CN111748021B - 一种对沙眼衣原体momp具有结合亲和力的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种对沙眼衣原体主要外膜蛋白特异性结合的多肽及其应用，首次揭示了一种对沙眼衣原体主要外膜蛋白具有结合亲和力的多肽；本发明还提供了该多肽的在诊断检测中的应用，并作为靶向载体在药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。

Description

一种对沙眼衣原体MOMP具有结合亲和力的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种对沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)具有结合亲和力的多肽及其应用。

背景技术

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)是性传播疾病的主要病原之一，主要引起男性尿道炎和女性***，并常与其他病原混合感染，通过性传播感染女性导致不良妊娠，如流产、死胎等，并与***的发生密切相关。近年来，我国由Ct引起的STDs发病呈持续上升趋势，已对人类健康构成了极大危害。对于Ct感染性疾病，迄今尚缺乏有效的防治方法。作为一类严格胞内寄生、具有独特发育周期的原核细胞型微生物，Ct以具有感染性的原体形式存在于胞外，和具有繁殖特性的始体存在于胞内。始体***繁殖产生大量原体，成熟原体从胞内释放感染新的易感细胞，进而增殖转化为始体，周而复始。Ct目前已鉴定出19个血清型别，其中D、E、F、G和H等血清型主要引起泌尿生殖道感染，而其中E血清型是国内外报道中最为常见的型别。主要外膜蛋白(Major outer membrane protein，MOMP)是存在于Ct原体和始体表面的一种含量高、功能广的跨膜蛋白，不仅在介导Ct粘附宿主细胞的过程中起重要作用，而且该蛋白含有多个抗原表位，可作为重要的免疫原刺激机体免疫应答。MOMP含较多半胱氨酸，可通过链内和链间二硫键形成复杂的三维结构和多聚体，故制备结构完整、构象天然的MOMP非常困难，极大限制了基于MOMP的衣原体疫苗的研制。研究发现，位于胞膜外的MOMP VD2和VD4区含有多个B细胞表位和T细胞表位，故该结构域可作为研究Ct疫苗、靶向治疗及诊断制剂研究的重要靶点。

目前，随着病原体持续性感染问题的产生，及肿瘤分子靶向治疗带来的突破性研究进展，国内外学者已尝试将感染性疾病的治疗研究转向分子靶向治疗。以单克隆抗体(mAb)为代表的靶向治疗已对感染性疾病和肿瘤的治疗带来了新希望，如已经FDA批准的用于预防婴幼儿呼吸道合胞病毒感染的帕利株单抗、用于治疗吸入性炭疽的瑞西巴库单抗、用于治疗转移性乳腺癌的曲妥珠单抗(赫赛汀)等。但基于mAb的靶向治疗仍然存在其应用的局限性，如组织渗透性弱的渗透、毒副作用较大、成本昂贵等严重影响了单抗在靶向治疗中的广泛应用。

基于上述说明，本领域仍然亟待研究靶向性治疗Ct感染的新方法，以改善目前临床现状。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽及其用途。

本发明的第一方面，提供一种对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽，该多肽是以葡萄球菌A蛋白(SPA)Z段(Z结构域)的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个(较佳地为13-16个，如14个、15个)氨基酸变异后获得的多肽。

在一个优选例中，相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35，43位上发生氨基酸突变。

在另一优选例中，相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽的：

第9位氨基酸突变为H；

第10位氨基酸突变为L；

第11位氨基酸突变为A；

第13位氨基酸突变为L；

第14位氨基酸突变为M；

第17位氨基酸突变为W；

第18位氨基酸突变为T；

第24位氨基酸突变为R；

第25位氨基酸突变为H；

第27位氨基酸突变为V；

第28位氨基酸突变为H；

第32位氨基酸突变为H；

第35位氨基酸突变为R；

第43位氨基酸突变为E。

在另一优选例中，所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

在另一优选例中，所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽与Ct MOMP蛋白相互作用的KD值为9.86×10^-7M。

在本发明的另一方面，提供一种靶向Ct MOMP的靶向性分子，所述的靶向性分子包括前面任一所述的多肽，以及与该多肽相连接(或偶联)的偶联物，所述的偶联物包括(但不限于)：半胱氨酸残基，多肽标签，抑制Ct的药物，或可检测标记物(如荧光标记、酶、生物素或放射性同位素)。

在一个优选例中，所述的偶联物是肽，所述的偶联物与所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽构成融合多肽。

在另一优选例中，所述的多肽标签包括但不限于：His标签(如6×His)、Myc标签、GST标签、Flag标签。

在另一优选例中，所述酶包括但不限于：碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

在另一优选例中，所述的偶联物与所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽以柔性肽连接，所述柔性肽包括(但不限于)：(Gly4Ser)3。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的靶向Ct MOMP的靶向性分子，且其中所述的偶联物是肽。

