CN111742054B - 用于级联加工新鲜的藻类的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于在环境温度加工新鲜的藻类的方法,其通过使藻类进行渗透休克并且用包括细胞壁降解酶的酶组合物处理破坏的藻类。在环境温度的该温和加工允许分离在存在盐的情况下也具有良好的溶解度、以及良好的起泡、乳化和水结合特性的藻类蛋白质。另一优势在于蛋白质分离的该方法允许级联生物精炼,因为蛋白质分离可随后为用碳水化合物降解酶处理剩余的生物质,以在厌氧消化中产生高收率的清洁沼气以及富含矿物质的水流。
Description
技术领域
本发明涉及用于加工藻类以回收藻类蛋白质和沼气(biogas)的方法。本发明也涉及通过该工艺回收的蛋白质。
背景技术
藻类是多糖、蛋白质、矿物质和油的有价值的来源。为了从藻类中分离这些有价值的成分,需要加工藻类。可在本地收获和加工淡水藻类。对于盐水藻类,所谓的海草,收获和加工发生在分开的地点。近海(offshore)收获海草,运输至大陆(onshore)并且然后在陆地上加工。等到开始加工时,海草已经开始分解或劣化。因此,除非在深加工或使用大量的抗微生物防腐剂之后,否则藻类不能被用于食品、医药或化妆品应用。另外,在将藻类带到陆地上的同时,运输了大量水,其非常重并且成本高。
可替选地,近海收获藻类并且也近海保存藻类,以延长加工之前的储存期或货架期。接着,将保存的海草运输到陆地上,用于进一步加工。这避免了运输大量水,但是无法避免对藻类成分如蛋白质的损伤。保存经常以干燥的形式或冷冻的形式。Vilg&Undeland(2017)J.Appl.Phycol.29:585描述了从冷冻的海草或冷冻干燥的海草中提取蛋白质。Postma等J Appl Phycol(2018)30:1281研究了从干燥海草的不同的蛋白质提取方法。Maehre等2016Mar.drgus 14:196描述了来自干燥海草优化的碱性蛋白质提取。Harnedy&FitzGerald 2013Food Sci technol 51:375描述了另一优化的从烘干的帕尔玛利亚掌叶红藻(Palmaria palmate)的碱性蛋白质提取。保存,且尤其用于干燥海草的热,可导致蛋白质变形或变性,并且因此导致官能度的减少以及相关的价值减小。另外,用于干燥大量的湿藻类生物质的加热要求大量的(成本高的)能量。另一缺点是通常将防腐剂添加至藻类生物质。这些防腐剂可终止于最终的食品中或如果酸(青贮)处理的话,也将破坏藻类成分,这是非期望的。
期望具有更有效、更经济和更温和的用于海草加工的方法,其产生良好质量的功能蛋白质产物,通常是完整的蛋白质产物,其可用于食品应用并且允许在蛋白质分离之后从剩余的生物质的进一步价值提取。
附图简述
图l根据本发明的装置的一个实施方式,包括收获和冲洗单元2;用于酶消化的加工单元3,用于蛋白质的分离和浓缩的回收单元4,厌氧消化加工单元6,用于回收来自6的产物的回收单元7和用于配制来自回收单元4或7的产物8的配制单元5。
具体实施方式
在一个方面中,本发明涉及用于加工藻类的方法。方法包括(i)使藻类进行渗透休克(osmotic shock);(ii)用包括细胞壁降解酶的酶组合物处理休克的藻类;(iii)将酶处理的藻类分离成固相和液相,其中在收获之后的三小时内开始藻类的酶处理和步骤(i)至步骤(iii)中的温度在4℃至30℃的范围内。
在常规的行业中,如果收获和加工发生在不同的场所,则生物质通常从收获的场所运输至加工的场所。在根据本发明的方法中,不是将收获的生物质带至加工场所,而是将加工设备(plant)带至收获生物质的场所,以便尽可能新鲜地加工生物质,以产生最高功能价值的成分。在根据本发明的方法中,在收获的场所或非常接近收获的场所加工藻类。如果藻类在另一场所而不是在主加工场所收获,例如近海收获(海藻类,也称为海草或大型藻类,通常是该情况),则这是特别有利的。使用本发明的工艺,在开始加工之前,藻类几乎没有机会分解或劣化。也避免了用于将例如,海草带到加工设备(海草包括大于90%w/w的水)的水路运输的高成本。所以,从藻类获得的蛋白质具有良好的质量,显示功能特性,例如良好的溶解度,可更经济地生产并且可用于食品应用。
根据本发明的方法的另一优势是在提取蛋白质之后,剩余的生物质可用于进一步价值提取。例如,生物质可用于生产沼气或回收矿物质。在根据本发明的一个实施方式中,将提取蛋白质之后剩余的生物质暴露于碳水化合物酶酶混合物,以便释放糖。接着,将富含碳水化合物的水解生物质进料至厌氧消化器,以产生沼气和富含矿物质的水流。后者可用作肥料组合物或用在肥料组合物中,肥料组合物也为本发明的一部分。从该富含碳水化合物的部分中,也可收回其他食物成分,比如例如糖、藻酸盐、角叉菜胶和岩藻依聚糖。
尽管方法对于加工海洋藻类非常有利,但是方法可用于任何类型的藻类加工,无论其是在陆地上还是近海的。在一个实施方式中,方法用于将藻类(尤其海草或大型藻类)近海加工成蛋白质,任选地随后从在蛋白质回收之后剩余的藻类生物质中进一步生产沼气或肥料组合物。术语“沼气”指生物质的厌氧消化或厌氧发酵的产物。沼气主要包括甲烷和二氧化碳,并且可具有少量的硫化氢、水分和硅氧烷。
在加工场所和收获场所分开的情况下收获生物质比如藻类时,本发明的方法是特别有利的,因为该方法允许立即加工生物质。通常快速开始加工,以使藻类暴露于空气或氧的时间最小化,比如从收获起的30分钟内、从收获起的60分钟内、从收获起的90分钟内、从收获起的2小时内、从收获起的2.5小时内或从收获起的3小时内。
在本上下文中,术语“加工”指包括用细胞壁降解酶破坏藻类细胞或处理藻类生物质的工艺。仅仅干燥藻类生物质,而没有进一步破坏细胞或没有酶处理不视为开始加工。
