CN111718898B

CN111718898B - 提高滑膜间充质干细胞逆境耐受性的方法及其试剂

Info

Publication number: CN111718898B
Application number: CN202010637806.7A
Authority: CN
Inventors: 刘欢; 邢越
Original assignee: Beijing Intelligent Treasure Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing intelligent treasure Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2020-07-06
Filing date: 2020-07-06
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2040-07-06
Also published as: CN111718898A

Abstract

本发明涉及一种提高滑膜间充质干细胞逆境耐受性的方法及其试剂，具体方法是向滑膜间充质干细胞中转入外源基因，该外源基因为SEQ ID NO：1所示的Epsin蛋白对应的编码基因。Epsin蛋白能够提高转基因的滑膜间充质干细胞的缺氧和缺血耐受性，能够较好的降低所述干细胞在缺氧缺血条件下的凋亡，可以用于缺氧和缺血环境下的关节修复中的用途，具有加好的应用前景。

Description

提高滑膜间充质干细胞逆境耐受性的方法及其试剂

技术领域

本发明属于干细胞领域，具体的涉及提高滑膜间充质干细胞逆境耐受性的方法及其试剂。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能特性的成体干细胞，其可塑性为组织工程研究及临床再生医学开辟了新的方向。，MSCs存在于骨髓、脂肪组织、脐带、骨骼肌、滑膜、循环***、牙髓和肺组织等多种人体组织器官，新近发现在女性月经血中也存在MSCs。组织培养过程中，人们发现这种外观呈纤维样的细胞具有黏附生长的特点，并具有向血液、骨、软骨、脂肪、肌肉、表皮、上皮、神经等多种组织细胞定向分化的潜能。在体外培养实验中证明MSCs不具有免疫原性，在体内实验证明MSCs具有同种异体免疫耐受，并具有免疫调节作用。因MSCs具有来源广泛、分化潜能大及无免疫原性等细胞特性，可以在组织再生和创伤修复过程中发挥重要生物学作用，成为再生医学研究中最重要的种子细胞，移植MSCs用于治疗组织损伤的相关研究也成为当今医学的热点。

例如缺氧缺血性脑损伤是一种弥漫性、进行性的神经元坏死和神经元程序性死亡，是导致脑性瘫痪、智力落后和癫痫的主要原因。目前多采用高压氧、神经营养药物、细胞因子、中药及针灸等方法治疗，以抑制脑细胞凋亡和促进神经功能恢复为主，但对已经坏死的细胞所造成的功能障碍难以恢复。神经干细胞(neuralstemcell，NSC)移植治疗新生儿，由于其取材不方便、来源有限，发生免疫排斥的可能性较大，且人源性NSC移植涉及的伦理学问题成为其临床应用难以突破的最大障碍。间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)是一类具有自我增殖和分化潜能的多能干细胞，MSC易获取和诱导分化，无成瘤性和免疫排斥反应发生，可以通过新生动物的血脑屏障，而且新生儿处于脑发育的特殊阶段，神经元和轴突生长旺盛，这些发育特点决定了新生儿期是接受MSC移植治疗的适宜年龄。

MSCs在缺血缺氧环境中不仅氧供应不足，还面临血液中各种细胞因子的缺失的影响。缺血缺氧诱导MSCs凋亡过程涉及线粒体的完整性和功能的变化，且该过程并不依赖p53和capase-8，凋亡过程中caspase-3mRNA表达增高和时间相关，并与凋亡细胞数成正相关。某些微小RNA的表达在凋亡过程中被抑制，如miR21、miR23a和miR-210在缺血缺氧环境中表达下调，并伴有MSCs凋亡增加。目前已知肿瘤抑制基因CDPD4、磷酸酶、张力蛋白同源物(PTEN)和FasL是miR21的靶基因，Fas基因是miR-23a潜在的靶基因，miR210可诱导MSCs在缺血缺氧环境中进行糖酵解以维持细胞生存，并抑制FLASH/caspase-8相关蛋白2(FLASH/casp8ap2)的表达，从而保护MSCs，但不保护线粒体。I型纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogenactivatorinhibitor-1，PAI-1)通过直接影响MSCs与周围基质结合的密合性来抑制MSCs在缺血缺氧环境中的存活。

