CN111713487A - 一种试剂红细胞保存体系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种试剂红细胞保存体系及其制备方法，所述的试剂红细胞保存体系的组成和含量为：枸橼酸‑1水0.400g/L；枸橼酸三钠‑2水6.100g/L；葡萄糖20.500g/L；肌苷0.350g/L；氯霉素0.143g/L；硫酸新霉素0.143g/L；NaCl 4.200g/L；腺嘌呤0.500g/L；甘露醇4.000g/L；磷酸二氢钾3.000g/L。经实验验证使用本发明的试剂红细胞保存体系在2‑8℃条件储存浓度为3％的试剂红细胞可有效保存90天，15％的试剂红细胞可有效保存60天。其优点表现在：使用该保存体系得到的试剂红细胞有效期限长，外观正常红细胞形态比例高、抗原稳定性好。

Description

一种试剂红细胞保存体系及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学技术领域，具体地说，是一种试剂红细胞保存体系及其制备方法。

背景技术

红细胞血型抗原通常是单次或多次穿膜的糖蛋白。在表达方式上，血型抗原蛋白又可 分为由核基因直接编码表达蛋白与吸附蛋白；在与细胞膜组分关系上，这些蛋白有些是构 成细胞骨架的锚定蛋白，有些是通过与锚定蛋白相互作用较稳定结合于膜上，有些仅依靠 与磷脂层相互作用结合于膜上。已有研究表明，红细胞膜及膜蛋白的结构和稳定性会随保 存时间的增加而发生改变，输血实验室通常用试剂红细胞(如：ABO反定型细胞、抗体筛 选细胞、谱红细胞、IgG致敏红细胞、酶处理细胞等)鉴定样本血浆/血清/放散液中的抗体。 已有研究表明，红细胞膜及膜蛋白的结构和稳定性会随保存时间的增加而发生改变，试剂 细胞一般在2-8℃储存，保存时间约2-3个月，如果上述红细胞血型抗原的结构和稳定性的 改变导致了红细胞血型抗原性质的改变，保存后期谱细胞抗原性的改变将影响抗体鉴定结 果。最终可能导致受血者抗体漏检，影响红细胞输注效果，甚至引发免疫性溶血反应。

与输注红细胞保存液原理相似试剂红细胞保存液需要适宜的渗透压力，以维持红细胞 膜正常结构。此外，由于在保存期间仍需要进行生理代谢，而这种代谢需要生理环境作为 基础并以能量物质为底物。因此，试剂红细胞保存液通常采用无机盐离子提供晶体渗透压， 以不能自由通过细胞膜的多糖分子提供胶体渗透压，以葡糖糖为能量代谢底物。

试剂红细胞评价标准一方面是通过溶血率计算，评估其在保存期间稳定性，溶血率越 高，证明保存期间红细胞破碎越严重。另一方面，抗原的稳定性标志着试剂红细胞有效性 的程度，因此通常用标定过的抗体对试剂红细胞表面抗原进行检测，其方法为按检测时间 点，通过同一标定抗体对试剂红细胞进行检测，通过其凝集强度是否下降判断抗原性是否 稳定；同时由于不同保存液配方不同，部分成分可能会造成假阳性凝集，在采用抗体对试 剂细胞进行检测时，凝集强度是否会有高于新鲜细胞也是重要考量标准。此外，随着自动 化检测的推进，凝胶卡自动化检测方法逐渐增多，而保存期间细胞形态变化(如皱缩、出 棘)，将影响红细胞通过凝胶微孔的速度，最终影响凝胶卡判读结果，因此，细胞形态也应作为试剂红细胞评价的指标。

本发明依据上述原理及评估方案，进行试剂保存液配制及保存效果评价，结果验证在2-8℃条件储存浓度为3％的试剂红细胞可有效保存90天，15％的试剂红细胞可有效保存60 天。

关于本发明一种试剂红细胞保存体系及其制备方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是，提供一种试剂红细胞保存体系及其用途。

本发明的另一的目的是，提供一种试剂红细胞及其制备方法。

为实现上述一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种试剂红细胞保存体系，所述的试剂红细胞保存体系的组成和含量如下：

