CN111741969B - 玉米基因krn2及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了控制玉米穗行数的KRN2基因、与KRN2紧密连锁的分子标记以及它们在分子育种中的应用。

Description

玉米基因KRN2及其用途
技术领域
本发明涉及植物遗传学与分子育种领域。具体地，本发明涉及控制玉米穗行数(KRN)的KRN2基因、与其紧密连锁的分子标记以及它们在分子育种中的应用。
背景技术
玉米是粮食、饲料和经济兼用作物，是世界第一大粮食作物。近年来，我国粮食总产实现“十二连增”，玉米发挥了重要作用，提高玉米产量对保障我国粮食安全具有重要战略意义。然而，随着我国种植结构的调整，我国玉米种植面积将呈现下降的趋势，但我国玉米需求将随着我国国民经济的快速发展和人民生活水平的不断提高而继续保持刚性增长的趋势。因此，提高玉米单产是增加我国粮食总量的重要途径，深入研究玉米产量性状的遗传基础对提高玉米单产具有重要意义。
玉米产量是一个极为复杂的数量性状。在构成玉米产量的诸多因素中，百粒重、穗行数、行粒数是影响玉米产量高低的决定性因素。穗行数(KRN)是指果穗的籽粒行数，其作为玉米产量性状最重要的构成因子之一，与产量显著正相关。在玉米驯化和遗传改良的过程中，穗行数受到强烈的选择，是多个基因位点控制的结果。因此，探明穗行数形成的遗传机理，以及克隆影响玉米穗行数数量变异的主效和微效数量性状位点(QTL)，对认知玉米产量性状形成的机理和深入了解遗传改良中优良等位基因的选择方式等具有重要意义。同时，还可以为玉米产量等性状的分子育种和遗传改良提供重要的理论指导。
然而玉米基因组非常复杂，对数量性状位点进行图位克隆存在很大的难度。图位克隆的主要原理是根据基因在图谱上的相对位置来克隆基因。首先利用初级作图群体对所研究的数量性状进行初步的QTL定位，然后结合回交和分子标记辅助选择，对目标QTL进行前景选择，同时进行背景的负向选择，培育目标QTL的近等基因系、染色体片段替换系或渗入系，再利用这些材料构建较大的分离群体，在目标区域设计特异性引物，对QTL进行精细定位，从而将目标QTL缩小到一个很小的基因组区域。在此基础上，利用染色体步移的方法构建覆盖目标区域的重叠群，鉴定出该位点的候选基因，并对候选基因的序列特征和编码产物进行分析和预测，最后通过表达分析或互补测验等进行功能验证。目前，QTL的置信区间通常在10cM以上,可能包含一个主效QTL，也有可能包括多个微效QTL，而多个微效QTL的克隆则进一步加大了难度。
分子育种是目前玉米遗传改良的重要途径，而控制目标性状基因的克隆是通过分子育种技术获得具有理想目标性状的新品种的前提。穗行数是玉米产量的主要构成因子之一，提高玉米穗行数对增加玉米产量具有重要的作用。因此，克隆玉米穗行数相关基因可为玉米高产新品种的选育提供新基因，对玉米单产的遗传改良具有重要的作用。并且，对玉米穗行数相关基因的研究也为其他作物，例如水稻、小麦、大麦、高粱中的与穗行数类似的性状特征或同源基因的研究提供重要启示。
发明内容
本发明的一个目的是提供与植物穗行数相关的蛋白KRN2及其编码基因。
在一个方面，本发明提供一种分离的或纯化的蛋白质，其包含选自以下的氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；和
(2)与SEQ ID NO：1具有至少70％序列同一性且具有调控植物穗行数活性的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供编码调控植物穗行数的蛋白质的核酸分子。优选地，所述核酸分子包含选自以下的核酸序列：
(1)如SEQ ID NO：2或3所示的核酸序列，或与其互补的序列；
(2)如SEQ ID NO：3第310-2400位所示的核酸序列，或与其互补的序列；
(3)与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：3第310-2400位所示的核酸序列具有至少70％序列同一性且具有调控植物穗行数活性的核酸序列，或与其互补的序列；和
(4)在严格条件下与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的核酸序列或SEQ ID NO：3第310-2400位所示的核酸序列杂交且具有调控植物穗行数活性的核酸序列，或与其互补的序列。
如本文所述，术语“严格条件”，通常是指由Sambrook等人，1989和由Haymes等人在：Nucleic acid hybridization，A practical approach，IRO Press，Washington，DC(1985)中所描述的条件。DNA杂交的合适的严格条件(例如大约45℃的6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着50℃的2.0×SSC洗涤)是本领域的技术人员已知的，或可以在CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50℃的大约2.0×SSC的低严格条件到50℃的大约0.2×SSC的高严格条件。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温(大约22℃)的低严格条件增加到大约65℃的高严格条件。温度和盐都可以变化，或者温度或盐浓度中的一种可以保持恒定，而另一个变量发生变化。例如，中等严格条件可以为大约2.0×SSC的盐浓度和大约65℃的温度，高严格条件可以为大约0.2×SSC的盐浓度和大约65℃的温度。在一个实施方案中，用于本发明中核酸序列杂交的严格条件是指在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并且在65℃下用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
本领域技术人员已知，“穗粒数”或“KRN”是指衡量果穗籽粒多少的数量性状。根据结穗形式的不同，穗粒数在不同的植物中有不同的构成因子。例如，在玉米、小麦、大麦中，穗粒数主要由穗行数和行粒数构成；在水稻、高粱中，穗粒数则由枝梗数和每个枝梗的粒数构成；而在拟南芥中，籽粒多少则由花序数量所决定。因此，本文所述的“穗行数”或“KRN”不仅包括玉米、小麦、大麦中的“穗行数”性状，也包括水稻、高粱中与“穗行数”相似的性状，如“枝梗数”，以及其他植物中类似的性状，例如拟南芥的花序数量。实际上，不同植物中调控穗行数的内在遗传机制具有共通性，例如，均涉及植物花序发育的调节(参见例如JunkoKyozuka,Hiroki Tokunaga and Akiko Yoshida.Control of grass inflorescence formby the fine-tuning of meristem phase change.Current Opinion in Plant Biology2014,17:110–115)。因此，本领域技术人员可以合理预期，本发明的KRN2基因不仅能调控玉米的“穗行数”，也能够调控其他植物中与“穗行数”相似的性状，例如以上提及的小麦等作物的穗行数、水稻等作物的枝梗数以及拟南芥的花序数。
