CN111735960A - 一种禽类肺动脉高压诊断试剂盒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及禽类肺动脉高压综合征检测技术领域,且公开了一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,包括以下步骤:S1、胶体金(AuNPs)颗粒的制备:方法如下:A、洗净三角瓶、转子、量筒后用超纯水润洗,去除杂质和灰尘;B、用专用100mL量筒,量取50mL超纯水,加入三角烧瓶中并做好标记后加热搅拌至沸腾;C、快速加入1%(w/v)氯金酸溶液1mL,稍等片刻后加入2mL的柠檬酸三钠溶液(10mg/mL)继续加热10min,关闭加热电源。利用禽源心肌钙蛋白I(cTnI)为检测抗原,以胶体金颗粒为信号物,采用双抗夹心法制备一种简便、快速和无需检测仪器,适合现场快速检测的免疫层析试纸条,能够大大降低检测成本,便于推广使用。

Description

一种禽类肺动脉高压诊断试剂盒的制备方法
技术领域
本发明涉及禽类肺动脉高压综合征检测技术领域,具体为一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法。
背景技术
禽类发生肺动脉高压综合征主要是诱发因素引起肺动脉高压,右心肥大继而导致心力衰竭和腹水。发生此症状的病有肉鸡猝死综合征(Sudden Death Syndrome,SDS)和肉鸡肺动脉高压综合征综合征 (pulmonaryhypertensionsyndrome,PHS)。本文主要以肉鸡肺动脉高压综合征综合征为例。肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonaryhypertensionsyndrome,PHS)又称“肉鸡心衰综合征”,是以病鸡出现明显的腹腔积水、右心室肥大扩张、肺淤血水肿、心肺功能衰竭、肝脏显著肿大为特征的一种非传染性营养代谢病。PHS不仅造成肉鸡死亡率升高,还造成肉鸡发育不良、屠宰体重不达标等影响。
一旦禽类出现禽类肺动脉高压综合征的临床症状,单纯的治疗常常难以奏效,多以死亡而告终。对于禽类肺动脉高压综合征的防控,在2周龄前必须从卫生、营养状况、饲养管理、减少应激和疾病以及采取有效的生产方式等各方面入手,采取综合性防治措施。因此研制简便、快速、灵敏、特异的检测方法至关重要。目前广泛使用的肉鸡肺动脉高压综合征血清学检测方法主要为酶联免疫吸附实验(ELISA),而ELISA检测试剂盒多为进口试剂盒,价格昂贵,很难满足临床大规模检测的需要。此外,ELISA检测需要在较高条件的实验室内进行,不适用于现场检测。
发明内容
本发明提供了一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,具备试剂盒制备简单、价格较低、使用方便等优点,解决了背景技术提出的问题。
本发明提供如下技术方案:一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
S1、蛋白表达
1.132a-cTnI质粒构建
通过NCBI查找的cTnI基因完全序列,筛选出CDS蛋白质(编码区639bp,理论分子量为24KD+10~20KD),交付于公司合成并连接于载体32a上,导入大肠杆菌DH5α诱变菌株;
1.2提取32a-cTnI阳性质粒
使用质粒提取试剂盒,3mLLB/Amp液体培养基加入2.5μL菌液,提前12小时复苏DH5α阳性菌株。按照试剂盒操作说明提取。提取出的32a-cTnI基因阳性质粒于-80℃冻存备用;
1.3BL21-32a-cTnI构建
冰上融化BL21感受态细胞与冻存的32a-cTnI质粒,取0.3μL质粒移液枪打入一管(100μL)BL21感受态细胞中,冰浴30分钟,45℃水浴80秒,再冰浴2分钟后,加入400μLSOC培养基,37℃摇床培养1小时,取全部已转化的感受态细胞涂布到LB/Amp固体培养皿中,37℃倒置培养12小时。挑取菌落接种于LB/Amp液体培养基扩殖,加甘油-20℃冻存备用;
1.4IPTG诱导pET32(a)-troponinI融合蛋白的表达与纯化:
1)、菌种活化:取10ul菌种接种于含50μg/mlAmp+的50mlLB培养液的试管中,37℃220rpm振摇过夜;
2)、放大培养:按1:100接种于50μg/mlAmp+的2LLB培养液中,37℃220rpm 振摇至菌体OD600为0.6-0.8;
3)、向培养物中加入IPTG至终浓度为0.1mM,37℃220rpm振摇4h,诱导融合蛋白表达;
4)、4000g,离心10min,收集菌体弃上清,用PBS重悬菌体再次离心收集菌体,0.01MPBS重悬液进行超声波破碎后(1:1000比例加入cocktail或AEBSF), 8000rpm,4℃离心20min,取上清(沉淀保留);
5)、上清纯化:利用低压层析***,以0.5ml/min流速上样至 Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱;