优选地，所述的试剂红细胞保存体系的组成和含量如下：

进一步地，如上所述的保存体系在制备保存试剂红细胞的试剂盒中的应用。

一种保存试剂红细胞的试剂盒，所述的试剂盒包括如上所述的保存体系。

为实现上述另一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种试剂红细胞，由上所述的保存体系和红细胞样本组成。

优选地，所述的红细胞样本来自经过了洗涤的原料血。

更优选地，保存15％试剂红细胞有效期不少于60天，保存3％试剂红细胞有效期不少 于90天。

进一步地，所述的试剂红细胞的制备方法，包括步骤：配制保存体系和加入红细胞， 其中所加入的红细胞事先经过了洗涤，用于去除血液中部分非红细胞成分。

优选地，所述的试剂红细胞的制备方法还包括步骤：对试剂红细胞保存的效果评价。

更优选地，所述的效果评价内容包括：对试剂红细胞保存外观评价和对试剂红细胞抗 原稳定性评价。

本发明优点在于：

本发明优选各组分及其浓度，整个体系各种成分协同作用，葡萄糖主要负责为保存期 间红细胞代谢提供能量，甘露醇提供胶体渗透压，其余盐类缓冲体系主要负责维持晶体渗 透压及缓冲保存期间代谢产物造成的pH波动。各组分相互牵制、协同作用，达到保持红细 胞活力并延长细胞保存期的目的，且实验结果表明使用本发明的保存体系得到的外观正常 红细胞形态比例高、抗原稳定性好，可很好的用于受血者抗体鉴定，应用前景广。

附图说明

附图1是不同保存液红细胞保存平行实验，A：4组第0天3％与15％三样品；B：I组 0天3％与15％三样品；C：R组0天3％与15％三样品；D：第30天3％组外观；E：第30 天15％组外观；F：第60天3％组外观；G：第60天15％组外观；H：第90天3％组外观； I：第90天15％组外观；注：D、E、F、G、H、I从左至右依次为4组3管、R组3管、I 组3管。

附图2是保存终末期红细胞形态，A：4号保存液3％保存浓度90天；B：Immucor保 存液3％保存浓度90天；C：上海血液生物红细胞稀释液3％保存浓度90天；D：4号保存 液15％保存浓度60天；E：Immucor保存液15％保存浓度60天；F：上海血液生物红细胞 稀释液15％保存浓度60天。

附图3是不同浓度各组溶血率比较，其中，A：3％浓度各组溶血率比较；B：15％浓度各组溶血率比较。

附图4是不同浓度各组PS外翻比较，其中，A：3％浓度各组PS外翻比较；B：15％浓度各组PS外翻比较。

附图5是梯度保存细胞实验结果图，其中，A：3％细胞浓度保存7天；B：3％细胞浓度保存75天；C：15％细胞浓度保存7天；D：15％细胞浓度保存75天；注：每图中从左至右 各支稀释度为0.7；0.8；0.9；1；1.2；1.5X。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。

实施例1效果实验

红细胞是一种特殊的细胞，成熟红细胞不具细胞核，致使其代谢全部依靠自身糖酵解 供能，且随着保存时间增加，能量物质的代谢会导致红细胞膜结构发生变化。这种膜结构 的变化，一方面会导致红细胞膜通透性改变，细胞形态变化；另一方面也会导致膜蛋白空 间构象改变，导致抗原性改变。因此，本实施例旨在对细胞膜结构及抗原性的评价客观反 映试剂红细胞保存液对试剂红细胞保存的效果。

1实验方法

1.1试剂红细胞保存液(试剂红细胞保存液，下简称4液)，其配置方法见表1。

表1、试剂红细胞保存液组成

1.2检测

采用单人份AB型红细胞3份，分别使用4液(后文用4代表)；Immucor试剂红细胞 保存液Red Blood Cell(RBC)storage Solution，

(下以I代表)LOT RR077， 有效期至2020-02-11；国内商品化血型分析用稀释液(下以R代表)，上海血液生物医药 有限公司(SHPBC)，产品批号20196201，有效期至20210422，设置3％及15％两浓度梯 度进行试验。分别于2-8℃保存第0、30、60、90天对相关评价指标进行检测。

