CN111733132A

CN111733132A - 一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法及应用

Info

Publication number: CN111733132A
Application number: CN202010599044.6A
Authority: CN
Inventors: 李炜; 贺佳; 欧尚坤; 刘祖国; 何昕; 孙慧敏
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2040-06-28
Also published as: CN111733132B

Abstract

本发明提供了一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，包括以下步骤：S1，将人胚胎干细胞复苏后在E8培养基中培养4‑6天，接种于低吸附培养皿中，使用NP培养基分化培养6‑10天后获得NP细胞；S2，将步骤S1得到的NP细胞消化，接种于贴附培养皿，使用上皮分化培养基继续分化4‑7天；S3，将步骤S2培养的细胞消化后，加入小鼠成纤维细胞系3T3细胞或接种于去上皮羊膜表面，再用上皮分化培养基进行混合培养7‑14天得角膜上皮细胞。

Description

一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法及应用

技术领域

本发明涉及一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法及应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

角膜上皮干细胞(Corneal epithelial stem cell CESC)又被称为角膜缘干细胞(Corneal Limbal stem cells CLSC)或角膜缘祖细胞(Corneal Limbal progenitorcells CLPC)，是角膜上皮细胞不断更新替换的唯一来源，起着维持角膜上皮动态平横和保持角膜透明的作用，还起着阻止结膜上皮细胞的“屏障”功能，防止结膜上皮细胞迁移至角膜表面。

角膜缘干细胞缺乏症(Corneal limbal stem cell dysfunction，LSCD)。是因角膜缘干细胞的缺失或异常，进而导致角膜上皮细胞无法再生，使角膜上皮无法维持其行使正常功能的细胞数量的疾病。角膜缘干细胞缺乏容易引起持续性的角膜上皮缺损、慢性炎症、角膜上皮结膜化以及新生血管侵入等，进而引起角膜浑浊、透明度下降，给患者造成严重的视力障碍，严重情况下将导致患者失去视力。

角膜缘干细胞缺乏症的治疗根据角膜缘干细胞的缺损程度的不同会有所不同。对轻度部分角膜缘干细胞缺乏的治疗需要根据患者的个体情况来确定。当患者的眼表上皮仍然完整，视力良好，且无其它症状时可采取保守治疗，给予眼部局部用药润滑，如自体血清等，起预防角膜上皮糜烂的作用。当患者出现部分角膜-角膜缘-结膜上皮缺损时，可通过简单手术将侵入角膜缘的结膜上皮刮除，跟踪观察角膜、结膜的愈合以及角膜缘的“屏障”重建情况。当患者出现部分角膜被结膜上皮覆盖或出现持续性的角膜上皮缺损时，则需要采取手术进行干预。对于重度/全角膜缘干细胞缺乏的患者，则需要进行角膜缘移植手术才可能角膜功能。这些手术的目的是期望通过移除患者病变的角膜上皮或角膜翳之后，移植新的角膜缘干细胞来修复原有被损伤的角膜上皮。

然而，这些技术都或多或少的面临一些无法逾越的难题，如复发/持续性的上皮缺损，新生血管侵入，角膜结膜化，角膜变薄/融化/穿孔，排异反应，细菌感染，供体缺乏，或者引起一些来自供体的潜在疾病的传播等。人们期望可以寻找到其它安全可靠的替代物，如人胚胎干细胞(hESC)等“种子”细胞来诱导分化成角膜缘上皮干细胞，进而成为分化成角膜上皮细胞的可靠细胞来源。

但是，现有技术中并没有成熟的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的方法。

发明内容

本发明提供了一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法及应用，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，包括以下步骤：

S1，将人胚胎干细胞复苏后在E8培养基中培养4-6天，接种于低吸附培养皿中，使用NP培养基分化培养6-10天后获得NP细胞；

S2，将步骤S1得到的NP细胞消化，接种于贴附培养皿，使用上皮分化培养基继续分化4-7天；

S3，将步骤S2培养的细胞消化后，加入小鼠成纤维细胞系3T3细胞或接种于去上皮羊膜表面，再用上皮分化培养基进行混合培养7-14天得角膜上皮细胞。

作为进一步改进的，所述NP培养基的制备方法为在基础培养基DMEM/F12中添加18-22wt％血清替代物KSR、0.5-1.5wt％丙酮酸钠、0.5-1.5wt％非必需氨基酸、0.5-1.5wt％谷氨酰胺、8-12nM的ROCK抑制剂Y27632和0.5-1.5v/v％双抗P/S。

作为进一步改进的，所述上皮分化培养基的制备方法为SHEM培养基与D-KSFM 培养基按照体积比1：1.5-2.5混合后，再添加0.5-1.5wt％丙酮酸钠、0.5-1.5wt％非必需氨基酸、0.5-1.5wt％谷氨酰胺和8-12nM的ROCK抑制剂Y27632；所述SHEM培养基的制备方法为基础培养基DMEM/F12中添加4-6v/v％血清FBS、0.4-0.6mg/ml的 Hydrocortision、4-6ml/L的ITS、0.4-0.6v/v％DMSO、8-12ng/ml人上皮细胞生长因子 EGF、0.5-1.5v/v％双抗P/S。

作为进一步改进的，所述步骤S1具体包括以下步骤：

S11，将人胚胎干细胞复苏后在E8培养基中培养4-6天后，细胞在10×显微镜下呈一角硬币大小的团块时，弃掉培养基，加入CTS^TM TrypLE^TM Select Enzyme于37℃消化2.5-3.5分钟；

S12，在显微镜下观察到细胞团块边缘松散发亮后，弃消化液，加入E8培养基；对整个培养皿划线，使细胞成团块状脱落形成细胞团块悬液；

S13，将细胞团块悬液以80-120转/分钟的转速离心4-6分钟；弃上清，用NP培养基重悬混匀，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养，每天换液。

作为进一步改进的，所述步骤S2具体包括以下步骤：

S21，将步骤S1得到的NP细胞以700-900转/分钟转速离心8-12分钟，弃上清，加入CTS^TM TrypLE^TM Select Enzyme于37℃消化4-6分钟，用NP培养基终止消化，轻轻吹打成单个细胞悬液；

S22，再以1400-1600转/分钟的转速离心8-12分钟，弃上清；加入上皮分化培养基重悬，按(2.5-3.5)×10⁴/cm²的接种密度接种至包被好的贴附培养皿中，置于5％CO₂、 37℃培养箱中培养4-7天，每天换液。