在本发明的另一方面，提供一种重组载体，该载体包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽的方法，所述方法包括：(1)培养所述的细胞，从而表达所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽；(2)分离纯化(1)获得的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽或所述的靶向Ct MOMP的靶向性分子的用途，用于制备治疗Ct MOMP蛋白表达阳性细胞的药物；或

用于制备检测Ct MOMP的检测试剂；或

用于制备诊断Ct感染的诊断试剂。

在一个优选例中，所述的靶向Ct MOMP的靶向性分子中，所述的偶联物是抗Ct药物(如毒素)，所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽，或所述的Ct MOMP的靶向性分子用于治疗Ct生殖道感染。

在另一优选例中，所述的靶向Ct MOMP的靶向性分子中，所述的偶联物是可检测标记物(如荧光标记或酶)，所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽，或所述的靶向Ct MOMP的靶向性分子用于Ct MOMP表达阳性细胞。

在另一优选例中，所述的Ct MOMP表达阳性细胞包括：泌尿生殖道感染上皮细胞等。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含：前面任一所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽或任一所述的靶向Ct MOMP的靶向性分子；和药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断或治疗Ct MOMP表达阳性细胞的药盒，所述的药盒中包括：任一前面所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽，或任一前面所述的靶向Ct MOMP的靶向性分子，或所述的药物组合物。

在一个优选例中，所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽或所述的靶向Ct MOMP的靶向性分子是有效量的。

在本发明的另一方面，提供一种治疗Ct感染，包括将所述的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽，或所述的靶向Ct MOMP的靶向性分子给予需要治疗的对象。

在本发明的另一方面，提供一种诊断Ct MOMP表达阳性细胞，包括将所述的靶向CtMOMP靶向性分子给予需要治疗的对象；所述的靶向性分子中，所述的偶联物是可检测标记物(如荧光标记或酶)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。

附图说明

图1、Z_{Ct MOMP}以及Zwt序列的对比。本发明的多肽Z_{Ct MOMP}中被修饰的氨基酸位点在图中已用加粗字体标出(SEQ ID NO：2)。

图2、实施例1中产生的Z_{Ct MOMP}多肽重组质粒构建图和重组蛋白的组成示意图。

(A)Z_{Ct MOMP}重组质粒构建图；(B)Zwt重组质粒构建图；(C)和(D)分别为Z_{Ct MOMP}和Zwt的原核表达全长重组蛋白的组成示意图，Z_{Ct MOMP}代表具有选自SEQ ID NO：2氨基酸序列，Zwt代表选自SEQ ID NO：1的氨基酸序列，6xHis代表六个组氨酸标记，HM代表NdeI(CATATG)翻译的氨基酸，LE代表XhoI(CTCGAG)翻译的氨基酸。

图3、pET21a(+)/Z_{Ct MOMP}的重组质粒电泳图。

A为pET21a(+)/Z_{Ct MOMP}。M1：1kb DNAmarker；1：pET21a(+)载体质粒；2：pET21a(+)/Z_{Ct MOMP}Affibody重组质粒；3：pET2 1a(+)/Z_{Ct MOMP} Affibody/NdeI+XhoI；4：Z_{Ct MOMP}Affibody DNA片段；M2：DL2000 DNAmarker。B为pET21a(+)/Zwt。M1：1kb DNA marker；1：pET21a(+)载体质粒；2：pET21a(+)/Zwt重组质粒；3：pET21a(+)/Zwt/NdeI+XhoI；4：Zwt DNA片段；M2：DL2000 DNA marker。

图4、Z_{Ct MOMP}重组蛋白原核表达纯化的SDS-PAGE(A)及Westernblot(B)分析。

M：蛋白Marker；1-2分别为纯化的Z_{Ct MOMP}和Zwt。在Westernblot实验中，一抗为Histag单抗。

图5、MOMP重组蛋白原核表达鉴定及兔血清抗体的制备分析。

(A)MOMP蛋白SDS-PAGE电泳分析，M：蛋白Marker；1：E.coli.BL21(DE3)菌；2.pET21a(+)/MOMP转化的E.coli.BL21(DE3)菌；3.pET21a(+)/MOMP转化的E.coli.BL21(DE3)菌IPTG诱导前；4.pET21a(+)/MOMP转化的E.coli.BL21(DE3)菌IPTG诱导后；5：纯化后MOMP蛋白；(B)MOMP重组纯化蛋白Western blot分析，一抗为his-tag单克隆抗体，1：纯化后的MOMP重组蛋白；2：载体蛋白；(C)为MOMP重组蛋白免疫后鼠血清抗体的效价。

图6、Ct的培养及鉴定。

(A)Ct感染HeLa229细胞后，分别采用碘染和Giemsa染色观察胞浆内的包涵体(内含大量原体和始体)。(B)间接免疫荧光法检测Ct包涵体。兔抗MOMP多克隆抗体为一抗，FITC-羊抗兔IgG为二抗，DAPI染细胞核。

