CN111719004A - 用于区分鉴定卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒和使用方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于区分鉴定卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒，含有用于扩增卫氏并殖吸虫的引物和检测卫氏并殖吸虫的探针，还含有用于扩增斯氏并殖吸虫囊蚴的引物和检测斯氏并殖吸虫囊蚴的探针。本发明还提供了上述试剂盒的使用方法。本发明确定以卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫线粒体COX1基因保守区基因序列作为扩增靶基因序列，分别设计合成了两对特异性引物和两条TaqMAN探针应用于对卫氏并殖吸虫的囊蚴和斯氏并殖吸虫的囊蚴进行检测。本发明的方法具有较高的灵敏度，最低能检测到30.5 copies/μL的卫氏并殖吸虫囊蚴DNA以及32.1 copies/μL的斯氏并殖吸虫囊蚴DNA。

Description

用于区分鉴定卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂 盒和使用方法
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及一种检测寄生虫的试剂盒和方法，具体来说是一种用于检测卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒和方法。
背景技术
并殖吸虫(Paragonimus)属于扁形动物门(Platyhelminths)、吸虫纲(Trematoda)、复殖目(Digenea)、并殖科(Paragonimidae)、并殖属(Paragonimus)。目前，全世界范围内有记载的并殖吸虫有50余种(包括亚种、同物异名等)，我国就有32种(包括亚种、同物异名等)，致病的并殖吸虫约有10余种，我国主要的虫种是卫氏并殖吸虫(Paragonimuswestermani)、斯氏并殖吸虫(Paragonimusskrjabini)、三平正并殖吸虫(Euparagonimuscenocopiosis)等。
卫氏并殖吸虫(P.westermani)也称为肺吸虫，成虫主要寄生于人、猫、狗等动物的肺脏里，虫卵随***物排出体外，进入水中发育并孵出毛蚴。毛蚴入侵第一中间宿主川卷螺，经过胞蚴、母雷蚴、子雷蚴与尾蚴各期，尾蚴从螺体逸出后，侵入第二中间宿主溪蟹或蝲蛄。体内发育为囊蚴，人因生食含有囊蚴的溪蟹或蝲蛄而感染。童虫在人体需经移行才能到达肺脏。卫氏并殖吸虫病一般症状表现为外周血嗜酸性粒细胞增多，咳嗽、咳铁锈色痰，如果虫体寄生在其他部位也会产生相应症状。
斯氏并殖吸虫的生活史与卫氏并殖吸虫相似。该虫感染人体主要表现为游走性皮下包块或结节。近年来，屡有报道斯氏并殖吸虫侵犯胸肺的病例报告。血项检查多表现为嗜酸性粒细胞明显增加。因本病表现多样，临床上误诊率相当高。
并殖吸虫的分类是一个非常有争议的话题。因为并殖吸虫生活史复杂，中间宿主种类多且广泛，地区及环境存在的差异，不同发育期标本的制作、种间和种内存在不同程度的变异等，所以并殖吸虫从首次发现至今160多年来，虫种分类依然尚未得到统一。
在形态学上，并殖吸虫的分类多以成虫为样本。一方面需要由熟悉并殖吸虫相关知识的专业人员来进行分类鉴别，且操作较为繁琐；另一方面并殖吸虫成虫、囊蚴及虫卵的大小、形状在不同环境、不同宿主体内略有差异。因此，形态学很难将并殖吸虫分类。我国对并殖吸虫的分类主要是采用形态学和DNA技术相结合的方法。先从形态学大致区分并殖吸虫虫种，结合分子技术进行分类鉴定，从而在基因水平准确区别虫种。
我国对并殖吸虫分类研究尚存在地区局限性，大多是针对某单独省份或某地区的虫种进行的，报道相对零散；且这些分子鉴定方法大多是以成虫为样本进行的研究，但成虫通常需要动物模型才能获取，试验过程耗材耗力。更为复杂的是，其中的每一个实验步骤皆需要较长时间，且有些操作过程易造成污染，产生假阳性等，使得目前的检测方法耗时长、检测仪器昂贵、对人员要求高，且需要通过相关技能培训并获得上岗证才能进行鉴定等，满足不了现场即时、快速的检测要求。
实时荧光定量PCR技术是具有巨大发展潜力的高新检测技术，在许多领域已得到了广泛的应用，该技术不仅实现了PCR方法从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、检测周期短、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，已广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。
由于目前并殖吸虫成虫样本难以获取，但中间宿主溪蟹较易采集，本研究建立一种针对并殖吸虫中间宿主溪蟹中囊蚴的及时、快速荧光定量PCR检测方法，开辟了并殖吸虫囊蚴检测方法的新路径，对并殖吸虫的分类、临床诊断、流行病学调查、地理分布、食品安全、检疫具有重要应用价值。
发明内容
本发明提供了一种用于检测卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒和方法，所述的这种用于检测卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒和方法要解决现有技术中的检测卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的方法特异性和灵敏性不高的技术问题。