CN201610311226.2公开了一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞及制备方法及应用，制备方法为：1)扩增人间充质干细胞；2)通过RNA干扰技术抑制人间充质干细胞中的ESE-3基因，所述ESE-3基因如SEQ ID NO:1所示，得到耐缺血缺氧的人间充质干细胞。实验证明，通过抑制人间充质干细胞的ESE-3基因的表达，能提高间充质干细胞在缺血缺氧环境的生存能力，可以减少在缺血缺氧状态导致的死亡。但是该发明针对的是特异性的胎盘间充质干细胞，并不涉及其他的间充质干细胞。

发明人前期在研究了miR-378对缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞生长增殖、细胞凋亡等生物学行为的影响。研究结果提示miR-378可促进缺血缺氧后骨髓间充质干细胞的生长增殖并抑制其在缺血缺氧条件下的细胞凋亡，同时可提高其促血管生成的能力。

但是现有技术中针对其他的因子对于缺血缺氧条件下对间充质干细胞生长增殖、细胞凋亡等生物学行为的影响研究还不足。

发明内容

本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种耐受缺血缺氧条件的滑膜间充质干细胞的制备方法及其制备得到的间充质干细胞。

一方面，本发明提供一种筛选滑膜间充质干细胞耐受缺血缺氧条件的基因的方法，其通过将滑膜间充质干细胞进行缺血缺氧条件诱导压力筛选，获得了相应的耐受性的干细胞，通过蛋白谱分析，质谱鉴定，筛选得到了特异性高表达二个蛋白，经鉴定，即为缺血缺氧耐受型蛋白，其中一个蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

另外一方面，本发明提供一种构建转基因滑膜间充质干细胞的方法，根据鉴定的蛋白序列，获得了相应的编码核苷酸序列，通过在基因二端分别添加了酶切位点，将pcDNA3.1质粒及基因分别用进行双酶切。产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收DNA。将双酶切后回收产物在T4 DNA连接酶的作用下，获得表达质粒。将所述质粒转染到干细胞，通过鉴定，阳性细胞株即为获得的转基因的干细胞。

进一步的，其中转基因的人滑膜间充质干细胞制备过程中，使用的转染方法中使用了亚精胺，提高了转染效果。

再一方面，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白在制备缺血缺氧耐受性转基因滑膜间充质干细胞中的用途。

另外，本发明还提供一种人滑膜间充质干细胞的制备方法，包括将滑膜组织移入无菌操作台，PBS冲洗，剪除脂肪和部分***，分离出平滑光亮的滑膜组织。用无菌眼科剪将滑膜剪成碎块，将碎片移入离心管，依次用胰蛋白酶和胶原酶P在CO₂培养箱中消化。消化结束后，经过滤，离心弃去上清液。重复3次，除去含胶原酶的上清液，重悬细胞并计数。细胞平铺于25cm²培养瓶中，在37℃、体积分数为5％的CO₂条件下，在基础培养基中培养，24h后换液，除去未贴壁细胞，单层培养7-14d。连续观察细胞克隆的生长和形态学特征，挑选合适的细胞继续扩增培养，以此作为原代滑膜间充质干细胞。细胞生长至亚融合状态时，胰蛋白酶消化，传代接种于培养皿，每3日更换培养基。第3代细胞形状为梭形的细胞即人滑膜间充质干细胞。

最后，本发明还提供了所属的转基因滑膜间充质干细胞在制备用于关节修复的药物中的用途。

有益效果

本发明通过分离人滑膜间充质干细胞，将所述细胞在缺氧缺血条件下进行诱导，通过蛋白谱表达分析，质谱坚定得到了二个高特异性差异表达的靶标蛋白，经过鉴定所述蛋白能够提高转基因的滑膜间充质干细胞的缺氧和缺血耐受性，能够较好的降低所述干细胞在缺氧缺血条件下的凋亡，可以用于缺氧和缺血环境下的关节修复中的用途，具有加好的应用前景。