在本发明的上下文中,“近海(offshore)”指海水地点或淡水地点,比如在大海、海洋、河口、河流或湖泊中;海岸或河岸。在一个实施方式中,海水地点或淡水地点为距离岸边、海岸或河岸至少1km,比如距离岸边、海岸或河岸在1km和200km之间、在1km和50km之间或在50km和200km之间。近海不是指陆地上的池塘或水沟。
因为加工期间的温度从不超过30℃,并且优选地在4℃和30℃之间、在5℃和25℃之间或在15℃和25℃之间,所以从藻类分离的蛋白质不经受变形或变性,并且保留了其功能特性,比如例如其溶解度。使用根据本发明的方法,可获得干燥的或浓缩的液体藻类蛋白质。
在根据本发明的方法中使用新鲜的藻类。在本发明的上下文中,“新鲜的藻类”指如收获的,而不进一步加工(比如干燥和冷冻)的藻类。所以,术语“新鲜的藻类”不包括干燥的、粉末化的、再水化的、冷冻的、青贮的(ensiled)或解冻的藻类。新鲜的藻类通常具有的水含量在80%w/w和95%w/w之间的范围内。少于四小时之前,比如三小时之前、两个小时之前或一小时之前,收获新鲜收获的藻类。
除了藻类之外,收获物(harvest)可包括小型海洋生物或其他固体,比如塑料(其优选地在加工藻类之前去除)。藻类可占收获物中的海洋生物的86%w/w至100%w/w之间。在优选的实施方式中,藻类占收获物中的海洋生物的90%w/w至100%w/w或99%w/w至100%w/w。收获指将藻类与周围的水分开,比如从海水地点或淡水地点,比如湖泊、河流或大海、河口或海洋回收藻类。可通过任何适当的手段收获藻类,例如通过收集自由漂浮藻类或通过从其上播种和生长出藻类生物质的网和绳子切割或剥离藻类生物质。在一个实施方式中,藻类或海草播种在培养绳子上。接着,收获包括从绳子剥离藻类或海草。
在从海水地点或淡水地点收获藻类之后的30分钟至两或三小时内,藻类进行渗透休克,其导致藻类的破坏并且导致细胞内含物的释放。渗透休克可部分或完全释放细胞内含物。渗透休克可破坏所有的藻类细胞或部分藻类细胞,比如例如至少50%、至少60%或至少75%的藻类细胞。可通过任何适当的手段实现渗透休克,比如通过使用水,只要温度从不超过30℃即可。渗透休克期间的温度优选地在4℃和30℃之间、在5℃和25℃之间或在15℃和25℃之间。在一个实施方式中,去矿物质水用于给予海草渗透休克。基于湿藻类的重量,优选地以1:1至1:10的藻类:水的比例使用去矿物质水。渗透休克处理通常持续5分钟至60分钟,优选5分钟至20分钟。
在它们进行渗透休克之前,可将藻类的尺寸调整为小块,例如通过将它们切割或切片,或将它们放入搅拌机或切割机中。在一个实施方式中,在去矿物质水中将藻类的尺寸调整为小块,其意味着在它们进行渗透休克的同时,将它们的尺寸调整为小块。
在收获之后立即或几乎立即,并且在它们进行渗透休克之前,可冲洗藻类,以去除小的海洋生物,比如鱼类、甲壳类和蟹类,并且去除碎片,比如塑料、漂浮的木材或浮标。对于冲洗,可使用例如过量的温度在4℃和30℃之间的海水。
在收获之后立即或几乎立即,并且在它们进行渗透休克之前,可去除附着的海水。为了不损伤藻类,可通过低速离心去除附着的海水。在一个实施方式中,通过以100rpm至500rpm、优选以100rpm至200rpm或者200rpm至300rpm离心,去除附着的海水。
在本发明的上下文中,术语“藻类(algae)”指一组单细胞或多细胞的光合作用的真核非维管水生生物体,其生活在大海里或大海中、半咸水或淡水里或半咸水或淡水中,并且其含有多种多样的在农业、化妆品行业、食品或饲料行业或制药行业中使用的生物活性化合物。尤其,海草富含显示抗微生物活性、抗氧化剂活性或抗病毒的活性的多糖。海草含有有价值的分子,比如蛋白质、维生素、孢子元件、多酚、碘、藻酸和衍生物、角叉菜胶、叶绿素、类胡萝卜素和琼脂。根据本发明的方法可用于加工藻类,尤其海藻类,也称为海草或大型藻类,比如红藻(红藻门(Rhodophyta))、绿藻(绿藻门(Chlorophyta))和褐藻(褐藻门(Ochrophyta),褐藻纲(Phaeophyceae))。可在根据本发明的方法中使用的藻类包括但不限于翅藻属(Alaria)物种、泡叶藻属(Ascophyllum)物种、蕨藻属(Caulerpa)物种、角叉菜属(Chondrus)物种、公牛藻属(Durvillaea)物种、浒苔属(Enteromorpha)物种、墨角藻属(Fucus)物种、江蓠属(Gracilaria)物种、昆布属(Laminara)物种、鹿角菜属(Pelvetia)物种、紫菜属(Pyropia)物种、紫菜属(Porphyra)物种、马尾藻属(Sargassum)物种、海带属(Saccharina)物种、石莼属(Ulva)物种和裙带菜属(Undoria)物种。特别感兴趣的为泡叶藻(Ascophyllum nodosum)、皱波角叉菜(Chondrus crispus)、浒苔(Enteromorphaintestinalis)、螺旋墨角藻(Fucus spiralis)、墨角藻(Fucus vesiculosus)、脆江蓠(Gracilaria bursa-pastoris)、厚江蓠(Gracilaria crassa)、硬江蓠(Gracilariadura)、Gracilaria longa、真江蓠(Gracilaria verrucosa)、掌状海带(Laminariadigitata)、楔基海带(Laminaria ochroleuca)、Laminaria pallida、黑色来生藻(Lessonia nigrescens)、Macrocystis integrifolia、巨藻(Macrocystis pyrifera)、海蕴(Nemacystus decipiens)、公牛海带(Nereocystis luetkeana)、帕尔玛利亚掌叶红藻(Palmaria palmata)、Porphyra purpurea、脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)、日本海带(Saccharina japonica)、糖巨藻(Saccharina latissima)、Saccharina longicruris、Saccharina sessilis、悬疣马尾藻(Sargassum filipendula)、羊栖菜(Sargassumfusiforme)、钝马尾藻(Sargassum muticum)、肠石莼(Ulva intestinalis)、扁石莼(Ulvacompressa)、石莼莴苣(Ulva lactuca)和裙带菜(Undaria pinantifida)。