本发明提供了一种用于区分鉴定卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒，
含有扩增卫氏并殖吸虫囊蚴的上游引物，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；
含有扩增卫氏并殖吸虫囊蚴的下游引物，其基因序列如SEQ ID NO.2所示；
含有检测卫氏并殖吸虫囊蚴的探针，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；
含有扩增斯氏并殖吸虫囊蚴的上游引物，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；
含有扩增斯氏并殖吸虫囊蚴的下游引物，其基因序列如SEQ ID NO.5所示；
含有检测斯氏并殖吸虫囊蚴的探针，其基因序列如SEQ ID NO.6所示；
在含有检测卫氏并殖吸虫囊蚴的探针的5’端标记荧光染料FAM，而3’端则标记荧光淬灭基团；
在含有检测斯氏并殖吸虫囊蚴的探针的5’端标记荧光染料VIC，而3’端则标记荧光淬灭基团。
进一步的，还含有分别与卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫的线粒体COX1基因对应一致的两个标准阳性对照质粒DNA模板，以及进行实时定量PCR检测所需要的试剂，所述的卫氏并殖吸虫的线粒体COX1基因序列如SEQ ID NO.7所示；所述的斯氏并殖吸虫的线粒体COX1基因序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了上述的一种用于区分鉴别卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒的使用方法，以待测分离的囊蚴基因组DNA为模板，将其与DNA聚合酶、缓冲液、灭菌超纯水以及试剂盒中的检测引物和特异性探针按比例混合均匀后，进行实时定量PCR检测，根据反应曲线的Ct值确定囊蚴的种类，从而判定溪蟹感染的是卫氏并殖吸虫囊蚴或是斯氏并殖吸虫囊蚴。
本发明所涉及的两组引物如表1和表2示：
表1检测卫氏并殖吸虫囊蚴荧光定量PCR引物和探针基因序列
Figure BDA0002620781550000031
表2检测斯氏并殖吸虫囊蚴荧光定量PCR引物和探针基因序列
Figure BDA0002620781550000032
Figure BDA0002620781550000041
本发明与常规PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快和全封闭反应等优点。在扩增靶标的选择上，线粒体COX1基因基因序列是寄生虫分子鉴定常用的靶标。COX1基因基因序列属于线粒体基因组，母系遗传进化速率较快，适用于种内遗传差异的分析。
本发明分别利用卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫线粒体COX1基因，该基因在并殖吸虫种内中高度保守，但在不同并殖吸虫虫种之间存在可变区。本发明利用该基因的这一特点，将COX1基因作为实时荧光定量PCR检测的靶标基因，选取卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫线粒体COX1基因(GeneBankTM登录号分别为U97205.1和U97216.1)，采用Mega6.0进行多重比较，筛选出卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫COX1基因片段各自保守的区域，利用PrimerPremier 5.0软件进行引物与探针的设计。本研究分别设计了针对卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫的特异性引物和探针，设计的引物与探针只能特异性的检测到相对应的卫氏并殖吸虫囊蚴或斯氏并殖吸虫囊蚴，且灵敏度较高，未能检测到其它相关的寄生虫。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明中的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可区别鉴定卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫囊蚴，同时还可对两种并殖吸虫基因组DNA进行定量分析。
附图说明
图1为实时荧光PCR检测技术特异性试验对照图(其中A图曲线1～3：卫氏并殖吸虫囊蚴；4～15：斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、大片吸虫、华支睾吸虫、肝片吸虫、旋毛虫、蛔虫、牛带绦虫、溪蟹肌肉的基因组DNA、无菌去离子水(2个)；B图曲线1～3：斯氏并殖吸虫囊蚴；4～15：卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、大片吸虫、华支睾吸虫、肝片吸虫、旋毛虫、蛔虫、牛带绦虫、溪蟹肌肉的基因组DNA、无菌去离子水(2个))。