作为进一步改进的，所述小鼠成纤维细胞系3T3细胞的处理包括以下步骤：

S31，当小鼠成纤维细胞系3T3细胞生长至70％-80％融合度时，弃上清，加入含 8-12μg/mL的丝裂霉素的SHEM培养基，于37℃孵育2.5-3小时后，弃上清，更换新鲜的SHEM培养基，放入5％CO2、37℃培养箱备用，隔天使用；

S32，取步骤S31得到的3T3细胞，弃培养基上清，加入0.20-0.30wt％EDTA的Trypsin 于37℃消化2.5-3.5分钟，当细胞在显微镜下呈圆形时加入分化培养基终止消化，轻轻吹打成单个细胞悬液，以1400-1600转/分钟的转速离心4-6分钟，弃上清，使用分化培养基将细胞调整至(4.5-5.5)×105cell/ml备用；

S33，取S32得到的3T3细胞悬液和加入到等量的步骤S2得到细胞的消化后的悬液中，混匀，置于5％CO2、37℃培养箱中培养7-14天，隔天换液。

作为进一步改进的，所述步骤S2培养的细胞消化包括以下步骤：取步骤S2得到的细胞，弃培养基上清，加入0.20-0.30wt％EDTA的Trypsin于37℃消化2.5-3.5分钟，当细胞在显微镜下全部变成圆形且有部分变为悬浮状态时加入上皮分化培养基终止消化；轻轻吹打成单个细胞悬液，以1400-1600转/分钟的转速离心4-6分钟，弃上清，使用分化培养基将细胞调整至(7.5-8.5)×103cells/ml备用；

作为进一步改进的，所述接种于去上皮羊膜表面包括以下步骤：

S41，在无菌条件下，将将羊膜从胎盘上分离，用HBSS漂洗，除去血迹，撕除羊膜上的残留的绒毛膜，获取透明羊膜，再用HBSS清洗，彻底剔除残留血迹；

S42，将羊膜置于解剖显微镜下，分出羊膜的上皮面和基质面，将羊膜的上皮面紧贴于已经消毒的羊膜固定环的内环；在羊膜环内加入DispaseII消化上皮细胞，并用DPBS反复清洗去除上皮细胞及海绵碎屑，加入分化培养基，置于37℃培养箱过夜；

S43，取步骤S2分化的细胞，消化成细胞悬液，接种至羊膜环内环，每个羊膜环接种(2.5-3.5)×10⁴个细胞，添加分化培养基，37℃、5％CO₂培养箱内培养7-14天，每天换液。

一种上述的方法制备的角膜上皮细胞及角膜上皮片。

一种上皮分化培养基，其制备方法为SHEM培养基与D-KSFM培养基按照体积比 1：1.5-2.5混合后，添加0.5-1.5wt％丙酮酸钠、0.5-1.5wt％非必需氨基酸、0.5-1.5wt％谷氨酰胺和8-12nM的ROCK抑制剂Y27632；所述SHEM培养基的制备方法为在基础培养基DMEM/F12中添加4-6v/v％血清FBS、0.4-0.6mg/ml的Hydrocortision、4-6ml/L的 ITS、0.4-0.6v/v％DMSO、8-12ng/ml人上皮细胞生长因子EGF、0.5-1.5v/v％双抗P/S。

本发明的有益效果是：

本发明的方法成功的将人胚胎干细胞诱导分化成角膜上皮细胞，可以用来修复原有损伤的角膜上皮。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例1提供的胚胎干细胞分化后的形态学变化图。A：人胚胎干细胞，B：NP细胞球，C：NP细胞向角膜上皮细胞方向分化第1天D：NP细胞向角膜上皮细胞方向分化第7天。

图2是本发明实施例1提供的分化不同时间的NP细胞的Pax6与P63的表达变化情况图。

图3是本发明实施例1提供的不同分化阶段细胞的胚胎干细胞和NP细胞标志物的表达情况图。

图4是本发明实施例1提供的不同分化阶段细胞表型的免疫荧光鉴定图。

图5是本发明实施例1提供的不同分化阶段细胞表型的qPCR检测鉴定图。

图6是本发明实施例2提供的分化阶段细胞表型的免疫荧光鉴定图。

图7是本发明实施例3提供的hES2来源的AM+ES-CE上皮片的形态学观察图。 A.10×显微镜下观察羊膜环内培养7天的AM+ES-CE上皮片，B.AM+ES-CE上皮细胞片切片的H&E染色。

图8是本发明实施例3提供的Western Blot检测分化细胞不同阶段或不同载体的基因表达情况图。

图9是本发明实施例3提供的组织工程角膜上皮的表型鉴定图。

图10是本发明实施例3提供的hES2来源的AM+ES-CE上皮片的细胞干性测定图。

图11是本发明实施例3提供的hES2来源的AM+ES-CE上皮片细胞克隆表型的检测图。图中标尺长度为20μm。

图12是本发明实施例3提供的成瘤检测图。A.手术后AM+ES-CE组，B.手术后 AM组(阴性对照)，C.手术后AM+hES2组(阳性对照)，D.8周后AM+ES-CE组皮下取材，E.8周后空羊膜AM组(阴性对照)皮下取材，F.8周后AM+hES2组(阳性对照)皮下取材。

图13是本发明实施例3提供的阳性对照组畸胎瘤切片HE染色结果图。A.外胚层(类内脏上皮)，B.中胚层(纤维母细胞)，C.内胚层(腺管)，D.内胚层(粘液腺)。

图14是本发明实施例3提供的分化过程中细胞分簇图。

图15是本发明实施例4提供的角膜缘干细胞缺术动物模型图。A.角膜缘干细胞缺乏动物术后D0天的裂隙灯照片。B.角膜缘干细胞缺乏动物术后D0天的荧光素钠染色照片。C.角膜缘干细胞缺乏动物术后8周的裂隙灯照片。D.角膜缘干细胞缺乏动物术后8周的荧光素钠染色照片。

图16是本发明实施例4提供的hES2来源的AM+ES-CE上皮片和AM对照组治疗角膜缘干细胞缺乏模型移植后裂隙灯照像情况。A1-8.AM+ES-CE上皮片组术后1-8周的裂隙灯照片。B1-8.AM+ES-CE上皮片组术后1-8周的荧光素钠染色照片。C1-8.AM 组术后1-8周的裂隙灯照片。D1-8.AM上皮片组术后1-8周的荧光素钠染色照片。N≥3。

