CN111721819B - 一种用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器 - Google Patents

一种用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器，包括以下步骤：选取材料和仪器：DNA序列均由生工生物工程股份有限公司合成，名称包括CEA‑Apt1(A1)，序列为5’‑SH‑TATCCAGCTTATTCAATT‑3’、CEA‑Apt2(A2)，序列为5’‑COOH‑AGGGGGTGAAGGGATACCC‑3’、PDGF‑BBApt1(B1)，序列为5’‑SH‑CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG‑3’、PDGF‑BB Apt2(B2)，序列为5’‑COOH‑CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG‑3’；本发明解决了目前只能单独对一种疾病标志物进行检测，需要对多种疾病进行检测时只能利用多种传感器，而且灵敏度交底，抗干扰能力差，响应性差的问题，具备金球良好的导电性能够增强导电能力，加速电极表面电子的转移，仪器操作简单、灵敏度高、响应性好和抗干扰能力强，能够实现单一目标物检测和双目标物同时检测的优点。

Description

一种用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器
技术领域
本发明涉及医疗检测技术领域，具体为一种用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器。
背景技术
疾病标志物在癌症风险评估和筛查、改善预后和评估对生物治疗的反应等方面发挥着越来越重要的作用。早期、灵敏地检测疾病标志物，可大大提高许多疾病的治疗效率。癌胚抗原(CEA)是一种高度糖基化的糖蛋白，在多种肿瘤中高表达，是用于癌症诊断的广谱疾病标志物。血小板衍生生长因子(PDGF)是人类血小板中发现的一种生长因子蛋白，由于其在调节细胞生长和***中的作用而变得越来越重要。由两种不同类型的二硫键连接的多肽链(称为A和B)组成的PDGF二聚体以三种亚型出现：PDGF-BB，PDGF-AB和PDGF-AA。在这些亚型中，PDGF-BB直接参与细胞转化过程以及肿瘤生长和进展。它在正常细胞中以不可检测的或低水平表达，但在人类恶性肿瘤中发现过表达。
作为潜在的蛋白质标志物，PDGF-BB的灵敏和快速检测在癌症的早期诊断，治疗和预后中尤其重要。目前只能单独对一种疾病标志物进行检测，需要对多种疾病进行检测时只能利用多种传感器，而且灵敏度交底，抗干扰能力差，响应性差，为此提出一种用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器，来解决此问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器，解决了目前只能单独对一种疾病标志物进行检测，需要对多种疾病进行检测时只能利用多种传感器，而且灵敏度交底，抗干扰能力差，响应性差的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器，包括以下步骤：
步骤1：选取材料和仪器：DNA序列均由生工生物工程股份有限公司合成，名称包括CEA-Apt1(A1)，序列为5’-SH-TATCCAGCTTATTCAATT-3’、CEA-Apt2(A2)，序列为5’-COOH-AGGGGGTGAAGGGATACCC-3’、PDGF-BBApt1(B1)，序列为5’-SH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’、PDGF-BB Apt2(B2)，序列为5’-COOH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；主要试剂包括尿酸(UA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、氯化镁(MgCl2)、铁***(K3Fe(CN)6)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原125(CA125)、粘蛋白(MUC1)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、***特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、聚乙烯亚氨(PEI)、6-巯基-1-己醇(MCH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；溶液包括电解质溶液和DNA缓冲液；主要仪器包括数显智能控温磁力搅拌器、透射电子显微镜、台式酸度计、电化学工作站、Milli-Q超纯水***、精密移液枪；
步骤2：PEI-Au的合成：在10.0mL 1.2mmol/L氯金酸溶液中快速加入1.0mL 4％PEI溶液，磁力搅拌下，升温至80℃，保持持续加热20min，待冷却至室温，得到PEI-Au；
步骤3：金属离子探针的制备：以PEI-Au-A2-Cu2+制备为例：首先，100μL 10μM A2溶液中加入1.0mg EDC和0.25g NHS，混合均匀，37℃反应1h；100μL PEI-Au加入以上体系，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm离心20min除去没有连上的A2，重新分散于200.0μL Cu(NO3)2溶液中，37℃反应12h，8000rpm离心20min除去上清液，重新分散在1xB2缓冲溶液中，制备完成PEI-Au-A2-Cu2+，同样的方法用于制备PEI-Au-B2-Pb2+，不同的是，将其分散在200.0μL Pb(NO3)2溶液中，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm 20min离心并洗涤数次后，将获得的金属探针分散在1xB2缓冲溶液中，4℃储存备用；
