CN111733080A - 木霉菌固态制剂、其制备方法及其应用 - Google Patents

木霉菌固态制剂、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了木霉菌固态制剂、其制备方法及其应用。该制备方法包括以下步骤：步骤S1，在液体培养基中对木霉菌菌株进行扩大培养，得到种子发酵液；步骤S2，将固态发酵基质原料、第一无机盐及第一酵母浸出粉混合，依次进行蒸料灭菌和冷却，得到固态发酵培养基；将种子发酵液与固态发酵培养基混合，然后进行固态发酵，得到固态发酵培养物；步骤S3，将固态发酵培养物烘干、粉碎，然后添加保护剂和增效剂，得到木霉菌固态制剂成品。该制备方法有效解决了现有技术中利用液态发酵法不适合生产木霉菌制剂，利用固态发酵法生产木霉菌制剂时发酵过程长、产孢量一般的问题。

Description

木霉菌固态制剂、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及农业种植领域中木霉菌制剂制备方法及应用，具体而言，涉及一种木霉菌固态制剂、其制备方法及其应用。
背景技术
农作物的病虫害是制约产量和品质的重要因素，其中，常见的真菌性土传病害如根腐病、猝倒病、菌核病、立枯病、黑胫病等，一旦发病，能造成农作物30％的减产，这些土传病害的病原菌在土壤中能够存活，借助农事操作和病残体传播。长期以来，化学手段如化学农药，化学杀菌剂是防治该类病害的常见方法，但是长期化学防治容易导致农产品农药残留超标，对环境造成污染，降低农产品的品质，造成产品的经济价值降低。
针对土传病害有效的预防方法有实行轮作、选用抗病品种等，但上述方法都有一定的局限性。生物防治由于其安全、高效的特点越来越受到用户的追捧，且使用量，使用面积也在逐年上升。木霉菌隶属于半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科真菌，是世界上研究最多的有效生防真菌之一。利用拮抗木霉菌防治植物病害是目前研究的重点和热点之一，目前已有许多菌株及剂型被正式登记为一种有效的生防菌制剂应用于农业生产中。木霉菌对农作物病害的生防机制主要是竞争作用、重寄生作用、抗生素作用、植物生长调节作用、诱导植物抗性、启动植物防御反应，并且几种作用协同增效。
微生物菌剂(木霉真菌)归属于生物刺激素(物质)范畴。长枝木霉是常见的生防木霉菌之一，经相关研究表明，对常见的植物病原菌具有不同程度的抑制作用，主要是根部腐烂病，如腐霉菌、镰胞菌、立枯丝核菌。有相关文献和专利报道将生防菌长枝木霉开发为水分散粒剂用于防治南方根结线虫及其他真菌性病害。
目前，市面上的主要木霉类农用微生物菌剂是哈茨木霉菌剂，有关长枝木霉的制剂研究较少。木酶菌制剂的发酵方法主要是液体发酵收集厚垣孢子。液态发酵具有生产条件严格，配套设备多，投资大，能耗高等缺点，液态发酵不适合于霉状真菌的发酵。采用现有常见的固态发酵技术制备长枝木霉制剂，发酵过程长，产孢量一般。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种木霉菌固态制剂、其制备方法及其应用，以解决现有技术中不适合利用液态发酵法生产木霉菌制剂，利用固态发酵法生产木霉菌制剂时发酵过程长、产孢量一般的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种木霉菌固态制剂的制备方法，其包括以下步骤：步骤S1，在液体培养基中对木霉菌菌株进行扩大培养，得到种子发酵液；步骤S2，将固态发酵基质原料、第一无机盐及第一酵母浸出粉混合，依次进行蒸料灭菌和冷却，得到固态发酵培养基；将上述种子发酵液与上述固态发酵培养基混合，然后进行固态发酵，得到固态发酵培养物；以及步骤S3，将上述固态发酵培养物烘干、粉碎，然后添加保护剂和增效剂，得到上述木霉菌固态制剂成品。
进一步地，种子发酵液和所述固态发酵培养基的重量百分比为(0.1～10)％：(90～99.9)％。
进一步地，每1000ml液体培养基中含有蛋白胨5～15g、第二酵母浸出粉0.001～5g、蔗糖5～20g、磷酸二氢钾0.01～5g；优选地，每1000ml液体培养基中含有蛋白胨8～12g、第二酵母浸出粉1～3g、蔗糖8～13g、磷酸二氢钾0.01～1g。