如本文使用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对多核苷酸序列或两个最佳比对多肽序列相同的程度。最优序列比对通过手动地比对两个序列，例如，参考序列和另一个DNA序列，以在具有适当内部核苷酸***、缺失或间隙的序列比对中最大限度地提高核苷酸匹配的数目来建立。如本文使用，术语“参考序列”是指SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：2和3以及SEQ ID NO：3第310-2400位所示的核酸序列。
如本文使用，术语“％序列同一性”或“％同一性”是同一性分率乘以100。与参考序列最佳比对的序列的“同一性百分比”是最佳比对中的核苷酸匹配的数目，除以参考序列中的核苷酸总数，例如，整个参考序列全长中的核苷酸总数。因此，本发明的一个实施方案提供包含序列的DNA分子，所述序列在与所述参考序列即SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：2和3或SEQ ID NO：3第310-2400位所示的核酸序列进行最佳比对时，与参考序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的同一性。
本发明的基因还包括KRN2基因通过其中的一个或多个核苷酸发生缺失、置换、***或添加的突变而衍生得到的变体序列，所述变体序列仍然保留KRN2基因的调控活性。基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的产生可以是自发的也可以是诱发的，人工诱变的方式包括物理诱变(如γ射线、x射线、紫外线和中子流等)、化学诱变(如烷化剂、碱基类似物和抗生素等)及生物诱变(如某些病毒和细菌等)。而且，可以利用重组DNA技术使DNA分子在指定位置上发生特定的变化，从而实现定向诱变。本领域技术人员可以使用这些公知的诱变方法中的任一种来获得包括一个或多个核苷酸发生缺失、置换、***或添加的突变的KRN2基因的变体序列。
优选地，本发明的核酸分子与异源启动子可操作连接，从而形成重组DNA分子。
在另一个方面，本发明提供包含上述重组DNA分子的表达盒、包含所述表达盒的重组载体、包含所述重组载体的宿主细胞以及包含所述重组DNA分子的转基因植物细胞、转基因植物及其植物部分。
如本文所用，“植物部分”包括但不限于叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明的植物部分可为能存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。本发明还包括并且提供包含本发明的DNA分子的转化植物细胞。本发明的转化或转基因植物细胞包含可再生和/或不可再生植物细胞。
本发明的植物包括单子叶植物和双子叶植物。具体地，其中KRN2基因表达被抑制以增加产量的植物可以选自作物植物例如玉米(玉米；Zea mays)；大豆(Glycine max)；棉花(Gossypium hirsutum；Gossypium sp.)；花生(Arachis hypogaea)；大麦(Hordeumvulgare)；燕麦(Avena sativa)；野茅(Dactylis glomerata)；水稻(Oryza sativa,包括籼稻和粳稻品种)；高粱(Sorghum bicolor)；甘蔗(Saccharum sp.)；高羊茅(Festucaarundinacea)；草坪草(例如物种:Agrostis stolonifera,Poa pratensis,Stenotaphrumsecundatum)；小麦(Triticum aestivum)；苜蓿(Medicago sativa)；拟南芥(Arabidopsisthaliana)；芸苔属成员，包括花椰菜、卷心菜、胡萝卜、白菜花、大白菜；黄瓜、干豆、茄子、烟草、茴香、菜豆、葫芦、韭菜、生菜、甜瓜、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、萝卜、菠菜、笋瓜、甜玉米、番茄、西瓜、观赏植物和其他水果、蔬菜、块茎、油籽和块根作物，其中油籽作物包括大豆、加拿大油菜、油菜籽、油棕、向日葵、橄榄、玉米、棉籽、花生、亚麻籽、红花和椰子。
发明人表明，KRN2基因表达与穗行数负相关。因此，通过抑制KRN2基因的表达，可以获得具有增加的穗行数的植物，从而获得增加的产量。因此，本发明的另一个目的是提供一种生产具有增加的穗行数或增加的产量的转基因植物的方法，包括获得与野生型植物相比具有抑制的KRN2基因或其基因产物表达的转基因植物细胞，并从所述转基因植物细胞再生转基因植物。抑制靶基因或其基因产物表达的方法是本领域已知的，例如转座子***、诱变、RNA介导的抑制、基因编辑等。在本申请上下文中，术语“KRN2基因”是指能够产生SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的任何核苷酸序列。在优选实施方案中，本文的KRN2基因是指SEQID NO：2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO：3第310-2400位所示的核酸序列。
在该方法的一个实施方案中，通过在KRN2基因中引入导致植物中KRN2基因表达的抑制的基因突变来产生具有增加的穗行数或增加的产量的转基因植物。基因突变的实例包括但不限于敲除突变、截短突变、点突变、错义突变、取代突变、移码突变、***突变、重复突变、扩增突变、易位突变或反向突变，以及导致相应基因活性降低或失活的任何其他基因突变。在靶基因中产生至少一个突变的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于随机诱变和筛选、定点诱变、PCR诱变、***诱变、物理诱变、化学诱变和辐射。可以是特异性或随机的诱变，例如可以通过使用合适的物理或化学诱变剂，使用合适的寡核苷酸，使DNA序列经历PCR产生的诱变或其任意组合来进行。物理和化学诱变剂的实例包括但不限于紫外线(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N'-亚硝基胍(NTG)O-甲基羟胺、亚硝酸、甲烷磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。当使用这种试剂时，诱变通常通过在合适的条件下在选择的诱变剂的存在下孵育待诱变的植物细胞或组织，然后选择表现出靶基因表达降低或不表达的突变体来进行。在该方法的一个实施方案中，通过植物中KRN2基因表达的RNA介导的抑制来产生具有增加的穗行数或增加的产量的转基因植物。特别地，所述KRN2基因表达的RNA介导的抑制通过将编码RNA分子的多核苷酸引入植物细胞中来实现，所述RNA分子包含与KRN2基因或其片段的至少15个连续核苷酸基本上互补的序列，其中多核苷酸的表达导致所述植物中KRN2基因表达的抑制。本发明范围还涵盖包含编码RNA分子的多核苷酸的构建体，所述RNA分子包含与KRN2基因或其片段的至少15个连续核苷酸基本上互补的序列，其中所述构建体的表达导致所述植物中KRN2基因表达的抑制。
