CN111712580A

CN111712580A - 用于扩增双链dna的方法和试剂盒

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Publication number: CN111712580A
Application number: CN201880087158.3A
Authority: CN
Inventors: 安赫尔·杰奎因·皮切尔·塞兰蒂斯; 贝蒂娜·布迪乌斯
Original assignee: 4 Beth Biology Ltd
Current assignee: 4 Beth Biology Ltd
Priority date: 2017-11-21
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2038-11-14
Also published as: SG11202004534RA; WO2019101596A1; US20200362403A1; JP2021503947A; US11920189B2; JP7026248B2; CN111712580B; EP3714064A1; AU2018371063A1

Abstract

本文公开了用于扩增双链DNA分子的装置和方法。用于扩增凋亡无细胞DNA(apoptotic cell‑free DNA)分子的方法可以包括对cfDNA分子进行末端修复和dA加尾，将单链发夹衔接子附接至末端修复的cfDNA分子的两端以产生加衔接子标签的单链共价闭合的DNA分子，以及通过使用具有链置换活性的DNA聚合酶，PrimPol酶和游离核苷酸的滚环扩增和多重置换扩增的组合来扩增加衔接子标签的单链共价闭合的DNA分子。

Description

用于扩增双链DNA的方法和试剂盒

关于联邦资助的研究的声明

无。

相关申请的引用

本申请与2017年11月21日提交的美国临时申请62/589,074有关。

联合研究协议的各方名称

无。

序列表

本文随附。

背景

过去10年见证了癌症疾病理解以及靶向疗法开发方面的巨大进步。在过去的10年里，FDA和EMA批准了数量空前的新药用于癌症治疗¹。最著名的药物中的一些包括靶向EGFR(HER2)受体的用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗(赫赛汀)、靶向EGFR(HER1)受体的用于治疗结肠直肠腺癌的西妥昔单抗(爱必妥)、靶向Bcr-Abl融合蛋白的用于骨髓增生性紊乱和CML的伊马替尼(格列卫)、靶向若干种酪氨酸蛋白激酶的用于肝癌和肾癌的索拉非尼(多吉美(Nexavar))、经由抑制ALK-EML融合蛋白用于治疗非小细胞肺癌的克唑替尼(赛可瑞(Xalkori))或经由抑制Braf V600E突变激酶用于治疗黑素瘤的维罗非尼(Vemurafenib)(泽波拉夫(Zelboraf))。大量靶向疗法的可用性产生了对患者进行有效分子分析(profiling)的需求。

“液体活组织检查”是为了描述对患者的血液或其他体液(例如尿液或脑脊液(CSF))中的核酸进行的诊断程序而创造的术语^2,3,4。在多种疾病(癌症、心肌梗死、移植排斥)中通过凋亡或坏死而死亡的细胞从其片段化的基因组释放DNA到血流中。此外，可以在母亲的血液中检测到来自胎儿的DNA。一种特殊情况是外来体，其为30-100nm的微囊泡，其紧挨着DNA或RNA，还含有来自来源细胞(originating cell)的蛋白和脂质^5,6,7。血液中的这些核酸可以使用基于PCR的方法、下一代测序(NGS)或阵列技术来检测和分析。通过分析液体活组织检查(例如，从体液而不是从肿瘤团块获得的核酸)产生的数据显示了该方法的巨大潜力，该方法对医学诊断可能具有革命性的影响，可能与之相似的只有引入磁共振成像(MRI)的影响。对于液体活组织检查方法，看起来特别有希望的临床应用是通过分析来自母亲的血液来诊断胎儿的染色体异常(特别是三体性)(也被称为基于cfDNA的非侵入性产前筛查(NIPT))^{8,9,10,11,12,13,14,15}，诊断和监测移植患者的移植物排斥(可以在患者的血液中检测到来自受宿主免疫细胞攻击的供体组织的DNA)^{16,17,18,19,20}，以及诊断和监测癌症疾病^{2,4,21,22,23,24,25}。迄今为止数据有限的领域是伴随组织坏死或凋亡的其他疾病，诸如心肌梗死²⁶。“液体活组织检查”的使用在检测胎儿染色体异常(特别是三体性)方面是最领先的，其中基因组诊断正在挑战通过超声测量颈后透明层厚度和三联筛查(AFP、hCG和雌三醇)的常规组合¹¹。然而，具有最高医学影响的有前景的领域显然是肿瘤学，其中在过去几年期间产生的数据显示，关键的癌症突变(反映常规肿瘤活组织检查中存在的那些)原则上可以通过液体活组织检查来检测^3,27,28。