6)、用Ni-IDABinding-Buffer(20mMTris-HCl,0.15MNaCl,pH8.0)以0.5ml/min 流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;
7)、用Ni-IDAWashing-Buffer(20mMTris-HCl,10mM咪唑,0.15MNaCl,pH8.0) 以1ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;
8)、用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl,100mM咪唑,0.15MNaCl, pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;
9)、同8)
10)、用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl,150mM咪唑,0.15MNaCl, pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;
11)、用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl,300mM咪唑,0.15MNaCl, pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;
12)、上述收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用0.01MPBSpH7.2-7.4进行透析过夜;
13)、沉淀:20mMTris,8M尿素,300mMNaCl,pH8.0直接溶解沉淀样品后, 8000rpm,4℃离心20min收集上清样品,按照步骤7-14进行蛋白纯化;
14)、将步骤12中的纯化洗脱样品装入透析袋依次放入6M尿素(含20mMTris,300mMNaCl,pH8.0),4M尿素(含20mMTris,300mMNaCl,pH8.0),2M尿素(含 20mMTris,300mMNaCl,pH8.0),1M尿素(含20mMTris,300mMNaCl,pH8.0), 0.5M尿素(含20mMTris,300mMNaCl,pH8.0)分别2-3h,最后20mMTris-HCl,100mMNaCl,pH8.0溶液中透析过夜。进行12%SDS-PAGE检测分析,考马斯亮蓝染色显带。
S2、cTnI单克隆抗体的制备
1)、小鼠免疫以重组表达并经纯化的鸡心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)作为免疫原。首次免疫采用 ip方式,将cTnI与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后免疫6周龄BalB/C小鼠, 每只0.2mg,间隔14d左右进行第2次免疫,将cTnI与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫小鼠,每只小鼠0.2mg,14d后尾静脉进行注射免疫,每只小鼠 0.2mg。融合前3d尾静脉加强免疫0.2mg;
2)、细胞融合及筛选
细胞融合按常规操作进行,采用间接ELISA法筛选阳性克隆,有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆化,3次亚克隆后仍为阳性者予以定株。
3)、腹水抗体制备及纯化
使用BalB/C小鼠体内诱生法大量生产单克隆抗体。将阳性杂交瘤细胞以105~106个/只的数量注入一周前用降植烷预致敏的小鼠腹腔中,7~14d后收集腹水,离心后分装,-70℃冻存。采用蛋白A亲和层析柱纯化腹水抗体。SDSPAGE 鉴定抗体纯度,考马斯亮兰法测定抗体含量。
S3、胶体金(AuNPs)颗粒的制备:
方法如下:
A、洗净三角瓶、转子、量筒后用超纯水润洗,去除杂质和灰尘;
B、用专用100mL量筒,量取50mL超纯水,加入三角烧瓶中并做好标后加热搅拌至沸腾;
C、快速加入1%(w/v)氯金酸溶液1mL,稍等片刻后加入2mL的柠檬酸三钠溶液(10mg/mL)继续加热10min,关闭电源;
D、移除加热装置,搅拌降温,降至室温后吸出转子并容至100mL,然后测其吸光度后,标记好日期,置于冰箱冷藏保存备用;
S2、金标cTnI单抗的制备:
方法如下:
A、取1mL烧制好的胶体金溶液放置在1.5mL的离心管(EP管)中,加入 8μL碳酸钾溶液调PH约7.5;
B、加入0.5μLcTnI单抗(3mg/mL),在室温下混匀一段时间后静置;
C、加入100μL10%浓度的牛血清白蛋白(BSA),在室温下混匀一段时间后静置;
D、在4℃,10000r/min的条件下离心15min,然后弃掉上清,加入60μ L的金标复溶液进行复溶,然后标记好放入冰箱冷藏备用;
优选的,S2中步骤B和C中的混匀时间为15min,静置时间与混匀时间相同;
S3、样品垫的处理:
称取1%PVPK40(聚乙烯吡咯烷酮系列中K值在40左右的高分子聚合物)、 1%BSA和1%酸水解酪素加入到0.15mol/LpH7.4PBS(磷酸缓冲盐溶液)中溶解、混匀后作为样品垫的处理液.