在一个实施方案中，上述编码RNA分子的多核苷酸涵盖具有15-25个核苷酸的长度的寡核苷酸(15聚体、16聚体、17聚体、18聚体、19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体、24聚体或25聚体)或其片段，或长度为26或更多个核苷酸的中等长度多核苷酸(26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290或约300个核苷酸)或其片段，或长度大于约300个核苷酸的长多核苷酸(例如，长度为约300-约400个核苷酸、约400-约500个核苷酸、约500-约600个核苷酸、约600-约700个核苷酸、约700-约800个核苷酸、约800-约900个核苷酸、约900-约1000个核苷酸、约300-约500个核苷酸、约300-约600个核苷酸、约300-约700个核苷酸、约300-约800个核苷酸、约300-约900个核苷酸、或约1000个核苷酸，或甚至长度大于约1000个核苷酸，例如直至靶基因的整个长度，包括靶基因的编码或非编码或编码部分和非编码部分两者)，其中多核苷酸或其片段与靶KRN2基因同源或互补，并且当在植物细胞中表达时抑制靶KRN2基因的表达。
许多RNA介导的抑制方法是本领域已知的。在RNA介导的抑制方法中使用的RNA分子的非限制性实例包括但不限于反义RNA、miRNA、siRNA和长的非编码RNA。反义RNA是单链RNA，其与细胞中转录的信使RNA(mRNA)链互补。当反义RNA在细胞中表达时，它结合特定的信使RNA分子并使之失活。siRNA是双链RNA分子，长度为20-25个碱基对。分离成单链并整合入活性RISC复合物中后，它与其靶mRNA碱基配对并诱导靶mRNA切割，从而阻止其被用作翻译模板。miRNA是通常约21个核苷酸的小RNA，其具有通过结合靶蛋白mRNA来调节靶基因表达的能力，从而导致靶蛋白mRNA的去稳定化或翻译抑制，最终导致靶蛋白的减少。选择和设计用于基因抑制的siRNA和miRNA的方法是本领域众所周知的。长的非编码RNA(长ncRNA或IncRNA)是长于200个核苷酸的非蛋白质编码转录物(Perkel,BioTechniques,54(6):301-304(2013))。与许多在不同物种中表现出强保守性的小RNA相比，长ncRNA通常缺乏强保守性。根据长ncRNA与基因组中蛋白质编码基因的接近程度，可以将其分为五类：有义、反义、双向、内含子和基因间，并通过多组机制调控基因表达，例如通过基因转录(例如，通过基因特异性转录调控和基础转录机制调控)、转录后调控(例如，通过mRNA剪接、翻译和siRNA定向的基因调控)或通过表观遗传调控。siRNA、miRNA或长非编码RNA对靶基因抑制的作用可通过beto-葡萄糖醛酸苷酶或uidA基因(GUS)报告基因表达比较来评估。
编码本发明的RNA分子的多核苷酸可以是单链或双链RNA或单链或双链DNA或双链DNA/RNA杂合体或其修饰的类似物，并且可以为寡核苷酸长度或更长。在本发明的更具体的实施方案中，在植物细胞中提供本发明的RNA分子的多核苷酸选自下组：(a)单链RNA分子(ssRNA)，(b)自杂交以形成双链RNA分子的单链RNA分子，(c)双链RNA分子(dsRNA)，(d)单链DNA分子(ssDNA)，(e)自杂交以形成双链DNA分子的单链DNA分子，和(f)包括被转录成RNA分子的修饰的Pol III基因的单链DNA分子，(g)双链DNA分子(dsDNA)，(h)包括被转录为RNA分子的修饰的Pol III基因的双链DNA分子，(i)双链的杂交RNA/DNA分子，或其组合。在一些实施方案中，这些多核苷酸包括化学修饰的核苷酸或非规范核苷酸。在该方法的实施方案中，多核苷酸包括通过分子内杂交形成的双链DNA、通过分子间杂交形成的双链DNA、通过分子内杂交形成的双链RNA或通过分子间杂交形成的双链RNA。在一个实施方案中，多核苷酸包括自杂交以形成具有至少部分双链结构的发夹结构的单链DNA或单链RNA，所述发夹结构包括至少一个将与由靶向抑制的基因转录的RNA杂交的区段。不受任何机制的束缚，据信这种多核苷酸是或将产生具有至少一个将与由靶向抑制的基因转录的RNA杂交的区段的单链RNA。在某些其他实施方案中，多核苷酸还包括启动子，通常是在植物中起作用的启动子，例如pol II启动子、pol III启动子、pol IV启动子或pol V启动子。
本领域技术人员知道，根据本发明的多核苷酸具有不必为100％，但是至少足以提供允许与由靶基因或靶基因的DNA转录的RNA杂交以形成双链体以允许基因沉默机制的RNA分子的序列互补性。因此，在实施方案中，将多核苷酸片段设计成与靶KRN2基因序列或由靶基因转录的信使RNA中的15或更多个连续核苷酸的序列基本上相同或基本互补。“基本上相同”是指当与至少15或更多个连续核苷酸(例如，至少16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个连续核苷酸)的序列相比时，具有100％的序列同一性或至少约70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列同一性；“基本上互补”是指当与至少15或更多个连续核苷酸(例如，至少16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个连续核苷酸)的序列相比时，具有100％的序列互补性或至少约70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列互补性。在一些实施方案中，将多核苷酸分子设计成与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员具有100％％的序列同一性或互补性。
