CN111733163B - 一种调节花青苷合成的IbMYB44基因及其重组表达载体与应用 - Google Patents

Abstract

一种调节花青苷合成的IbMYB44基因及其重组表达载体与应用，IbMYB44基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。IbMYB44基因在调节紫薯甘薯块根花青苷转运的应用，为调节甘薯块根花青苷的积累的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

Description

一种调节花青苷合成的IbMYB44基因及其重组表达载体与 应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及调节花青苷合成的IbMYB44基因及其重组表达载体的构建与应用，具体涉及从甘薯中分离、克隆得到一个参与甘薯块茎花青苷生物合成相关的MYB TF家族成员IbMYB44基因及其应用。

背景技术

甘薯是世界第七大最重要的作物，也是中国第四大最重要的作物，为人类提供大量的碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质。紫薯因外观漂亮和花青素含量高而非常受人欢迎，紫薯也是一种保健食物，其对预防癌症、糖尿病等疾病以及改善肝功能具有有益作用。紫薯块茎含有大量的多酚，花青苷是紫薯中常见的可见类多酚物质。紫薯花青苷具有很多的生理功能，紫薯花色苷除了具有抗氧化，调节血脂血糖外，还有消除炎症以及改善记忆力等其它生理功能。

花青苷是植物次生代谢产物中最显著的一类，在植物抗病、防紫外线、适应恶劣环境等方面具有重要的生物学作用。同时其还能决定花、果实、蔬菜的颜色，还能保护植物免受紫外线损伤，抵御低温、干旱胁迫及微生物病原体的侵害。在预防人类的神经***和心血管疾病，癌症和糖尿病方面也有重要的作用，因此花青苷具有很大的研究价值。大多数植物花色素的合成是通过MYB-bHLH复合物或者MYB-bHLH-WD40复合物(MBW复合物)进行调节。

在MBW复合物中，转录因子MYBs扮演着重要作用。例如，拟南芥中的ATMYB75(PAP1)、ATMYB90(PAP2)、ATMYB113和ATMYB114，苹果的MDMYB10和MDMYB110a，梨的PYMB10和PYMYB114以及草莓的FAMYB10都表现出作为激活剂参与了花青素的生物合成。除了作为激活剂，对花青苷起着负调控的MYBs转录因子也得到了广泛报道，包括拟南芥AtMYBL2和葡萄VvMYBC2-L1(R3-MYBs)和草莓FaMYB1、桃子PpMYB18和马铃薯StMYB44(R2R3-MYBs)。其中，EAR基序(LXLXL或DLNXXP)是植物中最主要常见的转录抑制基序。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调节花青苷合成的IbMYB44基因及其重组表达载体与应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种调节花青苷合成的IbMYB44基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种由上述调节花青苷合成的IbMYB44基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种上述调节花青苷合成的IbMYB44基因的宿主菌。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种克隆权上述调节花青苷合成的IbMYB44基因的引物对，上游引物IbMYB44-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物IbMYB44-R1序列如SEQ ID No.4所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述调节花青苷合成的IbMYB44基因在调节紫薯块茎中花青苷合成中的应用。

优选的技术方案为：所述的调节花青苷合成的IbMYB44基因联合IbMYB340基因在调节紫薯块茎中花青苷合成中的应用；所述的IbMYB340基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种含有上述调节花青苷合成的IbMYB44基因的重组表达载体。

优选的技术方案为：以pSAK277为出发载体，将权利要求1所述的调节花青苷合成的IbMYB44基因***EcoR I和Xbal I位点之间所得。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：所述的调节花青苷合成的IbMYB44基因的重组表达载体在调节紫薯块茎中花青苷合成中的应用。

优选的技术方案为：权利要求9所述的调节花青苷合成的IbMYB44基因的重组表达载体联合含IbMYB340基因的重组载体在甘薯块茎中花青苷合成中的应用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

1.IbMYB44基因在调节甘薯甘薯块茎花青苷转运的应用，为调节甘薯块茎花青苷的积累的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。

