CN111732639A

CN111732639A - 大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽及其应用

Info

Publication number: CN111732639A
Application number: CN202010655175.1A
Authority: CN
Inventors: 冯振月; 王丽姿; 崔玉东
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2020-10-02

Abstract

本发明涉及一种大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列为SEQ NO:1所示。本发明还涉及大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽在制备大肠杆菌单克隆抗体中的应用。本发明的E.coli YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽作为抗原能够检测E.coli YbhF蛋白的表达，且抗原纯度更高，可克服基因工程表达抗原纯化中菌体杂蛋白的残留所致的非特异性反应，重链为IgG1亚类、轻链为κ型，具有良好的特异性；所制备的单克隆抗体纯度更高，便于研究YbhFSR转运体中YbhF蛋白的功能，为YbhFSR转运体抑制剂的研发奠定基础。

Description

大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽及其应用

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，涉及大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽及其应用。

背景技术

大肠杆菌(Escherichin coli)在一定的条件下可致人及动物发病，成为致病性大肠杆菌。致病性大肠杆菌为医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一，给人类健康及畜牧业发展造成了严重危害。大肠杆菌是主要寄生于人和动物消化道的一种条件致病菌，是当今社区感染和医院感染的最重要的条件致病菌，在院内感染病原菌中分离率为第一位，常引起人体各部位如呼吸道、消化道、泌尿生殖道、血液、皮肤等的严重感染；在兽医临床上，由于致病性大肠杆菌的血清型复杂，仅国内报道就有80余种之多，故对E.coli引起的疾病并无理想的疫苗来预防，多采用有效的抗生素进行治疗。近几年由于人们对抗生素大量、持续并且不恰当的使用，导致大肠杆菌耐药株不断增多，耐药机制不断变迁，特别是大肠杆菌多重交叉耐药株的大量出现，使人医临床和兽医临床对大肠杆菌病的治疗变得十分困难，有时甚至找不到可治之药。近年来，大肠杆菌的耐药性问题己经引起了国内外医药界的广泛重视，引起细菌耐药性一个很重要的原因是药物外排泵的存在，而YbhFSR转运体是已经被实验证实的药物外排转运体，目前逆转细菌耐药性主要的手段是研发和筛选药物外排泵的抑制剂，针对YbhFSR转运体抑制剂的研发需要了解该转运体三个基因ybhF、ybhS、ybhR的功能和三个蛋白的作用模式，而YbhF蛋白单克隆抗体的制备是研究YbhF蛋白的基础。

YbhF蛋白是一种大肠杆菌中非常保守的蛋白，由579个氨基酸组成，在大肠杆菌耐药中发挥重要作用。功能研究表明，YbhF蛋白位于YbhFSR转运体内，属于ABC家族，该转运体具有四环素外排转运体，而YbhF蛋白蛋白具有ATP结合结构域，在四环素外排过程中通过水解YbhF蛋白结合ATP释放能量完成四环素的外排，因此YbhF蛋白在该转运体中具有决定性作用。因此对YbhF蛋白B细胞表位单克隆抗体的制备对于研究YbhF的功能乃至验证YbhFSR转运体的功能具有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，解决目前大肠杆菌的耐药性越来越强，而YbhF蛋白所在的转运体YbhFSR是引起大肠杆菌耐药性的重要原因，YbhF蛋白高纯度的大肠杆菌抗体难以制备的问题。

本发明的第二目的是提供上述大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽的用途。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列为SEQ IDNo:1所示。

利用生物信息学方法预测E.coli YbhF的B细胞抗原表位，其氨基酸序列为SEQ IDNo:1所示(⁶⁵TVIGFDPIKN⁷⁴)。该抗原表位序列在不同大肠杆菌菌株中高度保守。