鉴定或设计本发明的多核苷酸的方法是本领域已知的。例如，可以通过用具有与内源基因的核苷酸序列基本上相同或基本上互补的反义或有义多核苷酸的部分重叠的探针或非重叠的探针“平铺”基因靶来鉴定所述多核苷酸。为了研究覆盖一部分基因序列的多核苷酸分子(例如，一部分编码区域vs一部分非编码区域，或基因的5'部分vs 3'部分)或整个基因序列(包括靶基因的编码区和非编码区)，还可以将它们合并为几种处理方法。可以将合并的多核苷酸分子分为较小的池或单个分子，以鉴定提供所需效果的有效多核苷酸分子。
在该方法的一个实施方案中，通过基因编辑植物中的KRN2基因来产生具有增加的穗行数或增加的产量的转基因植物，从而抑制所述植物中KRN2基因的表达。
如本文所用，术语“基因编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个核苷酸的靶向诱变，或内源植物基因组核酸序列的去除或替换。一方面，本文提供的经编辑的核酸序列与目的内源核酸具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。
在优选实施方案中，通过提供选自大范围核酸酶、锌指核酸内切酶、TALEN核酸内切酶或CRISPR核酸内切酶的核酸内切酶来实现基因编辑。在特定实施方案中，CRISPR内切核酸酶是CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/CasX或CRISPR/CasY内切核酸酶。
在微生物物种中常见的大范围核酸酶具有独特的特性，即具有非常长的识别序列(>14bp)，因此使其天然地非常特异。但是，实际上没有机会发现对特定DNA序列起作用所需的确切大范围核酸酶。为了克服这一挑战，诱变和高通量筛选方法已用于创建识别独特序列的大范围核酸酶变体。其他人已经能够融合各种大范围核酸酶并产生识别新序列的杂合酶。还有其他人尝试以一种称为合理设计的大范围核酸酶的方法来改变大范围核酸酶的DNA相互作用氨基酸以设计序列特异性葡聚糖酶。
锌指核酸内切酶(ZFN)以模块化方式识别靶DNA：每个核酸内切酶由至少三个锌指结构域组成，并且单个锌指结构域与3-bp序列相互作用，使其成为理想的可编程序列特异性DNA结合蛋白。
TALEN在2011年成为ZFN的竞争替代品。与锌指不同，TALE蛋白中的每个重复结构域都识别单个碱基。可以将四个不同的重复结构域混合并匹配以产生新的DNA结合蛋白，其可以与FokI结构域连接以产生一类新的可编程靶DNA核酸酶。这些分子能够在特定的基因组位点进行精确的靶向和切割，以生成双链断裂(DSB)，然后进行非同源末端连接(NHEJ)或同源直接修复(HDR)介导的修复，从而实现精确的基因组编辑。
簇状规则散布的短回文重复序列(CRISPRs)***构成了原核生物中的适应性免疫***，其靶向侵袭性噬菌体的内切核苷酸的切割。CRISPR***依靠小RNA进行序列特异性检测，并靶向破坏外源核酸。细菌CRISPR***的组件是CRISPR相关(Cas)基因和由基因组靶序列(原间隔子)和短回文重复序列组成的CRISPR阵列。将原间隔子/重复元件转录成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)分子，然后通过反式作用的CRISPR RNA(tracrRNA)分子与pre-crRNA的回文重复序列之间的杂交触发酶切。由一个拷贝的间隔子和一个重复序列组成的所得的crRNA：tracrRNA分子与Cas核酸酶复合。然后将CRISPR/Cas复合物引导至与crRNA间隔子序列互补的DNA序列(原间隔子)，其中该RNA-Cas蛋白复合物通过两条链的酶切使靶DNA沉默。
天然细菌II型CRISPR***需要四个分子组件以靶向切割外源DNA：Cas内切核酸酶(例如Cas9)、管家RNaseIII、CRISPR RNA(crRNA)和反式作用CRISPR RNA(tracrRNA)。后两个组件形成dsRNA复合物并结合Cas9，形成RNA引导的DNA核酸内切酶复合物。对于真核生物中的靶向基因组修饰，该***简化为两个组件：Cas9核酸内切酶和嵌合的crRNA-tracrRNA，称为向导RNA(gRNA)或单向导RNA(sgRNA)。最初在真核***中进行的实验确定，RNaseIII组件对于实现靶向DNA切割不是必需的。具有sgRNA的Cas9的最小两组件***是唯一的独特组件，使这种靶向基因组修饰的CRISPR***比其他靶向平台(例如需要蛋白质工程化以在每个目标DNA位点进行修饰的大范围核酸酶、Zn-指核酸酶或TALE核酸酶)更具成本效益和灵活性。此外，sgRNA的设计和生产简便性为CRISPR***提供了应用靶向基因组修饰的若干优势。例如，可以在一次转化中复用为一个或多个基因组靶位点设计的CRISPR/Cas复合物组件(Cas核酸内切酶、sgRNA和任选的外源DNA以整合入基因组中)，或CRISPR/Cas复合物组件的引入可以在空间和/或时间上分开。
除了II型CRISPR，近年来还发现了新型V CRISPR。迄今为止，经过实验测试的V型CRISPR***包括使用以下效应蛋白，这些效应蛋白已被重新命名为Cas12a-e：Cas12a(也称为Cpf1；VA亚型)、Cas12b(也称为C2c1；VB亚型)、Cas12c(也称为C2c3；VC亚型)、Cas12d(也称为CasY；VD亚型)和Cas12e(也称为CasX；VE亚型)，所有这些在进化上都与Cas9不同。
因此，本发明范围还涵盖包含编码设计为靶向KRN2基因的单个向导RNA的序列的构建体，其中该构建体在植物中的表达与Cas相关基因的表达一起导致KRN2基因表达的抑制。可以将与Cas相关的基因克隆到具有单个向导RNA的相同构建体中，或克隆到单独的构建体中用于表达。将所述构建体递送到植物细胞中的方法是本领域已知的。
编码与Cas相关的基因的构建体可以包含启动子。在某些实施方案中，启动子是组成型启动子、组织特异性启动子、发育调节的启动子或细胞周期调节的启动子。某些预期的启动子包括仅在种系或生殖细胞中表达的启动子。这种发育调节的启动子具有将CRISPR***的表达限制为仅在随后的世代中遗传DNA的那些细胞的优点。因此，CRISPR介导的遗传修饰(即染色体或附加体dsDNA切割)仅限于参与将其基因组从一代传给下一代的细胞。如果CRISPR***的广泛表达具有遗传毒性或具有其他不良影响，则这可能很有用。这种启动子的实例包括编码DNA连接酶、重组酶、复制酶等的基因的启动子。本发明还提供了根据本发明的方法产生的具有增加的穗行数或增加的产量的转基因植物。本发明还提供了由根据本发明的方法制备的转基因植物或其植物部分制成的商品。在一个实施方案中，商品是蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、谷物、淀粉、种子、粗粉、面粉、生物质或种子油。