进一步地，在液体培养基中对木霉菌菌株进行扩大培养的步骤之前，步骤S1还包括将木霉菌菌株接入PDA平板培养基进行活化的步骤；优选地，每1000mlPDA平板培养基中含有200g煮熟马铃薯的浸出液、20g蔗糖、20g琼脂、25mg氯霉素；优选地，活化的步骤中的活化时间为3～7天。
进一步地，上述第一无机盐是硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铵构成的组中的任意一种或者几种。优选地是磷酸二氢钾。
进一步地，上述第一酵母浸出粉可以来自酵母的的任何种属。尤其是糖酵母(Saccharomyces genus)种属的酵母浸出粉，优选地是酿酒酵母(S.cerevisiae)，可以根据本领域技术人员已知的技术获得或者制备。也可以是购买的商品化的产品。
进一步地，固态发酵基质原料可以是以下物质中的两种以上：谷物类如大米、小米、小麦、玉米、大豆(或豆粕)、菜籽粕、芝麻粕、麸皮；纤维素类如木屑、秸秆、木糠、锯末、蘑菇渣、中药渣。
优选地，固态发酵基质原料包括玉米粉和麸皮。
进一步，按重量百分比计，固态发酵培养基包括：玉米粉10～30％、麸皮50～70％、第二无机盐0.1～5％、第二酵母浸出粉0.1～20％；优选地，固态发酵培养基包括：玉米粉20～30％、麸皮60～70％、第二无机盐0.1～1％、第二酵母浸出粉1～10％。
进一步，步骤S2中，在将麸皮、玉米粉、第二无机盐及第二酵母浸出粉混合后，用水将混合物料润湿后在进行蒸料灭菌步骤。
进一步，步骤S1中，扩大培养的时间为3～15d；优选地，步骤S2中，固态发酵的温度为25～35℃；优选地，步骤S2中，固态发酵的时间为3～20d。
进一步地，保护剂是凹凸棒粉土，优选地，增效剂包括可由不同种属的酵母或者其混合物利用糖蜜发酵后的剩余的营养液经浓缩干燥后的粉末，优选地是培养酿酒酵母(S.cerevisiae)后的干燥粉。干燥粉可以是培养以下酵母后的营养液干燥粉如面包酵母(Baker’s yeast)，也可以是啤酒酵母(brewer’s yeast)，酒类酵母(oenological)或者酒精酵母(distillery yeast)，其他类型的酵母浓缩液干燥粉也可以在本发明的背景下使用，例如生防酵母毕赤酵母(Pichin spp)，红冬孢酵母(Rhodosporporidiumpaludigenum)。
进一步地，保护剂的加入量为固态发酵培养物重量的5～20％，增效剂的加入量为固态发酵培养物重量的10～50％。
优选地，保护剂的加入量为固态发酵培养物重量的5～10％，增效剂的加入量为固态发酵培养物重量的10～30％；烘干固态发酵培养物的条件如下：在40～50℃烘干24～48h；优选地，在烘干固态发酵培养物之后向其中加入保护剂，在粉碎所述固态发酵培养物之后进一步向其中加入增效剂，进而得到木霉菌固态制剂成品。
进一步地，木霉菌是长枝木霉菌；优选地，木霉菌菌株为采用稀释平板涂布法从土壤中分离出的原始菌株，并经过了提取DNA、ITS序列测定的步骤。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了木霉菌固态制剂，其是通过上述的木霉菌固态制剂的制备方法制得。
根据本发明的另一方面，提供了上述的木霉菌固态制剂在预防农作物的真菌性土传病害和对农作物促生、增产中的应用。
进一步地，真菌性土传病害包括根腐病、枯萎病、茎基腐病。真菌性病害是灰霉病。
本发明提供了一种木霉菌固态制剂的制备方法，具体采用了固态发酵工艺，且在固态发酵过程中采用了麸皮、玉米粉、无机盐及酵母粉混合物作为培养基。与现有技术相比，本发明制备方法的原料来源广，发酵过程中添加无机盐和酵母粉能够缩短生产周期短，显著提高发酵产物的有效活菌数。固态发酵培养物中添加保护剂和增效剂后可替代部分农药使用，该制剂产品对植株促生抗逆明显，无残留，对人畜安全，具有良好的经济效应和生态效应。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了原始木霉菌菌株在PDA培养基上培养之初的形状；
图2示出了原始木霉菌菌株在PDA培养基上培养3d后的形状；
图3示出了长枝木霉菌株与灰霉病病原菌灰葡萄孢的对峙试验的结果；
图4示出了长枝木霉菌株与茄子根腐病的病原菌镰刀菌的对峙试验的结果；