在一个实施方式中,在根据本发明的方法中加工一个或多个上面的物种或两个或更多个提到的物种的组合。在优选的实施方式中,加工绿藻,尤其石莼物种,更尤其石莼莴苣。
在收获之后的两小时至三小时内,用包括细胞壁降解酶的组合物处理破裂的藻类生物质。组合物用于释放与其他细胞团,比如细胞壁和细胞器相连或相关的蛋白质。在一个实施方式中,基于酶组合物的总重,酶组合物包括至少0.10%w/w的细胞壁降解酶,例如所有基于酶组合物的总重的0.10%w/w至100%w/w、0.20%w/w至95%w/w、0.50%w/w至90%w/w、1.0%w/w至90%w/w、1.0%w/w至10%w/w、1.0%w/w至20%w/w、10%w/w至20%w/w、20%w/w至65%w/w、70%w/w至95%w/w或80%w/w至95%w/w。在另一实施方式中,酶组合物由细胞壁降解酶组成。
可在酶组合物中存在的适当的细胞壁降解酶包括但不限于纤维素酶(EC3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8和EC 3.2.1.32)、β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、淀粉酶(EC3.2.1.1和EC 3.2.1.2)、植酸酶(EC 3.1.3.8和EC 3.1.3.26)、磷脂酶(PLA1、PLA2、PLB、PLC、PLD、EC 3.1.1.4、EC 3.1.4.11和EC 3.1.4.4)和聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)。在一个实施方式中,细胞壁降解酶为酶组合物中的主要活性,在另一实施方式中,细胞壁降解酶为酶组合物中的副活性或次活性。酶组合物包括一种或多种这些细胞壁降解酶。本领域技术人员将理解,酶的最佳混合物可在藻类的类型和季节之间变化。所以,可使用细胞壁降解酶的任何混合物,只要其作用于新鲜的藻类或新鲜收获的藻类即可。在一个实施方式中,用包括纤维素酶、内切木聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶和磷脂酶PLA2的组合的酶组合物处理破裂的藻类。在另一实施方式中,用包括植酸酶(EC3.1.3.8)和磷脂酶(PLA1、PLA2、PLB、PLC、PLD、EC 3.1.1.4、EC 3.1.4.11和EC 3.1.4.4)的酶组合物处理破裂的藻类生物质。在另一实施方式中,用包括内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)和磷脂酶(PLA1、PLA2、PLB、PLC、PLD、EC 3.1.1.4、EC 3.1.4.11和EC 3.1.4.4)的酶组合物处理破裂的藻类生物质。在一个实施方式中,使用包括针对纤维素、木聚糖、β-葡聚糖、淀粉酶、植酸盐(phytate)、果胶、半乳糖醛酸或磷脂具有活性的酶的酶组合物。在另一实施方式中,使用包括β-葡聚糖酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶和磷脂酶的酶组合物。在另一实施方式中,使用包括活性为至少20 000AVJP/g的聚半乳糖醛酸酶;活性为至少80BGLU/g的内切1,3β葡聚糖酶;活性为至少100000BGF/g的真菌β葡聚糖酶;活性为至少7500U/g的细菌淀粉酶;活性为至少5000FTU/g的植酸酶;磷脂酶A2和木聚糖酶的酶组合物。在使用之前,这些酶以1:1:1:1:1:1的比例混合并且混合物的用量为每1000kg的100%干物质生物质500ml。这些酶是商业上可得的,例如来自荷兰代尔夫特DSM。
可通过,比如从植物、真菌或细菌中分离,通过从头合成或通过已知酶的诱变,而获得酶组合物中的细胞壁降解酶。
细胞壁降解酶用于释放部分或所有的细胞内蛋白质,包括与其他细胞团相连或相关的那些。在一个实施方式中,释放至少30%w/w、至少40%w/w、至少50%w/w、至少60%w/w、至少70%w/w、至少80%w/w、至少90%w/w,比如在30%w/w和60%w/w之间、在45%w/w和70%w/w之间或在50%w/w和90%w/w之间的细胞内蛋白质。
可使用任何适当的剂量的酶制剂。在一个实施方式中,每1000kg的100%干物质生物质,使用0.001%w/w至5%w/w、0.005%w/w至2%w/w或0.01%w/w至1%w/w的细胞壁降解酶组合物。藻类的干物质含量可通过本领域已知的任何方法确定,并且通常包括通过水的蒸发去除藻类样品或藻类中的所有水分,例如通过使藻类的代表性样品在烤箱中干燥并且在干燥之前和之后称重样品。
取决于酶剂量,可花费约5分钟至50小时、30分钟至48小时、6小时至24小时、18小时至30小时、或30小时至50小时,使得部分或所有的细胞内蛋白质可用。在一个实施方式中,将破裂的藻类生物质酶处理24小时至48小时。在酶处理期间,温度不超过30℃,并且优选地在4℃和30℃之间、在5℃和25℃之间或在15℃和25℃之间。