此外，发明人还在初步定位KRN2后开发了与KRN2和相应引物紧密连锁的新分子标记，这对筛选玉米穗行数性状有用，并为进一步对qKRN2进行精细定位和标记辅助选择育种铺平道路，从而加快玉米高产育种的进程。因此，本发明提供了可用于鉴定或辅助鉴定玉米穗行数性状的分子标记和相应引物，其中所述分子标记位于2号染色体上的16.37Mb-17.56Mb。在一个优选实施方案中，分子标记是使用玉米基因组DNA作为模板，采用至少一对选自SEQ ID NO：4-17的引物进行PCR扩增的DNA片段。本发明还提供了用于鉴定或辅助鉴定玉米的穗行数性状的试剂盒，其包含至少一对对应于位于2号染色体上的16.37Mb-17.56Mb的分子标记的引物，优选具有选自SEQ ID NO：4-17的序列的引物。在另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒还包含选自dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液中的至少一种。另外，本发明提供了所述分子标记和相应的引物以及试剂盒在鉴定或辅助鉴定玉米穗行数性状或玉米育种中的用途。
附图说明
图1：B73和MT-6的穗行数比较。a和b.B73和MT-6果穗的横切面。c.B73和MT-6的穗行数。
图2：B73/MT-6F2群体的遗传图谱，其中2号染色体图例右侧的浅灰色、深灰色和黑色长方形分别代表用海南、北京和河南三个环境的数据定位的QTL位置。
图3：qKRN2的LOD值峰图。
图4：a.用BC4F2和BC5F1重组植株进行初步精细定位，将qKRN2缩小到标记M8和IDP1612之间的区域；b.用BC4F3、BC5F2、BC5F1和BC6F1重组植株进行进一步精细定位，将qKRN2缩小到标记M31和MIL之间的区域。在图4a和4b中，左图示出的是不同重组植株的基因型，其中白色方框表示纯合B73/B73，黑色方框表示杂合MT-6/B73。右图示出的是各重组植株自交纯合后代的表现型，其中浅灰色表示纯合B73/B73的表现型(A)，深灰色表示纯合MT-6/MT-6的表现型(B)。NA/NB表示A表现型的个体数目/B表现型的个体数目，P值表示同一重组植株后代中A和B之间的差异显著性。**表示差异在统计学上是极显著的。
图5：a.近等基因系NILB73和NILMT-6的果穗表现；b.NILB73和NILMT-6的穗行数统计结果；c.KRN2基因在NILB73和NILMT-6未成熟幼穗中的表达水平。NILB73表示在目标区段为B73等位基因的近等基因系；NILMT-6在目标区段为MT-6等位基因的近等基因系。*表示差异在统计学上是显著的；**表示差异在统计学上是极显著的。
图:6：a.KRN2的基因结构和突变体(krn2-1)的Mu转座子***位置；b.野生型(WT)和突变体krn2-1的基因型，M1表示KRN2基因特异的上游引物和下游引物的PCR扩增结果，M2表示KRN2基因特异的下游引物和转座子特异引物TIR8-1的PCR扩增结果；c.野生型(WT)和突变体krn2-1的穗行数表现；d.野生型(WT)和突变体krn2-1的穗行数统计结果。**表示差异在统计学上是极显著的。
图7：超表达载体pBCXUN-Myc的示意图。
图8：KNR2超表达玉米品系(OE)和野生型(WT)中KRN2基因的相对表达水平(a)以及穗行数统计结果(b)。**表示差异在统计学上是极显著的。
图9：a.CRISPR/Cas9介导的基因编辑所设计的KRN2双靶点位置；b.CRISPR/Cas9基因编辑产生的新品系CR-krn2-1和CR-krn2-2的测序结果；c.CR-krn2-1和CR-krn-2的穗行数统计结果。**表示差异在统计学上是极显著的。
图10：a.水稻超表达转基因品系后代中阳性植株(OE)及日本晴(WT)的代表性稻穗形态表现；b.水稻超表达转基因品系后代中阳性植株(OE)及日本晴(WT)的OsKRN2基因相对表达水平；c-e.水稻超表达转基因新品系后代中阳性植株(OE)及日本晴(WT)的一次枝梗数(c)、二次枝梗数(d)和穗粒数(e)的统计结果。**表示差异在统计学上是极显著的。
图11：a.CRISPR/Cas9介导的基因编辑所设计的OsKRN2单靶点位置；b.CRISPR/Cas9介导的基因编辑产生的新品系CR-oskrn2-1、CR-oskrn2-2和CR-oskrn2-3的测序结果；c.三种基因编辑品系及其相应野生型(WT)的代表性稻穗形态表现；d-f.三种基因编辑新品系及其相应野生型(WT)的一次枝梗数(d)、二次枝梗数(e)和穗粒数(f)的统计结果。**表示差异在统计学上是极显著的。
图12：近等基因系NILB73和NILMT-6的各个农艺性状的统计结果：穗行数(a)、单穗粒数(b)、单穗粒重(c)、百粒重(d)、单产(e)、单穗重(f)、穗粗(g)、轴粗(h)、轴重(i)、穗长(j)、行粒数(k)、株高(l)、穗位高(m)、散粉期(n)、吐丝期(o)、叶夹角(p)、叶长(q)、叶宽(r)、雄穗主轴长(s)和雄穗分枝数(t)。*表示差异在统计学上是显著的；**表示差异在统计学上是极显著的。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：玉米穗行数QTL的初步定位
1.研制玉米自交系MT-6
将玉米自交系Mo17(187-2×C103，美国)作为母本与大刍草X26-4(登录号:PI566686；Zea mays ssp.Mexicana，来自美国睿智农业科技咨询公司)作为父本杂交得到F1代，随后每代选择穗行数较少的后代不断自交，最终获得穗行数为6行且能够稳定遗传的材料，命名为MT-6。玉米自交系B73(BSSS，美国)和MT-6的穗行数比较见图1。
2.构建F2群体和F2:3群体
将玉米自交系B73与MT-6杂交得到F1，选择一株自交得到266株F2后代，组成F2群体。同时，将每个F2单株自交，衍生成266个F2:3家系，组成F2:3群体。
3.调查F2群体和F2:3群体的穗行数
于2010年，在海南种植266株F2单株。此外，于2011年，在北京和河南以随机化完全区组设计种植266个F2:3家系。每个F2:3家系单行种植(每行3m，行之间间隔0.67m)，种植密度为45,000株/公顷。然后，测定F2群体中每个单株的穗行数以及每个F2:3家系中8株植物穗行数的平均值。其中，每个果穗的穗行数是指果穗的籽粒行数。调查结果如下表1所示：
表1.F2群体和F2:3群体的穗行数
Figure BDA0002504744610000161
Figure BDA0002504744610000171
4.筛选多态性标记