图5示出了根据本发明的木霉菌剂对花生幼苗灌根后的生长情况，其中(a)为使用木霉菌剂的情况，(b)为有机肥对照。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
正如背景技术部分所描述的，目前以液态发酵制备木霉菌类生防制剂具有生产条件严格，配套设备多，投资大，能耗高，液态发酵不适合于霉状真菌的发酵的问题。而利用常规的固态发酵法生产木霉菌制剂时发酵过程长、产孢量一般。为了解决这一问题，本发明提供了一种木霉菌固态制剂的制备方法，其包括以下步骤：步骤S1，在液体培养基中对木霉菌菌株进行扩大培养，得到种子发酵液；步骤S2，将固态发酵基质原料、第一无机盐及第一酵母浸出粉混合，依次进行蒸料灭菌和冷却，得到固态发酵培养基；将种子发酵液与固态发酵培养基混合，然后进行固态发酵，得到固态发酵培养物；以及步骤S3，将固态发酵培养物烘干、粉碎，然后添加保护剂和增效剂，得到木霉菌固态制剂成品。
本发明提供的上述制备方法中具体采用了固态发酵工艺，因此配套设备少，工艺简单，投资小，能耗低。本发明在固态发酵过程中采用了固态发酵基质原料、无机盐及酵母浸出粉混合物作为培养基。与现有技术相比，上述方法原料来源广，发酵过程中添加无机盐和酵母浸出粉能够缩短生产周期短，显著提高发酵产物的有效活菌数。固态发酵培养物中添加保护剂和增效剂后可替代部分农药使用，该制剂产品对植株促生抗逆明显，无残留，对人畜安全，具有良好的经济效应和生态效应，更适合于木霉菌的发酵生产。
在一种优选的实施方式中，种子发酵液和固态发酵培养基的重量比为(0.1～10)％：(90～99.9)％。将二者之间的重量关系控制在上述范围内，一方面能够更加促进木霉菌菌株的生长，提高木霉菌固态制剂成品中的木霉菌菌株的有效含量降低，同时还有利于避免固态发酵培养基的浪费。
在一种优选的实施方式中，每1000ml所述液体培养基中含有蛋白胨5～15g、第二酵母浸出粉0.001～5g、蔗糖5～20g、磷酸二氢钾0.01～5g。优选地，蛋白胨8～12g、酵母浸出粉1～3g、蔗糖8～13g、磷酸二氢钾0.01～1g。通过将各成分的含量设置在上述范围内，更有利于木霉菌菌株充分进行液体扩大培养，相应提高了扩大培养的效率。
在一种优选的实施方式中，在液体培养基中对木霉菌菌株进行扩大培养的步骤之前，步骤S1还包括将木霉菌菌株接入PDA平板培养基进行活化的步骤；优选地，每1000mlPDA平板培养基中含有马铃薯煮熟后的浸出液200g、蔗糖20g、琼脂20g、氯霉素25mg；优选地，活化的步骤中，活化时间为3～7天。通过在对木霉菌菌株进行扩大培养的步骤之前包括活化的步骤，能够筛选出存活、繁殖力强的菌株，相应有利于提高成品中的木霉菌菌株的有效含量。
在一种优选的实施方式中，第一无机盐是硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铵构成的组中的任意一种或者几种。优选KH2PO4。采用KH2PO4能够和酵母浸出粉进行更好地互补，在二者之间的协同作用下，固态发酵阶段具有更高的效率，同时产孢量进一步提升。更优选第一酵母浸出粉是安琪酵母浸出粉。包括糖酵母(Saccharomyces)种属的酵母浸出粉，优选地是酿酒酵母(S.cerevisiae)。
在一种优选的实施方式中，固态发酵基质原料是以下物质中的两种以上：谷物类如大米、小米、小麦、玉米、大豆(或豆粕)、菜籽粕、芝麻粕、麸皮；纤维素类如木屑、秸秆、木糠、锯末、蘑菇渣、中药渣。优选地，固态发酵基质原料包括玉米粉和麸皮。能够为木霉菌菌株的生长繁殖提供平衡的营养物质。
在一种优选的实施方式中，按重量百分比计，固态发酵培养基包括：玉米粉10～30％、麸皮50～70％、第二无机盐0.1～5％、第二酵母浸出粉0.1～20％。优选地，固态发酵培养基包括：玉米粉20～30％、麸皮60～70％、第二无机盐0.1～1％、第二酵母浸出粉1～10％。优选地，玉米粉和麸皮均为发酵基质。通过各成分的含量在上述范围内，能够为木霉菌菌株的生长繁殖提供更加丰富且平衡的营养物质和盐类，能进一步缩短发酵时间和提高产孢量，并且还有利于进一步提高成品中的木霉菌菌株的有效含量。优选上述第二无机盐和第一无机盐的选择类型相同，优选第二酵母浸出粉和第一酵母浸出粉的选择类型相同。