2.本发明将转录因子IbMYB44转化破色期番茄过时抑制果实花青苷合成，同时将IbMYB44与IbMYB340共转化烟草叶片调节烟草叶片花青苷积累，并经生物学功能验证，表明本发明克隆IbMYB44与IbMYB340联合调节甘薯块茎花青苷转运的功能。

附图说明

图1为本发明涉及的IbMYB44抑制破色期番茄果实的色素积累。其中a为空载，b-e为不同果实的侵染结果。照片为侵染7天后拍摄所得。

图2(a)为本发明IbMYB44与IbMYB340共转化烟草叶片调节花青苷的积累。a-h为IbMYB340：IbMYB44的不同菌液比例。(b)对烟草叶片总花色苷含量的测定。(c)通过色差仪测量烟草叶片花青苷积累区域的L*值，L*值代表光度，值越高代表颜色明亮。(d)通过色差仪测量烟草叶片花青苷积累附近色素积累，a*/b*的比值表示色素变化，a*/b*的比值从负值转为正值表示烟草叶片的颜色由绿色变为红色。(b-d)中误差线是六次检测的平均值。

图3为本发明IbMYB44与IbMYB340结合甘薯启动子IbANS共侵染烟草叶片进行双荧光素酶实验，验证其对IbANS启动子的激活效应。

图4通过酵母双杂交(Y2H)及萤光素酶互补实验验证转录因子之间的相互作用。(a)I-VI代表IbMYB340的不同氨基酸残基。(b)Y2H验证IbMYB340和IbMYB44的相互作用位点。(c)萤光素酶互补实验验证IbMYB340和IbMYB44的互作效应。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-4。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：本发明紫薯中IbMYB44基因的克隆和重组载体的构建

1、从甘薯块茎中提取RNA：甘薯的总RNA的提取采用Plant Total RNA IsolationKitPlus(Foregene，RE-05022)试剂盒，按照该试剂盒提供的操作说明书操作，具体为：取500mg冷冻干燥后的‘栗子香’甘薯的块根于研钵中，后续实验操作参照试剂盒说明书，获得RNA。随后取2μL的RNA跑琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度估算RNA的浓度，并于-80℃冰箱保存备用。具体为：取500mg冷冻干燥后的‘栗子香’甘薯的块根于研钵中，加入液氮充分研磨至细粉末；吸取500μLBufferPSL1于2mL离心管中，加入10μLβ-巯基乙醇，混匀；用液氮遇冷的蓝色枪头刮取磨好的适量(约50mg)粉末转入BufferPSL1中，漩涡震荡混匀；室温静置5min后加入100μLBufferPS，轻柔混匀；将所有液体转移至DNA-CleaningColumn中，12000rpm离心2min后去除过滤柱，保留收集管内上清液；小心转移上清液300mL至新的2mL离心管中，加入450mLBufferPSL2，轻柔混匀；取500μL混合液转移至RNA-onlyColumn中，12000rpm离心1min后弃掉废液；向RNA-onlyColumn中加入500μLBufferPRW1，离心1min后弃掉废液；加入700μL无水乙醇，离心1min后弃掉废液；向RNA-onlyColumn中加入700μLBufferPRW2，12000rpm离心1min，弃掉废液，并重复一次此步骤；12000rpm离心2min，弃掉收集管；将RNA-onlyColumn转移至新的2mL离心管中，向膜中央滴入60μL于65℃预热的RNase-FreeddH₂O，室温放置2min，12000rpm离心1min后收集RNA。取2μL的RNA跑琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度估算RNA的浓度，并于-80℃冰箱保存备用。

2、第一链cDNA的合成采用Prime Script^TM RT Master Mix(Takara)反转录试剂盒(按照该试剂盒提供的说明书操作)。反转录体系为10μL：5×PrimeScriptR^TMasterMix2μL，totalRNA2μL，RNase-FreeddH₂O6μL。反应条件为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。得到的cDNA可放置-20℃冰箱保存。经反转录得到的‘栗子香’第一链cDNA用于扩增IbMYB44基因全长。扩增基因引物对为IbMYB44-F1：5’-ACTAGTGGATCCAAAGAATTCATGGCGAGTATTAGTCCTAATGGG-3’(SEQ ID No.3)；IbMYB44-R1：5’-TCATTAAAGCAGGACTCTAGACTACTCTAATCGGTTAACTCCGACG-3’(SEQ ID No.4)。超保真DNA聚合酶