图7、Z_{Ct MOMP} affibody与MOMP重组蛋白亲和力在ProteOn XPR36仪器上的SPR检测。

A-B分别为Z_{Ct MOMP}及Zwt蛋白与靶蛋白MOMP蛋白的亲和力分析。

图8、Z_{Ct MOMP} affibody与MOMP蛋白结合的Western blot鉴定。

A-B分别为Z_{Ct MOMP} affibody及Zwt蛋白与感染Ct的HeLa229细胞内MOMP蛋白结合的Western blot检测。内参为GAPDH。

图9、Z_{Ct MOMP} affibody与MOMP蛋白结合的免疫沉淀鉴定。

A-B分别为Z_{Ct MOMP} affibody及Zwt蛋白与感染Ct的HeLa229细胞内MOMP蛋白结合的Western blot检测。内参为免疫球蛋白的重链和轻链。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

如本文所用，所述的“对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽”是指以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽，且该多肽能够特异性结合Ct MOMP、具有极少或没有非特异性结合。

如本文所用，所述的“本发明的多肽”、“对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽”、“CtMOMP结合多肽”、“Z_{Ct MOMP} affibody多肽”、“Z_{Ct MOMP}affibody”、“Z_{Ct MOMP}：461”、“affibody蛋白”、“affibody重组蛋白”、“Z_{Ct MOMP}重组蛋白”可以互换使用；Ct MOMP与MOMP可以互换使用；SPAZ与Zwt可以互换使用。

如本文所用，所述的“靶向性分子”是指将本发明的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽与其它功能性偶联物连接后获得的、可以靶向Ct MOMP的分子。所述的偶联物可以是半胱氨酸残基，多肽标签，抑制Ct的药物，酶或可检测标记物等。

如本文所用，所述的“融合多肽”是所述的“靶向性分子”的下位概念，是指本发明的对Ct MOMP具有结合亲和力的多肽与其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段)连接后获得的、可以靶向Ct MOMP的分子。

本发明人选择Ct MOMP作为靶抗原。本发明人以葡萄球菌A蛋白的Z结构域(Zwt，SEQ ID NO：1)作为支架，将其表面氨基酸残基模拟抗体结合位点进行随机突变，通过噬菌体展示技术构建突变体文库，以Ct MOMP作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大量的筛选工作，最终获得了对于Ct MOMP具有高度亲和力的多肽。

本发明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行14-20个(较佳地为14个)氨基酸变异后获得的多肽。作为本发明的优选方式，本发明的多肽相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35，43位上发生氨基酸突变。更优选地，本发明的多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，如图1所示。

本发明还涵盖了在所述Ct MOMP结合多肽的氨基酸序列任一末端或两端加入额外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合Ct MOMP时起作用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与标记抗体相互作用的六组氨酸肽(His₆)标记，或“myc”标记或“flag”标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代方式也包含在本发明中。

所述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与第一个、Ct MOMP结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。

本发明也包含在所述的Ct MOMP结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。

本发明也包含在本发明的Ct MOMP结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多肽。这些修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的Ct MOMP结合多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子，这种连接可通过化学键(包括肽键)相连或吸附；所述的化学键是共价键或非共价键。作为一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。所述的Ct MOMP结合多肽与偶联物之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用于本发明。

在“异源”融合多肽中，所述Ct MOMP结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合Ct MOMP外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了Ct MOMP外的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个Ct MOMP结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。

本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上，如将改造的铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL或颗粒酶(GrB)等通过柔性肽连接于Ct MOMP结合多肽的C-末端，构成融合蛋白。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶(例如羧肽酶)而进行“ADEPT″(抗体介导的酶前药治疗，antibody-directed enzyme prodrugtherapy)的酶；包括用以募集免疫***的效应细胞和其它组分的蛋白质；包括细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFa、IP10；包括促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素等。同时，为了更方便掺入放射性核素(如⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I、¹²⁵I)用于诊断或放射性核素(如⁹⁰y、¹³¹I、²¹¹At)用于治疗，可以考虑上述列举的额外的氨基酸(特别是六组胺酸标记和半胱氨酸)，其目的是将放射性同位素的鳌合剂偶联到多肽序列。

本发明还涵盖了在所述的Ct MOMP结合多肽上连接一个可检测标记物(如荧光标记，生物素或放射性同位素)，从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测表达Ct MOMP阳性细胞的目的。

“Ct MOMP结合亲和力”是指可以例如通过利用表面等离子共振(sutfaceplasmonresonance)技术如

装置进行检测的一种多肽特性。Ct MOMP结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将Ct MOMP蛋白固定在该装置的感应芯片上，然后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应芯片上，然后将含有Ct MOMP的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应图像建立多肽的Ct MOMP结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法，例如为了建立相互作用间的某个KD值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可以利用