步骤4：电化学适配体传感器的制备：首先，分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极(直径3.0mm)表面进行抛光，并用超纯水冲洗，在超纯水溶液中超声15s；在0.5mol/LH2SO4溶液中进行CV扫描，清洁金电极的表面，氮气吹干后，立刻在金电极表面滴加10μL 1μMApt1(A1或B1)，室温放置过夜；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL 1mmol/L MCH，37℃避光反应40min；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL不同浓度的目标物(CEA或PDGF-BB)，超纯水冲洗电极，氮气吹干；最后滴加10.0μL金属离子探针溶液(PEI-Au-CEA-A2-Cu2+或PEI-Au-B2-Pb2+)，37℃反应120min，用0.1mol/L Tris-HCl冲洗电极，传感器制备完成，置于4℃储存备用；
步骤5：单个疾病标志物的检测：实验选择DPV作为检测方法，采用三电极工作***(工作电极为Au电极；参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为Pt电极)进行测量，DPV测试在2.0mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行，CEA和PDGF-BB的DPV扫描范围分别为0.0V～0.5V和-0.5～0.2V；
步骤6：多个疾病标志物的检测：与单个疾病标志物检测不同的是，分别使用Cu2+和Pb2+合成两种金属探针Au-A2-Cu2+和Au-B2-Pb2+，按照1：1的比例混合得到用于同时检测的金属离子探针，同时检测的DPV扫描范围为-0.6V～0.6V。
优选的，所述在步骤1中，试剂和溶剂均为分析纯，无需进一步纯化可以直接使用。
优选的，所述在步骤1中，实验用水均为Millipore Milli-Q***净化的超纯水(电阻率18.2MΩ·cm)。
优选的，所述在步骤1中，电解质溶液(Tris-HCl缓冲液，pH＝7.4):0.1mol/LTris，0.5mol/L NaCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L MgCl2。
优选的，所述在步骤1中，DNA缓冲液(1X NEBuffer 2)：50mmol/L NaCl，10mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT，pH为7.9。
优选的，所述在步骤1中，数显智能控温磁力搅拌器的型号为SZCL-4，生产厂家为郑州科华仪器设备有限公司、透射电子显微镜的型号为HT7700，生产厂家为TEM，HITACHI，Japan、台式酸度计的型号为PB-10，生产厂家为德国赛多利斯仪器有限公司、电化学工作站的型号为CHI-660A，生产厂家为CH Instruments,USA、Milli-Q、超纯水***的型号为Academic，生产厂家为密理博中国有限公司、精密移液枪的型号为Eppendorf，生产厂家为艾本德中国有限公司。
优选的，所述在步骤4中，滴加的目标物是CEA时，37℃反应90min。
优选的，所述在步骤4中，该制备方法可以用于构建单一目标物PDGF-BB或CEA的传感器，也可以是用于多目标物CEA和PDGF-BB同时检测的传感器。
优选的，所述在步骤5中，在0.05ng/mL～20ng/mL范围内，CEA的检测呈现良好的线性关系，线性方程为：Ipa(μA)＝0.3520+0.0854C(μM)，R2＝0.990，其中C为CEA浓度，检测限为16pg/mL(S/N＝3)。
优选的，所述在步骤6中，分别使用6.0mmol/L Cu2+和30.0mmol/L Pb2+合成两种金属探针Au-A2-Cu2+和Au-B2-Pb2+。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过设置选取材料和仪器、PEI-Au的合成、金属离子探针的制备、电化学适配体传感器的制备、单个疾病标志物的检测和多个疾病标志物的检测的工艺流程，解决了目前只能单独对一种疾病标志物进行检测，需要对多种疾病进行检测时只能利用多种传感器，而且灵敏度交底，抗干扰能力差，响应性差的问题，该用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器，具备金球良好的导电性能够增强导电能力，加速电极表面电子的转移，仪器操作简单、灵敏度高、响应性好和抗干扰能力强，能够实现单一目标物检测和双目标物同时检测的优点。
具体实施方式
下面将通过实施例的方式对本发明作更详细的描述，这些实施例仅是举例说明性的而没有任何对本发明范围的限制。
本发明提供一种技术方案：一种用于同时检测多种疾病标志物电化学适配体传感器，包括以下步骤：