Super-Fidelity DNA Polymerase(P505-d1)购自诺唯赞生物科技公司。扩增的反应体系为50μL中包括200ng cDNA，2×Phanta MaxBuffer 25μL，10mM dNTP 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)1μL，10μM 2μL上述引物，加ddH₂O至50μL。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒,35个热循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。

PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自天根，中国)回收DNA片段，步骤参照使用说明书。回收纯化的DNA溶液一部分送至上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果表明，基因全长为1182bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。IbMYB44基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

回收纯化的DNA溶液一部分与双酶切(EcoRI/XbaI)的线性pSAK277载体进行连接反应，重组酶

II One Step Cloning Kit(货号：C112-01)购自诺唯赞生物科技公司，并按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是10μL，其中包括2μL的5×CE IIBuffer，50～200ng线性化克隆载体(本实施例具体为100ng)，50～200ng***片段扩增产物(本实施例具体为100ng)，1μL

II。37℃连接30min。待反应完成后，立即将反应放置于冰水浴中冷却5min，反应产物可直接进行转化。转化采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L壮观霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序。含有目的基因序列的正确质粒命名为ItfERF71a-pSAK277。应用冻融法将上述重组载体导入到农杆菌GV3101中。挑取农杆菌GV3101单菌落接种到20ml附加30μg/ml Gentamycin的YEB液体培养基，28℃，200rpm，培养1天；吸取200μl菌液加入20ml附加30μg/ml Gentamycin的YEB液体培养基，28℃培养至OD₆₀₀为0.3-0.4；取2ml菌液，4℃，10000rpm离心10min弃上清，用800μl冰预冷的0.01mol/L的Tris-Cl(pH7.0)重悬沉淀，离心10min弃上清；用冰预冷的100μl YEB液体培养基重悬菌块，并加入至分别含5μl的1.0μg/μl的pSAK277-IbMYB340 10μl冰预冷的LTE(10mmol/L Tris-Cl，1mmol/LNa₂EDTA，pH8.0)溶液中，轻柔混合，立即将混合物置于液氮中5min后，迅速转入37℃水浴锅25min；添加室温下放置的LB液体培养基100μL，28℃预表达1.5h，并涂布到附加60μg/mlGentamycin和60μg/mlKanamycin的YEB固体培养基上，28℃，培养1-2天，至单菌落出现。

辅助因子IbMYB340克隆的模板是紫薯cDNA，PCR扩增的正向引物序列是：5’-actagtggatccaaagaattcATGGTGGGAGCTGCTGAGAA-3’；反向引物序列是5’-tcattaaagcaggactctagaTCAGAAAATAAACCCTCCATTCCA-3’，扩增的反应体系为50μL中包括200ng cDNA，2×PhantaMax Buffer 25μL，10mM dNTP 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)1μL，10μM 2μL上述引物，加ddH₂O至50μL。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒,35个热循环，72℃延伸5分钟，4℃保存。PCR扩增的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用AxyGEN小量胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术杭州有限公司，中国)回收DNA片段，回收纯化的DNA溶液与双酶切(EcoRI/XhoI)的线性pSAK277载体进行连接反应，重组酶

II One StepCloning Kit(货号：C112-01)购自诺唯赞生物科技公司，并按说明书步骤操作。连接反应体系总体积是10μL，其中包括2μL的5×CE II Buffer，50～200ng线性化克隆载体(本实施例具体为100ng)，50～200ng***片段扩增产物(本实施例具体为100ng)，1μL