2000装置(Biocore AB)进行测定。Ct MOMP蛋白固定于该装置的感应芯片上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果中计算KD值。在本发明的实施例中，所述的多肽的KD值达到2.67×10^-6M。。

本发明还提供了编码本发明的Ct MOMP结合多肽或靶向性分子或融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得。

本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。

此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

生产本发明的Ct MOMP结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z结构域的质粒可以用作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。

当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。

本发明还涉及所述的Ct MOMP结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。

本发明的Ct MOMP结合多肽可作为Ct MOMP抗体在不同应用中的一种替代物。

作为非限制性的实例，其可用于治疗特征以Ct MOMP表达为特征的疾病，例如泌尿生殖道沙眼衣原体感染等。通过结合胞内Ct MOMP，用于相关疾病的体内和体外诊断。本发明的多肽可作为一种检测试剂、一种捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向Ct MOMP蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。

在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合Ct MOMP能力的该多肽的片段。

本发明多肽的Ct MOMP结合特性以及用该多肽生产靶向性分子(包括融合蛋白)和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向衣原体感染部位，这些部位包括表达Ct MOMP的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本文所述的CtMOMP结合多肽与一种具有抗癌活性的物质偶联的应用，以将所述物质运送到表达Ct MOMP的细胞，产生靶细胞的损伤或凋亡。

这种抗癌活性的物质可能是通过融合或通过化学键偶联到Ct MOMP结合多肽上的蛋白质，如选自用于“ADEPT”(antibody-directed enzyme prodrug therapy)应用的效应酶；用于募集免疫***的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP 10等；促凝血因子，如组织因子、von Willebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱等。或者，所述活性物质也可能是细胞毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素(如⁹⁰y、¹³¹I、²¹¹At等)，这种同位素可与CtMOMP结合多肽直接结合，或通过一种鳌合剂，如熟知的鳌合剂DOTA或DTPA而与Ct MOMP结合多肽结合。

在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗Ct活性的物质导向表达CtMOMP细胞的方法，包括施用给患者本文所述的所述活性物质与Ct MOMP结合多肽的偶联物。这种偶联物在前文已被适当描述。

本发明还包括使用所述的与Ct MOMP结合的多肽检测样品中的Ct MOMP。

例如，这种检测可以用来诊断特征为表达Ct MOMP的疾病情况。检测Ct MOMP的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用Westernblot、ELISA等方法。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针对与CtMOMP的抗体，这种方法可以适用于本发明的与Ct MOMP结合多肽，这种方法是Westernblot、ELISA等方法检测与Ct MOMP的存在，用来鉴定新鲜、冷冻的生殖道分泌物样品中CtMOMP的表达。

本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者，其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过鳌合剂标记。合适的放射性同位素包括⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I等。

本发明还包括将所述的Ct MOMP结合多肽应用于检测生物学液体样品中Ct MOMP。这个方法包括以下步骤：(1)提供被检测患者的生物学液体样品，(2)将本文所述的Ct MOMP结合多肽在能使所述多肽与样品中存在的任何Ct MOMP结合的条件下加入样品中，(3)除去非结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。被检测到的结合的多肽的量与样品中存在的CtMOMP量相关。在步骤(2)中，Ct MOMP结合多肽可以以任何适宜的形式加入到样品中，包括例如这样的情况，当Ct MOMP结合多肽被固定在一种固体支持物上，通过其使样品接触，或CtMOMP结合多肽存在于溶液中。

所述的Ct MOMP结合多肽的其它应用还包括：检测样品中Ct MOMP的方法，包括如下步骤：(1)提供一种怀疑含有Ct MOMP的组织样品，例如冷冻切片，(2)在适宜条件下加入本发明的Ct MOMP结合多肽到所述样品中，所述条件为益于所述多肽与样品中存在的任何Ct MOMP结合，(3)除去未结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的Ct MOMP的量相关。

本发明还提供了一个诊断组织样品中Ct MOMP表达的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的、本发明的Ct MOMP结合多肽、检测酶活性的试剂、和阳性和阴性对照组织切片。

本发明还提供了一个诊断组织样品中Ct MOMP表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记(如flag标记或myc标记)融合的本发明的Ct MOMP结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、检测酶活性的试剂，和阳性和阴性对照组织切片。

诊断应用的一个领域就是在体内检测Ct感染细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个鳌合物的、本发明的Ct MOMP结合多肽、一种诊断用放射性同位素(非限制性的例子是⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I等)，以及用于分析掺入效率的试剂。

如上所述，本发明涵盖了本发明的Ct MOMP结合多肽将活性物质靶向表达Ct MOMP的细胞如泌尿生殖道粘膜细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试剂盒包括用一个鳌合物标记的本发明的Ct MOMP结合多肽、一个治疗性放射性同位素(非限制性的例子是⁹⁰Y、¹³¹I、2¹¹At)，以及用于分析掺入效率的试剂。