步骤1：选取材料和仪器：DNA序列均由生工生物工程股份有限公司合成，名称包括CEA-Apt1(A1)，序列为5’-SH-TATCCAGCTTATTCAATT-3’、CEA-Apt2(A2)，序列为5’-COOH-AGGGGGTGAAGGGATACCC-3’、PDGF-BBApt1(B1)，序列为5’-SH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’、PDGF-BB Apt2(B2)，序列为5’-COOH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；主要试剂包括尿酸(UA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、氯化镁(MgCl2)、铁***(K3Fe(CN)6)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原125(CA125)、粘蛋白(MUC1)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、***特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、聚乙烯亚氨(PEI)、6-巯基-1-己醇(MCH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；溶液包括电解质溶液和DNA缓冲液；主要仪器包括数显智能控温磁力搅拌器、透射电子显微镜、台式酸度计、电化学工作站、Milli-Q超纯水***、精密移液枪；
步骤2：PEI-Au的合成：在10.0mL 1.2mmol/L氯金酸溶液中快速加入1.0mL 4％PEI溶液，磁力搅拌下，升温至80℃，保持持续加热20min，待冷却至室温，得到PEI-Au；
步骤3：金属离子探针的制备：以PEI-Au-A2-Cu2+制备为例：首先，100μL 10μM A2溶液中加入1.0mg EDC和0.25g NHS，混合均匀，37℃反应1h；100μL PEI-Au加入以上体系，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm离心20min除去没有连上的A2，重新分散于200.0μL Cu(NO3)2溶液中，37℃反应12h，8000rpm离心20min除去上清液，重新分散在1xB2缓冲溶液中，制备完成PEI-Au-A2-Cu2+，同样的方法用于制备PEI-Au-B2-Pb2+，不同的是，将其分散在200.0μL Pb(NO3)2溶液中，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm 20min离心并洗涤数次后，将获得的金属探针分散在1xB2缓冲溶液中，4℃储存备用；
步骤4：电化学适配体传感器的制备：首先，分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极(直径3.0mm)表面进行抛光，并用超纯水冲洗，在超纯水溶液中超声15s；在0.5mol/LH2SO4溶液中进行CV扫描，清洁金电极的表面，氮气吹干后，立刻在金电极表面滴加10μL 1μMApt1(A1或B1)，室温放置过夜；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL 1mmol/L MCH，37℃避光反应40min；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL不同浓度的目标物(CEA或PDGF-BB)，超纯水冲洗电极，氮气吹干；最后滴加10.0μL金属离子探针溶液(PEI-Au-CEA-A2-Cu2+或PEI-Au-B2-Pb2+)，37℃反应120min，用0.1mol/L Tris-HCl冲洗电极，传感器制备完成，置于4℃储存备用；
步骤5：单个疾病标志物的检测：实验选择DPV作为检测方法，采用三电极工作***(工作电极为Au电极；参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为Pt电极)进行测量，DPV测试在2.0mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行，CEA和PDGF-BB的DPV扫描范围分别为0.0V～0.5V和-0.5～0.2V；
步骤6：多个疾病标志物的检测：与单个疾病标志物检测不同的是，分别使用Cu2+和Pb2+合成两种金属探针Au-A2-Cu2+和Au-B2-Pb2+，按照1：1的比例混合得到用于同时检测的金属离子探针，同时检测的DPV扫描范围为-0.6V～0.6V。
实施例一：
选取材料和仪器：DNA序列均由生工生物工程股份有限公司合成，名称包括CEA-Apt1(A1)，序列为5’-SH-TATCCAGCTTATTCAATT-3’、CEA-Apt2(A2)，序列为5’-COOH-AGGGGGTGAAGGGATACCC-3’、PDGF-BBApt1(B1)，序列为5’-SH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’、PDGF-BB Apt2(B2)，序列为5’-COOH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；主要试剂包括尿酸(UA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、氯化镁(MgCl2)、铁***(K3Fe(CN)6)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原125(CA125)、粘蛋白(MUC1)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、***特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、聚乙烯亚氨(PEI)、6-巯基-1-己醇(MCH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；溶液包括电解质溶液和DNA缓冲液；主要仪器包括数显智能控温磁力搅拌器、透射电子显微镜、台式酸度计、电化学工作站、Milli-Q超纯水***、精密移液枪；PEI-Au的合成：在10.0mL 