在加工的任何步骤中,不需要调整pH。原样(as is)使用pH并且通常在pH 5.5至pH7.5的范围内,例如pH 6.0至pH 7.5的范围内。
在酶处理之后,将固体和液相分离(步骤(iii)),优选地通过离心或过滤。使用离心,获得了球团(pellet)和含有蛋白质的上清液。使用过滤,获得了截留物质和含有蛋白质的滤液。
通常通过浓缩,可从上清液或滤液回收蛋白质。浓缩可通过任何适当的手段,比如通过超滤、离心、沉淀或纳米过滤,只要温度不超过30℃即可,并且优选地在4℃和30℃之间、在5℃和25℃之间或在15℃和25℃之间。可储存浓缩的蛋白质直到使用。浓缩的蛋白质可容易运输至另一地点,例如,如果近海进行收获和加工,则运输至岸边。从新鲜的藻类分离的蛋白质比经常从干燥藻类制备的商业藻类蛋白质具有更好的官能度,并且可用在蛋白质或藻类蛋白质的已知应用中,比如用在食品行业中、饲料行业中、化妆品行业中或制药行业中,例如,作为起泡剂、凝胶剂、增稠剂、乳化剂、着色剂、颜料、抗氧化剂或抗微生物剂。
任选地,在陆地上或近海将蛋白质干燥,优选地通过速干方法,比如喷雾干燥。在一个实施方式中,使用箱式干燥器(丹麦欧登塞,Sanovo technology A/S),通过喷雾干燥,将蛋白质速干。用于箱式干燥的适当的条件为,例如175℃至185℃的范围内的入口温度和90℃至97℃的范围内的出口温度。可在干燥之前或干燥期间将蛋白质浓缩。
使用根据本发明的方法,可以以高收率获得蛋白质,比如例如,基于新鲜的藻类中的总蛋白质,可获得至少65%w/w、至少70%w/w、至少75%w/w、至少80%w/w、至少85%w/w或至少90%w/w的收率。
在将蛋白质分离之后的步骤(iii)中获得的固相,例如球团或截留物质,含有碳水化合物,其包括糖、脂肪、油和矿物质。作为固相的主要成分的碳水化合物可用于生产可再生能源,比如沼气、生物乙醇或生物塑料。矿物质可用作肥料。脂肪和油可用于饲料、食品、化妆品或药学应用。在提取蛋白质之后,剩余的生物质可因此用于进一步价值提取。
已经公开了用于通过厌氧消化从生物质生产沼气的许多适当的方法,比如使用一个反应器的一级工艺,和使用两个反应器的两级工艺,两种工艺都包括(a)水解和酸化以及(b)乙酸生成或甲烷生成的步骤。在两级工艺中,步骤(a)和步骤(b)在分开的反应器或隔室中进行。这些步骤都可用微生物进行。可替选地,步骤(a)使用酶制剂通过酶进行,并且步骤(b)用微生物进行,例如,如在WO 2013/000928中描述。在用于沼气生产的优选的实施方式中,在蛋白质提取之后剩余的固相进行两级工艺并且在通过产甲烷的生物体的微生物消化之前首先进行酶处理。可存在于酶组合物中的适当的碳水化合物降解酶包括但不限于淀粉酶(EC 3.2.1.1和EC 3.2.1.2)、葡糖氧化酶(EC 1.1.3.4)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8和EC 3.2.1.32)、β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、植酸酶(EC 3.1.3.8和EC3.1.3.26)、磷脂酶(PLA1、PLA2、PLB、PLC、PLD、EC 3.1.1.4、EC 3.1.4.11和EC 3.1.4.4)和聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)。酶组合物可包括一种或多种碳水化合物降解酶。本领域技术人员将理解,酶的最佳混合物可在藻类的类型和季节之间变化。所以,可使用碳水化合物降解酶的任何混合物,只要其作用于在从新鲜的藻类或新鲜收获的藻类中蛋白质提取之后获得的生物质即可。在一个实施方式中,细胞碳水化合物降解酶为酶组合物中的主要活性,在另一实施方式,碳水化合物降解酶为酶组合物中的副活性或次活性。所有的酶是商业上可得的,例如来自荷兰代尔夫特DSM。可使用任何适当的剂量的酶制剂。在一个实施方式中,使用包括活性为至少3500CMC U/g的纤维素酶、活性为至少100000BGF/g的葡聚糖酶、活性为至少120000\AVJP/g的木聚糖酶和活性为至少5000FTU/g的植酸酶的酶混合物,优选地包括1:2:2:1的重量比的酶并且混合物的用量为每kg蛋白质提取之后的湿重生物质0.05ml。
优选地,碳水化合物的酶水解和微生物消化发生在分开的反应器或分开的隔室中。任何适当的反应器配置可用于根据本发明的沼气生产,例如持续搅拌罐反应器(CSTR)、连续批式反应器(SBR)或厌氧膜生物反应器(AnMBR)。优选地,使用更精密的***,比如上流式厌氧污泥床反应器(UASB)或膨胀粒状污泥床(EGSB)。
从已经首先去除了蛋白质部分的新鲜的藻类生产沼气是非常有利的,因为与其中在酶处理之前还未去除蛋白质的常规沼气工艺相比,其可引起更高的产率的沼气以及含有更少的含氮杂质的更清洁的沼气。在约12小时停留时间之后,沼气收率可为约250Nm3至600Nm3,比如300Nm3至500Nm3或400Nm3至500Nm3沼气/1000kg的100%干重藻类,甲烷为60%至80%,比如70%。在一个实施方式中,在12小时停留时间时,生产460Nm3沼气/1000kg的100%干重海草,甲烷为70%。
所以,在去除大部分或所有的藻类蛋白质之后从新鲜的海草产生的清洁沼气为本发明的另一方面。本领域技术人员将理解,在分开用于沼气生产的固相之后,可从含蛋白质的液相中提取或不提取蛋白质。无论如何,将获得清洁的沼气。在一个实施方式中,本发明所以涉及下述方法:
(i)使藻类进行渗透休克;
(ii)用包括细胞壁降解酶的酶组合物处理休克的藻类;