在一种优选的实施方式中，步骤S2中，在将麸皮、玉米粉、第二无机盐及第二酵母浸出粉混合后，用水将混合物料润湿后在进行蒸料灭菌步骤。
在一种优选的实施方式中，步骤S1中，扩大培养的时间为2～15天。该时间下木霉菌菌株生长更充分，且有利于避免过长时间的生长引起的木霉菌菌株过度生长、活性降低。上述固态发酵生产条件简单容易实现，投资小，能耗低。为了使发酵效率更高，优选地，步骤S2中，固态发酵的条件为：25～35℃、自然光照下通气培养。如前文所述，正是由于固态发酵过程中酵母粉和无机盐的加入，提高了固态发酵的产孢量。为了提高最终产品中的木霉菌有效含量，优选地，步骤S2中，固态发酵时间为3～20d，当产孢量达到100亿/g后，停止固态发酵，得到固态发酵培养物。
在一种优选的实施方式中，保护剂是凹凸棒粉土，优选地，增效剂是酵母发酵浓缩液干粉，包括培养糖酵母(Saccharomyces)种属的酵母发酵后的浓缩液干燥粉，优选地是酿酒酵母(S.cerevisiae)。在这里，用凹凸棒粉做为木霉菌制剂的保护剂，替代硅藻土和滑石粉。用酵母发酵浓缩液干粉做为木霉菌制剂的增效剂，替代人工硫磺，农药原药等。酵母浓缩液干燥粉是利用酵母生产后的发酵母液经蒸发、喷雾干燥等现代工艺精制而成，富含氮磷钾大量元素、小分子有机质、多种氨基酸、生化黄腐酸、植物必需微量元素(钙、镁、硫、铁、锌、铜、锰、钼等)、粗蛋白等，重金属含量极低。其主要有优点有营养均衡又全面，易于吸收见效快，活化土壤，增强植物免疫力抗病害，改良农产品的品质。更为特别地，将酵母浓缩液干燥粉用作本发明制剂中的增效剂，对有效成分木霉菌的活性不会产生抑制作用，有利于木霉菌最大程度发挥对农作物的促生、防病、增产作用。凹凸棒粉土相比于硅藻土和滑石粉，同样更有利于充分发挥木霉菌的有效作用。
在一种优选的实施方式中，保护剂的加入量为固态发酵培养物重量的5～20％，增效剂的加入量为固态发酵培养物重量的10～50％。这有利于能够获得更高效、更安全的生防制剂。优选地，烘干固态发酵培养物的条件如下：在40～50℃烘干24～48h，这样有利于将培养物烘干至要求的水份且不损伤木霉菌菌株的活性。优选地，在烘干固态发酵培养物之后向其中加入保护剂5～10％，在粉碎固态发酵培养物之后进一步向其中加入增效剂10～30％，进而得到木霉菌固态制剂成品。
在一种优选的实施方式中，木霉菌是长枝木霉菌(所述长枝木霉与在市面上买到的长枝木霉一致，比如也可以直接采购市售的长枝木霉菌菌株ACCC 31767进行培养)；优选地，木霉菌菌株为采用稀释平板涂布法从土壤中分离出的原始菌株，并经过了提取DNA、ITS序列测定的步骤。长枝木霉菌对常见的植物病原菌具有不同程度的抑制作用，采用本发明提供的上述方法尤其适合制备长枝木霉菌固态制剂。木霉菌菌株为从土壤中分离出原始菌株，经过提取DNA、ITS序列测定获得，因此，原料来源广，容易获得。当然，此处的木霉菌菌株也可以通过市场购买。可以是任意生防，拮抗木霉菌如哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(T koningii)、绿色木霉、棘孢木霉(T viride)、钩状木霉(Thamatum)、里氏木霉(T reese)。
本发明还提供通过上述木霉菌固态制剂的制备方法制得的木霉菌固态制剂以及上述木霉菌固态制剂在预防农作物的真菌性土传病害和对农作物促生、增产中的应用。在一种优选的实施方式中，上述真菌性土传病害包括根腐病、枯萎病、茎基腐病。真菌性病害是灰霉病。
根据本发明的制备方法，用酵母发酵浓缩液干粉做为木霉菌制剂的增效剂，替代人工硫磺，农药原药等。但所述应用方法不限于替代人工硫磺，农药原药中的一种或几种。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
根据本发明的制备方法制备具有生防功能的木霉菌制剂并对其效果进行评价，步骤依次为：
一、菌种的分离鉴定
采用稀释平板涂布法从土壤中分离出原始菌株，提取DNA，经ITS序列测定，鉴定到种属，并对其进行生防功能验证。
二、菌种扩大培养
原始菌株接入PDA平板培养基，在其生长旺盛阶段接入液体培养基中培养，摇床28℃震荡培养3d，待其生长至产生大量菌丝体和分生孢子。
三、固态发酵培养