图17是本发明实施例4提供的移植术后两组兔角膜冰冻切片H&E染色,图中标尺长度为20μm。

图18是本发明实施例4提供的免疫荧光染色观察移植术后8周两组兔中央角膜上皮细胞的细胞表型。图中标尺长度为20μm。

图19是本发明实施例5提供的不添加丙酮酸钠的对照试验图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

培养基的配置如下：

SHEM的配置：

在基础培养基DMEM/F12中添加血清FBS(5v/v％)，Hydrocortision(0.5mg/ml)，ITS (5ml/L)，DMSO(0.5v/v％)，人上皮细胞生长因子EGF(10ng/ml)、双抗P/S(1v/v％),4℃保存。

NP培养基的配置：

在基础培养基DMEM/F12中添加血清替代物KSR(20v/v％)，丙酮酸钠(1wt％)，非必需氨基酸NEAA(1wt％)，谷氨酰胺Glutamin(1wt％)，ROCK inhibitor Y27632(10nM) 和P/S(1v/v％)，4℃保存。

上皮分化培养基的配置：

SHEM培养基与D-KSFM培养基(Invitrogen,Carlsbad,USA)按照体积比1：2的比例混合后，添加丙酮酸钠(1wt％)，非必需氨基酸NEAA(1wt％)，谷氨酰胺Glutamin (1wt％)和ROCK inhibitor Y27632(10nM)，使用时新鲜配制。

所用的抗体如下表所示。

抗体名称	生产厂家	货号	抗体使用浓度
				P63	Abcam	ab124762	1:300
K14	Abcam	ab181595	1:300
				K14	Abcam	ab7800	1:300
K3	Abcam	ab68260	1:300
				Pax6	Abcam	ab195045	1:300
Pax6	Abcam	ab735	1:300
				E-Cadherin	Abcam	ab78286	1:300
Oct3/4	Santacruz	sc5279	1:50
				Sox2	Abcam	ab92494	1:300
Pi67	Abcam	A11055	1:300
				Pan-ck	Abcam	ab80826	1:300
P75	Abcam	ab52987	1:300

实施例1胚胎干细胞向角膜上皮祖细胞方向分化实验

培养皿的处理

将1ml Vitronectin(Gibco,Carlsbad,USA)在4℃冰箱中融化后，分装到200μl的EP管中，25μl/支，-20℃备用；取一支Vitronectin(25μl)，4℃融化后加入至3ml的胚胎干细胞培养基E8中，混匀配置成包被液；取1ml包被液加入35mm培养板中，轻轻摇匀，使包被液覆盖整个培养皿底部，放入37℃培养箱中静置30分钟后取出放置于超净台备用；使用时，弃除包被液。(注：培养皿需要新鲜包被，每次使用前计算好时间处理培养皿。)

人胚胎干细胞的复苏

取10ml胚胎干细胞培养基E8(Gibco,Carlsbad,USA)加入15ml的离心管中，置于37℃培养箱中复温至37℃；从液氮罐中取出冻存的细胞(本实施例所使用的人胚胎干细胞为国际通用的人胚胎干细胞株系H1)，立即放入37℃水浴锅中，轻轻晃动，使细胞尽快解冻为细胞悬液；从15ml离心管中取1ml培养基缓慢轻柔的加入细胞冻存管中 (加一滴培养基后轻轻晃动混匀后再加入下一滴)，晃动混匀；将稀释后的细胞冻存悬液轻柔的加入15ml培养管中的培养基内，混匀，置于离心机中，1000转/分钟，离心5 分钟，弃上清；加入2ml复温的培养基重悬细胞，加入弃除包被液的培养皿中，轻轻晃动混匀，使细胞悬液均匀的平铺到培养皿中，放入5％CO₂，37℃培养箱中培养，每天换液。

胚胎干细胞向NP细胞的分化(NP细胞即神经干细胞)

当hES2细胞生长5天后，细胞在10x显微镜下呈1角硬币大小的团块时，弃掉培养基，使用无Ca²⁺，Mg²⁺的DPBS洗两遍；加入1ml消化液CTS^TM TrypLE^TM Select Enzyme(Gibco,Carlsbad,USA)，轻轻晃动均匀铺满整个培养皿后置于37℃培养箱中， 3分钟后取出，显微镜下观察到克隆团块边缘稍微的松散发亮即可；弃消化液，加入1.5ml E8培养基；取5ml移液管，沿着培养皿的周围画两圈，使靠近培养皿边缘的细胞脱落，之后对整个培养皿实施Z字型划线，使细胞成团块装脱落形成细胞团块悬液；细胞团块悬液移入15ml离心管中，100转/分钟，离心5分钟；弃上清，取6ml NP培养基重悬混匀，平均分到2个60mm的低吸附培养皿中(每个培养皿3ml细胞团混悬液)，置于 5％CO₂，37℃培养箱中培养，每天换液。

NP细胞向角膜上皮祖细胞方向的分化

NP细胞分化8天后，将含NP细胞球的培养基置于15ml离心管中，800转/分钟，离心10分钟，细胞球松散的置于离心管底部，弃上清；DPBS重悬后，使用800转/分钟，离心10分钟，弃上清；加入1ml消化液CTS^TM TrypLE^TM Select Enzyme重悬，置于37℃培养箱中5分钟后，轻轻吹打至单个细胞悬液；加入4ml NP培养基终止消化， 1500转/分钟，离心10分钟，弃上清；加入上皮分化培养基重悬，按3×10⁴/cm²的接种密度接种至包被好的培养皿中，每天换液，于第7天，第14天收集样品做表型检测。

滋养层细胞的准备

当小鼠成纤维细胞系3T3细胞生长至70％-80％融合度，即处于对数生长期的时候，弃上清，加入含10μg/mL的丝裂霉素MMC的SHEM培养基，于37℃培养箱孵育2.5-3 小时后，弃上清，DPBS洗一次，更换新鲜的SHEM培养基，放入5％CO₂，37℃培养箱备用，隔天使用。