液体活组织检查可能优于标准活组织检查，因为肿瘤的所有部分和所有转移灶都可能被取样。最近的数据表明，在大多数情况下，对循环肿瘤DNA的分析忠实地反映了在所有已知的癌症转移灶中发现的突变，或者甚至优于这种方法(例如，如果标准活组织检查失败则发现突变，或者比标准组织活组织检查显示出更多突变)²⁹，表明对循环肿瘤DNA测序可以给出比标准活组织检查更完整的全身性癌症疾病的分子图。此外，获取病人的血液也不成问题。可以容易地进行连续液体活组织检查以监测癌症治疗效果或筛查癌症复发，条件是对应的分析所需的血液体积较小(例如几毫升)。对于在非常早期的阶段检测癌症，例如在治疗性外科手术后癌症疾病复发的情况下，或者在基于群体的筛查程序中，该方法的灵敏度可能更佳。如果液体活组织检查能够在预防性筛查程序中改善肿瘤早期检测，将导致癌症疾病治愈率更高，特别是针对其的早期检测和预防性筛查的手段有限或不存在的肿瘤类型。

对癌症患者的液体活组织检查方法的若干研究揭示，该方法的成功率与患者在液体活组织检查时的肿瘤质量负荷和肿瘤阶段相关，并且在肿瘤质量低的情况下，该方法并不非常成功，因为没有太多的肿瘤细胞死亡并且将DNA释放到血液中^27,30。此外，该方法在一些肿瘤类型(例如结肠癌)中效果良好，但在其他肿瘤类型(例如胶质母细胞瘤)中效果不佳，这可能也是由于灵敏度问题²⁷。在其中需要通过全外显子组或全基因组测序而不是非常灵敏的基于PCR的方法诸如BEAMing来分析cfDNA的情况下，由于cfDNA的量非常少造成的限制可能更关系重大³¹。外显子组测序优于基于靶向PCR的方法，因为实际上可以分析整个基于外显子组的单核苷酸突变概况(landscape)，与靶向方法仅能评估少数且事先已知的突变相对。因此，外显子组测序对于以高灵敏度早期检测癌症和连续分析治疗后肿瘤的克隆情况变化具有大得多的用途。通常，在只能获取标准文库制备和测序基础设施的研究实验室中，文库构建需要100ng的量的无细胞DNA³²。用更专业化的方法，已经对最少2.3ng的量的cfDNA进行了外显子组测序³³。Newman和同事对低至7ng cfDNA进行了外显子组测序(“CAPP-seq”)³⁴。De Mattos-Arruda将低至22ng的cfDNA输入用于文库构建³⁵。

可能减少液体活组织检查方法的检测能力的第二个问题是无细胞DNA被来自不相关过程(例如，在血浆分离期间的有核血细胞裂解)的DNA“污染”。于血浆或其他体液(脑脊液、尿液、腹水)中存在的无细胞DNA可大致分为较小尺寸的片段(140-160及其2-3x倍)和较大尺寸的片段，较小尺寸的片段源于细胞内基因组DNA的凋亡分解，较大尺寸的片段主要源于坏死性细胞死亡(坏死)，但也源于外来体脱落和其他理解不太多的过程。凋亡来源的DNA片段也可以在健康人群中被检测到，并且可以在例如运动或感冒后增加。当前用于分析无细胞DNA的技术包括两种主要类型的方法学：A)下一代测序(NGS)：下一代外显子组测序^33,36，靶向程序(TAmseq ³⁷；CAPPseq ³⁴、FastSeqS ³⁸、mFAST-SeqS ³⁹、Safe-SeqS ⁴⁰)或全基因组测序²⁸。一些商业试剂盒(例如Thermo Fisher Ion AmpliSeq Cancer HotspotPanel v2)也被用于此。B)数字PCR(BEAMing：珠、乳液、扩增和磁性^{31,41,42,43,44}；数字PCR连接测定⁴⁵；使用来自RainDance或Bio-Rad的技术的基于乳液的ddPCR)。

WO 2014/140,309涉及使用来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27的热稳定的双功能复制酶“TthPrimPol”的用于核酸复制、扩增和测序的方法。已经发现，纯化的TthPrimPol对单链寡核苷酸展示出很强的DNA引发酶活性，其中潜在的引发酶识别序列(GTCC)侧翼为胸腺嘧啶残基。已经证明这样的具有嘧啶的部分(track)对于若干种病毒RNA引发酶、原核RNA引发酶和真核RNA引发酶启动引发反应是优选的模板环境。已经发现，引发仅发生在“TC”序列的前面，并且对聚dT部分没有引发。对模板序列要求的进一步分析揭示了模板起始位点前的核苷酸对TthPrimPol的引发酶活性的影响—C优先于A、G或T。即使TthPrimPol优选CTC作为模板起始位点，它通常也能作为引发酶对通用形式XTC的任何序列起作用，其中X代表A、C、G或T中的任一种。适度的序列要求是几乎所有的天然模板的随机引发的极佳基础。