(iii)将酶处理的藻类分离成固相和液相,其中在收获之后的三小时内开始藻类的酶处理,并且步骤(i)至步骤(iii)中的温度在4℃至30℃的范围内;
(iv)使用步骤(iii)中获得的固相用于生产沼气,优选地通过使用碳水化合物降解酶的酶水解,随后微生物甲烷生成;
(v)任选地,从在步骤(iii)中获得的液相中回收蛋白质。
优选地通过两级工艺生产沼气,其包括使用碳水化合物分解酶酶制剂的固相的酶水解,随后微生物甲烷生成。可替选地,固相可使用本领域已知的气化工艺转化成合成气。
在另一方面中,本发明涉及可通过根据本发明的工艺获得的,即从加工新鲜的藻类获得的藻类蛋白质制剂。从新鲜的藻类获得的藻类蛋白质制剂将具有良好的功能蛋白质特性,比如例如溶解度。其溶解度通常比从保存的海草,比如干燥海草制备的蛋白质的溶解度好,比如好两倍或三倍。在一个实施方式中,在pH 3至pH10的范围内的pH,基于形成分散体(dispersion)的总蛋白质,从新鲜的藻类获得的蛋白质制剂具有至少55%w/w、至少60%w/w、至少65%w/w或至少70%w/w的溶解度。在存在NaCl的情况下,溶解度也为良好的并且通常比从保存的海藻,比如干燥的海草制备的蛋白质的溶解度好,比如好三倍或四倍。在一个实施方式中,在存在NaCl的情况下,基于形成分散体的总蛋白质,从新鲜的藻类获得的蛋白质制剂具有至少55%w/w、至少60%w/w、至少65%w/w、至少70%w/w、至少75%w/w或至少80%w/w的溶解度。在一个实施方式中,在0.05%w/v至3%w/v NaCl的范围内的任何NaCl浓度,根据本发明的蛋白质具有1mg/ml的溶解度。在一个实施方式中,根据本发明的蛋白质在pH3至pH10的范围内的任何pH,具有至少55%w/w、至少60%w/w、至少65%w/w、至少70%w/w、至少75%w/w或至少80%w/w的溶解度,并且在存在0.05%w/v至3%w/v NaCl的情况下,具有至少55%w/w、至少60%w/w、至少65%w/w、至少70%w/w、至少75%w/w或至少80%w/w的溶解度。在不同pH值或NaCl浓度的溶解度可例如通过如下确定:将一定量的干燥产物分散在去矿物质水(demiwater)中,接着用磷酸或氢氧化钠调整pH,或接着用NaCl调整盐浓度,并且接下来将分散体/溶液离心。可接着,测量上清液中溶解的蛋白质,例如通过使用商业试剂盒,比如PierceTM BCA蛋白质试验试剂盒(荷兰布雷斯维克,Thermo Scientific)并且在分光计中在562nm测量吸收。蛋白质可具有在7.5至8.5的范围内的pH处的等电点。
本领域技术人员将理解,获得的蛋白质的精确的氨基酸组成可在海草类型之间变化,但是根据本发明的蛋白质可具有高水平的天冬酰胺或谷氨酰胺,例如基于总氨基酸的重量,至少10%w/w或至少15%w/w。其也可具有大量的甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸,例如基于总氨基酸的重量,至少5%w/w、至少7%w/w或至少10%w/w。
蛋白质也可具有良好的营养以及功能特性,比如起泡、乳化或水结合特性,并且可用在许多应用中,尤其用在食品、医药和化妆品以及饲料应用中。
在一个实施方式中,本发明涉及包括两种或更多种下述特点的藻类蛋白质或蛋白质制剂:
a)基于总氨基酸的重量,包括至少10%w/w或至少15%w/w的天冬酰胺或谷氨酰胺;
b)基于总氨基酸的重量,包括至少5%w/w、至少7%w/w或至少10%w/w的甘氨酸、脯氨酸或丙氨酸;
c)在pH3至pH10的范围内的任何pH,包括至少55%w/w、至少60%w/w、至少65%w/w、至少70%w/w、至少75%w/w或至少80%w/w的溶解度;
d)在0.05%w/v和3%w/v NaCl的范围内的任何NaCl浓度,至少55%w/w、至少60%w/w、至少65%w/w、至少70%w/w、至少75%w/w或至少80%w/w的溶解度;
e)在0.05%w/v和3%w/v NaCl的范围内的任何NaCl浓度,包括至少1mg/ml的溶解度;
f)包括在pH7至pH 9的范围内的pH处的等电点;
g)包括与卵蛋白(egg protein)相当的乳化特性。
在一个实施方式中,根据本发明的藻类蛋白质或蛋白质制剂具有所有这些特点。
在另一方面中,本发明涉及用于根据本发明的加工方法加工藻类的装置1(图1)。装置1为可移动的并且所以可移动至收获的场所或被带至收获的场所。装置包括用于收获、清洁和冲洗的收获单元2;用于收获物的酶消化的加工单元3;以及用于蛋白质的分离和浓缩的回收单元4。装置可任选地进一步包括厌氧消化加工单元6、用于回收和任选地浓缩来自6的产物的回收单元7和用于配制来自回收单元4或回收单元7的产物的配制单元5。装置可包括可移动单元或安装在可移动单元中、安装在可移动单元处、安装在可移动单元上或安装至可移动单元,该可移动单元可航行或可被拖拽至其中藻类茂盛、藻类生长或种植藻类的地方,例如至轮船、驳船或船舶(vessel)。这样,可在其中在一年的某些时间存在藻类的具体的场所收获藻类。
在一个实施方式中,本发明涉及用于加工藻类的方法,其中方法包括:
(i)使藻类进行渗透休克;
(ii)用包括细胞壁降解酶的酶组合物处理休克的藻类;
(iii)将酶处理的藻类分离成固相和液相,其中在收获之后的三小时内开始藻类的酶处理,并且在步骤(i)至步骤(iii)中的温度在4℃至30℃的范围内;
(iv)使步骤(iii)的液相干燥,以获得蛋白质,优选地通过喷雾干燥;
(v)任选地,使用步骤(iii)中获得的固相用于生产沼气、生物塑料或生物乙醇,其中步骤(i)至步骤(v)在根据本发明的可移动装置上近海进行。
本领域技术人员将理解,上面提到的实施方式可被组合以形成新的实施方式。为加工的方法提到的实施方式和优选的实施方式也可应用于根据本发明的加工方法的产物,比如蛋白质、沼气、矿物质流和可移动装置,并且反之亦然。