分化角膜上皮祖细胞的克隆培养

取分化的细胞，弃上清，DPBS洗一遍；吸干上清，加入500μL消化液(0.25％Trypsin/EDTA)，37℃培养箱消化，每隔3分钟取出，于10×显微镜下观察细胞形态，当细胞全部变成圆形且有部分变为悬浮状态时加入5ml培养基终止消化；使用1ml的枪头轻轻吹打，使培养皿上的细胞全部变成悬浮的单个细胞；将细胞悬液移入15ml离心管中，计数；1500转/分钟，离心5分钟。弃上清，使用分化培养基将细胞调整至8×10³ cells/ml备用。在消化分化角膜上皮祖细胞的同时，使用0.25％Trypsin/EDTA消化液消化丝裂霉素MMC处理过的3T3细胞，当细胞镜下呈圆形是，加分化培养基终止消化，轻轻吹打至单个细胞，移入15ml离心管中，1500转/分钟，离心5分钟，(分化的角膜上皮祖细胞和3T3细胞可同时离心)。弃上清，使用分化培养基将细胞调整至5×10⁵ cell/ml备用。分别取250μl分化的角膜上皮祖细胞悬液(2000个细胞)和250μl MMC 处理的3T3细胞悬液(1.25×10⁵个细胞)，混匀后，加入至12孔板中，即12孔板的每个孔加入500μl细胞混悬液。放入5％CO2，37℃培养箱中培养，隔天换液。收样检测。所述检测包括细胞免疫荧光染色、Western Blot检测及实时定量PCR。

实时定量PCR的引物设计如下表所示：

以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

如图1所示，取对数生长期的胚胎干细胞hES2，消化成小细胞团块后，使用NP 培养基于低吸附培养皿上培养，显微镜下可明显观测到细胞形态学上的改变。在hES2 状态下，细胞成克隆状态贴壁生长，克隆边缘光滑，细胞很小，核质比大，镜下可明显看到细胞核(图1A)。在分化成NP细胞球以后，细胞成球状形态悬浮生长(图1B)。将NP细胞球消化成单个细胞接种至培养皿中分化，细胞的形态逐渐变成典型的上皮细胞形态(图1D)。

如图2所示，本研究测试了分化不同时间的NP细胞的Pax6和P63的表达情况。收集未分化的hES2细胞为对照组，标记为NP-D0组，同时分别收集hES2细胞向NP 细胞分化第2天，第4天，第6天，第8天，以及第10天的NP细胞，分别标记为NP-D2， NP-D4，NP-D6，NP-D8和NP-D10。提取RNA，进行实时定量PCR检测。随着诱导时间的增加，上皮细胞增殖标志物P63的表达量逐渐升高(图2A)，而与角膜上皮发育密切相关的基因Pax6的表达在分化前期逐渐增高，到第8天时到达一个顶峰，之后第10 天的时候开始下降(图2B)。因而选择分化8天的NP细胞进行后续实验。

如图3所示，将细胞培养至不同的分化阶段，4％多聚甲醛固定细胞进行免疫荧光检测，或收取细胞的RNA，检测与胚胎干细胞表型相关的基因表达变化情况。hES2阶段细胞为对照组，标记为D0组，hES2分化8天后的NP阶段标记为D8组，NP细胞向角膜上皮祖细胞分化的第7天为D15组，第14天为D22组。免疫荧光结果显示，hES2 阶段，胚胎干细胞标志物Oct4呈阳性表达(图3A)，胚胎干细胞和神经干细胞标志物 Sox2呈阳性表达(图3E)，在NP阶段，Oct4阳性表达(图3B)，Sox2弱表达(图2-3 F)，而在分化的D15，D22阶段，Oct4，Sox2均不表达(图3C D G H)。

qPCR结果显示，胚胎干细胞标志物Oct4，Nanog，Tra-1-81在中间状态NP阶段有明显增加，随着分化过程的进行，这些标志物的表达量与hES2阶段相比，明显下调。 Sox2的表达随着分化时间的进行，表达量逐渐下降。与对照组相比具有显著差异。实验结果表明，随着分化流程的进行，细胞逐渐分化，与分化前期的胚胎干细胞有显著区别。

如图4所示，免疫荧光染色结果显示，神经干细胞标志物P75，在中间状态NP细胞阶段高表达，hES2，D15，D22阶段均未表达(图4A-D)。在角膜上皮中起重要作用的蛋白Pax6在hES2阶段不表达，NP阶段表达，在D15阶段的部分细胞中弱表达，D22 阶段的部分细胞中强表达(图4E-F)。上皮干细胞标志物P63在hES2阶段不表达，NP 阶段表达，在D15、D22阶段的部分细胞中强表达(图4E-F)，表达的细胞数量符合干细胞的特性，即部分细胞具有干细胞特性。上皮细胞标志物Pan-ck在hES2阶段不表达， NP阶段表达，在D15阶段的大部分细胞中表达，在D22阶段中，阳性细胞数量较D15 少，但是单细胞的表达量更高(图4M-P)。复层化上皮干细胞标志物K14在hES2阶段不表达，NP阶段表达，在D15阶段的大部分细胞中表达，在D22阶段中，阳性细胞数量与D15阶段相比急剧减少，但是单个细胞的表达量增高(图4R-U)。

如图5所示，在转录组水平检测诱导分化细胞的不同阶段的表型，检测的基因包括调控角膜上皮分化的重要因子Pax6，与上皮细胞增殖相关的标记物P63、K14，以及角膜上皮组织特异性标记物K12。以hES2(D0)阶段作为对照组，实验结果显示，P63 随着诱导进程，表达量逐渐增高，在诱导后期，其表达量增高达300-400倍。Pax6的表达在NP阶段(D8)急剧增高，之后开始逐渐降低，到分化的第15天(D15)，第22 天(D22)又开始逐渐增高，这两个阶段的表达量远高于D0阶段，K14与K12的表达量在分化的后期均显著增加。

以上结果说明，诱导分化的上皮样细胞不表达胚胎干细胞标志物，诱导中间阶段的 NP细胞具有向不同方向分化的潜能，诱导分化的上皮样细胞表达角膜上皮祖细胞的标志物，本实验成功地将胚胎干细胞诱导分化成角膜上皮细胞。

实施例2

设置在分化培养基中不加入丙酮酸钠的对照组，其他操作同实施例1。实验结果如图6所示，在加丙酮酸钠的组中，角膜上皮中起重要作用的蛋白Pax6、上皮干细胞标志物P63、上皮细胞标志物Pan-ck及细胞紧密连接蛋白E-cadherin的表达量明显多于不加丙酮酸钠的组，说明丙酮酸钠对诱导胚胎干细胞分化成角膜上皮细胞具有重要作用。