在全基因组范围内从公共玉米数据库(http://www.maziegdb.org)中选择多态性标记，并针对各多态性标记设计引物，以B73和MT-6的基因组DNA为模板进行PCR扩增。其中PCR扩增的体系和程序如下表2和表3所示：
表2.PCR扩增体系
Figure BDA0002504744610000172
表3.PCR扩增程序
Figure BDA0002504744610000173
选择在B73和MT-6之间多态性的分子标记作为本实施例中用于定位穗行数QTL的分子标记。结果获得192个多态性标记，分布在10条染色体上，如图2所示。
5.构建连锁图谱并初步定位穗行数QTL
如图2所示，B73/MT-6的F2群体的遗传图谱总长1230.5cM，分子标记平均间距为6.4cM。利用筛选到的192个多态性标记鉴定F2群体的基因型，并结合其表现型(即调查到的穗行数)，采用Windows QTL Cartographer 2.5软件中的复合区间作图法(CIM)进行穗行数QTL的定位，结果在2号染色体检测到控制穗行数的QTL，指定为qKRN2。如图3所示，在不同世代或环境中，qKRN2的LOD值均远远大于临界值3.4，表明在该区间确实存在QTL(即，检测结果为真阳性)。如下表4所示，qKRN2的遗传位置在55.0cM左右，置信区间为18.2cM(即分子标记umc2193和umc1259之间的遗传距离)，能够解释9.4％-16.1％的表型变异，是控制玉米穗行数的主效QTL。
表4.qKRN2在不同环境或世代中的效应
Figure BDA0002504744610000181
实施例2.qKRN2的初步精细定位
将B73与MT-6杂交得到的F1与B73回交，得到BC1F1。随后通过PCR扩增，利用umc2193和umc1259之间的8个分子标记(其中7个分子标记是已知的，即TIDP3276、IDP8454、IDP1612、IDP4525、IDP7742、IDP7551和IDP1415，1个分子标记是本发明人新增的，即位于IDP8454和IDP1612之间的M8，其相应的引物序列如SEQ ID NO：4和5所示)从BC1F1群体中筛选出QTL-qKRN2为杂合的植株继续与B73回交直到BC4F1。BC4F1自交后分离，得到QTL-qKRN2分别为B73基因型和MT-6基因型的家系(即NILB73和NILMT-6)，该两种家系互为近等基因系。
同时，BC4F1自交后获得的群体组成BC4F2，BC4F1与B73回交后获得的群体组成BC5F1。从大约10000株的BC4F2和BC5F1群体中再次利用上述8个分子标记筛选重组单株，即在QTL区间包含多个分子标记且其中一个或多个分子标记为杂合基因型的单株。重组位置发生在不同的相邻两个标记之间的重组单株自交产生相应的近等基因系。
分别调查30株的B73基因型近等基因系(NILB73)和MT-6基因型近等基因系(NILMT -6)的穗行数，并进行双样本等方差t检验。若P>0.05，则表示近等基因系之间穗行数无差异，该近等基因系差异区间不包含目标qKRN2；若P<0.05，则表示近等基因系之间穗行数存在显著差异，该近等基因系差异区间包含目标qKRN2。t检验的结果如图4a所示。因此，发明人进一步将目标区间缩小到标记M8和标记IDP1612之间大约2.4Mb的区段。
实施例3.qKRN2的进一步精细定位
1.设计新的多态性标记
利用Primer5.0软件，以自交系B73在标记M8和IDP1612之间的基因组序列作为参考序列设计引物，引物合成后对B73植株和MT-6植株的基因组DNA进行PCR扩增，并用琼脂凝胶电泳分离扩增产物，其中扩增的B73和MT-6产物有长度差异的即为本实施例中用于进一步精细定位qKRN2的多态性标记(InDel标记)。本实施例中用于进一步精细定位的InDel标记及其引物序列如下表5所示。
表5.标记M8和IDP1612之间的InDel标记及其引物序列
Figure BDA0002504744610000191
Figure BDA0002504744610000201
利用上述InDel标记，继续在大约18000株的BC4F3、BC5F2、BC5F1和BC6F1群体中筛选新的重组单株。具体过程为：从用于初步精细定位的BC4F2和BC5F1群体中选择t检验表现为差异显著的目标QTL区间为杂合基因型的家系，将其进行自交分别获得BC4F3和BC5F2群体，同时将选择的BC5F1家系与B73回交后获得BC6F1群体，然后利用表5所示的InDel标记检测目标QTL区间的基因型，若InDel标记表现为B73带型和杂合带型的组合，则定义为重组单株，若该种组合在用于初步精细定位的BC4F2和BC5F1群体中从未出现过，即定义为新的重组单株。
将所选出的新的重组单株自交后，对其后代的表现型进行t检验。若P>0.05，则表示近等基因系之间穗行数无差异，该近等基因系差异区间不包含目标qKRN2；若P<0.05，则表示近等基因系之间穗行数存在显著差异，该近等基因系差异区间为目标qKRN2。t检验的结果如图4b所示。发明人最终将目标区间缩小至标记M31和标记MIL之间大约20.82Kb的范围。
根据玉米全基因组信息，标记M31和MIL之间仅包含一个编码WD40重复蛋白的基因(本文中将其命名为KRN2基因)。已知WD40重复蛋白家族在植物发育过程中发挥多种作用，包括信号转导、染色质组装和RNA加工等，但目前没有任何研究报道过其与穗行数的关联。
KRN2基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，由696个氨基酸组成，且含有一个未知功能的蛋白结构域WD40重复序列。
KRN2基因的基因组序列(包含内含子)如SEQ ID NO:2所示，由7421个核苷酸组成，其中第368-3367位核苷酸为启动子序列。
KRN2基因的cDNA序列如SEQ ID NO:3所示，由2853个核苷酸组成，其中第310-2400位核苷酸为蛋白质编码序列。
该KRN2基因目前不仅在玉米中没有被克隆，在其他模式植物如拟南芥、水稻中也尚未有同源基因研究的报道，因此，对其进行深入研究具有十分重要的意义。
实施例4.KRN2的效应分析
调查27株NILB73和25株NILMT-6的穗行数，发现NILB73的穗行数比NILMT-6的穗行数少约1.3行，且该差异达到极显著水平(P值<0.01)(参见图5和表6)。从基因型来看，NILB73与NILMT-6的遗传背景基本一致，仅在标记M31附近(即KRN2基因所在区域)存在差异。换言之，NILB73与NILMT-6之间的穗行数差异是由于该区段含有控制穗行数主效QTL的KRN2基因引起的。
表6.KRN2的效应分析
Figure BDA0002504744610000211
注：与亲本B73带型相同的标记为“A”，与亲本MT-6带型相同的标记为“B”。