1.2mmol/L氯金酸溶液中快速加入1.0mL 4％PEI溶液，磁力搅拌下，升温至80℃，保持持续加热20min，待冷却至室温，得到PEI-Au；金属离子探针的制备：以PEI-Au-A2-Cu2+制备为例：首先，100μL 10μM A2溶液中加入1.0mg EDC和0.25g NHS，混合均匀，37℃反应1h；100μL PEI-Au加入以上体系，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm离心20min除去没有连上的A2，重新分散于200.0μL Cu(NO3)2溶液中，37℃反应12h，8000rpm离心20min除去上清液，重新分散在1xB2缓冲溶液中，制备完成PEI-Au-A2-Cu2+，同样的方法用于制备PEI-Au-B2-Pb2+，不同的是，将其分散在200.0μL Pb(NO3)2溶液中，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm 20min离心并洗涤数次后，将获得的金属探针分散在1xB2缓冲溶液中，4℃储存备用；电化学适配体传感器的制备：首先，分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极(直径3.0mm)表面进行抛光，并用超纯水冲洗，在超纯水溶液中超声15s；在0.5mol/L H2SO4溶液中进行CV扫描，清洁金电极的表面，氮气吹干后，立刻在金电极表面滴加10μL 1μM Apt1(A1或B1)，室温放置过夜；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL 1mmol/L MCH，37℃避光反应40min；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL不同浓度的目标物(CEA或PDGF-BB)，超纯水冲洗电极，氮气吹干；最后滴加10.0μL金属离子探针溶液(PEI-Au-CEA-A2-Cu2+或PEI-Au-B2-Pb2+)，37℃反应120min，用0.1mol/L Tris-HCl冲洗电极，传感器制备完成，置于4℃储存备用；单个疾病标志物的检测：实验选择DPV作为检测方法，采用三电极工作***(工作电极为Au电极；参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为Pt电极)进行测量，DPV测试在2.0mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行，CEA和PDGF-BB的DPV扫描范围分别为0.0V～0.5V和-0.5～0.2V；多个疾病标志物的检测：与单个疾病标志物检测不同的是，分别使用Cu2+和Pb2+合成两种金属探针Au-A2-Cu2+和Au-B2-Pb2+，按照1：1的比例混合得到用于同时检测的金属离子探针，同时检测的DPV扫描范围为-0.6V～0.6V。
实施例二：
在实施例一中，再加上下述工序：
在步骤1中，试剂和溶剂均为分析纯，无需进一步纯化可以直接使用，实验用水均为Millipore Milli-Q***净化的超纯水(电阻率18.2MΩ·cm)，电解质溶液(Tris-HCl缓冲液，pH＝7.4):0.1mol/L Tris，0.5mol/L NaCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L MgCl2，DNA缓冲液(1X NEBuffer 2)：50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT，pH为7.9，数显智能控温磁力搅拌器的型号为SZCL-4，生产厂家为郑州科华仪器设备有限公司、透射电子显微镜的型号为HT7700，生产厂家为TEM，HITACHI，Japan、台式酸度计的型号为PB-10，生产厂家为德国赛多利斯仪器有限公司、电化学工作站的型号为CHI-660A，生产厂家为CH Instruments,USA、Milli-Q、超纯水***的型号为Academic，生产厂家为密理博中国有限公司、精密移液枪的型号为Eppendorf，生产厂家为艾本德中国有限公司，可以避免操作途中寻找没有准备的材料。
选取材料和仪器：DNA序列均由生工生物工程股份有限公司合成，名称包括CEA-Apt1(A1)，序列为5’-SH-TATCCAGCTTATTCAATT-3’、CEA-Apt2(A2)，序列为5’-COOH-AGGGGGTGAAGGGATACCC-3’、PDGF-BBApt1(B1)，序列为5’-SH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’、PDGF-BB Apt2(B2)，序列为5’-COOH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；主要试剂包括尿酸(UA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、氯化镁(MgCl2)、铁***(K3Fe(CN)6)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原125(CA125)、粘蛋白(MUC1)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、***特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、聚乙烯亚氨(PEI)、6-巯基-1-己醇(MCH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；溶液包括电解质溶液和DNA缓冲液；主要仪器包括数显智能控温磁力搅拌器、透射电子显微镜、台式酸度计、电化学工作站、Milli-Q超纯水***、精密移液枪；PEI-Au的合成：在10.0mL 