附图说明

图1 pcDNA3.1质粒多克隆位点图谱

图2 PCR鉴定结果图

图3蛋白表达水平结果图

图4缺血缺氧条件对转基因干细胞增殖效果图

图5转基因的干细胞抗凋亡效果图

图6转基因的干细胞促血管形成结果图

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。

实施例1人滑膜间充质干细胞的获得和分离培养

将滑膜组织移入无菌操作台，PBS冲洗3次，剪除脂肪和部分***，分离出平滑光亮的滑膜组织。用无菌眼科剪将滑膜剪成1.0-2.0mm³碎块，将碎片移入15ml的离心管，依次用0.1％的胰蛋白酶(30min)和0.1％胶原酶P(2h)在37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中消化。消化结束后，经120目钢网过滤，1000r/min离心10min弃去上清液。重复3次，除去含胶原酶的上清液，重悬细胞并计数。以1×10⁴个有核细胞平铺于25cm²培养瓶中，在37℃、体积分数为5％的CO₂条件下，在基础培养基(HG-DMEM、体积分数10％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)中培养，24h后换液，除去未贴壁细胞，单层培养7-14d。连续观察细胞克隆的生长和形态学特征，挑选合适的细胞继续扩增培养，以此作为原代滑膜间充质干细胞。细胞生长至亚融合状态时，2.5g/L胰蛋白酶消化，1:3传代接种于培养皿，每3日更换培养基。第3代细胞形状为梭形的细胞即人滑膜间充质干细胞。具体的细胞表面抗原鉴定结果如下表1所示。

表1流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况

抗原	表达情况	表达值(％)
			CD90	+	99.33±0.52
CD44	+	99.64±0.27
			CD105	+	99.80±0.11
CD106	+	99.55±0.23
			CD34	-	8.23±1.57
CD45	-	5.78±1.71
			CD14	-	6.02±0.98
CD71	-	7.44±0.56

流式细胞仪对滑膜间充质干细胞的鉴定结果显示：同一表面分子在细胞群中的表达一致率在99％以上。其中CD44、CD106、CD105、CD90呈阳性表达(阳性率＞99.9％，表1)，CD34、CD45、CD14、CD71呈阴性表达，符合滑膜间充质干细胞的特性，说明分离成功。

实施例2缺血缺氧滑膜间充质干细胞的制备

诱导组：取培养得到的生长活性较好的同代人滑膜间充质干细胞，移入37℃、95％N₂、5％CO₂厌氧培养箱内，无血清培养5h，取活性稍好的细胞，在37℃、体积分数为5％的CO₂条件下，在基础培养基(HG-DMEM、体积分数10％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)中培养，24h后换液，除去未贴壁细胞，单层培养7d；取1×10⁴个细胞，移入37℃、95％N₂、5％CO₂厌氧培养箱内，无血清培养10h。收集存活的细胞，进行实验。

对照组：人滑膜间充质干细胞常规培养，即未作缺血缺氧处理，培养总时长相同。

取相同细胞数量的诱导组和实验组的细胞，经丙酮沉淀法研磨后，按每1mg样品加入10ul裂解液[7mol/L尿素、2mol/L硫脲、40mMDTT、4(w/v)CHAPS、2％(v/v)IPG buffer(pH3-10)、1mmol/L PMSF-]，室温放置4h后，去除不容物质，经2D-Quant Kit法蛋白定量，立即进行电泳。双向凝胶电泳：1mg蛋白，加入水化液(8mol/L尿素、2％CHAPS、2％IPG缓冲液、0.002％溴酚蓝，-20℃保存，使用前加入7mg DTT/2.5m1)至总体积450ul，离心10min，10000×g，4℃，取上清进行一向等电聚焦。等电聚焦程序：30V水化12h，300V一步升压，900Vh；600V梯度升压，1350Vh；1000V梯度升压，2400Vh；8 000V梯度升压，13500Vh；8000V一步升压，56000Vh。在含20mmol/L DTT和100mmol/L碘乙酰胺的平衡液(115mol/L Tris-HCl pH8.8、30％甘油、6mol/L尿素、20g/LSDS、痕量溴酚蓝)中平衡2次，每次15min。用12.5％SDS-PAGE凝胶行垂直电泳后进行胶体考马斯亮蓝染色。扫描染色凝胶，获取图像，用ImageMaster2D platinum 6.0图像分析软件对图像进行点检测、匹配、比较差异等分析。为保证研究的准确性，每个样品的双向电泳过程重复3次。采用相对体积差大于2.0倍定义为差异表达蛋白点，共选取差异蛋白点27个，送去质谱分析。将选取的明显差异的蛋白质点，切取胶粒，冻干，加入胰蛋白酶溶液15ng/ul，4℃孵育1h，37℃水浴酶解16h后分别加5％TFA水溶液37℃水浴1h，2.5％TFA/50％ACN 37℃水浴1h提取酶解肽段，提取液合并，冻干。冻干粉溶于10u1，0.1％的三氟乙酸中，取0.5ul点靶，取0.5ul基质覆盖在样品点上，待干后，应用ABI4800蛋白质组分析仪和MALDI-TOF/TOF质谱分析仪进行质谱鉴定。