麸皮、玉米粉、无机盐、酵母粉按比例添加后，蒸料灭菌，灭菌后待其冷却，将其添加加入扩培好的种子发酵液，充分混匀，在灭菌好的浅盘均匀铺开，厚度为1～3cm。
四、制剂的制备
发酵好的木霉菌，烘干至要求的水份后粉碎至一定的目数，按比例添加保护剂和增效剂，即为成品。
五、应用试验
将产品应用到室内试验，盆栽试验，田间试验。
实施例1
菌种的分离和鉴定
取健康茄子根系，收集抖下的泥土10g，用无菌水稀释至10-2，10-3，10-4g/L，各取100ul均匀涂于提前准备好的水琼脂平板上，25℃培养24h，在显微镜下挑取丝状霉菌单菌落，转移至提前准备好的PDA平板上，25℃培养持续观察培养性状(结果如图1和2所示)。
在PDA平板上，初为白色丝状单菌落(图1)，3d后长满平板(图2)，放射状生长，菌丝初为白色，后转成绿色，分生孢子老熟后转为黄绿色，形成同心圆环。
长枝木霉菌的分子鉴定
采用CTAB法提取木霉菌株的总DNA，以通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。将扩增产物送至上海生物工程有限公司测序，测序结果提交至GenBank进行Blast比对。结果表明，本实验菌株与登录号为KT852813.1、KP268994.1、KJ767090.1的长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)的ITS序列的同源性高达100％。其详细序列如下：
SEQ ID NO:1：
GACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCTCCCGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA
将上述从植物根际土壤中分离得到的木霉菌(Trichoderma longibrachiatum)菌株命名为mm-1，作为木霉菌制剂的有效成分。
与植物病原菌的对峙试验
供试菌株为茄子灰霉病的病原菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，茄子根腐病的病原菌镰刀菌(Fusarium.spp.)。在PDA平板培养基上的一侧接入上述长枝木霉，在对称的另一侧分别接入灰葡萄孢菌和镰刀菌，置入培养箱中25℃培养，观察记录结果。结果表明，长枝木霉对灰葡萄菌和镰刀菌具有一定程度的抑制作用。一周后对灰霉菌的抑制率为33.3％(图3)，对镰刀菌抑制率为50％(图4)。
菌种扩大培养
纯化鉴定后的原始菌株mm-1冻干后保存在本公司菌种室备用，菌株mm-1在PDA平板培养基上活化，PDA培养基配方为1000ml培养基200g马铃薯的浸出液、蔗糖20g、琼脂20g、氯霉素25mg，3天后接入改良的液体种子培养基中25℃培养3d，改良液体种子培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸出粉2g，蔗糖10g，KH2PO41g，定容至1000ml。
固态发酵培养
20％玉米粉、70％麸皮、1％KH2PO4、9％酵母浸出粉，整个物料用水润湿，将配好的物料用水润湿，将固体发酵培养基倒入通气浅盘中，进行蒸料灭菌，待其冷却后，然后扩大的发酵种子接种到冷却的固体发酵培养基中，接种时发酵种子与固体培养基的质量比为1：99，接种后控制室内温度30℃，停止发酵并45℃烘干48h，检测活菌数。
制剂的制备
烘干的发酵物加入8％凹凸棒粉土，粉碎后过80目，混20％酵母发酵浓缩液干粉作为增效剂，测定孢子含量，孢子含量大于5亿/克即为产品合格。
制剂性能验证：
一、绿豆种子萌发和幼苗生长的试验
清水对照，以常见微生物菌剂的常规使用浓度处理绿豆种子1h后，清水冲洗干净，放入带有湿润滤纸培养皿中，置入培养箱28℃培养，观察绿豆种子萌发情况。以商品木霉菌剂菌(绿陇哈茨木霉菌，山东绿陇生物技术有限公司生产)，有效活菌数≥2亿/g，为对比。
表1不同常见使用浓度的木霉菌菌剂对绿豆萌发和初期生长的影响
Figure BDA0002004548490000081
结果表明，适宜浓度的木霉菌剂能够提高绿豆种子的初期的出芽率，在初期生长的时期提高绿豆苗的平均重量，平均总长和根长，浓度过高效果反而一般。
二、对花生生长的影响的田间试验