本发明还提供一种药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的对Ct MOMP蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向Ct MOMP蛋白的靶向性分子，和药学上可接受的载体。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的对Ct MOMP蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1、Ct MOMP结合多肽的文库构建及筛选研究

构建噬菌体展示Ct MOMP结合多肽的随机组合文库，即许多不同的SPA结构域相关多肽的文库，从该文库中筛选Ct MOMP结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。

1、Ct MOMP结合多肽的随机组合噬菌体展示文库的构建和鉴定

根据野生型SPA-Z的氨基酸序列及结构(Nilsson B等，Protein Eng.1987；1(2)：107-113)，针对其三个螺旋结构区对应的编码序列设计随机引物，利用PCR方法扩增获得可导致随机氨基酸突变的SPA编码序列，命名为SPA-N。按分子克隆常规方法，通过SfiI和NotI位点将SPA-N编码序列克隆至pCANTAB5E载体构建pCANTAB5E/SPA-N重组质粒，转化至感受态E.coli TG1细胞中，涂布2YT-A平板，37℃培养过夜。即为初级库，标记为affibody初级库备用。随机挑取平板上长出的20个单克隆菌落，将提取质粒用SfiI和Not I双酶切鉴定为阳性克隆，经测序和分析其随机性。

结果：根据测序结果，送测序的20个克隆中有测序结果18个克隆，随机性完全不同，故重组率为18/20＝90％；多样性为18/18＝100％。取上述转化后培养的菌液，用2×YT培养液倍比稀释(1∶10，1∶10²......)，涂布SOB-AG平板，计算平板上的单菌落数，推算库容。通过增加连接转化次数累计库容，多次连接转化后使克隆数达到2.4×10⁶个Z蛋白变体(affibody分子)，其在第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35和43位具有随机的氨基酸残基。

2、Ct MOMP结合多肽的筛选和滴度测定

将纯化的MOMP包被96孔酶标板，经封闭、加噬菌体文库(初级库)孵育、再加入E.coli TG137℃，轻摇温育；取100μl，用2*YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOB-AG平板，30℃过夜，计数结合噬菌体感染菌落数，计算Ct MOMP结合噬菌体滴度；结果平板可见菌落，滴度是1×10⁵；此时完成第一轮淘洗，另部分菌液加10¹⁰辅助噬菌体M13KO7和卡那霉素培养过夜，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤，获得Ct MOMP亲和筛选后的噬菌体文库，为一级库。重复上述3轮富集筛选，分别获得Ct MOMP亲和筛选后的噬菌体文库，为二级，滴度分别为1×10⁶；在二级库的基础上再重复上述4轮富集筛选，为三级文库。同时设置不加噬菌体的空白对照作同步筛选。

3、Ct MOMP结合多肽单克隆噬菌体的制备及ELISA鉴定

ELISA用于筛选表达Ct MOMP结合affibody分子的噬菌体。将Ct MOMP以2μg/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；PBS洗涤，用2％脱脂奶粉封闭2h；洗涤，取四轮筛选后获得的噬菌体与等体积的3％脱脂奶粉混匀，200μl/孔，37℃，2h。洗涤，加入1∶10000稀释的HRP/anti-M13酶标二抗(兔抗M13，Abcam#ab6188)，200μl/孔，37℃，1h；洗涤，加入OPD显色液200μl/孔，37℃，15min；2M H₂8O₄ 50μl/孔，终止反应；置酶标仪(ELx800^TM，BIO-TEK，Winooski，USA)读取OD490值。

在四轮淘选循环中选择结合抗原的affibody分子，经过这四轮选择循环，进一步用噬菌体ELISA检测以分析其与Ct MOMP结合活性，用高于0.5的A490的ELISA值为选择标准，鉴定编码Ct MOMP结合多肽的噬菌体，选择高于这个ELISA信号值的45个克隆进行DNA序列分析。

4、Ct MOMP亲和体分子的序列检测及筛选

共45个单克隆送中国上海生工公司测序，测序引物为CATATGGTTGACAACAAATTCAACAAAGAA(SEQ ID NO：5)。测序结果用DNA STAR软件分析对标准序列Zwt与SPA-N进一步分析其三个螺旋区的随机性和多样性。结果获20个完全正确克隆序列，有部分序列完全重复，兼并重复序列后获得20个序列完全正确的克隆。

根据DNA测序结果进行分析，在上述测序正确的20个克隆中，选择与Ct MOMP结合活性最强的1个单克隆噬菌体(即呈现Ct MOMP亲和体分子的单克隆噬菌体)的DNA序列(为Z_{Ct MOMP})作为靶目标进行研究，氨基酸序列为图1中的SEQ ID NO：2，它们的编码序列如SEQID NO：3。用于下一步用于Ct MOMP结合亲和体的分子克隆和表达及功能检测。