质谱分析结果使用GPS和MASCOT在SwissProt中查询，27个差异蛋白检索鉴定得到蛋白12个蛋白质(有4个蛋白点鉴定结果为同一个蛋白)，其中差异最显著的二个蛋白点序列如下，初步确定这二个蛋白与细胞的氧化应激以及逆境应激有关，预期这二个蛋白具有较好的调节干细胞耐低氧耐无血清环境，具体见下表2所示。

表2双向电泳和MALDI-TOF/TOF质谱鉴定出的差异表达最大的二组蛋白

下面对上述两个蛋白中的Epsin蛋白的具体作用做进一步实验研究：

实施例3转基因干细胞的制备

1、基因的获得及质粒构建

根据实施例2鉴定的Epsin蛋白序列如SEQ ID NO：1所示，获得了相应的编码核苷酸序列，具体如SEQ ID NO：2所示。通过全基因序列合成的方法，并且在基因二端分别添加了酶切位点：BamH1和XbaI(上海生工合成)。

将pcDNA3.1质粒(多克隆位点图谱如图1所示)以及Epsin基因分别用BamH1和XbaI进行双酶切。产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收DNA。将双酶切后回收产物在T4DNA连接酶的作用下，获得Epsin表达质粒pcDNA3.1-Epsin。取适量DH5α感受态细胞,向其中加入9μl连接反应物后的Epsin表达质粒pcDNA3.1-Epsin,混匀,冰浴30min；放入42℃水浴，热休克2min；立即转移到冰水浴中冷却1min；冷却后向其中加入400μl LB液体培养液，37℃,180rpm,震荡培养1h，使其活化。涂布于含X-gal,IPT,Amp的LB固体培养基上，置于37℃生化培养箱15min，待菌液吸收完全后，倒置培养20h。挑取白色菌落接种于5ml LB液体培养基(含氨苄抗性)中，过夜培养，根据质粒小提取试剂盒提取质粒，采用PCR鉴定显示，可以观察到扩增出的1500bp左右的特异性目的条带(如图2)，与实验前预期结果一致。说明质粒pcDNA3.1-Epsin构建成功。

2、pcDNA3.1-Epsin的转染及表达

取实施例1制备得到的干细胞制备成单细胞悬液。将4μL Lipofectamine 2000转染试剂加入75μL不含血清含有干细胞的新鲜RPMI1640培养基中混匀，同时将1μg质粒pcDNA3.1-Epsin加入150μL不含血清的新鲜RPMI1640培养基中孵育5min后与前述制备的含有转染试剂的干细胞溶液两溶液混匀并保证其中含有30μmol/L亚精胺，培养5h后收集细胞，换成新鲜含5％胎牛血清、10％小牛血清的RPMI1640培养基，每室300μL，再培养48h，通过pcDNA3.1质粒特异性的测序引物5’测序引物ctagagaacccactgcttac和3’测序引物tagaaggcacagtcgagg进行鉴定，选择阳性细胞株即为获得的转基因的干细胞，扩增备用。

实施例4转基因滑膜间充质干细胞的Epsin蛋白表达水平检测

按照实施例3的方法制备的转基因滑膜间充质干细胞，同时以pc-DNA3.1作为空白对照，转染72h后提取细胞蛋白裂解液进行Western blot检测，结果显示转染了Epsin质粒的滑膜间充质干细胞中Epsin的蛋白水平较对照组明显增加，说明Epsin的蛋白水平成功地过表达，如图3所示。