检测方法如下：

保存外观通过拍照记录，抗原稳定性采用标化后的抗体(标化至与抗原阳性红细胞反 应中等凝集强度，见表2)对ABO血型***、Rh血型***、MN血型***、Kidd血型系 统、Duffy血型***主要血型抗原进行检测，检测采用Bio-rad凝胶柱法对凝集强度进行记 录。红细胞外观采用40倍倒置显微镜(Biotekcytation)拍照记录。上清溶血率使用BioAssaySystems公司血红蛋白检测试剂盒进行检测，方法依照试剂盒说明书进行。PS外翻检测采用公司的Annexin V-APC检测试剂盒检测。检测结果见效果评价部分。

表2、检测抗原所用试剂批次及标化稀释度

*溯源至WHO国际标准物质IgM抗A、抗B和抗D的冻干粉；

#上海血液生物医药有限公司SHPBC。

由于试剂红细胞的重要价值是通过其上具有的特异的血型抗原，对血清/血浆样本中的 抗体特异性进行鉴定。故试剂红细胞抗原稳定性对整个血清学实验结果有决定性的影响。 因此，我们将试剂红细胞抗原稳定性作为最重要的评价依据。由于血清学实验较难量化， 本实验中采用打分制对抗原稳定性进行评价。其主要方法是：使用标化的一系列抗体试剂 (见表2)，与不同保存时间的红细胞反应。通过标准化的检测条件，读取反应强度。反应 强度用阴性、±～4+表示，并对不同凝集加号赋值。红细胞在保存期间如果特定抗原减弱， 则凝集不断减弱，通过凝集加号转化为相应数值以便于相互比对。

使用国内外商品化红细胞保存液作为对照，分别将红细胞浓度调整到3％和15％两个浓 度，每一种保存液的每一个浓度均设置3复管，分别标识为“1”、“2”、“3”，三管中 分别加入不同个体来源的新鲜红细胞红细胞。分别在4℃保存“0天”、“30天”、“60 天”、“90”天进行检测。特定抗体分别与3复管红细胞反应，凝集强度转化为数值后取 平均值进行比较，平均值减少的量对应抗原减弱的程度。

为了定量估算红细胞保存液的效果，研究中使用了较为稳定可靠的微柱凝集卡方法对 各类抗原的保存进行检测。其中包括糖类抗原中比较有代表性的A、B、M、N；蛋白抗原中比较有代表性的D、c、e、Fya和Jka。所有抗体和保存红细胞反应，其强度均被标化至 1+至3+左右，并分装冻存。尽量使每一次检测所使用的抗体保持一致。对于凝集强度的判 断，由同一人按以下标准进行判断，并将判断结果转化为分值，以利于统计计算。

表3、红细胞血型抗原检测评估打分表

在统计中，先将不同保存液第0天与3例不同个体的红细胞与特定抗体反应所表现出 的凝集强度的平均值作为标准，保存期间该特定抗体与各组红细胞反应强度均减去该标准 值，作为保存期间红细胞抗原变化的度量。然后计算糖、蛋白类抗原分别在3％、15％浓度 下不同天数检测的平均值，由此进行T检验，判断不同类型抗体，在不同保存液中的保存 情况是否存在显著性差异。结果见下表4、表5。

2效果评价

2.1保存外观：

试剂红细胞保存外观，会直接影响到结果判读(血清学实验中，溶血亦作为阳性判读)， 故我们将红细胞保存外观这一直观指标作为首要的评价标准。由外观拍照记录可知：各组 起始时总体积与红细胞比例相同，因此外观溶血程度可直观表现其对红细胞保存的能力， 通过保存发现，3％实验组中，第60天I组出现轻微溶血；90天R组出现轻微溶血、I组出 现明显溶血，15％实验组中，第30天I组出现轻微溶血；第60天R组出现轻微溶血、I组 出现明显溶血；第90天4组出现轻微溶血、R组出现明显溶血、I组出现严重溶血，从实 验可知3％与15％保存浓度下，4组在各检测点溶血率略优于R组，明显优于I组(见图1)。