实施例2、Ct MOMP结合多肽重组质粒构建和原核蛋白表达及纯化

如前选择了具有较高ELISA读数的1个克隆(图1中的Z_{Ct MOMP})，及Zwt作为Ct MOMP结合多肽的阴性对照。为了对筛选的affibody分子进行功能检测，对其进行重组质粒构建、原核蛋白的表达及其鉴定，并制备纯化蛋白。

1.pET21a(+)/affibody的重组质粒构建和鉴定

参照affibody基因序列(GenBank：GY324633.1)设计PCR引物，上游引物

5’GGGAATTCCATATGGTTGACAACAAATTCAACAAAGAA 3’(SEQ ID NO：6，斜体和下划线表示Ned I酶切位点)，下游引物5’CCGGAATTCCGTTTCGGAGCCTGAGCGT 3’(SEQ ID NO：7，斜体和下划线表示XhoI酶切位点)；以筛选的测序正确三级库单克隆affibodyZ_{Ct MOMP}为模板，通过PCR扩增affibody目的基因(SEQ ID NO：3)，同时将affibodyZwt经原核密码子优化后全序列(SEQ ID NO：4)合成作为阴性对照。将PCR扩增的目的基因经NdeI和XhoI克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/Z_{Ct MOMP}的重组质粒，并经测序鉴定(图2，图3)。

2.Z_{Ct MOMP}原核蛋白制备

将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，37℃，培养16h；加0.8mM异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(默克公司，德国)IPTG诱导培养6h表达带有His标签的Z_{Ct MOMP}及Zwt蛋白。经诱导后表达的重组蛋白，用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)(QIAGEN公司，美国)亲和层析法纯化并经SDS-PAGE分析鉴定。结果，利用分子生物学技术成功构建了pET21a(+)/Z_{Ct MOMP}重组质粒，并采用原核表达***制备了纯化的Z_{ct MOMP}及Zwt重组融合蛋白，经SDS-PAGE电泳分析及以His tag抗体为一抗进行Western blot检测(图4)证实，出现考马斯亮蓝浓染的条带分子质量约7.8kDa，与预期Z_{Ct MOMP}的分子质量大小一致，Western blot结果再次验证该位置的蛋白即为目的蛋白。本发明选择pET21a(+)载体，在设计上利用其多克隆位点的起始酶位点为NdeI(CATATG)，其密码子ATG即为目的蛋白翻译的氨基酸(M)起始密码子，这样利用原核表达***表达的蛋白即为全长的目的蛋白Z_{Ct MOMP}而不带载体蛋白片段，避免了载体蛋白对实验结果的干扰。

实施例3、Z_{Ct MOMP}与Ct MOMP蛋白的结合

为鉴定Z_{Ct MOMP}与Ct MOMP结合的特异性，利用表面等离子共振技术(SPR)分析筛选的Z_{Ct MOMP}及其对照Zwt affibody与靶蛋白MOMP结合的亲和力和特异性。

1.Ct MOMP的制备和鉴定

将实验室构建并保存的pET21a(+)/Ct MOMP转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达重组蛋白，用Ni-NTA亲和层析法纯化制备蛋白，并常规免疫日本大白耳兔制备血清抗体。结果，SDS-PAGE电泳显示一明显蛋白条带出现在相对分子质量(Mr)约40kDa的位置，与预期蛋白Mr大小相符(图5A)；以小鼠抗6×His mAb为一抗进行Western blot分析，均可见在Mr 40kDa处出现单一的信号反应带(图5B)，表明Ct MOMP蛋白能被His标签抗体所特异性识别和结合。经ELISA检测，兔经Ct MOMP蛋白免疫后出现了高效价的抗体反应，表明成功制备高效价的Ct MOMP特异性兔血清抗体(图5C)。

2.Ct的培养及鉴定

细胞培养：将HeLa229细胞按照10⁵个/孔的量接种到6孔细胞培养板中，待细胞长成致密单层后弃掉细胞培养液，每孔加入含DEAE-D(30μg/ml)的PBS溶液2ml，室温下作用30min。再取出冻存于-80℃的E型Ct标准株，反复冻融两次，加入2颗无菌玻璃珠，旋涡振荡1min，置于低速离心机内32℃，3000r/min，离心5min，留取上清。弃掉细胞孔内的DEAE-D溶液，每孔加入2ml RPMI1640培养基和45μ1E型Ct标准株(7.1×10⁴IFU/孔)。1500r/min离心1h，吸去孔中液体，每孔加入2ml衣原体感染液(RPMI1640培养基180ml，胎牛血清20ml，放线菌酮1mg/L，庆大霉素50mg/L，万古霉素25mg/L)继续培养。44～48h后，采用碘染和Giemsa染色鉴定Ct所形成的的包涵体；同时以上述制备的兔MOMP多克隆抗体为一抗，FITC-羊抗兔为二抗，进行间接免疫荧光检测。