图2为不同拷贝数阳性质控标准品荧光PCR扩增的动力学曲线(从左往右依次是：将DNA进行100倍倍比稀释，卫氏并殖吸虫稀释梯度为0.305-3.05×109copies/μL，1～6:3.05×109copies/μL、3.05×107copies/μL、3.05×105copies/μL、3.05×103copies/μL、30.5copies/μL、0.305copies/μL；斯氏并殖吸虫稀释梯度为0.321-3.21×109copies/μL，1～6:3.21×109copies/μL、3.21×107copies/μL、3.21×105copies/μL、3.21×103copies/μL、32.1copies/μL、0.321copies/μL)。
图3为实时荧光PCR标准曲线(A为卫氏并殖吸虫实时荧光PCR标准曲线，B为斯氏并殖吸虫实时荧光PCR标准曲线)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：
1.囊蚴(来自浙江永嘉和福建漳州的淡水溪蟹)分离：
1.1对捕获的溪蟹测量大小、分雌雄；
1.2将溪蟹头胸甲、螫肢和步足分别剪碎，与其内脏一起置于乳钵内；
1.3竹筒和竹棒(或其他类似替代品)捣碎；
1.4用生理盐水清洗捣碎样品用并用10目网筛过滤，除去粗蟹壳；
1.5滤液再用40目网筛过滤，将获得的滤液置于锥形量筒内，加水至量筒的最大刻度处，自然沉淀洗涤至水清；
1.6将全部沉渣吸入玻璃平皿，在体视显微镜下，收集囊蚴并计数登记；
1.7将收集的囊蚴保存于75％酒精中或于少量生理盐水中-80℃速冻。
2.基因组DNA提取：
2.1取形态特征一致的囊蚴1个～10个放入1.5mL离心管中，加入100μL PBS和少量玻璃珠振荡5min～10min，再按照通用基因组提取试剂盒进行DNA提取；
3.PCR引物及探针：选取卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫线粒体COX1基因(GeneBankTM登录号分别为U97205.1和U97216.1)，采用Mega6.0进行多重比较，筛选出卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫各自保守的区域，利用Primer Premier 5.0软件进行引物与探针的设计。
设计卫氏并殖吸虫荧光定量引物和探针所用的COX1基因序列：gggtttggtatcgtgagccacatttgcatgaccctgaccaacaacgattccttgttcgggtactacgggctggtgtttgcgatgggggccattgtgtgtctgggtagtgttgtgtgggcgcatcacatgttcatggttggtttggatgtcaagactgctgttttctttagttctgtcacgggagtgattgggatacccacggggattaaggttttctcttggttgttcatgctgggtggaactcgtttgcggttttgggatcctgttttgtggtgaattcttgggtttatcttcctgttcaccataggtggtgtgaccggcatcattctgtcctcctccatactggatagtctgttgcatgatacgtggttcgt(如SEQ ID NO.7所示)
设计斯氏并殖吸虫荧光定量引物和探针所用的COX1基因序列：
gggttcggggttgtgagacatatttgtatgactttaactaataaagattctttgtttggctattatggattggtttttgctatgggggctattgtttgtctaggaagggttgtttgggcgcatcatatgtttatggttggtctggatgttaagactgctgtgttttttagctctgttacgggggttataggtatccctacaggaattaaggttttttcttggttgtttatgttgggaggggctcgtttacggttttgggatccggtaatttggtgaattttggggtttatttttctttttacgatagggggggtaactgggattattttgtcttcatctattttggatagcttattgcatgatacttggtttgt(如SEQ ID NO.8所示)
卫氏并殖吸虫所用引物和探针：
PWF(正向引物)：5′-TTGTTCGGGTACTACGGGCT-3′3’(SEQ ID NO.1)
PWR(反向引物)：5′-CCGCAAACGAGTTCCACC-3′3’(SEQ ID NO.2)
探针PWP:5’-FAM-AGTTCTGTCACGGGAGTGATTGGG-BHQ1-MGB-3’(SEQ ID NO.3)，在其5’端标记荧光染料FAM，而3’端则标记非荧光淬灭基团。
斯氏并殖吸虫所用引物和探针：
PSF(正向引物):5’-CTATTATGGATTGGTTTTTG-3’(SEQ ID NO.4)，
PSR(反向引物):5’-ACCTATAACCCCCGTAACAGAGCT-3’(SEQ ID NO.5)，
探针PSP：5’-VIC-GGGCTATTGTTTGTCTAGGAAGG-BHQ1-MGB-3’(SEQ ID NO.6)，在其5’端标记荧光染料VIC，而3’端则标记非荧光淬灭基团。
4.阳性质控标准品的制备：
将卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫的常规PCR产物与克隆载体PUC57vector连接，转化入大肠杆菌DH5α，并保存阳性重组菌，参照MiniBEST Plasmid Purification Kit说明书制备质粒并进行定量；
4.1大肠杆菌的培养，从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4mL的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养；
4.2取1～4mL的过夜培养菌液，12000r/min离心2min，弃上清；
4.3用250μL的SolutionⅠ(溶解试剂Ⅰ)含RNaseA1充分悬浮细菌沉淀；
4.4加入250μL的SolutionⅡ(溶解试剂Ⅱ)轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充***解，形成透明溶液；
4.5加入400μL的4℃预冷的SolutionⅢ(溶解试剂Ⅲ)，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min；
4.6室温12000r/min离心10min，取上清；
4.7将试剂盒中的旋转柱安置于收集管上；
4.8将上述操作4.6的上清液转移至旋转柱中，12000r/min离心1min，弃滤液；
4.9将500μL的Rinse A(洗液A)加入旋转柱，12000r/min离心30s，弃滤液；
4.10将700μL的Rinse B(洗液B)加入旋转柱中，12000r/min离心30s，弃滤液；
4.11重复操作步骤4.10；
4.12将旋转柱安置于新的1.5mL的离心管上，在旋转柱膜的中央处加入60μL的灭菌蒸馏水或溶解缓冲液，室温静置1min；
4.1312000r/min离心1min洗脱DNA；
在质粒提取后吸取50μL，以5或10的倍比连续稀释制成不同浓度梯度的阳性质控标准品进行定量检测，-20℃保存备用。
其中，在提取质粒后吸取50μL进行定量检测的具体方法如下：取10μL质粒稀释到500μL，测定OD260，然后算出质粒的质量，再算出摩尔浓度，最后乘以阿伏伽德罗常数6.02×1023，即为单位体积的拷贝数，计算公式为：阳性质粒拷贝数copies/μL＝(OD260×50×10-9×稀释倍数×6.02×1023)/(660×碱基数)式中：50代表用1cm的比色杯在OD260为1时相对应的双链DNA浓度为50μg/mL；660代表双链DNA平均每个碱基对的分子量。
5.反应体系的建立与优化：
对不同浓度梯度的阳性质控标准品进行预试验，选取Ct在20左右的浓度3.05×1010copies/μL(卫氏并殖吸虫)和3.21×1010copies/μL(斯氏并殖吸虫)作为体系优化时的模板。
反应体系的建立与优化的步骤包括：
5.1荧光定量PCR反应所用试剂为东洋纺TOYOBO THUNDERBIRD Probe One-stepqRT-PCR Kit(包括2×buffer，QRZ DNA酶)；
5.2 QRZ DNA酶单因子浓度梯度优化在反应体系中其他条件相同的情况下，将rTaq酶的用量在0.25～2μL，以每0.25μL递增，通过试验结果的比较分析，确定最佳QRZ DNA酶的用量是0.5μL；
5.3探针单因子浓度梯度优化在反应体系中其他条件相同的情况下将探针用量范围设在每个反应0.10～0.50μL，以每0.05μL递增，对重复试验进行比较分析，确定试剂盒中每个反应的最佳探针用量均为0.40μL；
5.4引物浓度的优化在反应体系中其他条件相同的情况下，将上下游引物用量分别设在每个反应0.10～0.90μL，以每0.10μL递增，矩阵分析，确定卫氏并殖吸虫荧光定量PCR每个反应的最佳引物用量是上下游引物均为0.40μL；斯卫氏并殖吸虫荧光定量PCR每个反应的最佳引物用量是上下游引物均为0.80μL；
5.5循环参数的确定：
对变性时间、退火和延伸温度、时间及循环次数进行适当的调节件，选取检测时间最短，扩增曲线最好的循环参数作为PCR的温度和时间参数，即95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，40cycles，于60℃时收集荧光信号。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴实时荧光PCR检测体系为20μL，所需各组分及相应的用量如下所示：
6.所述的卫氏并殖吸虫荧光定量PCR扩增反应体系为：
无菌双蒸水 8.3μL
2倍反应缓冲液(2×) 10μL
引物1(10pmol/μL) 0.4μL
引物2(10pmol/μL) 0.4μL
探针(10pmol/μL) 0.4μL
模板DNA 2μL
QRZ DNA酶(4U/μl) 0.5μL
反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，40cycles；40℃5min，1cycle；于60℃时收集荧光信号。
7、所述的斯并殖吸虫荧光定量PCR扩增反应体系为：
无菌双蒸水 7.5μL
2倍反应缓冲液(2×) 10μL
引物1(10pmol/μL) 0.8μL
引物2(10pmol/μL) 0.8μL
探针(10pmol/μL) 0.4μL
模板DNA 2μL
QRZ酶(4U/μL) 0.5μL