实施例
材料和方法
酶制剂A
用于释放细胞内含物的酶制剂含有下述酶(所有都来自荷兰代尔夫特DSM,除非另有说明):
-2ml纤维素酶(Filtrase BRX),
-2ml木聚糖酶(Filtrase NLC),
-2ml淀粉酶(MATS classic),
-2ml植酸酶(Phytase 5000L),
-2ml磷脂酶A2(Purifinae PLA2),和
-90ml去矿物质水,
-2gβ-葡聚糖酶/内切木聚糖酶(Battonage,Oenobrands,Montferrer-sur-Iez,法国),其在温和搅拌下溶于液体形式的前面提到的酶中。对于稀释的酶制剂,用去矿物质水稀释酶制剂。
实施例1使用根据本发明的方法加工绿藻
收获新鲜的绿藻(石莼莴苣,5kg)并且使用温度最高为20℃的过量新鲜海水冲洗。通过低速离心去除附着的水。接着,添加5升去矿物质的、冷却的水并且将混合物在搅拌机中切碎,直到获得约1mm2的块。将切片的生物质分成两个部分。向一个部分-对照中添加25ml去矿物质水。将另一部分,在收获之后的一小时内,用25ml的十倍稀释的酶制剂A培育,用于释放细胞内含物。
在室温(实际<20℃),将两个部分搅拌24小时,然后在4℃,4500rpm离心10分钟并且收集上清液。将球团在去矿物质水中再悬浮,再次离心和收集上清液并且添加至第一次的上清液。将收集的上清液冷冻,直到进一步分析。进一步分析显示上清液含有蛋白质。这显示使用根据本发明的温和工艺可从藻类分离蛋白质。通过喷雾干燥上清液而将蛋白质干燥并且储存用于进一步分析。
实施例2使用根据本发明的方法加工红藻
收获新鲜的红藻(江蓠(Gracillaria),5kg)并且使用最高温度为20℃的过量新鲜海水冲洗。通过低速离心去除附着的水,并且切割成约1mm2的块并且如实施例1中描述的进一步处理,包括在收获之后的两个小时内酶处理。将收集的上清液冷冻,直到进一步分析。进一步分析显示来自江蓠的上清液含有蛋白质。而且,收获另一类型的红藻,新鲜的角叉菜(Chondrus)并且使用如实施例1中描述的方案加工,包括在收获之后的两个小时内酶处理。将收集的上清液冷冻,直到进一步分析。进一步分析显示来自角叉菜的上清液含有蛋白质。这显示使用根据本发明的温和工艺可从红藻分离蛋白质。
实施例3使用根据本发明的方法加工褐藻
收获新鲜的褐藻(墨角藻(Fucus)),并且使用温度最高为20℃的过量新鲜海水冲洗。通过低速离心去除附着的水,并且将藻类切割成约1mm2的块并且如实施例1中描述的进一步处理,包括在收获之后的两个小时内酶处理。将收集的上清液冷冻,直到进一步分析。进一步分析显示上清液含有蛋白质。该实施例显示根据本发明的工艺也可用于来自褐藻的蛋白质分离。
实施例4大规模加工用于在级联工艺中分离蛋白质和生产沼气的新鲜石莼。
收获绿藻(石莼莴苣,76kg),并且使用温度最高为20℃的过量新鲜海水冲洗。通过低速离心去除附着的水。将1kg海草的部分与1升的去矿物质水混合,并且在Robot Coupe切割机R10中切碎成约1mm2的块。用另外的1升去矿物质水,将切碎的海草放入清洁的新的1000升IBC中。在收获之后的三小时内,将总共76kg的石莼用600升的去矿物质水在恒定温和搅拌下培育24小时。在开始24小时培育时间段时,添加酶制剂A(500ml酶混合物/1000kg的100%干物质生物质)。在培育时间段之后,通过在4次折叠的纱布上过滤总料浆,去除剩余的海草固体。收集穿过纱布的液体,含蛋白质的部分,滤液并且通过使用入口温度为180℃和出口温度为94℃的箱式干燥器(丹麦欧登塞,Sanovo technology A/S),使上清液喷雾干燥,而将蛋白质干燥。接着,如在下面的实施例中描述的表征喷雾干燥的蛋白质。根据本发明的方法的蛋白质提取效率呈现在表1中并且基于起始材料中存在的总蛋白质的干重和以百分数计,为约81%w/w。使用BCA试验(荷兰布雷斯维克,Thermo Scientific)测量蛋白质。
表1
接着,将纱布中保留的固体用包括重量比为1:2:2:1的纤维素酶Methaplus L100(>3500CMC U/g)/葡聚糖酶;Axiase 100(>120000AVJP/g)/木聚糖酶;Filtrase NLC(>100000BGF/g)和植酸酶;Maxamyl P(>5000FTu/g)(所有的酶来自荷兰DSM.Delft)的碳水化合物分解酶酶制剂再培育48小时,并且用量为蛋白质提取之后的每kg湿重生物质0.05ml(混合物),以便将尽可能多的碳水化合物水解至溶液中。将这些水解的固体转移至厌氧消化器(Hydrothane的EGSB-skid),用于产生沼气和富含矿物质的水流,该矿物质流可用作肥料。沼气转化显示不需要pH稳定剂,也不需要另外的养分,并且在12小时的停留时间,可实现70%甲烷的460Nm3沼气/1000kg 100%干重海草的结果。这是比当使用所有的微生物工艺,即不用酶处理时,或当使用总海草,而不首先提取蛋白质时可预期的收率高很多的收率。
实施例5根据本发明的方法分离的GOA蛋白质的SDS Page分析。