因此，当前液体活组织检查方法的灵敏度和特异性限制是需要技术改进的领域。

附图简述

并入本文并且形成本说明书一部分的附图说明了示例性实施方案，并且与本说明书一起进一步用于使相关领域的技术人员能够进行和使用这些实施方案以及对本领域技术人员将明显的其他实施方案。将结合以下附图更具体地描述本发明，其中：

图1示出了对无细胞DNA去除突出末端、恢复5'磷酸和3'羟基基团并且添加3'dA突出端的预处理。

图2示出了凋亡无细胞DNA(apoptotic cell-free DNA)的扩增试剂盒的机制。

图3示出了表明TruePrime技术需要添加发夹衔接子以通过引发酶启动的多重置换扩增有效地扩增短DNA分子(200bp)的证据。“NTC”是指“无模板对照”(未添加DNA作为反应输入)。“HgDNA”代表人类基因组DNA。

图4示出了来自图3的扩增的DNA(3次独立的重复)(DNA1)被EcoRI限制性酶切割获得了预期的单元尺寸(来自原始DNA片段的200bp+来自发夹衔接子的36bp)。

图5A和图5B示出了取决于用于启动扩增的方法(TthPrimPol或随机引物)的扩增产量(5A，上部)和用限制性酶消化每种扩增的DNA的结果(5B，下部)。

图6示出了需要添加发夹衔接子的通过引发酶启动的多重置换扩增的短DNA分子(从50bp至1250bp)的扩增产量。

图7示出了用于测试TthPrimPol的DNA引发酶活性的衔接子。

图8示出了对每种发夹衔接子观察到的TthPrimPol DNA引发酶活性。

图9示出了从来自48名癌症患者的cfDNA样品获得的DNA扩增产量以及扩增过程的详细方案。

图10示出了从来自癌症患者的不同量的cfDNA获得的扩增产量，以微克计。

图11示出了被发夹衔接子序列[SEQ ID NO:1]间隔开的片段相对于MinION读段(Oxford Nanopore)的长度的高度相关性。

图12示出了来自同一结肠癌患者的两个被扩增的cfDNA样品的基因组覆盖率和拷贝数变异检测。

图13以不同的分辨率示出了来自同一结肠癌患者的两个被扩增的cfDNA样品的覆盖率图。该图反映了用本文描述方法扩增的来自同一结肠癌患者的两个cfDNA样品的读段沿4号染色体的分布。进行了全基因组测序，并且将获得的读段与人类参考基因组比对。在独立扩增反应中以不同的分辨率观察到非常均匀且均一的读段分布。该图放大地示出了两个样品中的分布模式有多相似。

图14示出了在三名患者中的每一名中检测到的注释的和未注释的变异的数目，对每个病例比较扩增的和未扩增的cfDNA样品。

图15示出了第一个患者在两个不同的等位基因频率(1％和35％)所获得的变异调用结果以及扩增的和未扩增的cfDNA样品之间的相关性。

图16示出了第二个患者在两个不同的等位基因频率(1％和35％)所获得的变异调用结果以及扩增的和未扩增的cfDNA样品之间的相关性。

图17示出了第三个患者在两个不同的等位基因频率(1％和35％)所获得的变异调用结果以及扩增的和未扩增的cfDNA样品之间的相关性。

图18示出了TthPrimPol的氨基酸序列[SEQ ID NO:10]。

概述

肿瘤学和其他领域中对无细胞DNA的分析为改善患者的诊断和治疗提供了巨大的机会。一个关键问题是难以从无细胞DNA含量非常低的生物流体诸如血浆、尿液或CSF样品中获得结果。本文公开的方法通过扩增包括双链DNA在内的短双链多核苷酸片段提供了解决该问题的方案。这包括但不限于无细胞DNA中存在的那些分子。扩增基于被称为“引发酶启动的多重置换扩增”(“PI-MDA”，也称为“TruePrime”)的扩增技术与允许通过后续步骤诸如滚环DNA扩增来有效扩增样品的一组新的样品预处理的组合。如本文使用的，“引发酶启动的多重置换扩增”或“TruePrime”是指多重置换扩增(“MDA”)的一种形式，其使用引发酶/聚合酶来提供引物，以通过DNA聚合酶进行引物延伸。通常，聚合酶具有非常强的置换能力和良好的合成保真度，以避免该过程期间的序列变化。一种这样的聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。虽然当前的金标准MDA需要短的DNA片段(“寡核苷酸”)来启动扩增，但引发酶启动的多重置换扩增不需要任何合成的随机引物。