实施例3组织工程角膜上皮片(AM+ES-CE上皮片)的构建实验

羊膜的获取

与健康剖宫产妇(HIV-I、乙肝、丙肝、梅毒检测指标均阴性)签订知情同意书后，获取胎盘。在无菌超净台中，将羊膜从胎盘上分离，1×Hanks’平衡盐溶液(HBSS)漂洗2次，除去血迹，用镊子撕除羊膜上的残留的绒毛膜，获取透明羊膜，再用1×HBSS 清洗，彻底剔除残留血迹，转移到15ml无菌离心管或50ml无菌离心管中，-80℃保存。

羊膜环的安装

将冻存于-80℃的羊膜提前取出放置于4℃融化(约4-8小时)。将定制的羊膜固定环Insert(含大环、内环)浸泡在含30％84消毒液的无菌去离子水中过夜。将Insert浸泡于75％的酒精中，消毒15分钟。使用添加10％P/S的灭菌水洗3次，一次10分钟。浸泡在添加2％P/S的1×DPBS中待用。取出解冻好的羊膜置于解剖显微镜下，分出羊膜的上皮面和基质面。羊膜的上皮面紧贴内环，上好外环，将羊膜夹在中间构成一个培养细胞的羊膜载体结构，剪掉多余的羊膜。在羊膜环内加入2mg/ml的DispaseII，37℃ 培养箱孵育10分钟。使用消毒的海绵搽掉消化好的上皮细胞。使用分化培养基终止消化，并用1×DPBS反复清洗去除上皮细胞及海绵碎屑。加入分化培养基，置于37℃培养箱过夜，检测是否污染。确定无污染后，加入新鲜的分化培养基，置于37℃培养箱备用(可吸干培养基，放置于35mm培养板中，使用封口膜密封，-20℃保存备用，使用时，室温复温)。胚胎干细胞向NP细胞的分化和NP细胞向角膜上皮祖细胞方向的分化的操作同实施例1。

hES2来源的角膜上皮片的构建

当NP细胞在培养皿中分化7天(D15)后，弃上皮细胞分化培养基，1×DPBS洗1 次。加入400μl CTS^TM TrypLE^TM Select Enzyme，放置于37℃培养箱中消化3分钟，待细胞镜下成圆形时加入上皮细胞分化培养基终止。轻轻吹打细胞，使之完全脱落，转移至10ml离心管，1500转/分钟，离心10分钟，弃上清。加入新鲜上皮细胞分化培养基重悬细胞，细胞计数。接种细胞至羊膜环内环，每个羊膜环接种3×10⁴个细胞(大约一个35mm培养皿接种3-4个环)，内环里的培养基补齐至500μl，羊膜环外添加1.5ml培养基，37℃，5％CO2培养箱内培养7-14天，每天换液。检测方法同实施例1，检测结果如下：

如图7所示，NP细胞经过上皮细胞诱导培养基贴壁诱导分化4-7天后，消化成单个细胞，接种至制备好的去上皮羊膜环中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养7天。镜下观察，上皮片表层结构致密。上皮片横切面切片的HE染色结果显示，上皮片由3-4层细胞构成，细胞排列紧密，近羊膜侧与远羊膜侧细胞形态相同，没有明显差异，即细胞片没有形成类似角膜上皮细胞的极性。

如图8所示，在诱导分化过程中，我们在第二个分化阶段中的第二步，选择了两种不同的载体，一种为直接在培养皿上分化，一种为在羊膜上分化，通过Western Blot 结果发现，在不同的载体上分化，标志物P63，Pax6，K14，K3+K12在两种载体上均有表达，但是其表达量不同，在培养皿上分化的细胞标志物的表达量高于在羊膜上分化的细胞。对此，我们认为，在培养皿或羊膜上诱导，细胞的分化方向、进程一致，但表达量有差异。

如图9所示，免疫荧光染色结果显示，在角膜上皮中起重要作用的蛋白Pax6在上皮片组部分细胞表达。上皮干细胞标志物P63在部分细胞中表达，表达量符合干细胞的特性，即部分细胞具有干细胞特性。与细胞间紧密连接相关的分子E-Cadherin在上皮片中几乎所有细胞均有表达。上皮细胞标志物Pan-ck在上皮片全层中均有表达。复层化上皮干细胞标志物K14在部分细胞中表达，部分近羊膜侧的细胞中未见K14的表达。而作为角膜上皮细胞特异的分化成熟标志物K3、K12在上皮片部分细胞中表达。

组织细胞的更替是由组织中的干细胞来承担的，因而需要评估分化获得的 AM+ES-CE上皮片是否具有长时间稳定修复角膜缘干细胞缺乏动物模型眼表功能的潜能，我们需要检测hES2来源的AM+ES-CE上皮片是否含有组织干细胞。因此我们采取了克隆培养的方式来检测。

如图10所示，实验结果发现，分化15天的细胞在接种后第三天即可观察到克隆的出现(图10，A)，部分克隆随着培养时间的延长而逐渐长大，培养至第六天时，镜下可明显看到克隆远大于第三天(图10，B)，部分克隆为假克隆，即在第三天出现但不能随着培养时间的延长而增大。在培养至第六天时，镜下克隆分为两类，一类克隆的中间细胞大，排列松散，边缘细胞小，排列紧密，克隆与饲养层3T3细胞有明显的界限，边界细胞聚集，形成类似山峰一样的隔断(图10，B)。另一类细胞与周围的饲养层细胞也可以看到明显的界限，但是克隆内的细胞中间与边缘没有差异，均是较小的细胞，排列紧密(图10，C)。整体细胞的克隆形成率，按照(克隆形成数/接种细胞数)×100％计算，发现与正常体细胞的干细胞比率相差不大，约为0.5％～1％(图10，D)。分化 22天的细胞，克隆形成情况同分化15天的细胞类似，接种的第三天开始出现克隆(图 10，E)，部分克隆为假克隆，部分克隆生长为大克隆，在接种的第6天，出现类似的两种不同类型的克隆(图10，F，G)。但其克隆形成率远小于分化15天的细胞，约为0.05％～ 0.1％(图10，H)，即12孔板的每个孔接种2000个细胞，长出1～2个克隆，不同分化批次的上皮片细胞的不同重复孔情况一致。