使用SDS-PAGE分析在实施例4中获得的喷雾干燥的蛋白质。根据Laemmli(1970)Nature 227:5259,进行电泳。在用热空气将海草干燥,将其研磨成薄片并且在分离蛋白质之前将其储存八周之后,从石莼获得的蛋白质样品(中国,Hello Seaweed,FuzhouBeautiful Agricultural Co)当作参考。对于SDS-PAGE分析,将两种样品暴露于淡水。干燥的海草样品经历数小时的再水合时间并且GOA样品经历相同的时间量,以再溶解,二者都在温和搅拌下。在离心之后,丢弃球团并且回收含有蛋白质的上清液。从上清液用移液管吸取来自每个样品的等分试样,接着,用提取缓冲液(1.5%SDS、20%甘油和0.01%溴酚蓝)稀释至类似的蛋白质浓度。在快速染色即用型凝胶(德国,SERVA电泳GmbH)中,使凝胶蛋白质条带显影。用免费软件:GelAnalyzer 2010进行凝胶分析。使用6kDa-67kDa的标记组。SDS-PAGE分析显示从新鲜的石莼海草中获得的GOA蛋白质样品相比从干燥材料获得的石莼参考样品含有更多的分子尺寸大于40kDa的蛋白质。GOA样品具有几乎两倍量的27kDa至30kDa蛋白质并且含有更少的尺寸较小的6kDa范围的蛋白质(表2)。这些结果指示从新鲜的海草获得的蛋白质样品相比来自干燥海草的样品,含有更多的完整蛋白质和更少的劣化蛋白质。更多的完整蛋白质也意味着更多的功能蛋白质。蛋白质的降解对于功能特性,比如乳化作用、粘度和热定型胶凝是有害的。
表2
实施例6根据本发明的蛋白质样品的氨基酸组成
实施例4的喷雾干燥的蛋白质样品的氨基酸组成通过酸水解和HPLC确定并且呈现在表3中。蛋白质含有高水平的天冬酰胺(总氨基酸的15%)和谷氨酰胺(氨基酸的20%),以及大量的甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸。
表3
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实施例7在不同pH值的蛋白质溶解度
为了分析在实施例4中获得的喷雾干燥的蛋白质样品(GOA样品)的蛋白质溶解度,将GOA蛋白质样品的1g干燥产物分散在100ml去矿物质水中。在相同实验中运行从干燥的和研磨的石莼中获得的样品。石莼样品中,使用2g干燥的石莼/100ml去矿物质水,以便在测试中具有相当量的蛋白质载荷。用磷酸(低pH)和氢氧化钠(高pH),将分散体调整在pH 3、4、4.5、5、6、7、8、9。然后,将分散体/溶液离心。在各自试管中,从上清液中用移液管吸取100微升等分试样,并且稀释至适于使用Shimadzu UV/VIS分光计在562nm,用PierceTM BCA蛋白质分析试剂盒(荷兰布雷斯维克,Thermo Scientific)的可溶性蛋白质分析的浓度范围。接着,为在BCA分析中使用的样品重量和稀释系数,校正测量的蛋白质mg/ml。海草蛋白质的溶解度显示很少的变化并且为相对恒定的。表4为石莼和GOA蛋白质的溶解度的比较,并且清楚地显示GOA蛋白质样品的溶解度比石莼参考样品溶解度高3至12倍。对于GOA蛋白质样品,平均蛋白质溶解度高5倍。结果也显示对于石莼38%的变化度(variability),与对于GOA仅仅5%的变化度,指示石莼相比GOA对pH更敏感,石莼在pH 6显示最小溶解度。这意味着从新鲜的海草中分离蛋白质允许蛋白质样品的制剂相比来自干燥海草的蛋白质样品具有高得多的溶解度并且在整个pH范围内恒定得多。
表4
呈现的结果也指示三种蛋白质样品的不同的等电点。溶解度的下降指示等电点。这样,GOA样品的等电点在pH 8附近并且石莼参考样品的等电点在pH 6附近。这些结果指示从新鲜的海草分离蛋白质导致具有不同的等电点并且因此在应用中具有不同的pH行为的蛋白质。
表5
样品 | 估计的等电点(pH) |
卵白蛋白 | 4.5 |
干燥的石莼 | 6 |
本发明的GOA样品 | 8 |
实施例8来自新鲜的海草的蛋白质样品的盐敏感性
为了分析在存在不同浓度的NaCl的情况下的蛋白质溶解度,将实施例4中获得的1g喷雾干燥的蛋白质样品(GOA样品)分散在100ml去矿物质水中。卵白蛋白(EA)样品和从干燥和研磨的石莼中获得的样品在相同的实验中运行作为参考。石莼样品中,使用2g以便在测试中具有相当量的蛋白质载荷。将来自GOA、石莼和EA的溶解的蛋白质在去矿物质水中稀释,以减少样品的盐作用。接着,将稀释的样品设置在0-3%的NaCl浓度。将蛋白质溶液离心并且从各自样品的上清液中用移液管吸取100μl,用于使用在562nm的Shimadzu UV/VIS分光计,用PierceTM BCA蛋白质分析试剂盒(荷兰布雷斯维克,Thermo Scientific)的可溶性蛋白质分析。接着,为在BCA分析中使用的样品重量和稀释系数,校正测量的蛋白质mg/ml。一式两份进行测量。在所有的盐浓度,GOA蛋白质样品比石莼样品具有高得多的溶解度。对于石莼,对于增加盐百分数,平均44±12mg蛋白质为可溶的。对于GOA,对于增加盐百分数,192±11mg蛋白质为可溶的。在存在NaCl的情况下的百分数溶解度显示在表6中。可注意到,GOA的平均蛋白质溶解度比石莼高4倍,并且,相比仅仅为6%的GOA的变化度,石莼的变化度为27%,这指示石莼对于盐浓度的改变更敏感。这显示按照本发明从新鲜的海草中获得的蛋白质样品相比来自干燥海草的蛋白质样品具有更高的溶解度,其稳定性不受高盐浓度的影响。
表6
实施例9制备海绵蛋糕
标准配方(意大利蛋糕形式):9克全蛋粉、221克水、210克糖、150克小麦面粉和75克马铃薯淀粉。全蛋粉用蛋白质,如大豆蛋白质、乳清蛋白质、向日葵蛋白质或根据本发明的GOA-蛋白质替换。
使用Hobart N50,将混合物揉捏成面团。将面团切割为10cm的圆,以形成蛋糕。将面团在180℃的烤箱中烘烤22分钟,直到蛋糕具有漂亮的金色/黄色。从烤箱取出蛋糕并且冷却。由海草(GOA)蛋白质制备的蛋糕具有非常漂亮的外观,与从全蛋蛋白质制备的蛋糕相当。(GOA)海草蛋糕保持圆形并且未破碎,与由其他蛋白质,如大豆蛋白质、乳清蛋白质和向日葵蛋白质制备的当触碰时破碎或具有非常粗糙/不均匀表面的蛋糕不同。这显示,对于面团一致性和烘烤特性,GOA(海草)蛋白质可用作全蛋粉的替换品。
实施例10制备75%蛋黄酱