II。37℃连接30min。待反应完成后，立即将反应放置于冰水浴中冷却5min，反应产物可直接进行转化。转化采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L壮观霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个阳性克隆测序(由上海英骏生物技术有限公司完成)。测序结果表明，IbMYB340基因全长为720bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，构建重组载体命名为pSAK277-IbMYB340；应用冻融法将上述重组载体导入到农杆菌GV3101中。挑取农杆菌GV3101单菌落接种到20ml附加30μg/ml Gentamycin的YEB液体培养基，28℃，200rpm，培养1天；吸取200μl菌液加入20ml附加30μg/ml Gentamycin的YEB液体培养基，28℃培养至OD₆₀₀为0.3-0.4；取2ml菌液，4℃，10000rpm离心10min弃上清，用800μl冰预冷的0.01mol/L的Tris-Cl(pH7.0)重悬沉淀，离心10min弃上清；用冰预冷的100μl YEB液体培养基重悬菌块，并加入至分别含5μl的1.0μg/μl的pSAK277-IbMYB34010μl冰预冷的LTE(10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L Na₂EDTA，pH8.0)溶液中，轻柔混合，立即将混合物置于液氮中5min后，迅速转入37℃水浴锅25min；添加室温下放置的LB液体培养基100μL，28℃预表达1.5h，并涂布到附加60μg/mlGentamycin和60μg/mlKanamycin的YEB固体培养基上，28℃，培养1-2天，至单菌落出现。

实施例2：本发明涉及的IbMYB44抑制破色期番茄果实的色素积累

如图1所示，其中(a)为空白对照，从(b)-(e)可以发现IbMYB44可以抑制破色期番茄果实的色素积累。

实施例3：本发明IbMYB44基因与其共作用因子IbMYB340共转化调节烟草叶片花青苷积累

花青苷合成相关的IbMYB44基因联合IbMYB340基因在调节烟草叶片中花青苷合成中的应用；所述的IbMYB340基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

构建的重组载体通过农杆菌介导瞬时转化烟草叶片。

实施方式一：挑取携带植物表达载体IbMYB44-pSAK277质粒的农杆菌GV3101单菌落，然后在28℃下倒置培养2d，将农杆菌GV3101重新悬浮于10ml含有10mM MgCl₂、200μm乙酰丁香酮和10mM MES(2-(N-吗啉)-乙磺酸，ph＝5.6)的缓冲液中至OD600值为0.8-1.0，在25℃下悬浮培养4～5小时后用于侵染，得到IbMYB44菌液。随后用注射器在2～3周龄的烟草叶片背面沿轴线两端注射适量菌液，随后将烟草至于16℃避光诱导12h后拿出放置长日照(16h)组培间培养4～7天观察表型并拍照取样，用于后续实验。

实施方式二：挑取携带植物表达载体pSAK277-IbMYB340质粒的农杆菌GV3101单菌落，然后在28℃下倒置培养2d，将农杆菌GV3101重新悬浮于10ml含有10mM MgCl₂、200μm乙酰丁香酮和10mM MES(2-(N-吗啉)-乙磺酸，ph＝5.6)的缓冲液中至OD600值为0.8-1.0，在25℃下悬浮培养4～5小时后用于侵染，得到IbMYB340菌液。用注射器在2～3周龄的烟草叶片背面沿轴线两端注射由IbMYB44菌液和IbMYB340菌液按照1：1的质量比例构成的混合菌液，随后将烟草至于16℃避光诱导12h后拿出放置长日照(16h)组培间培养4～7天观察表型并拍照取样，用于后续实验。

结果表明，单独转化IbMYB340有较明显的花青苷含量的积累，而随着侵染液中IbMYB44比例的增加，烟草中花青苷含量积累逐渐变少(图3)。花青苷积累的烟草叶片通过分光光度计和色差仪检测色素含量及颜色变化(图3)，结果与表型图一致。因此，IbMYB44基因与IbMYB340共转化烟草叶片可以调节烟草叶片花青苷的合成。

实施例4：IbMYB44与IbMYB340结合甘薯启动子IbANS共侵染烟草叶片进行双荧光素酶实验，验证其对IbANS启动子的激活效应。

将IbANS启动子与转录因子IbMYB44及IbMYB340按照1：9的比例混合注射烟草叶片，其中IbMYB44与IbMYB340按照实验设计的不同比例混合菌液。取样检测LUC：REN值，验证IbMYB44与IbMYB340共转化对IbANS启动子的激活效应，如图3所示，可以发现随着混合菌液中IbMYB44比例的提高，IbANS启动子的活性逐渐降低，从而调节烟草叶片中的花青苷合成。