如图11所示，使用免疫荧光染色法检测克隆中细胞的表型。实验结果显示，Pax6在克隆中几乎所有的细胞核中均有表达，P63则表达于大多数细胞的细胞核，克隆边缘的少部分细胞未见阳性染色。K14、Pan-ck表达于克隆中的所有细胞。而作为角膜上皮分化成熟的特异标志物K3、K12的荧光染色为阴性。分化15天的细胞与分化22天的细胞所形成的克隆的表型一致。

如图12所示，为检测AM+ES-CE上皮细胞片(AM+ES-CE组)的生物安全性，以未分化的胚胎干细胞hES2组(AM+hES2对照组)为阳性对照，不带细胞的羊膜组(AM 组)为阴性对照，进行免疫缺陷BALB/c nude鼠体内成瘤试验加以验证。结果显示，在术后第5周时，移植AM+hES2组的小鼠皮肤下形成肉眼可见大小的肿瘤，而移植 AM+ES-CE组和AM对照组，皮肤下未见肿瘤形成，观察至8周时，移植AM+ES-CE 片组和AM对照组仍未生成肿瘤。

如图13所示，将AM+hES2组的肿瘤冰冻切片，经HE染色可明显观察到三个不同的胚层，上皮细胞(外胚层)(图13A)，纤维母细胞(中胚层)(图13B)，腺体(内胚层)和粘液腺(内胚层)(图13C，D)。

为了检测每个分化阶段的细胞状态，我们进行了单细胞测序实验。分四个时间点收集样品送检。样品1:未分化的“种子”细胞阶段，胚胎干细胞hES2；样品2:分化的中间状态NP细胞；样品3:NP细胞向角膜上皮细胞方向分化，在培养皿上分化7天后的细胞，即D15；样品4:NP细胞向角膜上皮细胞方向分化，在培养皿分化7天后消化传代接种于羊膜环中，在羊膜环中培养7天，即本研究所构建的组织工程角膜上皮片，即 D22。

如图14所示，测试得到结果后，将带有四个不同时期标签的原始数据进行混合。混合后使用monocle进行数据分析，图14A为tsne降维后的二维图，如图所示，其中样品1与样品2的细胞群有部分重合，样品3与样品4的细胞群部分重合。这种现象与本研究中的分化流程吻合，我们使用NP培养基将胚胎干细胞hES2诱导分化成NP细胞，分化过程是一个动态的过程，因而NP阶段的少量细胞可能仍处于为分化的胚胎干细胞状态，从而使得样品1与样品2的部分细胞群重合。而在分化的后面两个阶段，使用同一种上皮分化培养基分化，样品3与样品4是一个连续的分化过程，细胞的分化进度存在差别，从而造成这两组细胞群部分重合的现象。在图14A的基础上，根据细胞基因表达的特性，尝试使用不同的簇来对四个阶段的混合数据进行聚类，如图14B所示，可以明显看出，和图14A相比，当簇的个数为4的时候，聚类结果与四个阶段的标签结果几乎一一对应以及吻合。

实施例4组织工程角膜上皮片治疗角膜缘干细胞缺乏动物模型实验

实验动物：35只8周龄，健康雄性新西兰大白兔，14只8周龄，健康雄性黄兔，由厦门大学动物实验中心提供并负责饲养。

角膜缘干细胞缺乏动物模型的构建

将兔子固定，肌肉注射1％戊巴比妥钠(2mL/kg)联合速眠新(0.1mL/kg)麻醉，注射后大约10分钟，动物陷入深度麻醉状态。当兔子完全麻醉后，侧卧位放置，暴露右侧单眼,使用碘伏充分消毒术区。麻醉后的兔子放置于手术台上，铺洞巾，开睑器开睑后，眼表予爱尔凯因进行表面麻醉。使用电动上皮刮刀彻底破坏角膜缘组织，同时分离近角膜缘结膜后，切除约2mm宽×0.2mm深角膜缘组织。使用上皮刮刀彻底刮除中央及周边角膜上皮细胞。采用1×DPBS多次冲洗眼表及结膜囊，彻底去除残留的角膜上皮碎片。

AM+ES-CE上皮片的运输

移植手术当天提前更换新鲜培养基，封口膜密封培养皿后放入无菌运输箱中，箱内维持10℃左右低温，运输过程避免震荡。

AM+ES-CE上皮片的移植手术

角膜缘干细胞缺乏动物随机分为2组，分别移植AM(羊膜)植片和AM+ES-CE 植片。使用1xDPBS轻轻冲洗植片，并采用吸血海绵擦干角膜缘干细胞缺乏动物模型的眼表面多余的DPBS。将植片以上皮朝下方向贴附于受体角膜基质表面，使用虹膜恢复器轻轻地迅速展平植片，尽量避免气泡产生。使用10-0可吸收线将植片固定于周边球结膜表面，缝合时可选择连续缝合或间断缝合。术闭在结膜囊内涂妥布霉素***眼膏(典必殊)。为保护眼表因动物抓扰而影响结果，使用8-0的缝线于中外1/3眼睑处将兔眼睑缝合。同一批手术由同一个经验的手术操作者完成，减少因不同操作者的手术技巧差异对实验结果造成影响。

术后用药：术后眼部用药主要采用抗炎、抗感染及促进干细胞生长的药物。

第1周：小牛血清去蛋白提取物滴眼液，一天3次；环孢素滴眼液，一天3次；典必殊滴眼液，一天3次；典必殊眼膏，一天3次。

第2周：小牛血去蛋白提取物滴眼液，一天3次；环孢素滴眼液，一天2次；典必殊滴眼液，一天2次；典必殊眼膏，一天2次。

第3周至第5周：小牛血去蛋白提取物滴眼液，一天1次；环孢素滴眼液，一天 1次；典必殊滴眼液，一天1次；典必殊眼膏，一天1次。

第6周至第8周：小牛血去蛋白提取物滴眼液，一天1次；环孢素滴眼液，一天 1次；迪可罗眼膏，一天1次。

如图15所示，将麻醉后的兔子眼表给予爱尔凯因进行表面麻醉，使用电动上皮刮刀深度破坏角膜缘结构，同时分离近角膜缘结膜后，切除约2mm宽×0.2mm深角膜缘组织。空白对照组在手术后予以裂隙灯拍照观察，结果显示其全角膜荧光素钠染色阳性(图15AB)。此外，其术后用药同实验组，每天予以抗炎、抗感染及促进上皮细胞生长的药物。术后8周裂隙灯结果显示，角膜表面弥漫新生血管生长，中央角膜重度浑浊，角膜上皮不光滑，荧光素钠染色发现中央及周边角膜有片状着色(图15C D)。综上，该结果证实我们已成功构建角膜缘干细胞缺乏动物模型。