试剂红细胞随着保存时间的延长，会出现形变，而形变后的红细胞由于吸附能力的改 变，会影响血清学结果判读，尤其是凝胶卡结果判读。故我们将红细胞外观作为重要的评 价指标。通过比较我们发现：4液保存的红细胞形态方面，不论3％组或15％组，各个检测 节点，正常红细胞形态比例最高，说明其对红细胞保存效果优于其他两种保存液。见图2。

2.2试剂红细胞抗原稳定性：

表4、3％浓度保存红细胞血型抗原稳定性比较

注：*：具有统计学差异

表5、15％浓度保存红细胞血型抗原稳定性比较

使用成对T检验，专利配方在保存3％红细胞时，糖类抗原以及蛋白类抗原的保存明显 优于国产保养液，与国际知名公司保养液无显著性差异；在保存15％红细胞时，糖类抗原 以及蛋白类抗原的保存上与国产及国际知名公司保养液均无显著性差异。

2.3上清溶血率指标：

上清溶血率直接反应试剂红细胞样品中，发生溶解或因膜破坏造成通透性改变导致血 红蛋白外流的红细胞百分比，其原理为：(上清血红蛋白光吸收度–本底吸光度)/样本总血 红蛋白吸光度％＝溶解细胞/总体细胞％，为了量化细胞保存效果，我们将上清溶血率指标作 为试剂红细胞保存的重要参考标准。通过比较我们发现：3％保存实验中，第30天I组溶血 率显著高于4组(p＜0.05)，第90天I组、R组分别显著高于4组(p＜0.05)；15％组保存实验中，第60天溶血率I组显著高于4组(p＜0.05)，第90天I组、R组分别显著高于 4组(p＜0.05)(见图3)。

2.4试剂红细胞膜稳定性检测(PS外翻检测)

PS(磷脂酰丝氨酸)外翻，标志着试剂红细胞膜稳定性的下降，而这种下降势必造成 细胞溶血发生与非特异性吸附的产生，影响试剂细胞使用。故我们最后将试剂红细胞膜稳 定性作为保存效果的重要参考依据。通过使用荧光抗体进行流式细胞术检测，我们发现： 3％保存实验中，第30天I组PS外翻程度显著高于4组(p＜0.01)，第90天I组、R组分 别显著高于4组(p＜0.01)；15％组保存实验中，第60天I组PS外翻程度显著高于4组 (p＜0.05)，第90天I组、R组分别显著高于4组(p＜0.01)(见图4)。

实施例2浓度梯度试验

1实验方法

分别配制0.7；0.8；0.9；1；1.2；1.5X保存液(最佳浓度为1)，并进行3％细胞比例与15％细胞比例保存实验。选择第7天及3％与15％细胞计划保存时期中点75天为两个检测节点，评估梯度短期与长期对细胞的作用。

2结果

保存外观观察：从7天及75天的保存外观说明，1X保存液保存效果最佳，为最佳浓度(见图5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员， 在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本 发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种试剂红细胞保存体系，其特征在于，所述的试剂红细胞保存体系的组成和含量如下：

2.根据权利要求1所述的试剂红细胞保存体系，其特征在于，所述的试剂红细胞保存体系的组成和含量如下：

3.权利要求1-2任一所述的保存体系在制备保存试剂红细胞的试剂盒中的应用。

4.一种保存试剂红细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1-2任一所述的保存体系。

5.一种试剂红细胞，由权利要求1-2任一所述的保存体系和红细胞样本组成。

6.根据权利要求5所述的试剂红细胞，其特征在于，所述的红细胞样本来自经过了洗涤的原料血。

7.根据权利要求5所述的试剂红细胞，其特征在于，保存15％试剂红细胞有效期不少于60天，保存3％试剂红细胞有效期不少于90天。

8.权利要求5所述的试剂红细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：配制保存体系和加入红细胞，其中所加入的红细胞事先经过了洗涤，用于去除血液中部分非红细胞成分。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤：对试剂红细胞保存的效果评价。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述的效果评价内容包括：对试剂红细胞保存外观评价和对试剂红细胞抗原稳定性评价。

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