将配置好的样品垫处理液加入到长30cm,宽2cm的玻璃纤维的垫上使其浸泡整条样品垫,然后放在室温晾干后放在恒温恒湿柜中备用;
S4、NC膜的包被:
首先将NC膜贴于PVC底板的顶面,然后放在37℃的恒温箱中平衡15min;喷金划膜仪洗涤调试好准备进行划膜,将稀释好的cTnI单抗和兔抗鸡免疫球蛋白G(兔抗鸡IgG)以1.0μL/cm包被于NC膜上,放置在37℃的恒温箱中平衡十五小时后放在恒温恒湿柜中备用;
S5、试纸条反应体系的优化:
(1)胶体金最佳工作pH值的选择
用浓度0.1mol/L碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH调节为不同梯度,各取 1mL加入10μg鼠源McAb(单克隆抗体),混匀,在室温下反应10min,加入 0.1mL10%NaCl溶液,静置2h,观察颜色变化,在12000r/min条件下离心10min,将沉淀用含1%BSA的PBS中溶解,已完全溶解且呈均匀***管的pH为胶体金最佳工作pH;
优选的,S5中的步骤(1)的胶体金溶液的pH调节的不同梯度为6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5;
(2)单抗标记反应体系pH值的优化
按上述方法标记cTnI单抗时,加不同量的碳酸钾(0.25M)调pH,然后将标记好的cTnI单抗喷金于结合垫上(1.5μL/cm)并置于37℃恒温箱中平衡12h,并用标记的cTnI单抗组装免疫层析试纸条用于阳性样品的检测,最后以检测阳性样品T线(检测线)出线最亮时所选用的碳酸钾(0.25M)加入量为cTnI单抗标记反应体系最佳标记pH;
优选的,S5中步骤(2)的碳酸钾添加量梯度为6μL、7μL、8μL、9μ l和10μL;
(3)单抗标记量的优化
用优化的cTnI单抗标记反应体系最佳pH去标记cTnI单抗,标记时加入不同量的cTnI单抗,然后将标记好的cTnI单抗喷于结合垫上(1.5μL/cm) 置于37℃恒温箱中平衡12h后组条,最后以检测阳性样品T线出线最亮时所用单抗标记量为最佳标记量;
优选的,S5中步骤(3)的cTnI标记梯度为5μL、10μL、20μL和40 μL;
(4)cTnI单抗包被浓度的优化:
将cTnI单抗稀释成不同的浓度梯度后用喷金划膜仪将其包被于NC膜的T 线上,然后放置在37℃恒温箱中平衡15h后组条,最后以检测阳性样品T线最亮且检测cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的cTnI单抗包被浓度即为最佳包被浓度;
优选的,S5中步骤(4)的cTnI单抗稀释浓度梯度为0.8mg/mL、1.25mg/mL、 2.5mg/mL、5.0mg/mL和10mg/mL;
(5)样品垫处理液的优化
样品垫处理液的配方分别为1号(1%BSA、1%PVPK-40和0.5%Tween-20)、 2号(3%BSA、2%PVPK-40、1%PEG4000和0.5%Tween-20)、3号(1%BSA、1%PEG4000 和0.5%Tween-20)、4号(1%海藻糖、1%BSA、1%PVPK-40、1%PEG4000、1%酸水解酪素和1%Tween-20)、5号(1%海藻糖、1%BSA、1%PVPK-40、0.5%PEG4000、 1%酸水解酪素和3%TritonX-10)、6号(1%海藻糖、1%BSA、1%PVPK-40、 1%PEG4000、1%酸水解酪素和3%TritonX-10)、7号(2%海藻糖、0.5%PEG4000、 2%Tween-20、0.1%肝素钠和0.5%BSA)、8号(1%BSA、2%PVPK-40、2%PEG4000 和1%Tween-20)、9号(2.5%蔗糖、2%BSA和1%Tween-20)、10号(1%BSA 和5%蔗糖),稀释液为0.15mol/LPBS(pH7.4),来优化样品垫处理液的最终配方。在上述优化的条件下组装试纸条,然后以检测阳性样品T线出线最亮且检测和cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的样品垫处理液即为最佳处理液。
(6)AuNPs-cTnI单抗喷金量的优化
按上述优化的标记量和最佳标记pH去标记cTnI单抗,将标记好的cTnI 单抗按不同的喷金量喷于结合垫上,然后置于37℃恒温箱中平衡12h后组条,最后以检测阳性样品T线出线最亮且检测线cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的AuNPs-cTnI单抗喷金量为即为最佳喷金量;
优选的,S5中步骤(6)的喷金量梯度为3μL/cm、4μL/cm、5μL/cm、 6μL/cm和7μL/cm;
(7)cTnI稀释液的优化
选用PB缓冲液、PBST缓冲液(磷酸盐吐温缓冲液)、PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)、BB缓冲液(巴比妥缓冲液)和Tris-HCl缓冲液(三氨基甲烷缓冲液)来稀释cTnI,然后以检测阳性样品T线出线较亮且检测cTnI稀释液T 线没有非特异性反应时所用的缓冲液即为最佳cTnI稀释液。