1.2mmol/L氯金酸溶液中快速加入1.0mL 4％PEI溶液，磁力搅拌下，升温至80℃，保持持续加热20min，待冷却至室温，得到PEI-Au；金属离子探针的制备：以PEI-Au-A2-Cu2+制备为例：首先，100μL 10μM A2溶液中加入1.0mg EDC和0.25g NHS，混合均匀，37℃反应1h；100μL PEI-Au加入以上体系，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm离心20min除去没有连上的A2，重新分散于200.0μL Cu(NO3)2溶液中，37℃反应12h，8000rpm离心20min除去上清液，重新分散在1xB2缓冲溶液中，制备完成PEI-Au-A2-Cu2+，同样的方法用于制备PEI-Au-B2-Pb2+，不同的是，将其分散在200.0μL Pb(NO3)2溶液中，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm 20min离心并洗涤数次后，将获得的金属探针分散在1xB2缓冲溶液中，4℃储存备用；电化学适配体传感器的制备：首先，分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极(直径3.0mm)表面进行抛光，并用超纯水冲洗，在超纯水溶液中超声15s；在0.5mol/L H2SO4溶液中进行CV扫描，清洁金电极的表面，氮气吹干后，立刻在金电极表面滴加10μL 1μM Apt1(A1或B1)，室温放置过夜；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL 1mmol/L MCH，37℃避光反应40min；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL不同浓度的目标物(CEA或PDGF-BB)，超纯水冲洗电极，氮气吹干；最后滴加10.0μL金属离子探针溶液(PEI-Au-CEA-A2-Cu2+或PEI-Au-B2-Pb2+)，37℃反应120min，用0.1mol/L Tris-HCl冲洗电极，传感器制备完成，置于4℃储存备用；单个疾病标志物的检测：实验选择DPV作为检测方法，采用三电极工作***(工作电极为Au电极；参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为Pt电极)进行测量，DPV测试在2.0mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行，CEA和PDGF-BB的DPV扫描范围分别为0.0V～0.5V和-0.5～0.2V；多个疾病标志物的检测：与单个疾病标志物检测不同的是，分别使用Cu2+和Pb2+合成两种金属探针Au-A2-Cu2+和Au-B2-Pb2+，按照1：1的比例混合得到用于同时检测的金属离子探针，同时检测的DPV扫描范围为-0.6V～0.6V。
实施例三：
在实施例二中，再加上下述工序：
在步骤4中，滴加的目标物是CEA时，37℃反应90min，该制备方法可以用于构建单一目标物PDGF-BB或CEA的传感器，也可以是用于多目标物CEA和PDGF-BB同时检测的传感器，让操作取得最佳效果。
选取材料和仪器：DNA序列均由生工生物工程股份有限公司合成，名称包括CEA-Apt1(A1)，序列为5’-SH-TATCCAGCTTATTCAATT-3’、CEA-Apt2(A2)，序列为5’-COOH-AGGGGGTGAAGGGATACCC-3’、PDGF-BBApt1(B1)，序列为5’-SH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’、PDGF-BB Apt2(B2)，序列为5’-COOH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；主要试剂包括尿酸(UA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、氯化镁(MgCl2)、铁***(K3Fe(CN)6)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原125(CA125)、粘蛋白(MUC1)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、***特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、聚乙烯亚氨(PEI)、6-巯基-1-己醇(MCH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；溶液包括电解质溶液和DNA缓冲液；主要仪器包括数显智能控温磁力搅拌器、透射电子显微镜、台式酸度计、电化学工作站、Milli-Q超纯水***、精密移液枪；PEI-Au的合成：在10.0mL 1.2mmol/L氯金酸溶液中快速加入1.0mL 4％PEI溶液，磁力搅拌下，升温至80℃，保持持续加热20min，待冷却至室温，得到PEI-Au；金属离子探针的制备：以PEI-Au-A2-Cu2+制备为例：首先，100μL 10μM A2溶液中加入1.0mg EDC和0.25g NHS，混合均匀，37℃反应1h；100μL PEI-Au加入以上体系，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm离心20min除去没有连上的A2，重新分散于200.0μL