以上效应统计结果说明，本发明鉴定的QTL qKRN2是控制穗行数的主效QTL。
发明人还检测了近等基因系NILB73和NILMT-6未成熟幼穗的KRN2基因表达水平，发现KRN2基因在NILMT-6未成熟幼穗中的表达水平显著高于NILB73(参见图5c)，这证明KRN2基因对穗行数具有负调控作用。即，KRN2表达水平越高，穗行数越少。
实施例5.验证KRN2基因控制玉米穗行数的作用
从Maize Stock Center订购KRN2基因的Mu转座子突变体krn2-1。krn2-1突变体的Mu转座子***在KRN2基因的第一外显子上(具***置为SEQ ID NO：3的第682位和第683位之间)，如图6a所示。利用基因特异性引物(上游引物序列为TAGGCTGTAGGATGGAGATG(SEQ IDNO:18)，下游引物序列为GACCTTGACCCTTTCATACC(SEQ ID NO:19))鉴定野生型植株，同时利用SEQ ID NO：19所示的下游引物和转座子特异引物TIR8-1(CGCCTCCATTTCGTCGAATCCCCTS(SEQ ID NO:20))鉴定纯合krn2-1突变体植株。结果如图6b所示，krn2-1突变体中KRN2基因确实存在转座子的***。
进一步调查KRN2基因野生型和突变体krn2-1的表现型，结果如图6c和6d所示，野生型的穗行数平均为14.38行，而纯合krn2-1突变体的穗行数平均为16.76行，即纯合krn2-1突变体的穗行数与野生型相比显著增加，增加幅度为2.38行左右。
由此可见，KRN2基因确实能够控制玉米的穗行数。
实施例6.利用超表达验证KRN2基因控制玉米穗行数的作用
1.构建含有编码KRN2蛋白的核酸分子的重组表达载体：通过酶切、连接将SEQ IDNO：3所示的cDNA片段的第310-2400位核苷酸(即KRN2基因的编码区)克隆到超表达载体pBCXUN-Myc(如图7所示)的两个XcmⅠ酶切位点之间(启动子为Ubiquitin启动子)，经测序证实，获得重组表达载体。
2.将所述重组表达载体转化到EHA105农杆菌中，获得含有重组表达载体的重组农杆菌；将该重组农杆菌转染到受体玉米品系的胚细胞中，使所述核酸分子整合到受体玉米基因组中获得重组细胞。该过程中涉及的表达载体的转化以及农杆菌的转染的相关方法和试剂是本领域技术人员已知的。
3.培养所述重组细胞获得转基因玉米种苗，获得至少一粒在其基因组中含有上述核酸分子的玉米新品系种子。
种植所述种子，并观察其生长植株中KRN2基因的表达水平以及穗行数的表现型。图8展示了***性品系KRN2-OE1、KRN2-OE3和KRN2-OE4中的KRN2基因的相对表达水平(图8a)及其相应的穗行数表现(图8b)。结果表明，KRN2基因超表达的三个转基因品系的穗行数比野生型减少2行左右(P<0.01)。
实施例7.KRN2基因编辑制备具有较多穗行数的玉米品系
1.构建含有KRN2基因特异的gRNA靶点的CRISPR/Cas9载体：筛选KRN2基因特异的双gRNA靶点(参见图9a，gRNA-KRN2-1序列:GGCCCTGCATTGCCGTGGT(SEQ ID NO:23),靶点:SEQ ID NO:2的核苷酸3470-3488；gRNA-KRN2-2序列:AGAGTGCTGCCCGGCTCCC(SEQ ID NO:24),靶点:SEQ ID NO:2的核苷酸3547-3565)，并设计成两对引物，以载体pCBC-MT1T2为模板进行四条引物的PCR扩增。回收PCR产物，结合BsaⅠ内切酶和T4连接酶建立酶切-连接体系，将PCR产物连接到pBUE411载体上，菌落PCR鉴定并测序，获得重组Cas9载体。
2.将所述重组Cas9载体转化到EHA105农杆菌菌种中，获得含有重组Cas9载体的重组农杆菌；将该重组农杆菌转染到受体玉米品系的胚细胞中，获得重组细胞。
3.培养重组细胞获得转基因玉米种苗，对T0代进行该基因靶位点的测序鉴定，获得KRN2基因中被敲除了64bp和73bp的玉米新品系种子，分别为CR-krn2-1和CR-krn2-2(参见图9b)。这两个新品系中的KRN2基因功能均缺失。
种植所述新品系种子，观察其后代植株的穗行数。与对照相比，这两个通过基因编辑的新品系的穗行数均增加1.8行左右，达到统计学上的显著水平(图9c)。
实施例8.本发明的InDel标记在筛选育种材料中的应用
利用表5所示的本发明的InDel标记检测待选材料的基因型，筛选与B73同样带型的材料作为穗行数增加的优良材料。
具体地，利用表5所示的本发明的InDel标记通过PCR检测并统计各样本的基因型，同时统计各样本的穗行数，结果如下表7所示。
表7.不同样本的穗行数统计
Figure BDA0002504744610000241
由上表可以看出，对于标记M8，有33株植株的基因型与B73相同，平均穗行数为17.03，54株植株的基因型与MT-6相同，平均穗行数为15.3。换言之，在主效QTL区域，KRN2表达水平较低的玉米材料的穗行数比KRN2表达水平较高的玉米材料的穗行数多1.73，这在统计学上具有极显著差异。因此，通过标记M8能够有效筛选穗行数多的玉米材料，即主效QTLKRN2表达水平较低的玉米材料。对于其他标记M13、M20、M27、M31、MIL、M36而言，结果与此类似。
由此可以看出，利用新开发的分子标记M8、M13、M20、M27、M31、MIL和M36，可以在苗期有效筛选出穗行数较多的玉米，节约实验成本，提高选择效率，从而更快筛选出穗行数更多的株系，加速玉米高产育种的进程。
因此，本发明同时开发了穗行数主效QTL qKRN2区间内的分子标记，增加了目标区间的标记丰度，构建获得目标区间的分子标记连锁图谱。继而，通过QTL的再次定位分析，获得与目标QTL紧密连锁的分子标记M8、M13、M20、M27、M31、MIL和M36，并将其应用到玉米材料的穗行数选择上，有效筛选出穗行数较多的玉米品种或品系。本申请也为玉米产量QTL的相关研究提供标记信息。
实施例9.KRN2拟南芥同源基因的效应
利用玉米KRN2基因的氨基酸序列搜索拟南芥TIGR数据库，发现基因编号为AT5G53500的蛋白序列与KRN2的相似性最高(序列一致性为40％)，为KRN2的拟南芥同源基因，命名为atKRN2。将该同源基因atKRN2的CDS区域通过酶切-连接的方法连接到pCAMBIA130载体中，构建了atKRN2的超表达载体，启动子为CaMV35S启动子，经测序证实，获得重组表达载体。
同时，采用CRISPR/Cas9技术对atKRN2基因进行编辑，即筛选该基因特异性的双gRNA靶点，并设计成两对引物，以载体pCBC-DT1T2为模板进行PCR扩增，回收PCR产物，结合BsaⅠ内切酶和T4连接酶建立酶切-连接体系，将PCR产物连接到pHEE401e载体上，菌落PCR鉴定并测序证实，获得重组Cas9载体。