(8)胶体金粒径的优化
用不同粒径的胶体金颗粒(16nm、24nm、30nm、40nm)去标记cTnI单抗,在上述优化的条件下组装试纸条,然后以检测阳性样品T线出线最亮且检测和cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的胶体金粒径即为最佳胶体金粒径。
S6、试纸条的组装:
将制备好的金标cTnI单抗以1.5μL/cm喷于结合垫上,然后放在37℃的恒温箱中平衡12h后组条;
将制备好的结合垫裁剪成上下各留白1mm左右,然后将处理好的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸进行组装。样品垫、结合垫和NC膜之间的叠加约1-2mm,各部分组装好后用切条机切成0.38cm的长条,最后装在特订的卡壳中即试纸条组装完成;
S7、灵敏性试验:
用所建立的cTnI试纸条检测方法,检测不同含量的cTnI(1×、2×、4×、8 ×、16×、32×、64×和128×稀释),以评价该方法的灵敏性。
S8、动物实验验证试剂盒的灵敏性和准确度:
实验动物选用1日龄的白羽肉鸡150羽,自由采食饮水,24小时光照,常规免疫至14日龄时进行分组,实验组120羽,对照组30羽。实验组于20 日龄时通过颈静脉注射CM-32离子交换纤维素悬液,每只0.35mL,用以诱发肉鸡腹水综合征。纤维素悬液为含有0.02g/mL纤维素、150U/mL肝素的生理盐水,悬液现配现用,使用过程中用磁力搅拌器连续搅拌混匀。对照组注射相同体积的生理盐水。检测指标:
(1)从21日龄起,记录试验鸡只的发病情况,取心脏记录右心室与全心室的重量比(RV/TV),右心室和全心室重量比值大于等于0.28、腹腔中出现明显腹水者为发病鸡,右心室和全心室重量比值大于等于0.25、无明显腹水者位亚临床病鸡。
(2)免疫印迹法检测鸡血清中cTnI的含量
(3)使用研制的胶体金试纸条分别检测对照组鸡、发病鸡、亚临床病鸡血清中cTnI的量
优选的,S1的步骤D中的搅拌速度与步骤B的搅拌速度相同,保证溶解的速率,冰箱的冷藏温度为4℃。
优选的,S2中步骤B和C中的混匀时间为15min,静置时间与混匀时间相同。
优选的,S5中的步骤(1)的胶体金溶液的pH调节的不同梯度为6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。
优选的,S5中步骤(2)的碳酸钾添加量梯度为6μL、7μL、8μL、9μ l和10μL。
优选的,S5中步骤(3)的cTnI添加量梯度为5μL、10μL、20μL和 40μL。
优选的,S5中步骤(4)的cTnI单抗稀释浓度梯度为0.8mg/mL、1.25mg/mL、 2.5mg/mL、5.0mg/mL和10mg/mL。
优选的,S5中步骤(6)的喷金量梯度为3μL/cm、4μL/cm、5μL/cm、 6μL/cm和7μL/cm。
本发明具备以下有益效果:
该种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,利用心肌钙蛋白I (cTnI)为检测抗原,以胶体金颗粒为信号物,采用双抗夹心法制备一种简便、快速和无需检测仪器适合现场快速检测的免疫层析试纸条,能够大大降低检测成本,便于推广使用。
附图说明
图1为本发明流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
请参阅图1,一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
S3、胶体金(AuNPs)颗粒的制备:
方法如下:
A、洗净三角瓶、转子、量筒后用超纯水润洗,去除杂质和灰尘;
B、用专用100mL量筒,量取50mL超纯水,加入三角烧瓶中并做好标后加热搅拌至沸腾;
C、快速加入1%(w/v)氯金酸溶液1mL,稍等片刻后加入2mL的柠檬酸三钠溶液(10mg/mL)继续加热10min,关闭电源;
D、移除加热装置,搅拌降温,降至室温后吸出转子并容至100mL,然后测其吸光度后,标记好日期,置于冰箱冷藏保存备用;
S2、金标cTnI单抗的制备:
方法如下:
A、取1mL烧制好的胶体金溶液放置在1.5mL的离心管(EP管)中,加入 8μL碳酸钾溶液调PH约7.5;
B、加入0.5μLcTnI单抗(3mg/mL),在室温下混匀一段时间后静置;
C、加入100μL10%浓度的牛血清白蛋白(BSA),在室温下混匀一段时间后静置;
D、在4℃,10000r/min的条件下离心15min,然后弃掉上清,加入60μ L的金标复溶液进行复溶,然后标记好放入冰箱冷藏备用;
优选的,S2中步骤B和C中的混匀时间为15min,静置时间与混匀时间相同;
S3、样品垫的处理:
称取1%PVPK40(聚乙烯吡咯烷酮系列中K值在40左右的高分子聚合物)、 1%BSA和1%酸水解酪素加入到0.15mol/LpH7.4PBS(磷酸缓冲盐溶液)中溶解、混匀后作为样品垫的处理液.