结果显示，Ct感染HeLa229细胞后，(A)碘染和Giemsa染色均可观察到胞浆内的包涵体(内含大量原体和始体)。碘染色可在胞浆内观察到棕黄色的包涵体，Giemsa染色后可在胞浆内发现淡染的包涵体，常将细胞核挤至一侧(图6A)。(B)间接免疫荧光法检测Ct包涵体，胞浆内可见体积较大的蓝绿色荧光团块即为Ct包涵体(图6B)，未感染细胞组及PBS对照组均未出现包涵体。以上结果说明，Ct培养成功，制备的兔抗MOMP抗体可有效识别MOMP蛋白。

3.Z_{Ct MOMP}多肽的传感器分析

在ProteOn XPR36***仪器(Bio-Rad公司)进行Ct MOMP蛋白和Z_{Ct MOMP}多肽之间相互作用的亲和力分析，即利用表面等离子共振技术(SPR)分析上述带有His标签的Z_{Ct MOMP}及其对照Zwt affibody分子与Ct MOMP蛋白之间的相互作用。根据操作手册，在不同的流动池上通过偶联于GLH芯片将Ct MOMP蛋白固定，进行与筛选多肽之间的亲和力测定。第7个流动池表面被激活和失活以作为注射时的空白对照。affibody分子分别进行5个不同梯度浓度稀释，即4000nM、2000nM、1000nM、500nM、250nM、125nM，分别与Ct MOMP结合。所有的分析在25℃进行，注射标本的容量为200μl，并以流速30μl/min随机顺序注射，随后用100mM HCl(BIO-RAD货号：#176-2250100mM HCl)洗涤6min(解离)，利用ProteOn Manager^TM软件(BIO-RAD)的1：1朗缪尔结合模型分析结合曲线(感应图)。

结果随着Z_{Ct MOMP}分子浓度升高，其与靶蛋白Ct MOMP相互作用的能力增强，亲和力平衡解离常数KD值，Z_{Ct MOMP}及其对照Zwt分子分别的为9.86×10^-7mol/L及8.83×10^-3mol/L(图7)。Z_{Ct MOMP}分子的KD值相差至10000倍。经筛选获得的Z_{Ct MOMP}能与Ct MOMP重组蛋白结合以高亲和力结合，与此同时野生型的Zwt分子和Ct MOMP蛋白几乎没有结合力。表明筛选出的Z_{Ct MOMP}分子与Ct MOMP蛋白具有较高的特异亲和力，同时也表明原核诱导表达的Z_{Ct MOMP}分子与Ct MOMP蛋白均具有生物活性。

因此，本发明的Z_{Ct MOMP}分子与MOMP具有相互结合和识别能力。从蛋白水平验证了Z_{Ct MOMP}与MOMP之间的亲和力。

实施例4、Z_{Ct MOMP}多肽与细胞内表达的Ct MOMP蛋白的结合

为进一步验证筛选的Z_{Ct MOMP}与Ct MOMP的亲和力，利用E型Ct感染的HeLa229细胞作为研究对象，裂解后取细胞总蛋白，分别采用Western blot和免疫沉淀方法进一步验证Z_{Ct MOMP}分子与Ct MOMP蛋白分子之间的结合。

细胞培养：将HeLa229细胞按照10⁵个/孔的量接种到6孔细胞培养板中，待细胞长成致密单层后弃掉细胞培养液，每孔加入含DEAE-D(30μg/ml)的PBS溶液2ml，室温下作用30min。再取出冻存于-80℃的E型Ct标准株，反复冻融两次，加入2颗无菌玻璃珠，旋涡振荡1min，置于低速离心机内32℃，3000r/min，离心5min，留取上清。弃掉细胞孔内的DEAE-D溶液，每孔加入2ml RPMI1640培养基和45μl E型Ct标准株(7.1×10⁴IFU/孔)。1500r/min离心1h，吸去孔中液体，每孔加入2ml衣原体感染液(RPMI1640培养基180ml，胎牛血清20ml，放线菌酮1mg/L，庆大霉素50mg/L，万古霉素25mg/L)继续培养。44～48h后，加入细胞裂解液，10000r/min离心15分钟，取上清蛋白。

Western blot检测：取部分上清蛋白煮沸后，经SDS-PAGE电泳后转膜，以Z_{Ct MOMP}分子为一抗、鼠抗-His tag为二抗、HRP-羊抗鼠为三抗进行Western blot检测。