本发明所述的抗原表位SEQ ID No:1(⁶⁵TVIGFDPIKN⁷⁴)对制备的mAb进行鉴定，重链为IgG1亚类、轻链为κ型，具有良好的特异性。

本发明鉴定的YbhF蛋白B细胞表位用于后续检测鉴定YbhF蛋白、研究其功能以及转运机制提供帮助。

本发明制备的E.coli YbhF的B细胞抗原表位多肽对E.coli进行Western blot检测。结果显示，E.coli菌株均检测到YbhF蛋白表达。以上结果表明，YbhF蛋白的单克隆抗体能够用于该蛋白特异性检测和鉴定。该研究不仅为检测鉴定YbhF蛋白提供技术手段，也有助于进一步研究YbhF蛋白功能及其耐药***药物转运机制。

二、上述的大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽在制备大肠杆菌单克隆抗体中的应用。

采用上述技术方案的积极效果：本发明的E.coli YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽作为抗原能够检测E.coli YbhF蛋白的表达，且抗原纯度更高，可克服基因工程表达抗原纯化中菌体杂蛋白的残留所致的非特异性反应，重链为IgG1亚类、轻链为κ型，具有良好的特异性；所制备的单克隆抗体纯度更高，便于研究YbhFSR转运体中YbhF蛋白的功能，为YbhFSR转运体抑制剂的研发奠定基础。

附图说明

图1重组质粒pET-28a(+)-YbhF的PCR及酶切鉴定，图中从左至右依次为M：Trans8KDNA ladder；1：PCR扩增以ddH2O为模板阴性对照；2：PCR扩增YbhF基因；3：pET-28a(+)-YbhF经Bam HI酶切鉴定；4：pET-28a(+)-YbhF经Hin dIII酶切鉴定；5：pET-28a(+)-YbhF经BamHI和Hin dIII双酶切鉴定；

图2为YbhF蛋白的融合表达分析，(A)SDS-PAGE方法鉴定YbhF融合蛋白的表达与纯化；(B)Western blot方法鉴定YbhF融合蛋白的表达与纯化；图中从左至右依次为M：Prestained Protein Ladder；1：pET-28a(+)全菌体诱导前；2：pET-28a(+)全菌体诱导后；3：pET-28a(+)/ybhF全菌体诱导前；4：pET-28a(+)/ybhF全菌体诱导后上清；5：pET-28a(+)/ybhF全菌体诱导后沉淀；6：纯化后的YbhF蛋白。

图3SDS-PAGE方法检测纯化后单抗，图中从左至右依次为M：蛋白分子量标准；1：单克隆抗体的重链和轻链；

图4Western blot方法鉴定单抗mAbs与目的蛋白反应性；

图5Western blot方法检测mAbs特异性，(A)(B)Western blot方法检测mAb 3C9特异性；

图6单克隆抗体亚类的鉴定，图中从左至右依次为M：蛋白分子量标准；1：E.coli重组YbhF-6×His蛋白；2.S.aureus重组GapC-6×His蛋白；3.S.aureus重组MntC-6×His蛋白；4.S.aureus重组TraP-6×His蛋白；5.E.coli重组OmpA-6×His蛋白；

图7MAb阳性噬菌体克隆的筛选；

图8融合蛋白及关键氨基酸鉴定，(A)SDS-PAGE方法鉴定融合蛋白的表达；(B)Western blot方法鉴定关键氨基酸。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明YbhF蛋白的融合表达与纯化。

根据大肠杆菌K-12菌株YbhF基因序列(基因序列号：945413)，设计一对引物，上游引物为：5’cgcggatccatgaatgatgccgttatcacg 3’在上游引物的5’端为BamHⅠ的酶切位点(SEQ ID No:2)；下游引物为：5’cccaagcttttactcattgctatgctccttatcc 3’下游引物的5’端为HinⅢ的酶切位点(SEQ ID No:3)。提取大肠杆菌K-12菌株基因组DNA，PCR扩增YbhF基因。将YbhF蛋白经胶回收纯化后经BamH，HinⅢ双酶切，再回收，与同样酶切的pET28-az载体连接，构建了重组融合表达质粒。为检测重组质粒是否正确构建，将重组质粒pET-28a(+)-ybhF转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞后挑取克隆扩大培养后提取质粒进行Bam HI单酶切、Hin dIII单酶切及Bam HI、Hin dIII双酶切鉴定和PCR方法鉴定(图1)。

