL，加培养基至200μL。
⑤分出100μL细胞悬液作TIM3单阳对照，加入TIM3抗体5μL，加培养基至200μL。
⑥剩下1500μL作实验组(至少6×106个细胞)，加入CD3抗体20μL，CD8抗体5μL，PD1抗体5μL，TIM3抗体5μL，混匀，4-8℃置于摇床避光染色30min。
⑦染色完成后，3000rpm离心5min，弃上清。用0.5-0.6mL PBS重悬，3000rpm,离心5min,弃去上清。用500μL分选缓冲液重悬(至少5×106个细胞)，流式收集CD3+CD8+PD1+TIM3+耗竭型T细胞和CD3+CD8+PD1-TIM3-非耗竭型T细胞。代表性的流式分选结果如图6(sample6)、图7(sample 7)所示。
2、qPCR测定特征基因表达量
步骤1中分选出的细胞，采用qPCR进行基因表达量的分析。
(1)总RNA提取
将步骤1中分选出的细胞12000rpm离心2min，收集细胞沉淀。按照天根的培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(DP430)中的步骤提取总RNA。
①裂解：将分选好的膀胱癌干细胞和非干细胞离心收集后，加300μL裂解液RL(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)混匀。
②将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，收集滤液。
③向滤液中加入1倍体积70％乙醇(通常为350μL或600μL)，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱CR3放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
④向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
⑤DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。
⑥向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。
⑦向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
⑧向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。重复一次。
⑨12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
⑩将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液。利用Nanodrop 2000测定提取总RNA的浓度加入适量裂解液，将所有溶液转移至过滤柱CS上，12000rpm离心2min，收集滤液。向滤液中加入1倍体积的70％乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀仪器转入吸附柱CR3中，12000rpm离心2min，倒掉废液。向吸附柱中加入去蛋白液，1200rpm离心30-60sec，倒掉废液。向吸附柱中加入DNase工作液，室温放置15min，再加入去蛋白液，12000rpm离心2min，倒掉废液。向吸附柱中加入漂洗液，12000rpm离心2min，倒掉废液，重复一次。将吸附柱置于60℃恒温器5min，彻底晾干残留的漂洗液。将吸附柱转移到新的RNase-Free离心管中，加入30-50μL RNase-Free双蒸水，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。
(2)反转录
gDNA去除反应体系：
组成成分 使用量
5x gDNA Buffer 2μL
Total RNA X
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 补足到10μL
从(1)所得的RNA溶液中用RNA专用移液枪取出3-5μL于离心管PCR管中，用于测定该RNA溶液的浓度。总RNA的量应在1-2微克之间，根据RNA溶液的浓度确定gDNA去除体系中Total RNA的用量。
gDNA去除反应体系配好后置于42℃，孵育3min，然后置于冰上放置。
反转录反应体系:
试剂 使用量
10x king RT Buffer 2μL
FastKing RT Enzyme Mix 1μL
FQ-RT Primer Mix 2μL
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 补足到10μL
将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃孵育15min，95℃孵育3min之后置于冰上，得到的cDNA可用于后续试验或低温保存。
(3)荧光定量PCR检测特征基因表达量
以(2)中得到的cDNA为模板进行荧光定量PCR检测特征基因表达量。
反应体系：
试剂 使用量
2x SuperReal PreMix Plus 10μL
正向引物 0.5μL
反向引物 0.5μL
cDNA模板 0.5μL
RNase free ddH<sub>2</sub>O 8.2μL
50x ROX Reference Dye 0.3μL
引物序列：
Figure BDA0002567120740000221
荧光定量PCR条件如下：
Figure BDA0002567120740000222
荧光定量PCR检测膀胱癌肿瘤浸润CD8+耗竭型T细胞和非耗竭型T细胞中LUC7L3、IKZF3、TRGC2的表达量，结果参见图8。结果表明，LUC7L3、IKZF3、TRGC2在耗竭型T细胞中的表达量显著高于非耗竭型T细胞。
因此，LUC7L3、IKZF3、TRGC2是全新的CD8+耗竭型T细胞的生物标志物，在鉴定肿瘤浸润CD8+耗竭型T细胞方面有良好的应用前景，并有望成为膀胱癌免疫治疗的新靶点。

Claims (10)

1.一种用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组，其特征在于，所述生物标志物组包含基因LUC7L3、IKZF3、TRGC2中的一种或几种，或者所述基因编码表达的蛋白或蛋白片段。
2.一种用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组在制备用于肿瘤的辅助诊断、预后判断、免疫治疗的药物中的应用，其特征在于，所述生物标志物组包含基因LUC7L3、IKZF3、TRGC2中的一种或几种，或者所述基因编码表达的蛋白或蛋白片段。
3.根据权利要求2所述的用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组在制备用于肿瘤的辅助诊断、预后判断、免疫治疗的药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为膀胱癌。
4.一种用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含能与目标基因或其编码表达的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，所述目标基因选自LUC7L3、IKZF3、TRGC2中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组的检测试剂，其特征在于，所述结合剂包括核酸、配体、酶、底物，和/或抗体。
6.根据权利要求4所述的用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组的检测试剂，其特征在于，
所述结合剂是能与所述目标基因特异性结合的核酸探针或配体；或
所述结合剂是能特异性扩增所述目标基因的引物；或
所述结合剂是能与所述目标基因编码表达的蛋白或蛋白片段特异性结合的抗体；或
所述结合剂能进一步结合指示分子，所述指示分子包括：荧光物质、放射性物质、和/或酶。
7.一种用于识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求4-6任一项所述的检测试剂。
8.一种根据权利要求4-6任一项所述的识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组的检测试剂或根据权利要求7所述的识别或鉴定CD8+耗竭型T细胞的生物标志物组的检测试剂盒在制备用于肿瘤的辅助诊断、预后判断、免疫治疗的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为膀胱癌。
10.一种CD8+耗竭型T细胞亚群，其特征在于，所述CD8+耗竭型T细胞亚群高表达基因LUC7L3、IKZF3、TRGC2中的一种或几种。
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