免疫沉淀(IP)：取部分上清蛋白与兔抗MOMP多克隆抗体共孵育，4℃缓慢摇动过夜。加入20μl充分重悬的ProteinA+GAgarose，4℃缓慢摇动3个小时。2500r/min离心5分钟，小心吸除上清。用PBS洗涤沉淀5次，去上清，加入40μl 1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液重悬沉淀，煮沸后经SDS-PAGE电泳、转膜，以Z_{Ct MOMP}分子为一抗、兔抗-His tag为二抗、HRP-羊抗兔为三抗进行Western blot检测。

Western blot结果显示，Z_{Ct MOMP}分子能特异性识别并结合Ct感染HeLa229细胞中分子量约100kDa的三聚体MOMP，而未感染的HeLa229细胞在相同位置则看不到该条带，同时该目的蛋白也不能被阴性对照Zwt识别(图8)；IP结果显示被兔MOMP多克隆抗体特异性识别和结合的蛋白，确实能被Z_{Ct MOMP}分子结合，且分子量在100kDa左右(图9)，证实为MOMP的三聚体形式。

上述结果进一步从细胞水平验证了Z_{Ct MOMP}分子与Ct MOMP具有很强的亲和力和结合的特异性。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种对沙眼衣原体MOMP具有结合亲和力的多肽及其应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 1

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 2

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu His Leu Ala Ala Leu Met Glu Ile

1 5 10 15

Trp Thr Leu Pro Asn Leu Asn Arg His Gln Val His Ala Phe Ile His

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 3

<211> 174

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 3

gttgacaaca aattcaacaa agaacacctc gcggctttgatggaaatctg 50

gaccctgccg aacctgaacc gacaccaggt acacgctttc atccactctc 100

tgcggaacaa cccgtctcag tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa 150

ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 4

<211> 174

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 4

gttgacaaca aattcaacaa agaacagcag aacgctttct acgaaatcct 50

gcacctgccg aacctgaacg aagaacagcg taacgctttc atccagtctc 100

tgaaagacga cccgtctcag tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa 150

ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> 人工序列

<222> (1)..(30)

<400> 5

catatggttgacaacaaattcaacaaagaa 30

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> 人工序列

<222> (1)..(38)

<400> 6

gggaattccatatggttgacaacaaattcaacaaagaa 38

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> 人工序列

<222> (1)..(28)

<400> 7

ccggaattccgtttcggagcctgagcgt 28

Claims (10)

1.一种对沙眼衣原体主要外膜蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于：多肽是以如SEQ ID NO:1所示的葡萄球菌A蛋白Z 段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20 个氨基酸变异后获得的多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:2所示的序列，所述序列具体的为相对于SEQ ID NO:1所示的葡萄球菌A 蛋白Z 段的氨基酸序列，

第9位氨基酸突变为H；

第10位氨基酸突变为L；

第11位氨基酸突变为A；

第13位氨基酸突变为L；

第14位氨基酸突变为M；

第17位氨基酸突变为W；

第18位氨基酸突变为T；

第24位氨基酸突变为R；

第25位氨基酸突变为H；

第27位氨基酸突变为V；

第28位氨基酸突变为H；

第32位氨基酸突变为H；

第35位氨基酸突变为R。

2.如权利要求1所述的一种对沙眼衣原体主要外膜蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于，该多肽与沙眼衣原体主要外膜蛋白相互作用的KD值为9.86×10^-7M。

3.一种靶向沙眼衣原体主要外膜蛋白的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括权利要求1或2所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述的偶联物包括：半胱氨酸残基，多肽标签，可检测标记物，或抑制沙眼衣原体的药物。

4.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的对沙眼衣原体主要外膜蛋白具有结合亲和力的多肽，该多核苷酸序列如序列SEQ ID NO: 3所示。

5.一种重组载体，其特征在于，该载体包含权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求5所述的重组载体,或其包含有基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

7.权利要求3所述的靶向沙眼衣原体靶向性分子的用途，其特征在于，所述偶联物是沙眼衣原体主要外膜蛋白的药物，用于制备治疗沙眼衣原体感染疾病的药物；

或所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，用于制备检测沙眼衣原体感染的检测试剂或用于制备诊断沙眼衣原体感染疾病的诊断试剂。

8.一种药物组合物，其特征在于，其包含：权利要求1或2所述的对沙眼衣原体主要外膜蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求3任一所述的靶向沙眼衣原体主要外膜蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。

9.一种用于诊断沙眼衣原体感染疾病的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求3所述的靶向沙眼衣原体主要外膜蛋白的靶向性分子，所述靶向性分子为多肽标签或者可检测标记物，和检测多肽标签或者可检测标记物的检测试剂。

10.一种用于治疗沙眼衣原体感染疾病的药盒，其特征在于，所述药盒中包括：权利要求1或2所述的对沙眼衣原体主要外膜蛋白具有结合亲和力的多肽，或权利要求3任一所述的靶向沙眼衣原体主要外膜蛋白的靶向性分子，或权利要求8任一所述的药物组合。

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