Cu(NO3)2溶液中，37℃反应12h，8000rpm离心20min除去上清液，重新分散在1xB2缓冲溶液中，制备完成PEI-Au-A2-Cu2+，同样的方法用于制备PEI-Au-B2-Pb2+，不同的是，将其分散在200.0μL Pb(NO3)2溶液中，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm 20min离心并洗涤数次后，将获得的金属探针分散在1xB2缓冲溶液中，4℃储存备用；电化学适配体传感器的制备：首先，分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极(直径3.0mm)表面进行抛光，并用超纯水冲洗，在超纯水溶液中超声15s；在0.5mol/L H2SO4溶液中进行CV扫描，清洁金电极的表面，氮气吹干后，立刻在金电极表面滴加10μL 1μM Apt1(A1或B1)，室温放置过夜；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL 1mmol/L MCH，37℃避光反应40min；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL不同浓度的目标物(CEA或PDGF-BB)，超纯水冲洗电极，氮气吹干；最后滴加10.0μL金属离子探针溶液(PEI-Au-CEA-A2-Cu2+或PEI-Au-B2-Pb2+)，37℃反应120min，用0.1mol/L Tris-HCl冲洗电极，传感器制备完成，置于4℃储存备用；单个疾病标志物的检测：实验选择DPV作为检测方法，采用三电极工作***(工作电极为Au电极；参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为Pt电极)进行测量，DPV测试在2.0mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行，CEA和PDGF-BB的DPV扫描范围分别为0.0V～0.5V和-0.5～0.2V；多个疾病标志物的检测：与单个疾病标志物检测不同的是，分别使用Cu2+和Pb2+合成两种金属探针Au-A2-Cu2+和Au-B2-Pb2+，按照1：1的比例混合得到用于同时检测的金属离子探针，同时检测的DPV扫描范围为-0.6V～0.6V。
实施例四：
在实施例三中，再加上下述工序：
在步骤5中，在0.05ng/mL～20ng/mL范围内，CEA的检测呈现良好的线性关系，线性方程为：Ipa(μA)＝0.3520+0.0854C(μM)，R2＝0.990，其中C为CEA浓度，检测限为16pg/mL(S/N＝3)，确保检测的准确性。
选取材料和仪器：DNA序列均由生工生物工程股份有限公司合成，名称包括CEA-Apt1(A1)，序列为5’-SH-TATCCAGCTTATTCAATT-3’、CEA-Apt2(A2)，序列为5’-COOH-AGGGGGTGAAGGGATACCC-3’、PDGF-BBApt1(B1)，序列为5’-SH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’、PDGF-BB Apt2(B2)，序列为5’-COOH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；主要试剂包括尿酸(UA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、氯化镁(MgCl2)、铁***(K3Fe(CN)6)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原125(CA125)、粘蛋白(MUC1)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、***特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、聚乙烯亚氨(PEI)、6-巯基-1-己醇(MCH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；溶液包括电解质溶液和DNA缓冲液；主要仪器包括数显智能控温磁力搅拌器、透射电子显微镜、台式酸度计、电化学工作站、Milli-Q超纯水***、精密移液枪；PEI-Au的合成：在10.0mL 1.2mmol/L氯金酸溶液中快速加入1.0mL 4％PEI溶液，磁力搅拌下，升温至80℃，保持持续加热20min，待冷却至室温，得到PEI-Au；金属离子探针的制备：以PEI-Au-A2-Cu2+制备为例：首先，100μL 10μM A2溶液中加入1.0mg EDC和0.25g NHS，混合均匀，37℃反应1h；100μL PEI-Au加入以上体系，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm离心20min除去没有连上的A2，重新分散于200.0μL Cu(NO3)2溶液中，37℃反应12h，8000rpm离心20min除去上清液，重新分散在1xB2缓冲溶液中，制备完成PEI-Au-A2-Cu2+，同样的方法用于制备PEI-Au-B2-Pb2+，不同的是，将其分散在200.0μL Pb(NO3)2溶液中，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm 20min离心并洗涤数次后，将获得的金属探针分散在1xB2缓冲溶液中，4℃储存备用；电化学适配体传感器的制备：首先，分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极(直径3.0mm)表面进行抛光，并用超纯水冲洗，在超纯水溶液中超声15s；在0.5mol/L