将配置好的样品垫处理液加入到长30cm,宽2cm的玻璃纤维的垫上使其浸泡整条样品垫,然后放在室温晾干后放在恒温恒湿柜中备用;
S4、NC膜的包被:
首先将NC膜贴于PVC底板的顶面,然后放在37℃的恒温箱中平衡15min;喷金划膜仪洗涤调试好准备进行划膜,将稀释好的cTnI单抗和兔抗鸡免疫球蛋白G(兔抗鸡IgG)以1.0μL/cm包被于NC膜上,放置在37℃的恒温箱中平衡十五小时后放在恒温恒湿柜中备用;
S5、试纸条反应体系的优化:
(1)胶体金最佳工作pH值的选择
用浓度0.1mol/L碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH调节为不同梯度,各取 1mL加入10μg鼠源McAb(单克隆抗体),混匀,在室温下反应10min,加入 0.1mL10%NaCl溶液,静置2h,观察颜色变化,在12000r/min条件下离心10min,将沉淀用含1%BSA的PBS中溶解,已完全溶解且呈均匀***管的pH为胶体金最佳工作pH;
优选的,S5中的步骤(1)的胶体金溶液的pH调节的不同梯度为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5;
(2)单抗标记反应体系pH值的优化
按上述方法标记cTnI单抗时,加不同量的碳酸钾(0.25M)调pH,然后将标记好的cTnI单抗喷金于结合垫上(1.5μL/cm)并置于37℃恒温箱中平衡12h,并用标记的cTnI单抗组装免疫层析试纸条用于阳性样品的检测,最后以检测阳性样品T线(检测线)出线最亮时所选用的碳酸钾(0.25M)加入量为cTnI单抗标记反应体系最佳标记pH;
优选的,S5中步骤(2)的碳酸钾添加量梯度为6μL、7μL、8μL、9μ l和10μL;
(3)单抗标记量的优化
用优化的cTnI单抗标记反应体系最佳pH去标记cTnI单抗,标记时加入不同量的cTnI单抗,然后将标记好的cTnI单抗喷于结合垫上(1.5μL/cm) 置于37℃恒温箱中平衡12h后组条,最后以检测阳性样品T线出线最亮时所用单抗标记量为最佳标记量;
优选的,S5中步骤(3)的cTnI标记梯度为5μL、10μL、20μL和40 μL;
(4)cTnI单抗包被浓度的优化:
将cTnI单抗稀释成不同的浓度梯度后用喷金划膜仪将其包被于NC膜的T 线上,然后放置在37℃恒温箱中平衡15h后组条,最后以检测阳性样品T线最亮且检测cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的cTnI单抗包被浓度即为最佳包被浓度;
优选的,S5中步骤(4)的cTnI单抗稀释浓度梯度为0.8mg/mL、1.25mg/mL、 2.5mg/mL、5.0mg/mL和10mg/mL;
(5)样品垫处理液的优化
样品垫处理液的配方分别为1号(1%BSA、1%PVPK-40和0.5%Tween-20)、2号(3%BSA、2%PVPK-40、1%PEG4000和0.5%Tween-20)、3号(1%BSA、1%PEG4000 和0.5%Tween-20)、4号(1%海藻糖、1%BSA、1%PVPK-40、1%PEG4000、1%酸水解酪素和1%Tween-20)、5号(1%海藻糖、1%BSA、1%PVPK-40、0.5%PEG4000、 1%酸水解酪素和3%TritonX-10)、6号(1%海藻糖、1%BSA、1%PVPK-40、 1%PEG4000、1%酸水解酪素和3%TritonX-10)、7号(2%海藻糖、0.5%PEG4000、 2%Tween-20、0.1%肝素钠和0.5%BSA)、8号(1%BSA、2%PVPK-40、2%PEG4000 和1%Tween-20)、9号(2.5%蔗糖、2%BSA和1%Tween-20)、10号(1%BSA 和5%蔗糖),稀释液为0.15mol/LPBS(pH7.4),来优化样品垫处理液的最终配方。在上述优化的条件下组装试纸条,然后以检测阳性样品T线出线最亮且检测和cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的样品垫处理液即为最佳处理液。
(6)AuNPs-cTnI单抗喷金量的优化
按上述优化的标记量和最佳标记pH去标记cTnI单抗,将标记好的cTnI 单抗按不同的喷金量喷于结合垫上,然后置于37℃恒温箱中平衡12h后组条,最后以检测阳性样品T线出线最亮且检测线cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的AuNPs-cTnI单抗喷金量为即为最佳喷金量;
优选的,S5中步骤(6)的喷金量梯度为3μL/cm、4μL/cm、5μL/cm、 6μL/cm和7μL/cm;
(7)cTnI稀释液的优化
选用PB缓冲液、PBST缓冲液(磷酸盐吐温缓冲液)、PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)、BB缓冲液(巴比妥缓冲液)和Tris-HCl缓冲液(三氨基甲烷缓冲液)来稀释cTnI,然后以检测阳性样品T线出线较亮且检测cTnI稀释液T 线没有非特异性反应时所用的缓冲液即为最佳cTnI稀释液。
(8)胶体金粒径的优化
用不同粒径的胶体金颗粒(16nm、24nm、30nm、40nm)去标记cTnI单抗,在上述优化的条件下组装试纸条,然后以检测阳性样品T线出线最亮且检测和cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的胶体金粒径即为最佳胶体金粒径。
S6、试纸条的组装:
将制备好的金标cTnI单抗以1.5μL/cm喷于结合垫上,然后放在37℃的恒温箱中平衡12h后组条;
将制备好的结合垫裁剪成上下各留白1mm左右,然后将处理好的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸进行组装。样品垫、结合垫和NC膜之间的叠加约1-2mm,各部分组装好后用切条机切成0.38cm的长条,最后装在特订的卡壳中即试纸条组装完成;