实施例5缺血缺氧条件对转基因干细胞增殖影响

将细胞分为未转基因间充质干细胞组和转基因间充质干细胞组，分别于正常条件(完全培养基，体积分数为20％O₂)和缺血缺氧条件下培养24h。缺血缺氧处理：缺血缺氧前1d对细胞株进行传代，接种第3代细胞于25cm²培养瓶培养至90％-95％铺满后，更换为无血清低糖培养基，置于体积分数为1％O₂、5％CO₂、94％N₂培养箱中缺血缺氧培养24h，然后收集细胞及培养上清以备后续实验用。缺血缺氧培养24h后，消化细胞后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×10⁸L^-1，接种到96孔板，每孔100μL，即每孔细胞为1×10⁴个，待细胞贴壁后，收集各个时间点的细胞(0，24，48，72h)加入cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂，比例为1/10，即100μL培养液加入10μL检测液。孵育4h后，multiscan MK3酶标仪读板，MTS检测读取A490值。结果如图4检测结果显示，转基因间充质干细胞在缺血缺氧后24，48，72h的A490值均高于未转基因的滑膜间充质干细胞组，也比在正常培养条件的间充质干细胞的值要高，特别是在72h时，A490达到了2.4±0.07，比对照显著提高。这也说明转基因的滑膜间充质干细胞具有更好的逆境耐受性以及细胞增殖活性。

实施例6TUNEL法检测细胞凋亡情况

将转基因和未转基因的滑膜间充质干细胞分别缺血缺氧培养24h，取出爬片24h后采用TUNEL法检测细胞凋亡情况。培养好的细胞用PBS洗去培养液，体积分数为4％甲醛溶液4℃固定25min；PBS洗涤5min，2次；0.2％Triton X-100室温孵育5min；PBS洗涤5min，2次；加100μL Equilibration Buffer室温平衡10min；加入50μL TdT工作液37℃湿盒避光孵育60min。在高倍镜下随机选择5个视野进行凋亡细胞计数，每个实验组计数至少重复3遍。TUNEL检测结果如图5所示，在缺血缺氧条件下，转基因的干细胞的凋亡比例为0.025±0.01，而未转基因的干细胞的凋亡比例为0.12±0.005，差异有显著性意义(P<0.01，图5)，这充分的说明，转基因的干细胞还具有抗凋亡的作用。

实施例7血管形成实验

人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)培养与传代：HUVECs中加入内皮细胞生长因子(Endothelial Cell Growth Supplement，ECGs)的内皮细胞培养液(Endothelial Cell Medium，ECM)。

Matrigel培养下内皮细胞管腔形成实验：①Matrigel保存于-20℃，经4℃过夜溶解呈液态，所有相关器械经-20℃降温，4℃预冷，Matrigel包被96孔板需于冰上完成：96孔板内每孔加入60μl液态Matrigel包被，置于37℃孵化30min使Matrigel成胶；②取转基因的第3代滑膜间充质干细胞以及未转基因的滑膜间充质干细胞(对照)(第3代)及HUVECs分别消化后1100转/min，5min离心沉淀，分别取实验所需的培养液重悬，计数，调整细胞密度。

实验分组：共分为3组。(1)转基因共培养组：在Matrigel包被96孔板内加入20000个HUVECs，并加入5000个转基因的第3代滑膜间充质干细胞，使得HUVECs目标细胞群为4:1，加入200μl ECM(含1％FBS)，于37℃温育；

(2)未转基因共培养组：在Matrigel包被96孔板内加入20000个HUVECs，并加入5000个未转基因的第3代滑膜间充质干细胞，使得HUVECs目标细胞群为4:1，加入200μl ECM(含1％FBS)，于37℃温育；

(3)阴性对照组：Matrigel包被96孔板加入25000个HUVECs，加入200μl DMEM(含10％FBS)。每组分别设置3处复孔。

三组实验分别在缺氧条件下96孔板温育16h后置于研究级倒置荧光显微镜下100倍数观察，对每孔随机选择视野拍照，有细胞视野入选实验结果。根据本领域常规的Matrigel培养下内皮细胞管腔形成实验鉴定方法进行结果鉴定，结果如图6所示。