H2SO4溶液中进行CV扫描，清洁金电极的表面，氮气吹干后，立刻在金电极表面滴加10μL 1μM Apt1(A1或B1)，室温放置过夜；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL 1mmol/L MCH，37℃避光反应40min；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL不同浓度的目标物(CEA或PDGF-BB)，超纯水冲洗电极，氮气吹干；最后滴加10.0μL金属离子探针溶液(PEI-Au-CEA-A2-Cu2+或PEI-Au-B2-Pb2+)，37℃反应120min，用0.1mol/L Tris-HCl冲洗电极，传感器制备完成，置于4℃储存备用；单个疾病标志物的检测：实验选择DPV作为检测方法，采用三电极工作***(工作电极为Au电极；参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为Pt电极)进行测量，DPV测试在2.0mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行，CEA和PDGF-BB的DPV扫描范围分别为0.0V～0.5V和-0.5～0.2V；多个疾病标志物的检测：与单个疾病标志物检测不同的是，分别使用Cu2+和Pb2+合成两种金属探针Au-A2-Cu2+和Au-B2-Pb2+，按照1：1的比例混合得到用于同时检测的金属离子探针，同时检测的DPV扫描范围为-0.6V～0.6V。
实施例五：
在实施例四中，再加上下述工序：
在步骤6中，分别使用6.0mmol/L Cu2+和30.0mmol/L Pb2+合成两种金属探针Au-A2-Cu2+和Au-B2-Pb2+，取得最佳的效果。
选取材料和仪器：DNA序列均由生工生物工程股份有限公司合成，名称包括CEA-Apt1(A1)，序列为5’-SH-TATCCAGCTTATTCAATT-3’、CEA-Apt2(A2)，序列为5’-COOH-AGGGGGTGAAGGGATACCC-3’、PDGF-BBApt1(B1)，序列为5’-SH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’、PDGF-BB Apt2(B2)，序列为5’-COOH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；主要试剂包括尿酸(UA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、氯化镁(MgCl2)、铁***(K3Fe(CN)6)、亚铁***(K4Fe(CN)6·3H2O)、癌胚抗原(CEA)、糖链抗原125(CA125)、粘蛋白(MUC1)、血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、***特异性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、聚乙烯亚氨(PEI)、6-巯基-1-己醇(MCH)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；溶液包括电解质溶液和DNA缓冲液；主要仪器包括数显智能控温磁力搅拌器、透射电子显微镜、台式酸度计、电化学工作站、Milli-Q超纯水***、精密移液枪；PEI-Au的合成：在10.0mL 1.2mmol/L氯金酸溶液中快速加入1.0mL 4％PEI溶液，磁力搅拌下，升温至80℃，保持持续加热20min，待冷却至室温，得到PEI-Au；金属离子探针的制备：以PEI-Au-A2-Cu2+制备为例：首先，100μL 10μM A2溶液中加入1.0mg EDC和0.25g NHS，混合均匀，37℃反应1h；100μL PEI-Au加入以上体系，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm离心20min除去没有连上的A2，重新分散于200.0μL Cu(NO3)2溶液中，37℃反应12h，8000rpm离心20min除去上清液，重新分散在1xB2缓冲溶液中，制备完成PEI-Au-A2-Cu2+，同样的方法用于制备PEI-Au-B2-Pb2+，不同的是，将其分散在200.0μL Pb(NO3)2溶液中，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm 20min离心并洗涤数次后，将获得的金属探针分散在1xB2缓冲溶液中，4℃储存备用；电化学适配体传感器的制备：首先，分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极(直径3.0mm)表面进行抛光，并用超纯水冲洗，在超纯水溶液中超声15s；在0.5mol/L H2SO4溶液中进行CV扫描，清洁金电极的表面，氮气吹干后，立刻在金电极表面滴加10μL 1μM Apt1(A1或B1)，室温放置过夜；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL 1mmol/L MCH，37℃避光反应40min；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL不同浓度的目标物(CEA或PDGF-BB)，超纯水冲洗电极，氮气吹干；最后滴加10.0μL金属离子探针溶液(PEI-Au-CEA-A2-Cu2+或PEI-Au-B2-Pb2+)，37℃反应120min，用0.1mol/L Tris-HCl冲洗电极，传感器制备完成，置于4℃储存备用；单个疾病标志物的检测：实验选择DPV作为检测方法，采用三电极工作***(工作电极为Au电极；参比电极为Ag/AgCl电极；对电极为Pt电极)进行测量，DPV测试在2.0mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行，CEA和PDGF-BB的DPV扫描范围分别为0.0V～0.5V和-0.5～0.2V；多个疾病标志物的检测：与单个疾病标志物检测不同的是，分别使用Cu2+和Pb2+合成两种金属探针Au-A2-Cu2+和Au-B2-Pb2+，按照1：1的比例混合得到用于同时检测的金属离子探针，同时检测的DPV扫描范围为-0.6V～0.6V。