S7、灵敏性试验:
用所建立的cTnI试纸条检测方法,检测不同含量的cTnI(1×、2×、4 ×、8×、16×、32×、64×和128×稀释),以评价该方法的灵敏性。
S8、动物实验验证试剂盒的灵敏性和准确度:
实验动物选用1日龄的白羽肉鸡150羽,自由采食饮水,24小时光照,常规免疫至14日龄时进行分组,实验组120羽,对照组30羽。实验组于20日龄时通过颈静脉注射CM-32离子交换纤维素悬液,每只0.35mL,用以诱发肉鸡腹水综合征。纤维素悬液为含有0.02g/mL纤维素、150U/mL肝素的生理盐水,悬液现配现用,使用过程中用磁力搅拌器连续搅拌混匀。对照组注射相同体积的生理盐水。检测指标包括右心室和全心室重量的比值(RV/TV)、红细胞比容(PCV)等,对比血清滴加到试剂盒检测效果。
工作原理:使用时分别设置实验组和对照组,实验组诱发肉鸡腹水综合征,采用控制变量的方法对实验组注射通过颈静脉注射CM-32离子交换纤维素悬液,对照组注射相同体积的生理盐水,间隔相同时间采样检测RV/TV、PCV,对比血清滴加到试剂盒检测效果即可得出检测结果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
S1、蛋白表达
1.1 32a-cTnI质粒构建
通过NCBI查找的cTnI基因完全序列,筛选出CDS蛋白质(编码区639bp,理论分子量为24KD+10~20KD),交付于公司合成并连接于载体32a上,导入大肠杆菌DH5α诱变菌株;
1.2提取32a-cTnI阳性质粒
使用质粒提取试剂盒,3mLLB/Amp液体培养基加入2.5μL菌液,提前12小时复苏DH5α阳性菌株。按照试剂盒操作说明提取。提取出的32a-cTnI基因阳性质粒于-80℃冻存备用;
1.3BL21-32a-cTnI构建
冰上融化BL21感受态细胞与冻存的32a-cTnI质粒,取0.3μL质粒移液枪打入一管(100μL)BL21感受态细胞中,冰浴30分钟,45℃水浴80秒,再冰浴2分钟后,加入400μLSOC培养基,37℃摇床培养1小时,取全部已转化的感受态细胞涂布到LB/Amp固体培养皿中,37℃倒置培养12小时。挑取菌落接种于LB/Amp液体培养基扩殖,加甘油-20℃冻存备用;
1.4IPTG诱导pET32(a)-troponinI融合蛋白的表达与纯化:
1)、菌种活化:取10ul菌种接种于含50μg/mlAmp+的50mlLB培养液的试管中,37℃220rpm振摇过夜;
2)、放大培养:按1:100接种于50μg/mlAmp+的2LLB培养液中,37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8;
3)、向培养物中加入IPTG至终浓度为0.1mM,37℃220rpm振摇4h,诱导融合蛋白表达;
4)、4000g,离心10min,收集菌体弃上清,用PBS重悬菌体再次离心收集菌体,0.01MPBS重悬液进行超声波破碎后(1:1000比例加入cocktail或AEBSF),8000rpm,4℃离心20min,取上清(沉淀保留);
5)、上清纯化:利用低压层析***,以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱;
6)、用Ni-IDABinding-Buffer(20mMTris-HCl,0.15MNaCl,pH8.0)以0.5ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;
7)、用Ni-IDAWashing-Buffer(20mMTris-HCl,10mM咪唑,0.15MNaCl,pH8.0)以1ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;
8)、用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl,100mM咪唑,0.15MNaCl,pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;
9)、同8)
10)、用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl,150mM咪唑,0.15MNaCl,pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;
11)、用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl,300mM咪唑,0.15MNaCl,pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;
12)、上述收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用0.01MPBSpH7.2-7.4进行透析过夜;
13)、沉淀:20mMTris,8M尿素,300mMNaCl,pH8.0直接溶解沉淀样品后,8000rpm,4℃离心20min收集上清样品,按照步骤7-14进行蛋白纯化;
14)、将步骤12中的纯化洗脱样品装入透析袋依次放入6M尿素(含20mMTris,300mMNaCl,pH8.0),4M尿素(含20mMTris,300mMNaCl,pH8.0),2M尿素(含20mMTris,300mMNaCl,pH8.0),1M尿素(含20mMTris,300mMNaCl,pH8.0),0.5M尿素(含20mMTris,300mMNaCl,pH8.0)分别2-3h,最后20mMTris-HCl,100mMNaCl,pH8.0溶液中透析过夜。进行12%SDS-PAGE检测分析,考马斯亮蓝染色显带。
S2、cTnI单克隆抗体的制备
1)、小鼠免疫