实施例2

本实施例说明YbhF融合蛋白的表达鉴定。

为鉴定重组蛋白的表达，用IPTG诱导重组菌后进行SDS-PAGE鉴定，结果显示诱导后重组沉淀在69kDa出现目的条带，说明重组YbhF蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。通过镍柱对重组YbhF蛋白进行纯化，能够看出蛋白纯度很高。接着用Anti-His antibody作为一抗进行Western blot，诱导后的重组菌沉淀和纯化后的蛋白在正确的位置出现了反应条带，证明了重组YbhF蛋白的正确表达(图2)。

实施例3

本实施例说明抗原抗体最佳稀释度。

为确定抗原抗体的最佳稀释度，利用棋盘法使用ELISA方法对YbhF蛋白和抗体的包被浓度进行检测，结果显示纯化的YbhF蛋白的最佳包被浓度为1:200(5μg/mL)，抗体的最佳稀释倍数为1:3200(表1)。

表1抗原和抗体最佳稀释度

注:(+)阳性血清(－)阴性血清

实施例4

本实施例说明免疫小鼠血清抗体效价检测。

为检测3次免疫后小鼠的血清抗体效价，在3次免疫后第14天对小鼠进行尾静脉采血，利用间接ELISA方法按照纯化的YbhF蛋白包被浓度为1:200(5μg/mL)测定免疫后小鼠血清的抗体效价，阴阳性血清按照1:2,000、1:4,000、1:8,000、二倍倍比稀释至1:128,000，免疫后4只小鼠抗体效价均达到1:128,000(表2)，可以用于细胞融合。

表2 BALB/c小鼠第三次免疫后效价

实施例5

本实施例说明mAb 3C9的纯化。

使用SDS-PAGE电泳观察mAb 3C9的纯化程度，结果可以看出mAb 3C9已得到较好纯化，在50kDa左右出现抗体重链，在25kDa左右出现抗体轻链(图3)。

实施例6

本实施例说明MAbs特异性鉴定。

为检测2株mAbs与重组蛋白YbhF的反应性，分别以杂交瘤细胞3C9与4D5的上清作为一抗进行分析，实验结果发现两株杂交瘤细胞上清都在69kDa左右出现了目的条带，说明mAb 3C9与mAb 4D5都能够与E.coli YbhF特异性结合(图4)。

实施例7

本实施例说明MAbs的特异性。

将纯化后E.coli重组YbhF-6×His蛋白，E.coli重组OmpA-6×His蛋白，S.aureus重组GapC-6×His蛋白，S.aureus重组TraP-6×His蛋白和S.aureus重组MntC-6×His蛋白处理后以杂交瘤细胞3C9与4D5的上清分别作为一抗进行Western blot分析(图5A，B)，结果显示两株杂交瘤细胞的上清都只与重组蛋白YbhF-6×His反应，而不与其他带有相同标签的重组蛋白反应。

实施例8

本实施例说明MAbs亚类鉴定。

为鉴定mAbs的抗体亚类，使用抗体分型试剂盒对mAbs进行鉴定，结果显示mAb3C9为IgG1亚类，mAb 4D5为IgM亚类，轻链均为κ型(图6)。

实施例9

本实施例说明MAbs分泌抗体的稳定性。

MAbs分泌抗体的稳定性使用间接ELISA方法对初始及传代20代或冻存3个月的杂交瘤细胞株上清进行效价检测，结果显示杂交瘤细胞株3C9初始效价为1:400，在传代20代后及冻存三个月后仍能保持1:400的抗体效价，说明杂交瘤细胞株3C9分泌抗体具有稳定性。杂交瘤细胞株4D5初始效价为1:200，在传代20代后及冻存三个月后仍能保持1:200的抗体效价，说明杂交瘤细胞株4D5分泌抗体具有稳定性(表3)。