反应条件均为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，40cycles；40℃5min，1cycle；于60℃时收集荧光信号。
7.特异性试验
用建立的卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫实时荧光PCR检测方法分别对卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、大片吸虫、华支睾吸虫、肝片吸虫、旋毛虫、蛔虫、牛带绦虫、溪蟹肌肉的基因组DNA及水对照进行检测，以探究该方法检测的特异性。
如图1所述，本发明分别以卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、大片吸虫、华支睾吸虫、肝片吸虫、旋毛虫、蛔虫、牛带绦虫、溪蟹肌肉的基因组DNA进行实验，以探究该方法检测的特异性。其中A图曲线1～3：卫氏并殖吸虫囊蚴；4～15：斯氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、大片吸虫、华支睾吸虫、肝片吸虫、旋毛虫、蛔虫、牛带绦虫、溪蟹肌肉的基因组DNA、无菌去离子水(2个)；B图曲线1～3：斯氏并殖吸虫囊蚴；4～15：卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、大片吸虫、华支睾吸虫、肝片吸虫、旋毛虫、蛔虫、牛带绦虫、溪蟹肌肉的基因组DNA、无菌去离子水(2个)。结果仅卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫分别能检测到相应的扩增曲线，而其他寄生虫和健康宿主均无荧光信号的增加，证明该方法具有很好的检测特异性。
8.灵敏性试验
以制备的不同浓度梯度的阳性质控标准品为PCR模板，按上述PCR反应体系和反应程序在荧光PCR仪上进行扩增，经计算机分析得出不同拷贝数的Ct值，根据Ct值以及相应拷贝数的对数作出标准曲线，计算扩增效率，E＝10-1/K-1，其中K值为标准曲线的斜率。
将两种并殖吸虫的阳性质粒进行100倍倍比稀释(卫氏并殖吸虫稀释梯度为0.305-3.05×109copies/μL；斯氏并殖吸虫稀释梯度为0.321-3.21×109copies/μL，采用本研究建立的方法进行灵敏度实验，实验结果显示：两种并殖吸虫的单重荧光定量PCR鉴定检测方法的灵敏度分别达到卫氏并殖吸虫30.5copies/μL，斯氏并殖吸虫32.1copies/μL。
如图2所述，分别将两种并殖吸虫的DNA进行100倍倍比稀释，卫氏并殖吸虫稀释梯度为0.305-3.05×109copies/μL，1～6:3.05×109copies/μl、3.05×107copies/μl、3.05×105copies/μl、3.05×103copies/μl、30.5copies/μl、0.305copies/μl(A图)；斯氏并殖吸虫稀释梯度为0.321-3.21×109copies/μL，1～6:3.21×109copies/μl、3.21×107copies/μl、3.21×105copies/μl、3.21×103copies/μl、32.1copies/μl、0.321copies/μl(B图)。各取上述浓度的阳性质控标准品1μL，以无模板水对照做阴性对照，在荧光PCR仪上进行扩增反应，结果显示每个反应管内的荧光信号达到阈值所需的循环数(Ct)和起始模板拷贝数的对数存在明显的线性关系(R2＝0.9998和R2＝0.9997)，阳性质控标准品在标准曲线上的数据点与曲线拟合均良好。
如图3所述，A为卫氏并殖吸虫实时荧光PCR标准曲线，B为斯氏并殖吸虫实时荧光PCR标准曲线。卫氏并殖吸虫：R2＝0.9998、扩增效率E＝96.6％、扩增方程Y＝-6.8128x+37.059，灵敏度可达30.5copies/μL。斯氏并殖吸虫R2＝0.9997、扩增效率E＝91.8％、Y＝-7.0721x+45.106。NTC(no template control)无模板对照均无荧光扩增曲线，为阴性结果，说明本方法具有极高敏感性。
9.重复性试验
9.1对同一阳性质控标准品设3复管同时检测，计算Ct值的变异系数，考察检测方法的重复性和稳定性。
9.2灵敏性试验中检测的不同浓度梯度的阳性质控标准品，于-20℃保存30d后重检，两次检测的Ct值进行比较假设检验，观察是否存在显著差异，考察本发明方法检测的稳定性。
9.3本发明实时荧光PCR重复3次检测同一阳性质控标准品，检测所得Ct值的变异系数为1.2％(卫氏并殖吸虫)和0.27％(斯氏并殖吸虫)；两次(间隔30d)检测同一批不同浓度梯度的阳性质控标准品，检测所得Ct值经比较假设检验无显著差异，可见本方法具有良好的重复性和稳定性。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）