以重组表达并经纯化的鸡心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)作为免疫原。首次免疫采用ip方式,将cTnI与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后免疫6周龄BalB/C小鼠,每只0.2mg,间隔14d左右进行第2次免疫,将cTnI与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫小鼠,每只小鼠0.2mg,14d后尾静脉进行注射免疫,每只小鼠0.2mg。融合前3d尾静脉加强免疫0.2mg;
2)、细胞融合及筛选
细胞融合按常规操作进行,采用间接ELISA法筛选阳性克隆,有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆化,3次亚克隆后仍为阳性者予以定株。
3)、腹水抗体制备及纯化
使用BalB/C小鼠体内诱生法大量生产单克隆抗体。将阳性杂交瘤细胞以105~106个/只的数量注入一周前用降植烷预致敏的小鼠腹腔中,7~14d后收集腹水,离心后分装,-70℃冻存。采用蛋白A亲和层析柱纯化腹水抗体。SDSPAGE鉴定抗体纯度,考马斯亮兰法测定抗体含量。
S3、胶体金(AuNPs)颗粒的制备:
方法如下:
A、洗净三角瓶、转子、量筒后用超纯水润洗,去除杂质和灰尘;
B、用专用100mL量筒,量取50mL超纯水,加入三角烧瓶中并做好标后加热搅拌至沸腾;
C、快速加入1%(w/v)氯金酸溶液1mL,稍等片刻后加入2mL的柠檬酸三钠溶液(10mg/mL)继续加热10min,关闭电源;
D、移除加热装置,搅拌降温,降至室温后吸出转子并容至100mL,然后测其吸光度后,标记好日期,置于冰箱冷藏保存备用;
S2、金标cTnI单抗的制备:
方法如下:
A、取1mL烧制好的胶体金溶液放置在1.5mL的离心管(EP管)中,加入8μL碳酸钾溶液调PH约7.5;
B、加入0.5μLcTnI单抗(3mg/mL),在室温下混匀一段时间后静置;
C、加入100μL10%浓度的牛血清白蛋白(BSA),在室温下混匀一段时间后静置;
D、在4℃,10000r/min的条件下离心15min,然后弃掉上清,加入60μL的金标复溶液进行复溶,然后标记好放入冰箱冷藏备用;
优选的,S2中步骤B和C中的混匀时间为15min,静置时间与混匀时间相同;
S3、样品垫的处理:
称取1%PVPK40(聚乙烯吡咯烷酮系列中K值在40左右的高分子聚合物)、1%BSA和1%酸水解酪素加入到0.15mol/LpH7.4PBS(磷酸缓冲盐溶液)中溶解、混匀后作为样品垫的处理液.
将配置好的样品垫处理液加入到长30cm,宽2cm的玻璃纤维的垫上使其浸泡整条样品垫,然后放在室温晾干后放在恒温恒湿柜中备用;
S4、NC膜的包被:
首先将NC膜贴于PVC底板的顶面,然后放在37℃的恒温箱中平衡15min;喷金划膜仪洗涤调试好准备进行划膜,将稀释好的cTnI单抗和兔抗鸡免疫球蛋白G(兔抗鸡IgG)以1.0μL/cm包被于NC膜上,放置在37℃的恒温箱中平衡十五小时后放在恒温恒湿柜中备用;
S5、试纸条反应体系的优化:
(1)胶体金最佳工作pH值的选择
用浓度0.1mol/L碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH调节为不同梯度,各取1mL加入10μg鼠源McAb(单克隆抗体),混匀,在室温下反应10min,加入0.1mL10%NaCl溶液,静置2h,观察颜色变化,在12000r/min条件下离心10min,将沉淀用含1%BSA的PBS中溶解,已完全溶解且呈均匀***管的pH为胶体金最佳工作pH;
优选的,S5中的步骤(1)的胶体金溶液的pH调节的不同梯度为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5;
(2)单抗标记反应体系pH值的优化
按上述方法标记cTnI单抗时,加不同量的碳酸钾(0.25M)调pH,然后将标记好的cTnI单抗喷金于结合垫上(1.5μL/cm)并置于37℃恒温箱中平衡12h,并用标记的cTnI单抗组装免疫层析试纸条用于阳性样品的检测,最后以检测阳性样品T线(检测线)出线最亮时所选用的碳酸钾(0.25M)加入量为cTnI单抗标记反应体系最佳标记pH;
优选的,S5中步骤(2)的碳酸钾添加量梯度为6μL、7μL、8μL、9μl和10μL;
(3)单抗标记量的优化
用优化的cTnI单抗标记反应体系最佳pH去标记cTnI单抗,标记时加入不同量的cTnI单抗,然后将标记好的cTnI单抗喷于结合垫上(1.5μL/cm)置于37℃恒温箱中平衡12h后组条,最后以检测阳性样品T线出线最亮时所用单抗标记量为最佳标记量;
优选的,S5中步骤(3)的cTnI标记梯度为5μL、10μL、20μL和40μL;
(4)cTnI单抗包被浓度的优化:
将cTnI单抗稀释成不同的浓度梯度后用喷金划膜仪将其包被于NC膜的T线上,然后放置在37℃恒温箱中平衡15h后组条,最后以检测阳性样品T线最亮且检测cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的cTnI单抗包被浓度即为最佳包被浓度;
优选的,S5中步骤(4)的cTnI单抗稀释浓度梯度为0.8mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL和10mg/mL;
(5)样品垫处理液的优化