表3杂交瘤细胞上清抗体效价

实施例10

本实施例说明噬菌体展示12肽库淘选。

噬菌体展示12肽库购买于NEB公司。为筛选E.coli YbhF的表位，选用各方面表现更为优异的mAb 3C9对噬菌体展示12肽库进行筛选，在淘选期间去除了与mAb非特异性结合的噬菌体，噬菌体的产出比＝(噬菌体产出量/噬菌体投入量)×100％。第1轮的产出比为3.9×10^-7，第2轮的产出比为1.7×10^-3，第3轮的产出比为3.7×10^-4，第4轮的产出比为1.6×10^-3，可以看出与mAb 3C9特异性结合的噬菌体随着4轮筛选得到了富集(表4)。

表4噬菌体展示肽库淘选结果

实施例11

本实施例说明噬菌体阳性克隆的筛选。

为鉴定表位⁶⁵TVIGFDP⁷¹的关键氨基酸，在氨基酸序列TVIGFDP的前面增加2个氨基酸，后面增加2个氨基酸，表位序列为⁶³SATVIGFDPIK⁷³，利用定点突变技术将氨基酸逐个替换为丙氨酸，设计突变表位的寡核苷酸序列送至吉林库美公司合成，诱导融合蛋白表达后进行SDS-PAGE分析并用mAb 3C9作为一抗进行Western blot分析，结果显示V66，G68，P71，I72和K73突变后完全破坏了表位与mAb 3C9的反应性，但P71，I72和K73全部为表位的关键氨基酸，是否K73后还存在关键氨基酸并不清楚，因此我们在氨基酸序列TVIGFDP的前面增加2个氨基酸，后面增加4个氨基酸，表位序列为⁶³SATVIGFDPIKNDGA⁷⁷，设计突变表位的寡核苷酸序列送至吉林库美公司合成(表5)，诱导融合蛋白表达后进行SDS-PAGE分析并用mAb3C9作为一抗进行Western blot分析，结果显示V66，G68，P71，I72和K73突变后完全破坏了表位与mAb 3C9的反应性，(图7)，且关键氨基酸终止于K73。说明V，G，P，I和K五个氨基酸在表位⁶⁵TVIGFDPIKN⁷⁴中起着关键性作用。

表5表位65TVIGFDPIKN74丙氨酸定点突变的退火寡聚核酸片段

注:突变的氨基酸下面有下划线“_”

实施例12

本实施例说明鉴定表位⁶⁵TVIGFDP⁷¹的关键氨基酸。

利用定点突变技术将氨基酸逐个替换为丙氨酸，设计突变表位的寡核苷酸序列送至吉林库美公司合成，诱导融合蛋白表达后进行SDS-PAGE分析并用mAb 3C9作为一抗进行Western blot分析，结果显示V66，G68，P71，I72和K73突变后完全破坏了表位与mAb 3C9的反应性，说明V，G，P，I和K五个氨基酸在表位⁶⁵TVIGFDPIKN⁷⁴中起着关键性作用(图8)。

实施例13

为了分析筛选的抗原表位是否具有保守性，从GeneBank选取40株E.coli菌株，将表位的氨基酸序列利用DNASTAR软件与相应表位区域氨基酸序列进行分析(表6)。分析的结果显示表位⁶⁵TVIGFDPIKN⁷⁴在E.coli中呈高度保守，无氨基酸的差异。

表6 65TVIGFDPIKN74表位与E.coli YbhF蛋白同源性比对结果

本发明的E.coli YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽作为抗原能够检测E.coliYbhF蛋白的表达，且抗原纯度更高，可克服基因工程表达抗原纯化中菌体杂蛋白的残留所致的非特异性反应，重链为IgG1亚类、轻链为κ型，具有良好的特异性；所制备的单克隆抗体纯度更高，背景清楚，因此YbhF蛋白单克隆抗体对于药物外排转运体YbhFSR抑制剂的研发奠定基础，而抑制剂的研发是目前逆转临床抗大肠杆菌药物抗性的最有效手段。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽及其应用

<130> B006

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

Thr Val Ile Gly Phe Asp Pro Ile Lys Asn

1 5 10

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatcca tgaatgatgc cgttatcacg 30

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagcttt tactcattgc tatgctcctt atcc 34

Claims

1.一种大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列为SEQ ID No:1所示。

2.权利要求1所述的大肠杆菌YbhF蛋白特异性B细胞抗原表位多肽在制备大肠杆菌单克隆抗体中的应用。