人脐静脉内皮细胞分别与二组间充质干细胞培养液上清共培养后，在matrigel中均形成血管腔样结构。与未转基因的滑膜间充质干细胞组相比较，在正常条件和缺氧条件下，转基因的滑膜间充质干细胞组对人脐静脉内皮细胞形成血管腔样结构有更加明显的促进作用，在缺氧条件下转基因干细胞对应的管腔样结构数量为(26.0±2.0)个较未转基因的干细胞对应的管腔样结构数量显著增多。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和***的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。

序列表

<110> 北京广未生物科技有限公司

<120> 提高滑膜间充质干细胞逆境耐受性的方法及其试剂

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ala Ala Pro Pro Leu Arg Asp Arg Leu Ser Phe Leu His Arg

1 5 10 15

Leu Pro Ile Leu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Asp Asp Val Pro Cys Pro

20 25 30

Gly Tyr Leu Phe Glu Glu Ile Ala Lys Ile Ser His Glu Ser Pro Gly

35 40 45

Ser Ser Gln Cys Leu Leu Glu Tyr Leu Leu Ser Arg Leu His Ser Ser

50 55 60

Ser Gly His Gly Lys Leu Lys Val Leu Lys Ile Leu Leu Tyr Leu Cys

65 70 75 80

Ser His Gly Ser Ser Phe Phe Leu Leu Ile Leu Lys Arg Asn Ser Ala

85 90 95

Phe Ile Gln Glu Ala Ala Ala Phe Ala Gly Pro Pro Asp Pro Leu His

100 105 110

Gly Asn Ser Leu Tyr Gln Lys Val Arg Ala Ala Ala Gln Asp Leu Gly

115 120 125

Ser Thr Leu Phe Ser Asp Thr Val Leu Pro Leu Ala Pro Ser Gln Pro

130 135 140

Leu Gly Thr Pro Pro Ala Thr Gly Met Gly Ser Gln Ala Arg Pro His

145 150 155 160

Ser Thr Leu Gln Gly Phe Gly Tyr Ser Lys Glu His Gly Arg Thr Ala

165 170 175

Val Arg His Gln Pro Gly Gln Ala Gly Gly Gly Trp Asp Glu Leu Asp

180 185 190

Ser Gly Pro Ser Ser Gln Asn Ser Ser Gln Asn Ser Asp Leu Ser Arg

195 200 205

Val Ser Asp Ser Gly Ser His Ser Gly Ser Asp Ser His Ser Gly Ala

210 215 220

Ser Arg Glu Pro Gly Asp Leu Ala Glu Arg Val Glu Val Val Ala Leu

225 230 235 240

Ser Asp Cys Gln Gln Glu Leu Ser Leu Val Arg Thr Val Thr Arg Gly

245 250 255

Pro Arg Ala Phe Leu Ser Arg Glu Glu Ala Gln His Phe Ile Lys Ala

260 265 270

Cys Gly Leu Leu Asn Cys Glu Ala Val Leu Gln Leu Leu Thr Cys His

275 280 285

Leu Arg Gly Thr Ser Glu Cys Thr Gln Leu Arg Ala Leu Cys Ala Ile

290 295 300

Ala Ser Leu Gly Ser Ser Asp Leu Leu Pro Gln Glu His Ile Leu Leu

305 310 315 320

Arg Thr Arg Pro Trp Leu Gln Glu Leu Ser Met Gly Ser Pro Gly Pro

325 330 335

Val Thr Asn Lys Ala Thr Lys Ile Leu Arg His Phe Glu Ala Ser Cys

340 345 350

Gly Gln Leu Ser Pro Ala Arg Gly Thr Ser Ala Glu Pro Gly Pro Thr

355 360 365

Ala Ala Leu Pro Gly Pro Ser Asp Leu Leu Thr Asp Ala Val Pro Leu

370 375 380

Pro Gly Ser Gln Val Phe Leu Gln Pro Leu Ser Ser Thr Pro Val Ser

385 390 395 400

Ser Arg Ser Pro Ala Pro Ser Ser Gly Met Pro Ser Ser Pro Val Pro

405 410 415

Thr Pro Pro Pro Asp Ala Ser Pro Ile Pro Ala Pro Gly Asp Pro Ser

420 425 430

Glu Ala Glu Ala Arg Leu Ala Glu Ser Arg Arg Trp Arg Pro Glu Arg

435 440 445

Ile Pro Gly Gly Thr Asp Ser Pro Lys Arg Gly Pro Ser Ser Cys Ala

450 455 460

Trp Ser Arg Asp Ser Leu Phe Ala Gly Met Glu Leu Val Ala Cys Pro

465 470 475 480

Arg Leu Val Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Glu Ser Cys Pro Asp Ala