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种电化学适配体传感器用于同时检测多种疾病标志物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：选取材料和仪器：DNA序列名称包括DNA序列A1为CEA-Apt1，序列为5’-SH-TATCCAGCTTATTCAATT-3’、DNA序列A2为CEA-Apt2，其序列为5’-COOH-AGGGGGTGAAGGGATACCC-3’、DNA序列B1为PDGF-BBApt1，序列为5’-SH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’、DNA序列B2为PDGF-BB Apt2，序列为5’-COOH-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；
步骤2：PEI-Au的合成：在10.0mL 1.2mmol/L氯金酸溶液中快速加入1.0mL 4％PEI溶液，磁力搅拌下，升温至80℃，保持持续加热20min，待冷却至室温，得到PEI-Au；
步骤3：金属离子探针的制备：PEI-Au-A2-Cu2+的制备：首先，100μL 10μM A2溶液中加入1.0mg EDC和0.25g NHS，混合均匀，37℃反应1h；100μL PEI-Au加入以上体系，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm离心20min除去没有连上的A2，重新分散于200.0μL Cu(NO3)2溶液中，37℃反应12h，8000rpm离心20min除去上清液，重新分散在1xB2缓冲溶液中，制备完成PEI-Au-A2-Cu2+，同样的方法用于制备PEI-Au-B2-Pb2+，不同的是，将其分散在200.0μL Pb(NO3)2溶液中，37℃300rpm振摇反应12h，8000rpm 20min离心并洗涤数次后，将获得的金属探针分散在1xB2缓冲溶液中，4℃储存备用；
步骤4：电化学适配体传感器的制备：首先，分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对金电极表面进行抛光，并用超纯水冲洗，在超纯水溶液中超声15s；在0.5mol/L H2SO4溶液中进行CV扫描，清洁金电极的表面，氮气吹干后，立刻在金电极表面滴加10μL 1μM Apt1，室温放置过夜；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL 1mmol/L MCH，37℃避光反应40min；超纯水冲洗电极，氮气吹干，滴加10.0μL不同浓度的目标物CEA或PDGF-BB，超纯水冲洗电极，氮气吹干；最后滴加10.0μL金属离子探针溶液PEI-Au-A2-Cu2+或PEI-Au-B2-Pb2+，37℃反应120min，用0.1mol/L Tris-HCl冲洗电极，传感器制备完成，置于4℃储存备用；
步骤5：多个疾病标志物的检测：分别使用Cu2+和Pb2+合成两种金属探针PEI-Au-A2-Cu2+和PEI-Au-B2-Pb2+，按照1：1的比例混合得到用于同时检测的金属离子探针，同时检测的DPV扫描范围为-0.6V～0.6V。
2.根据权利要求1所述的一种电化学适配体传感器用于同时检测多种疾病标志物的方法，其特征在于：所述在步骤1中，电解质溶液为Tris-HCl缓冲液，pH＝7.4:0.1mol/L Tris，0.5mol/L NaCl，0.1mol/L KCl，0.1mol/L MgCl2。
3.根据权利要求1所述的一种电化学适配体传感器用于同时检测多种疾病标志物的方法，其特征在于：所述在步骤1中，DNA缓冲液1X NEBuffer2：50mmol/L NaCl，10mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgCl2，1mmol/LDTT，pH为7.9。
4.根据权利要求1所述的一种电化学适配体传感器用于同时检测多种疾病标志物的方法，其特征在于：所述在步骤4中，滴加的目标物是CEA时，37℃反应90min。
5.根据权利要求1所述的一种电化学适配体传感器用于同时检测多种疾病标志物的方法，其特征在于：所述在步骤4中，该制备方法可以用于构建单一目标物PDGF-BB或CEA的传感器，也可以是用于多目标物CEA和PDGF-BB同时检测的传感器。
6.根据权利要求1所述的一种电化学适配体传感器用于同时检测多种疾病标志物的方法，其特征在于：所述在步骤5中，在0.05ng/mL～20ng/mL范围内，CEA的检测呈现良好的线性关系，线性方程为：Ipa(μA)＝0.3520+0.0854C(μM)，R2＝0.990，其中C为CEA浓度，检测限为16pg/mL(S/N＝3)。
7.根据权利要求1所述的一种电化学适配体传感器用于同时检测多种疾病标志物的方法，其特征在于：所述在步骤5中，分别使用6.0mmol/L Cu2+和30.0mmol/L Pb2+合成两种金属探针PEI-Au-A2-Cu2+和PEI-Au-B2-Pb2+。
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