实施例5：酵母双杂交验证IbMYB44和IbMYB340之间的互作

为了验证IbMYB44和IbMYB340是否存在互作，通过酵母双杂交试验进行验证，IbMYB340 CDS全长序列和C-或N-端残基氨基酸序列分别克隆，并***到pGBKT7载体，分别验证自激活活性。同时克隆了IbMYB44的CDS全长序列***pGADT7载体目的是检测与IbMYB340是否存在蛋白互作。首先共转化IbMYB44与IbMYB340在二缺SD-Trp-Leu的培养基上生长，再把转化子转移到四缺SD-Trp-Leu-His-Ade的培养基上筛选，结果表明，IbMYB340CDS的氨基酸序列(IV)表现出很强的转录激活活性。共同转化酵母时，氨基酸序列(IV)与IbMYB44不但能在在二缺SD-Trp-Leu的培养基上生长，而且能在四缺SD-Trp-Leu-His-Ade培养基上生长，这说明IbMYB340与IbMYB44之间存在互作位点(图4的b)。

同时，为了进一步得验证IbMYB44和IbMYB340之间的互作效应。我们将IbMYB340CDS全长序列克隆并***到Nluc载体中，IbMYB44则克隆其全长序列并***到CLuc载体中。将构建成功载体转化农杆菌GV3101后1∶1共转化烟草叶片进行荧光素酶互补实验，取样检测Luc荧光值。结果可得NLuc-IbMYB340+CLuc-IbMYB44显现较高的荧光值，而在对照组中没有检测到较明显的荧光素酶活性，这说明IbMYB340与IbMYB44之间存在互作效应(图4)。

实施例6：一种上述调节花青苷合成的IbMYB44基因的宿主菌

取-80度保存的GV3101农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化。处于冰水混合状态时***冰中。向50ul感受态加入0.1ug的pSAK277-IbMYB44重组质粒，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37度水浴5分钟、冰浴5分钟。加入700ul无抗生素的LB，于28度振荡培养2～3小时。6000rpm离心一分钟收菌，留取100ul左右上清轻轻吹打重悬菌液涂布于含壮观霉素和利福平的LB平板(每100ml固体LB加80ul 100mg/ml和250ul10mg/ml利福平上，倒置放于28度培养箱培养2～3天。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种调节花青苷合成的IbMYB44基因及其重组表达载体与应用