485 490 495

Pro Arg Ala Pro Gln Thr Ser Ser Gln Arg Thr Ala Ala Lys Glu Pro

500 505 510

Pro Gly Ser Glu Pro Ser Ala Phe Ala Phe Leu Asn Ala

515 520 525

<210> 2

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcagctg ccccacccct gagggataga ctgtcttttt tgcataggct cccaatcttg 60

cttaaaggta ccagtgacga tgatgtgcct tgccctgggt atctctttga ggagattgcg 120

aagatctctc acgagagtcc cgggagctca caatgtctgc ttgagtattt gttgtcacgc 180

ctgcacagct cttccggaca cggaaaactc aaagtgctta agattcttct gtatttgtgt 240

agtcacggaa gtagcttctt cctgttgatt ctgaagcgca atagcgcctt catccaagag 300

gcagcagctt ttgcaggacc acccgacccc ttgcatggca attcactcta ccagaaagtc 360

agggctgcgg ctcaggattt gggatcaact ctgttctccg acaccgtgct tcctctggct 420

cctagccagc cacttggcac acccccagca accggaatgg gtagccaagc aagaccacac 480

tctacgctgc aggggtttgg gtactccaag gagcatggca ggactgctgt acgacatcaa 540

cctggtcaag ccgggggtgg atgggatgag ctggattccg gcccctcctc acagaacagc 600

tctcagaaca gcgacctcag cagagtgagt gattctgggt ctcactcagg atctgactca 660

cacagtggag cttcccgaga gccaggtgat ctcgcggaaa gggtggaagt tgtggccttg 720

agcgactgtc aacaagaact gtctctcgtc agaactgtga ctcgcggacc acgagcattc 780

ctctccagag aggaggccca gcattttatc aaagcttgcg gcctcctgaa ctgtgaagcg 840

gttctgcagc tgctcacttg tcacctgcgg ggcacatccg aatgcacaca gctgcgcgcc 900

ttgtgtgcca tcgcttctct gggttcaagc gaccttctgc cccaggaaca catattgctg 960

aggacccgac cttggttgca ggaactgtca atggggtctc ccgggccagt tactaacaaa 1020

gctacaaaga tactgcggca ttttgaggct agctgtggac agctgtctcc tgctagagga 1080

accagtgctg aacctggtcc aacagccgca ttgcctggac catcagacct gctgacggat 1140

gctgtgcctc tcccgggaag ccaagtgttc cttcagcccc ttagttcaac cccagtgagt 1200

agccgctctc cagctccctc ttctggcatg ccttccagcc ctgttccaac gcctccacca 1260

gatgccagcc caattccagc acctggtgac ccttccgagg ctgaagcaag attggctgag 1320

tccagacgat ggcgaccaga acgaattcct ggcggaaccg attctccaaa gcggggacca 1380

tctagctgcg catggagccg agactccttg ttcgcaggta tggaactggt ggcttgccca 1440

agattggtgg gagctggagc agcagcagga gagtcttgtc cagatgctcc cagggctcca 1500

cagacttcta gccagcggac agctgcaaag gagccacctg gctctgagcc aagcgccttt 1560

gcgttcctga acgca 1575

Claims

1.如SEQ ID NO：1所示的Epsin蛋白在提高滑膜间充质干细胞耐受缺氧缺血逆境中的用途。

2.一种提高滑膜间充质干细胞耐受缺氧缺血逆境的方法，其特征在于：向滑膜间充质干细胞中转入外源基因，所述外源基因为SEQ ID NO：1所示的Epsin蛋白对应的编码基因。

3.如权利要求2所述的方法，其特在于：所述方法中使用的转基因载体是本领域常用的哺乳动物表达载体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述载体为pcDNA3.1。

5.如权利要求4所述的方法，其中转基因的人滑膜间充质干细胞制备过程中，使用的转染方法中使用了亚精胺，提高转染效果。