使用标准配方(Sanovo蛋组):15%蛋黄粉末、107克水、2克盐、375克(菜籽)油和10克醋。所有温和地并且以连续的顺序添加并且通过使用速度混合器(Bosch 300W型4179或Hobart N50)混合。将乳液在2℃-5℃储存24小时,以稳定。在24小时之后,测量粘度。为了比较,用GOA(海草)蛋白质、大豆蛋白质、豌豆蛋白质、向日葵蛋白质替换蛋黄粉末。也测试混合物(50/50)全蛋粉/GOA(海草)蛋白质。
来自在实施例4中获得的海草(GOA)蛋白质的蛋黄酱具有良好的一致性。大豆蛋白质-蛋黄酱乳液或豌豆蛋白质-蛋黄酱乳液甚至在其形成之前就破裂。这显示GOA蛋白质具有与蛋黄相当的良好乳化特性。其也显示GOA蛋白质乳液的良好铲取性和涂抹性。全蛋粉/GOA蛋白质的混合物并不比单个纯蛋白质表现更差。
对于GOA蛋白质主要观察到的区别显示在乳液的非常低的脱水收缩作用中。后者显示GOA蛋白质相比全蛋粉,并且清楚地比其他测试的大豆蛋白质、豌豆蛋白质或向日葵蛋白质的乳液形成更稳定的乳液。在2℃-5℃的4周冷藏储存之后,GOA(海草)蛋白质乳液中仍没有脱水收缩作用,而所有的其他都已经几乎完全变成液体。由于在所有样品上霉菌的形成而停止了实验。
总结,a)通过根据本发明的方法分离的蛋白质允许很好的乳液形成;b)根据本发明的蛋白质和蛋的混合物不影响乳液的特性;c)根据本发明的蛋白质相比测试的蛋白质,如大豆蛋白质、乳清蛋白质、向日葵蛋白质或豌豆蛋白质,显示低得多的脱水收缩作用,其为这种乳液在食品应用中的用途提供了新的机会。
Claims (17)
1.一种用于加工海草的方法,所述方法包括:
(i)使海草进行渗透休克5分钟至20分钟;
(ii)用包括细胞壁降解酶的酶组合物处理休克的海草;
(iii)将酶处理的海草分离成固相和液相;
所述方法特征在于在收获所述海草的三小时内开始所述休克的海草的酶处理并且步骤(i)至步骤(iii)中的温度在4℃至30℃的范围内,并且
其中基于所述海草中的总蛋白质,以至少65% w/w的收率获得蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述海草的加工发生在5℃至25℃的范围内的温度。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述海草的加工发生在15℃至25℃的范围内的温度。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于基于所述海草中的总蛋白质,以至少75% w/w的收率获得蛋白质。
5.根据权利要求l-3中任一项所述的方法,其特征在于加工期间的pH不被调整。
6.根据权利要求l-3中任一项所述的方法,其特征在于加工期间的pH在pH 5.5和pH7.5之间。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于所述细胞壁降解酶组合物包括纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶和磷脂酶中的一种或多种。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于所述方法进一步包括使步骤(iii)的所述液相干燥,以获得蛋白质。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于使步骤(iii)的所述液相干燥以获得蛋白质是通过喷雾干燥。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于所述方法进一步包括使步骤(iii)中获得的固相进行厌氧消化用于生产沼气。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于所述方法进一步包括从步骤(iii)中获得的固相回收矿物质、脂肪或油。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于所述方法进一步包括将步骤(iii)中获得的固相中的碳水化合物转化成生物塑料或生物乙醇。
13.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于通过两级厌氧消化工艺,从在步骤(iii)中获得的所述固相生产沼气,包括用碳水化合物降解酶制剂的水解,随后微生物甲烷生成。
14.根据权利要求13所述的方法,其特征在于所述方法进一步包括回收所述厌氧消化的包含矿物质的水流。
15.通过根据权利要求1-14中任一项所述的方法能够获得的蛋白质。
16.根据权利要求15所述的蛋白质,其特征在于在pH 2至pH 10的范围内的pH或在0.05% w/v和3% w/v NaCl的范围内的NaCl浓度,基于总蛋白质重量具有至少60% w/w的溶解度。
17.根据权利要求15或16所述的蛋白质在食品行业或饲料行业中的用途。
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Biorefinery of the macroalgae ULVA lactuca :extraction of proteins and carbohydrates by mild disintegration;P R Postma 等;Journal of applied phycology;第30卷(第2期);第1281页-1293页 * |
海藻功能物质的提取工艺、理化性质以及在农业领域中的应用;耿银银 等;生态学杂志;第2951-2960页 * |
海藻糖及其在眼科的研究进展;高洪瑞;蒋华;;国际眼科杂志(11);全文 * |
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