<140> 2019107248674

<141> 2019-08-07

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> Ipomoea batatas

<400> 1

atggcgagta ttagtcctaa tgggaggagg aaagatatgg atcgagtgaa ggggccatgg 60

agtcctgagg aagatgagct tttacagcag ctggtgcaga agcatgggcc tcggaactgg 120

tcgctgatca gtaaatcgat tccggggaga tcggggaagt cgtgccggtt gcggtggtgt 180

aatcagctgt cgccgcaggt ggagcaccgg gcgtttacgg cggaggagga tgatactata 240

atccgggcgc atgctcggtt tgggaacaag tgggcgacca tagctaggtt gttggctggg 300

cggaccgaca acgcgattaa gaaccactgg aactctacct tgaagaggaa gtgctcgtcc 360

atgagcgccg atgaagggaa tgatctggcg gataggcttc aacagcagcc gttgaagaga 420

tcggtgagtg ccggggccgc ggttacgctc tcgggtctgc acttcaatcc ggggagtcct 480

tccgggtcgg atgttagcga atcgagtttg ccggttatgt ccccgtctca cgtgtttaaa 540

ccgatagcta gaacaggtgg agttctacca ccaccggtag agacgcctcc gcctccgccg 600

cctccaccgc cagcgaacga ccctcctact tcgctcagcc tctctctccc aggagttgac 660

tcgtcgtctg atgtctcccc tagattgacc gagtcaactc aacccataag cccgattcag 720

ctattttctt ccgctattca tacacctccc cctccaccgc ccctgccggt gccgtttcaa 780

cagccactag aaaaattcga tcttggagga ggcgcgccac cgccgatggc ttgtccaata 840

ccgccaaagg aggcggtgcc ggctccagct cagcaagacc gagtttttct cccgttcagc 900

caggagctac tggcggtgat gcaggacatg ataaagacgg aggtgcggaa ctacatgatg 960

ggcgtcgaac cacaacaacc acaaccatcg cagcagcagc gttatcacca acaccaccac 1020

caacaacatc aacaacaaca gcagtttcag tttcaacagc aacagcaatt gcagaatggg 1080

attgggcgcg ggatgtgctt gcagcgagcc accagcaacg acggattgag atatgcagcg 1140

gcggcgaccg tgaatcgcgt cggagttaac cgattagagt ag 1182

<210> 2

<211> 393

<212> PRT

<213> Ipomoea batatas

<400> 2

Met Ala Ser Ile Ser Pro Asn Gly Arg Arg Lys Asp Met Asp Arg Val

1 5 10 15

Lys Gly Pro Trp Ser Pro Glu Glu Asp Glu Leu Leu Gln Gln Leu Val

20 25 30

Gln Lys His Gly Pro Arg Asn Trp Ser Leu Ile Ser Lys Ser Ile Pro

35 40 45

Gly Arg Ser Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Cys Asn Gln Leu Ser

50 55 60

Pro Gln Val Glu His Arg Ala Phe Thr Ala Glu Glu Asp Asp Thr Ile

65 70 75 80

Ile Arg Ala His Ala Arg Phe Gly Asn Lys Trp Ala Thr Ile Ala Arg

85 90 95

Leu Leu Ala Gly Arg Thr Asp Asn Ala Ile Lys Asn His Trp Asn Ser

100 105 110

Thr Leu Lys Arg Lys Cys Ser Ser Met Ser Ala Asp Glu Gly Asn Asp

115 120 125

Leu Ala Asp Arg Leu Gln Gln Gln Pro Leu Lys Arg Ser Val Ser Ala

130 135 140

Gly Ala Ala Val Thr Leu Ser Gly Leu His Phe Asn Pro Gly Ser Pro

145 150 155 160

Ser Gly Ser Asp Val Ser Glu Ser Ser Leu Pro Val Met Ser Pro Ser

165 170 175

His Val Phe Lys Pro Ile Ala Arg Thr Gly Gly Val Leu Pro Pro Pro

180 185 190

Val Glu Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Asn Asp Pro

195 200 205

Pro Thr Ser Leu Ser Leu Ser Leu Pro Gly Val Asp Ser Ser Ser Asp

210 215 220

Val Ser Pro Arg Leu Thr Glu Ser Thr Gln Pro Ile Ser Pro Ile Gln

225 230 235 240

Leu Phe Ser Ser Ala Ile His Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro

245 250 255

Val Pro Phe Gln Gln Pro Leu Glu Lys Phe Asp Leu Gly Gly Gly Ala

260 265 270

Pro Pro Pro Met Ala Cys Pro Ile Pro Pro Lys Glu Ala Val Pro Ala

275 280 285

Pro Ala Gln Gln Asp Arg Val Phe Leu Pro Phe Ser Gln Glu Leu Leu

290 295 300

Ala Val Met Gln Asp Met Ile Lys Thr Glu Val Arg Asn Tyr Met Met

305 310 315 320

Gly Val Glu Pro Gln Gln Pro Gln Pro Ser Gln Gln Gln Arg Tyr His

325 330 335

Gln His His His Gln Gln His Gln Gln Gln Gln Gln Phe Gln Phe Gln

340 345 350

Gln Gln Gln Gln Leu Gln Asn Gly Ile Gly Arg Gly Met Cys Leu Gln

355 360 365

Arg Ala Thr Ser Asn Asp Gly Leu Arg Tyr Ala Ala Ala Ala Thr Val

370 375 380

Asn Arg Val Gly Val Asn Arg Leu Glu

385 390

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actagtggat ccaaagaatt catggcgagt attagtccta atggg 45

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcattaaagc aggactctag actactctaa tcggttaact ccgacg 46

<210> 5

<211> 635

<212> PRT

<213> Ipomoea batatas

<400> 5

Ala Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly

1 5 10 15

Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Gly

35 40 45

Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys

50 55 60

Thr Thr Cys Thr Thr Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Thr

65 70 75 80

Thr Ala Gly Cys Thr Thr Gly Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala

85 90 95

Gly Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Cys Thr Gly

100 105 110

Thr Gly Gly Cys Thr Ala Gly Ala Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly

115 120 125

Thr Thr Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Cys Ala Thr Gly Cys Thr Thr

130 135 140

Thr Ala Thr Gly Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly

145 150 155 160

Gly Thr Cys Ala Ala Cys Thr Ala Thr Ala Gly Cys Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Thr Ala Cys Thr Thr Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala

180 185 190

Cys Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Thr Ala Ala Ala

195 200 205

Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Thr

210 215 220

Cys Ala Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys

225 230 235 240

Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys

245 250 255

Thr Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Ala Thr

260 265 270

Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Gly Cys Ala

275 280 285

Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala

290 295 300

Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Cys Gly Ala Cys

305 310 315 320

Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala

325 330 335

Cys Gly Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly Ala

340 345 350

Thr Thr Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys

355 360 365

Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala

370 375 380

Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Cys Cys Ala

385 390 395 400

Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Cys Ala

405 410 415

Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Gly Thr

420 425 430

Cys Gly Thr Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala

435 440 445

Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Ala

450 455 460

Gly Ala Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly

465 470 475 480

Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Gly Thr Gly

485 490 495

Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly

500 505 510

Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Thr Gly

515 520 525

Ala Cys Ala Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys

530 535 540

Gly Gly Cys Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly

545 550 555 560

Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Thr Gly Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala

565 570 575

Ala Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Gly Gly

580 585 590

Ala Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys Gly Thr Thr

595 600 605

Ala Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Gly

610 615 620

Gly Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Cys

625 630 635

<210> 6

<211> 202

<212> PRT

<213> Ipomoea batatas

<400> 6

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1 5 10 15

Pro Lys Glu Asp Lys Leu Leu Gly Asp Tyr Val Ser Leu His Gly Glu

20 25 30

Gly Arg Trp Ser Ser Val Ala Arg Cys Ala Gly Leu Asn Cys Met Leu

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Gly Gln Leu Gln Asp Thr Cys Gln Glu Glu Gln

50 55 60

Thr Met Arg Arg Thr Thr Gly Glu Leu Ile Ser Arg Arg Asn Leu Gln

65 70 75 80

Leu Gly Arg Leu Ala Lys Ser Lys Ile Gly Glu Arg Thr Ala Glu Arg

85 90 95

Glu Met Lys Arg Lys Thr Thr Pro Asn His Lys Arg Arg Val Ile Met

100 105 110

Ile Leu Arg Ala Ser Pro Pro Pro Pro Leu Arg Trp Glu Ile Ile Thr

115 120 125

Ser Trp Ala Val Arg Gln Pro Thr Leu Arg Arg Arg Cys Ile Met Lys

130 135 140

Thr Leu Asn Pro Gly Thr Ala Leu Pro Trp Ile Trp Met Val Cys Gly

145 150 155 160

Glu Gly Asn Tyr Gly Thr Thr Met Met Thr Val Ile Leu Lys Arg His

165 170 175

Tyr Ser Arg Ala Thr Phe Lys Ile Leu Val Val Leu Glu Leu Ile Met

180 185 190

Pro Leu Thr Ser Gly Met Glu Gly Leu Phe

195 200

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

actagtggat ccaaagaatt catggtggga gctgctgaga a 41

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcattaaagc aggactctag atcagaaaat aaaccctcca ttcca 45

Claims (4)

1.IbMYB44基因在促进番茄果实中花青苷合成中的应用，所述IbMYB44基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

2.IbMYB44基因在促进烟草叶片中花青苷合成中的应用，其特征在于：IbMYB44基因联合IbMYB340基因在促进烟草叶片中花青苷合成中的应用；所述IbMYB44基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，所述的IbMYB340基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

3.含有IbMYB44基因的重组表达载体在促进番茄果实中花青苷合成中的应用，所述IbMYB44基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

4.含有IbMYB44基因的重组表达载体联合含IbMYB340基因的重组表达载体在促进烟草叶片中花青苷合成中的应用，所述IbMYB44基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，所述的IbMYB340基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

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