如图16所示，我们将构建的hES2来源的AM+ES-CE上皮片移植到全角膜缘干细胞缺乏的动物模型上，观察AM+ES-CE上皮片是否能够重建受损眼表。移植术后1周观察发现，AM+ES-CE组与AM组的羊膜均未溶解，两组间无明显差别，AM+ES-CE 组的眼睑缝线已松脱，而AM组的眼睑缝线处于即将松脱状态。术后第2周，羊膜仍未溶解完全，AM+ES-CE组与AM组无明显差异，术后3周，AM+ES-CE组羊膜未溶解， AM+ES-CE组因羊膜覆盖，无法观测到眼表情况。AM组羊膜开始溶解，荧光素钠染色可以明显观察到大片羊膜，暴露出角膜缘上皮位置。AM组虽然眼表被羊膜覆盖无法观测到中央角膜部分，但是在周边角膜可以看到新生血管侵入角膜。第4周时，AM+ES-CE 组羊膜开始轻微溶解，暴露出角膜缘位置，角膜缘有少量新生血管侵入。AM组的羊膜溶解完全，上方角膜可见大量新生血管，侵入角膜缘约4mm。下方角膜新生血管侵入角膜缘约2mm，颞侧角膜新生血管侵入角膜缘约1mm，鼻侧角膜未见明显的新生血管侵入。荧光素钠染色在中央角膜可见大片状着色。第5周时，AM+ES-CE组羊膜开始溶解，可观察到大块即将脱落的羊膜，同时在鼻上方角膜可见新生血管侵入角膜缘约3.5mm，而角膜下方、颞测与鼻侧均可见明显新生血管生长。AM组新生血管继续向瞳孔方向生长，角膜上方新生血管侵入角膜约5mm，角膜下方、鼻侧与颞侧新生血管侵入角膜缘约2mm，全角膜浑浊，中央角膜可见荧光素钠染色大片状着色，与第4周相比，面积明显增大。第6周时，AM+ES-CE组羊膜完全溶解，角膜恢复透明，新生血管与第5周相比明显减轻，只有少量血管侵入角膜缘约2.5mm，且数量较前明显减少，荧光素钠染色可见少量点状着色。AM组的角膜浑浊程度较前明显加深，新生血管继续向瞳孔方向生长，侵入角膜缘约6mm，抵达瞳孔缘，同时角膜下方、颞侧与鼻侧的新生血管继续向瞳孔方向生长，侵入角膜缘约3mm，荧光素钠染色仍可见大片状着色。第7 周时，AM+ES-CE组角膜透明，眼球上方新生血管完全消退，下方可见少量新生血管，侵入角膜缘约2.5mm，荧光素钠染色未见明显着色。而AM组角膜浑浊进一步加重，大量新生血管弥漫生长，角膜上方新生血管侵入角膜缘约7mm，瞳孔的一半区域被新生血管覆盖，眼球下方新生血管有所好转，鼻侧的新生血管侵入角膜缘约2.5mm，颞侧可见大量新生血管侵入角膜缘约2.5mm，同时荧光素钠染色仍可见大片状着色。第8周时， AM+ES-CE组角膜透明，新生血管进一步退化至角膜缘周围，荧光素钠染色未见明显着色点。AM组的角膜进一步浑浊，全角膜新生血管覆盖，荧光素钠染色仍可见大片状着色。

如图17所示，移植术后8周处死动物，兔角膜标本进行冰冻切片H&E染色，结果发现：AM+ES-CE移植组与正常对照组组织结构相似，在角膜缘区域，AM+ES-CE移植组可在移植后8周形成良好栅栏结构，与正常对照组结构一致，其角膜缘处包含6-7 层角膜缘上皮细胞，且基质未见明显炎症细胞浸润。而AM移植组在移植后8周仍无法形成角膜缘栅栏结构，仅形成2-3层角膜上皮细胞，且基质内含有大量的炎症细胞浸润。在中央角膜区域，AM+ES-CE移植组在移植后8周含有4-5层角膜上皮细胞，其细胞生长具有极性，即靠近基质侧细胞呈竖状排列，远离基质侧细胞呈横向排列，这与正常对照组一致。但角膜上皮的厚度较正常对照组稍薄，正常对照组中央角膜可含有5-6层上皮细胞。而AM移植组中央角膜上皮在移植术后8周仅形成2-3层角膜上皮细胞，且细胞无极性。

如图18所示，为进一步观察h ES2来源的AM+ES-CE移植后对兔子中央角膜的修复情况，以及移植后中央角膜上皮细胞标志物的表达情况，我们对移植8周后处死的兔角膜标本进行了human nuclei，Pax6，Pan-ck，K14以及K3+K12的免疫荧光染色。human nuclei(绿色)在AM+ES-CE组的兔中央角膜上皮及靠近上皮的部分基质细胞中均有表达，而在AM对照组、Normal对照组中，未见human nuclei的阳性表达(图18A-C)。 Pax6在AM+ES-CE组的中央角膜上皮细胞中呈阳性表达，而AM对照组和Normal对照组均未见阳性染色(图18D-F)。上皮标志物Pan-ck在三个组中均呈阳性表达(图18 G-I)。眼表上皮干细胞标志物K14，在AM+ES-CE组的角膜上皮基底层中高表达，AM 对照组部分上皮细胞中表达，Normal对照组的中央角膜上皮全层中表达(图18J-L)。角膜上皮特异标志物K3+K12，在AM+ES-CE组与Normal对照组中，中央角膜上皮细胞中高表达，AM对照组中部分上皮细胞表达(图18M-O)。实验结果说明，hES2来源的AM+ES-CE可以很好的修复中央角膜的结构与功能。

实施例5

AM+ES-CE上皮片的制备同实施例2，组织工程角膜上皮片治疗角膜缘干细胞缺乏动物模型实验同实施例4。丙酮酸钠组为在分化培养基中添加了丙酮酸钠，构建组织工程角膜上皮片，用于治疗角膜缘干细胞缺乏动物模型；没有加丙酮酸钠对照组为在分化培养基中不添加了丙酮酸钠，构建组织工程角膜上皮片，用于治疗角膜缘干细胞缺乏动物模型；羊膜对照组是用空白羊膜治疗角膜缘干细胞缺乏动物模型。