选择地势平坦，肥力一致的小区，面积共20m2，将实施例1中的木酶制剂与5％有机肥混用，终浓度为0.2亿/克，共计12kg。用5％生物有机肥做对照，做底肥施用。一个月后待幼苗长出后灌根，灌根浓度为0.2亿/g十天后结果表明，菌剂处理过的花生出芽率高，植株健壮，叶片大，叶色浓绿，平整，主根根系好，平均鲜重12.32g；未加菌剂处理过的花生长势慢，叶小卷曲，缺窝率略高于菌剂处理过的，平均鲜重11.10g(结果如图5所示，其中(a)为使用木酶制剂的情况，(b)为有机肥对照)。
三、对豇豆生长影响的田间试验
选择地势平坦，生长一致的田块，划小区，每个小区面积为10m2，种植豇豆，待豇豆长至第二个三叶期时，将实施例1中的木酶制剂10g用水稀释至6L.等量均匀灌入根部。一个月后第二次灌根。
结果：10d后，清水对照长势缓慢，叶小且卷曲，新长出的叶子有黄化和病斑产生；微生物菌剂处理过的豇豆叶片浓绿，平展，新长出的叶子无黄化，无斑点，进入抽蔓期，马上进入生殖生长期。
第二次使用微生物菌剂后，豇豆花数增多，结荚率提高，产量增加，根系固氮根瘤数量增多，土壤中真菌数量增加733％。
实施例2
25％玉米粉、69.5％麸皮、0.5％KH2PO4、5％酵母浸出粉，整个物料用水润湿，将配好的物料用水润湿，将固体发酵培养基倒入通气浅盘中，进行蒸料灭菌，待其冷却后，然后扩大的发酵种子接种到冷却的固体发酵培养基中，接种时发酵种子与固体培养基的质量比为0.1：99.9，接种后控制室内温度32℃，4d后停止发酵并48℃烘干40h，检测活菌数。
制剂的制备
烘干的发酵物加入5％凹凸棒粉土，粉碎后过80目，混15％酵母发酵浓缩液干粉作为增效剂，测定孢子含量，孢子含量大于5亿/克即为产品合格。
表2产品技术指标检测
指标 发酵结束有效活菌数(亿/g) 成品有效活菌数(亿/g) 水分(％) 有机质(％)
实施例1 110 93 9 30
实施例2 90 76 6 20
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明的木霉菌制剂对农作物具有促进种子萌发，幼苗生长，增加植物抗逆的作用，从而达到农作物的促生、防病和增产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安琪酵母股份有限公司
<120> 木霉菌固态制剂、其制备方法及其应用
<130> PN099813ANGEL
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 616
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(616)
<223> a1序列
<400> 1
GACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCTCCCGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA 616

Claims (16)

1.一种木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，在液体培养基中对木霉菌菌株进行扩大培养，得到种子发酵液；
步骤S2，将固态发酵基质原料、第一无机盐及第一酵母浸出粉混合，依次进行蒸料灭菌和冷却，得到固态发酵培养基；将所述种子发酵液与所述固态发酵培养基混合，然后进行固态发酵，得到固态发酵培养物；
步骤S3，将所述固态发酵培养物烘干、粉碎，然后添加保护剂和增效剂，得到所述木霉菌固态制剂成品。
2.根据权利要求1所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
所述种子发酵液和所述固态发酵培养基的重量百分比为(0.1～10)％：(90～99.9)％。
3.根据权利要求1所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
每1000ml所述液体培养基中含有蛋白胨5～15g、第二酵母浸出粉0.001～5g、蔗糖5～20g、磷酸二氢钾0.01～5g；
优选地，每1000ml所述液体培养基中含有所述蛋白胨8～12g、所述第二酵母浸出粉1～3g、所述蔗糖8～13g、所述磷酸二氢钾0.01～1g。