将重组表达载体和重组Cas9载体转化到EHA105农杆菌中，分别获得含有重组表达载体和重组Cas9载体的重组农杆菌，进而将重组农杆菌转染到受体拟南芥(哥伦比亚生态型，T0代)的花器官中，使所述载体整合到受体拟南芥基因组中获得重组细胞，T0代自交后收获T1代种子并鉴定获得阳性苗。
种植上述T1种子，观察拟南芥atKRN2的基因表达水平和花序表型。
实施例10.KRN2水稻同源基因的效应
利用玉米KRN2基因的氨基酸序列搜索NCBI数据库，发现水稻基因编号为OS04G0568400(LOC_OS04G48010)的蛋白序列与KRN2的相似性最高(序列一致性为74％)，为KRN2的水稻同源基因，命名为OsKRN2(SEQ ID NO:21)。将该同源基因OsKRN2的CDS区域(SEQID NO:22)通过酶切-连接的方法连接到pCUbi1390载体中，构建了水稻(日本晴背景)中KRN2同源基因OsKRN2的超表达载体，基因的启动子为Ubiquitin启动子，经测序证实，获得重组表达载体。
同时，采用CRISPR/Cas9技术对LOC_OS04G48010基因进行编辑，即筛选该基因特异性的单gRNA靶点(参见图11a，gRNA-OsKRN2-1序列:aggttcactcgtaccggaag(SEQ ID NO:25),靶点:SEQ ID NO:21的核苷酸620-640)，并设计成一对引物，将该对引物进行退火，形成引物二聚体，结合Aar I内切酶和T4连接酶建立酶切-连接体系，将引物二聚体连接到包含Cas9基因的CRISPR/Cas9载体上，菌落PCR鉴定并测序证实，获得重组Cas9载体。
将重组表达载体和重组Cas9载体转化到EHA105农杆菌中，分别获得含有重组表达载体和重组Cas9载体的重组农杆菌，进而将重组农杆菌转染到受体日本晴的愈伤组织中，使所述载体整合到受体日本晴基因组中获得重组细胞，在T0代进行阳性苗筛选并收获T1代种子。
种植上述T1种子，观察水稻OsKRN2的基因表达水平和穗粒数的变化。结果表明，三个超表达新品系中OsKRN2基因的表达水平显著升高(图10b)，穗粒数和二次枝梗数与对照野生型水稻相比均显著减少(图10c-e)。另外，三个基因编辑所得的品系CR-oskrn2-1、CR-oskrn2-2和CR-oskrn2-3中，观察到穗粒数和二次枝梗数的显著增加(图11)。
实施例11.KRN2基因对提高玉米产量有潜在的应用价值：
在同一田间条件下种植近等基因系NILB73和NILMT-6(2017年夏季，辽宁省铁岭市)，单株调查其田间各农艺性状，包括散粉期、吐丝期、株高、穗位高、叶长、叶宽、叶夹角、雄穗主轴长和雄穗分枝数等；果穗成熟收获后，对结实正常籽粒饱满且无突尖和病害的果穗进行穗部性状的调查，包括单穗重、穗长、行粒数、穗行数、穗粗、单穗粒数、单穗粒重、轴重、轴粗、百粒重等，并对近等基因系的单产水平进行评估。重复该实验两次(即，17TLR1和17TLR2)。
对近等基因系的NILB73和NILMT-6各性状进行双样品等方差t检验。结果发现，在NILB73中，穗行数显著多于NILMT-6，而百粒重、穗长、行粒数不变，进而导致单穗粒数、单穗粒重、单穗重和单产显著高于NILMT-6(图12a-c和e-f)。除此之外，相比于NILMT-6，NILB73的穗粗、轴粗、轴重也有所提高(图12g-i)，但所调查的植物农艺性状均无显著变化(参见图12l-t)。
这些结果说明，KRN2基因可以通过增加穗行数来增加单穗粒数、单穗粒重和单穗重，进而提高玉米产量，同时对其他农艺性状不会产生明显的影响，这对玉米高产新品种的遗传改良具有重要的应用价值。
Figure IDA0002632294690000011
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Claims (10)

1.一种制备具有增加的穗行数或增加的产量的转基因玉米的方法，包括获得与野生型玉米相比具有抑制的KRN2基因或其基因产物表达的转基因玉米细胞，以及从所述转基因玉米细胞再生转基因玉米，其中所述KRN2基因是指能够编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的任何核苷酸序列。
2.权利要求1所述的方法，其中所述转基因玉米细胞通过定点诱变、***诱变、基因编辑或RNA-介导的KRN2基因抑制获得。
3.权利要求2所述的方法，其中所述基因编辑通过提供选自大范围核酸酶、锌指核酸内切酶、TALEN核酸内切酶或CRISPR核酸内切酶的核酸内切酶来实现。
4.权利要求2所述的方法，其中所述RNA-介导的抑制包括将编码RNA分子的多核苷酸引入玉米细胞中，所述多核苷酸与KRN2基因的至少15个连续核苷酸互补。
5.一种构建体，其包含编码RNA分子的多核苷酸，所述多核苷酸包含与KRN2基因的至少15个连续核苷酸互补的序列，其中所述构建体在植物中的表达导致KRN2基因表达的抑制，其中所述KRN2基因是指能够编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的任何核苷酸序列。
6.权利要求5所述的构建体，其中所述RNA分子选自下组：反义RNA、miRNA、siRNA和长非编码RNA。
7.一种构建体，其包含编码设计为靶向KRN2基因的单个向导RNA的序列，其中所述构建体在植物中的表达与Cas相关基因的表达一起导致KRN2基因表达的抑制，其中所述KRN2基因是指能够编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的任何核苷酸序列。
8.一种转基因植物部分或植物细胞，包含权利要求5-7任一项所述的构建体，其中所述植物部分和植物细胞是不可再生的，其中所述植物为玉米。
9.一种制备商品的方法，其包括：
由权利要求1-4任一项所述的方法制备的转基因玉米或其部分制备商品，其中所述商品是蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、粗粉、面粉、生物质或种子油。
10.分子标记在鉴定或辅助鉴定玉米穗行数性状或在玉米育种中的用途，其中所述分子标记为M8、M13、M20、M27、M31、MIL、M36，其中M8由SEQ ID NO：4和5所示的引物扩增得到，M13由SEQ ID NO：6和7所示的引物扩增得到，M20由SEQ ID NO：8和9所示的引物扩增得到，M27由SEQ ID NO：10和11所示的引物扩增得到，M31由SEQ ID NO：12和13所示的引物扩增得到，MIL由SEQ ID NO：14和15所示的引物扩增得到，M36由SEQ ID NO：16和17所示的引物扩增得到。
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