如图19所示，从裂隙灯的结果可以看出，在移植后2周，羊膜对照组、没有加丙酮酸钠对照组与加入丙酮酸钠对照组之间没有明显区别；在移植后第4周，加丙酮酸钠旁中央角膜可见角膜上皮长入，而羊膜对照组、没有加丙酮酸钠没有明显的角膜上皮长入，而且可见角膜新生血管长入。在移植后第6周，加丙酮酸钠组角膜上皮基本完整，而而羊膜对照组、没有加丙酮酸钠可见反复角膜上皮脱落。在移植后第8周依然维持类似的表型。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

<120> 一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法及应用

<130> 2020

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acactcggac cacatccttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtgagaggc aacctggaga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggataagtac acgctgcccg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtgcgcgt aactgtccat 20

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaggcctcag cacctaccta c 21

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gactggatgt tctgggtctg g 21

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agcagcatca actacccacc 20

<210> 8

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<400> 8

acttatcttg ggccgggttg 20

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<212> DNA

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<400> 9

tgacgtggac atccgcaaag 20

<210> 10

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<400> 10

ctggaaggtg gacagcgagg 20

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<212> DNA

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tccaggaacg gaaaatcaag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcctcctcat cccctacttc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acgtgactac caggagctga tg 22

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<213> 人工序列

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atgctgacag cactcggaca ct 22

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<213> 人工序列

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agcagaatcg gaaggacgct ga 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acctcgctct tgctggactg aa 22

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<213> 人工序列

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tgccgaggaa tggttcttca cc 22

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gaatcagaga agacaggcca 20

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cacctggacg tattccactg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

catcaccttg atctggatgg 20

Claims

1.一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述NP培养基的制备方法为在基础培养基DMEM/F12中添加18-22wt％血清替代物KSR、0.5-1.5wt％丙酮酸钠、0.5-1.5wt％非必需氨基酸、0.5-1.5wt％谷氨酰胺、8-12nM的ROCK抑制剂Y27632和0.5-1.5v/v％双抗P/S。

3.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述上皮分化培养基的制备方法为SHEM培养基与D-KSFM培养基按照体积比1：1.5-2.5混合后，再添加0.5-1.5wt％丙酮酸钠、0.5-1.5wt％非必需氨基酸、0.5-1.5wt％谷氨酰胺和8-12nM的ROCK抑制剂Y27632；所述SHEM培养基的制备方法为基础培养基DMEM/F12中添加4-6v/v％血清FBS、0.4-0.6mg/ml的Hydrocortision、4-6ml/L的ITS、0.4-0.6v/v％DMSO、8-12ng/ml人上皮细胞生长因子EGF、0.5-1.5v/v％双抗P/S。

4.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下步骤：

S11，将人胚胎干细胞复苏后在E8培养基中培养4-6天后，细胞在10×显微镜下呈一角硬币大小的团块时，弃掉培养基，加入CTS^TMTrypLE^TMSelect Enzyme于37℃消化2.5-3.5分钟；

S13，将细胞团块悬液以80-120转/分钟的转速离心4-6分钟；弃上清，用NP培养基重悬混匀，接种于低吸附培养皿，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养6-8天，每天换液。

5.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下步骤：

S21，将步骤S1得到的NP细胞以700-900转/分钟转速离心8-12分钟，弃上清，加入CTS^TMTrypLE^TMSelect Enzyme于37℃消化4-6分钟，用NP培养基终止消化，轻轻吹打成单个细胞悬液；

S22，再以1400-1600转/分钟的转速离心8-12分钟，弃上清；加入上皮分化培养基重悬，按(2.5-3.5)×10⁴/cm²的接种密度接种至包被好的贴附培养皿中，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养4-7天，每天换液。

6.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述小鼠成纤维细胞系3T3细胞的处理包括以下步骤：

S31，当小鼠成纤维细胞系3T3细胞生长至70％-80％融合度时，弃上清，加入含8-12μg/mL的丝裂霉素的SHEM培养基，于37℃孵育2.5-3小时后，弃上清，更换新鲜的SHEM培养基，放入5％CO₂、37℃培养箱备用，隔天使用；

S32，取步骤S31得到的3T3细胞，弃培养基上清，加入0.20-0.30wt％EDTA的Trypsin于37℃消化2.5-3.5分钟，当细胞在显微镜下呈圆形时加入分化培养基终止消化，轻轻吹打成单个细胞悬液，以1400-1600转/分钟的转速离心4-6分钟，弃上清，使用分化培养基将细胞调整至(4.5-5.5)×10⁵cell/ml备用；

S33，取S32得到的3T3细胞悬液和加入到等量的步骤S2得到细胞的消化后的悬液中，混匀，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养7-14天，隔天换液。

7.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2培养的细胞消化包括以下步骤：取步骤S2得到的细胞，弃培养基上清，加入0.20-0.30wt％EDTA的Trypsin于37℃消化2.5-3.5分钟，当细胞在显微镜下全部变成圆形且有部分变为悬浮状态时加入上皮分化培养基终止消化；轻轻吹打成单个细胞悬液，以1400-1600转/分钟的转速离心4-6分钟，弃上清，使用分化培养基将细胞调整至(7.5-8.5)×10³cells/ml备用。

8.根据权利要求1所述的诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜上皮细胞的培养方法，其特征在于，所述接种于去上皮羊膜表面包括以下步骤：

9.一种权利要求1至8任一项所述的方法制备的角膜上皮细胞及角膜上皮片。

10.一种上皮分化培养基，其特征在于，其制备方法为SHEM培养基与D-KSFM培养基按照体积比1：1.5-2.5混合后，添加0.5-1.5wt％丙酮酸钠、0.5-1.5wt％非必需氨基酸、0.5-1.5wt％谷氨酰胺和8-12nM的ROCK抑制剂Y27632；所述SHEM培养基的制备方法为在基础培养基DMEM/F12中添加4-6v/v％血清FBS、0.4-0.6mg/ml的Hydrocortision、4-6ml/L的ITS、0.4-0.6v/v％DMSO、8-12ng/ml人上皮细胞生长因子EGF、0.5-1.5v/v％双抗P/S。