4.根据权利要求1所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
在所述液体培养基中对所述木霉菌菌株进行扩大培养的步骤之前，所述步骤S1还包括将所述木霉菌菌株接入PDA平板培养基进行活化的步骤；
优选地，每1000ml所述PDA平板培养基中含有200g马铃薯煮熟后的浸出液、蔗糖20g、琼脂20g、氯霉素25mg；
优选地，所述活化的步骤中的活化时间为3～7d。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
所述第一无机盐是硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铵构成的组中的任意一种或者几种，
优选地，所述第一无机盐是磷酸二氢钾。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
所述第一酵母浸出粉包括糖酵母种属的酵母浸出粉，优选地是酿酒酵母。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
所述固态发酵基质原料是以下物质中的两种或两种以上：大米、小米、小麦、玉米、大豆、菜籽粕、芝麻粕、麸皮、木屑、秸秆、木糠、锯末、蘑菇渣、中药渣；
优选地，所述固态发酵基质原料包括玉米粉和麸皮。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
按重量百分比计，所述固态发酵培养基包括：玉米粉10～30％、麸皮50～70％、第二无机盐0.1～5％、第二酵母浸出粉0.1～20％，
优选地，所述固态发酵培养基包括：所述玉米粉20～30％、所述麸皮60～70％、所述第二无机盐0.1～1％、所述第二酵母浸出粉1～10％。
9.根据权利要求8所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
所述步骤S2中，在将所述麸皮、所述玉米粉、所述第二无机盐及所述第二酵母浸出粉混合后，用水将混合物料润湿后在进行所述蒸料灭菌步骤。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
所述步骤S1中，所述扩大培养的时间为2～15d；
优选地，所述步骤S2中，所述固态发酵的温度为：25℃～35℃；
优选地，所述步骤S2中，所述固态发酵的时间为3～20d。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
所述保护剂是凹凸棒粉土，优选地，所述增效剂包括培养糖酵母种属的酵母发酵后的浓缩液干燥粉，优选地是酿酒酵母。
12.根据权利要求11所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
所述保护剂的加入量为所述固态发酵培养物重量的5～20％，所述增效剂的加入量为所述固态发酵培养物重量的10～50％；
优选地，烘干所述固态发酵培养物的条件如下：40～50℃烘干24～48h；
优选地，在烘干所述固态发酵培养物之后向其中加入所述保护剂5～10％，在粉碎所述固态发酵培养物之后进一步向其中加入所述增效剂10～30％，进而得到所述木霉菌固态制剂成品。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的木霉菌固态制剂的制备方法，其特征在于，
所述木霉菌是长枝木霉菌；
优选地，所述木霉菌菌株为采用稀释平板涂布法从土壤中分离出的原始菌株，并经过了提取DNA、ITS序列测定的步骤。
14.一种木霉菌固态制剂，其特征在于，通过权利要求1至13中任一项所述的木霉菌固态制剂的制备方法制得。
15.根据权利要求14所述的木霉菌固态制剂在预防农作物的真菌性土传病害和对农作物促生、增产中的应用。
16.根据权利要求15所述的木霉菌固态制剂在预防农作物的真菌性土传病害和对农作物促生、增产中的应用，其中，
所述真菌性土传病害包括根腐病、枯萎病、茎基腐病，
真菌性病害是灰霉病。
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