样品垫处理液的配方分别为1号(1%BSA、1%PVPK-40和0.5%Tween-20)、2号(3%BSA、2%PVPK-40、1%PEG4000和0.5%Tween-20)、3号(1%BSA、1%PEG4000和0.5%Tween-20)、4号(1%海藻糖、1%BSA、1%PVPK-40、1%PEG4000、1%酸水解酪素和1%Tween-20)、5号(1%海藻糖、1%BSA、1%PVPK-40、0.5%PEG4000、1%酸水解酪素和3%TritonX-10)、6号(1%海藻糖、1%BSA、1%PVPK-40、1%PEG4000、1%酸水解酪素和3%TritonX-10)、7号(2%海藻糖、0.5%PEG4000、2%Tween-20、0.1%肝素钠和0.5%BSA)、8号(1%BSA、2%PVPK-40、2%PEG4000和1%Tween-20)、9号(2.5%蔗糖、2%BSA和1%Tween-20)、10号(1%BSA和5%蔗糖),稀释液为0.15mol/LPBS(pH7.4),来优化样品垫处理液的最终配方。在上述优化的条件下组装试纸条,然后以检测阳性样品T线出线最亮且检测和cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的样品垫处理液即为最佳处理液。
(6)AuNPs-cTnI单抗喷金量的优化
按上述优化的标记量和最佳标记pH去标记cTnI单抗,将标记好的cTnI单抗按不同的喷金量喷于结合垫上,然后置于37℃恒温箱中平衡12h后组条,最后以检测阳性样品T线出线最亮且检测线cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的AuNPs-cTnI单抗喷金量为即为最佳喷金量;
优选的,S5中步骤(6)的喷金量梯度为3μL/cm、4μL/cm、5μL/cm、、6μL/cm和7μL/cm;
(7)cTnI稀释液的优化
选用PB缓冲液、PBST缓冲液(磷酸盐吐温缓冲液)、PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)、BB缓冲液(巴比妥缓冲液)和Tris-HCl缓冲液(三氨基甲烷缓冲液)来稀释cTnI,然后以检测阳性样品T线出线较亮且检测cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的缓冲液即为最佳cTnI稀释液。
(8)胶体金粒径的优化
用不同粒径的胶体金颗粒(16nm、24nm、30nm、40nm)去标记cTnI单抗,在上述优化的条件下组装试纸条,然后以检测阳性样品T线出线最亮且检测和cTnI稀释液T线没有非特异性反应时所用的胶体金粒径即为最佳胶体金粒径。
S6、试纸条的组装:
将制备好的金标cTnI单抗以1.5μL/cm喷于结合垫上,然后放在37℃的恒温箱中平衡12h后组条;
将制备好的结合垫裁剪成上下各留白1mm左右,然后将处理好的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸进行组装。样品垫、结合垫和NC膜之间的叠加约1-2mm,各部分组装好后用切条机切成0.38cm的长条,最后装在特订的卡壳中即试纸条组装完成;
S7、灵敏性试验:
用所建立的cTnI试纸条检测方法,检测不同含量的cTnI(1×、2×、4×、8×、16×、32×、64×和128×稀释),以评价该方法的灵敏性。
S8、动物实验验证试剂盒的灵敏性和准确度:
实验动物选用1日龄的白羽肉鸡150羽,自由采食饮水,24小时光照,常规免疫至14日龄时进行分组,实验组120羽,对照组30羽。实验组于20日龄时通过颈静脉注射CM-32离子交换纤维素悬液,每只0.35mL,用以诱发肉鸡腹水综合征。纤维素悬液为含有0.02g/mL纤维素、150U/mL肝素的生理盐水,悬液现配现用,使用过程中用磁力搅拌器连续搅拌混匀。对照组注射相同体积的生理盐水。检测指标:
(1)从21日龄起,记录试验鸡只的发病情况,取心脏记录右心室与全心室的重量比(RV/TV),右心室和全心室重量比值大于等于0.28、腹腔中出现明显腹水者为发病鸡,右心室和全心室重量比值大于等于0.25、无明显腹水者位亚临床病鸡。
(2)免疫印迹法检测鸡血清中cTnI的含量
(3)使用研制的胶体金试纸条分别检测对照组鸡、发病鸡、亚临床病鸡血清中cTnI的量。
2.根据权利要求1所述的一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,其特征在于:S1的步骤D中的搅拌速度与步骤B的搅拌速度相同,保证溶解的速率,冰箱的冷藏温度为4℃。
3.根据权利要求1所述的一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,其特征在于:优选的,S2中步骤B和C中的混匀时间为15min,静置时间与混匀时间相同。
4.根据权利要求1所述的一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,其特征在于:S5中的步骤(1)的胶体金溶液的pH调节的不同梯度为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。
5.根据权利要求1所述的一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,其特征在于:S5中步骤(2)的碳酸钾添加量梯度为6μL、7μL、8μL、9μl和10μL。
6.根据权利要求1所述的一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,其特征在于:S5中步骤(3)的cTnI添加量梯度为5μL、10μL、20μL和40μL。
7.根据权利要求1所述的一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,其特征在于:S5中步骤(4)的cTnI单抗稀释浓度梯度为0.8mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mL和10mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种禽类肺动脉高压综合征诊断试剂盒的制备方法,其特征在于:S5中步骤(6)的喷金量梯度为3μL/cm、4μL/cm、5μL/cm、6μL/cm和7μL/cm。
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