<120> 用于区分鉴定卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒和使用方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgttcgggt actacgggct 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgcaaacga gttccacc 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agttctgtca cgggagtgat tggg 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctattatgga ttggtttttg 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acctataacc cccgtaacag agct 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggctattgt ttgtctagga agg 23
<210> 7
<211> 374
<212> DNA
<213> 卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)
<400> 7
gggtttggta tcgtgagcca catttgcatg accctgacca acaacgattc cttgttcggg 60
tactacgggc tggtgtttgc gatgggggcc attgtgtgtc tgggtagtgt tgtgtgggcg 120
catcacatgt tcatggttgg tttggatgtc aagactgctg ttttctttag ttctgtcacg 180
ggagtgattg ggatacccac ggggattaag gttttctctt ggttgttcat gctgggtgga 240
actcgtttgc ggttttggga tcctgttttg tggtgaattc ttgggtttat cttcctgttc 300
accataggtg gtgtgaccgg catcattctg tcctcctcca tactggatag tctgttgcat 360
gatacgtggt tcgt 374
<210> 8
<211> 374
<212> DNA
<213> 斯氏并殖吸虫(Paragonimus skrjabini)
<400> 8
gggttcgggg ttgtgagaca tatttgtatg actttaacta ataaagattc tttgtttggc 60
tattatggat tggtttttgc tatgggggct attgtttgtc taggaagggt tgtttgggcg 120
catcatatgt ttatggttgg tctggatgtt aagactgctg tgttttttag ctctgttacg 180
ggggttatag gtatccctac aggaattaag gttttttctt ggttgtttat gttgggaggg 240
gctcgtttac ggttttggga tccggtaatt tggtgaattt tggggtttat ttttcttttt 300
acgatagggg gggtaactgg gattattttg tcttcatcta ttttggatag cttattgcat 360
gatacttggt ttgt 374

Claims (3)

1.一种用于区分鉴定卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒，其特征在于：
含有扩增卫氏并殖吸虫囊蚴的上游引物，其基因序列如SEQ ID NO .1所示；
含有扩增卫氏并殖吸虫囊蚴的下游引物，其基因序列如SEQ ID NO .2所示；
含有检测卫氏并殖吸虫囊蚴的探针，其基因序列如SEQ ID NO .3所示；
含有扩增斯氏并殖吸虫囊蚴的上游引物，其基因序列如SEQ ID NO .4所示；
含有扩增斯氏并殖吸虫囊蚴的下游引物，其基因序列如SEQ ID NO .5所示；
含有检测斯氏并殖吸虫囊蚴的探针，其基因序列如SEQ ID NO .6所示；
在含有检测卫氏并殖吸虫囊蚴的探针的5’端标记荧光染料FAM，而3’端则标记荧光淬灭基团；
在含有检测斯氏并殖吸虫囊蚴的探针的5’端标记荧光染料VIC，而3’端则标记荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种用于区分鉴别卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒，其特征在于：还含有分别与卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫的线粒体COX1基因对应一致的两个标准阳性对照质粒DNA模板，以及进行实时定量PCR检测所需要的试剂，所述的卫氏并殖吸虫的线粒体COX1基因序列如SEQ ID NO .7所示；所述的斯氏并殖吸虫的线粒体COX1基因序列如SEQ ID NO .8所示。
3.权利要求1或2所述的一种用于区分鉴别卫氏并殖吸虫囊蚴和斯氏并殖吸虫囊蚴的试剂盒的使用方法，其特征在于：以待测分离的囊蚴基因组DNA为模板，将其与DNA聚合酶、缓冲液、灭菌超纯水以及试剂盒中的检测引物和特异性探针按比例混合均匀后，进行实时定量PCR检测，根据反应曲线的Ct值确定囊蚴的种类，从而判定溪蟹感染的是卫氏并殖吸虫囊蚴或是斯氏并殖吸虫囊蚴。
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