除了其他问题之外，本公开内容的方法通过基于PI-MDA技术(“TruePrime”)的调整的对凋亡无细胞DNA的扩增解决了液体活组织检查的灵敏度和特异性这个问题，所述PI-MDA技术是通过迭代引发、复制和置换步骤进行DNA扩增的方法。⁴⁶TruePrime试剂盒和方案可从Expedeon AG及其子公司商购。本公开内容提供了现有TruePrime与添加的样品预处理步骤的组合，所述添加的样品预处理步骤包括末端修复、dA加尾和连接发夹衔接子(参见图1)。单独地，这些步骤可以通过本领域已知的方法来进行，包括通过使用New EnglandBiolabs NEBNext Ultra II DNA Library Prep试剂盒以及类似的产品和方法和/或例如：(a)对于末端修复，通常使用T4多核苷酸激酶(PNK)+T4 DNA聚合酶、克列诺片段和T4 DNA聚合酶大片段(b)对于dA加尾，通常使用Taq聚合酶。这种新的方法组合提供了原本不能工作或低效的有效方法：通过常规的TruePrime或其他方法扩增DNA小片段。该方法步骤之后可以任选地为滚环DNA扩增方法(参见图2)。因此，我们提供了一种新的方法，所述方法在无需连接的情况下扩增短DNA分子，例如但不限于凋亡无细胞DNA，允许可用于任何分析技术的DNA增加，具有优异的灵敏度和特异性。虽然本文公开的方法为短DNA片段提供了特别的优势，但它们也能很好地用于任何长度的DNA样品。

详述

I.引言

PrimPol是一种从嗜热细菌，嗜热栖热菌获得的酶。PrimPol在单个热稳定蛋白中组合了两种不同的互补的活性：引发酶和聚合酶。常规聚合酶需要与模板分子退火的小段核苷酸(引物)来合成互补序列。相反，PrimPol产生其自身的引物序列，从而提供了全新的应用。

此外，PrimPol能够拷贝DNA和RNA两者。RNA反映在细胞中实际表达了何种遗传信息，而DNA是指存在于身体的每个细胞中的一般遗传信息，并且通常仅反映一个人发展疾病的易感性。PrimPol的开发将有助于简化DNA和RNA扩增程序的技术方面。

PrimPol对受损的DNA也表现出很强的耐受性。DNA在细胞内经受化学修饰。此外，在纯化遗传物质所需的过程期间，以及储存法医样品和临床样品(例如石蜡包埋的***固定的组织)期间，也会触发这样的修饰。已经证明化学修饰在若干生物过程诸如衰老、神经退行性疾病和癌症中发挥着越来越重要的作用。因此，对开发用于在测序的背景下研究受损DNA的方法存在极大兴趣。因此，能够处理经修饰的模板的酶是特别感兴趣的，因为当前的扩增应用以及第二代和第三代测序技术尚未被优化以使用受损的样品。

由于其将多种底物核苷酸(例如荧光核苷酸)引入DNA和RNA模板分子的能力，PrimPol也适用于不同的第二代和第三代测序技术。

最后，PrimPol在多重置换扩增(MDA)反应中起作用，产生引物供Phi29DNA聚合酶随后使用，因此不需要使用随机合成引物，并且可能导致更一致的DNA扩增。

II.扩增线性双链多核苷酸的方法

除其他外，本文提供了扩增线性双链多核苷酸(例如，DNA分子)尤其是凋亡(单核小体)无细胞DNA的方法。扩增线性双链DNA的方法包括将单链发夹衔接子附接至DNA分子的两端，以产生单链共价闭合的DNA分子，并且通过滚环扩增和多重置换扩增(例如，引发酶启动的多重置换扩增)来扩增共价闭合的DNA分子。

A.线性双链DNA

用于本文描述的扩增方法的线性双链DNA可以从任何来源提供。这包括，例如，来自真核生物、真细菌、古细菌和病毒的DNA。DNA的真核生物来源可以包括植物、动物、脊椎动物、哺乳动物和人类。DNA的微生物来源可以包括来源于个体微生物组或来源于环境的微生物。

本文公开的扩增方法中使用的线性双链DNA可以是任何长度。在某些实施方案中，线性双链DNA具有的长度不多于5000个核苷酸、不多于1000个核苷酸、不多于500个核苷酸或不多于200个核苷酸。在其它实施方案中，待扩增的线性双链DNA分子的群体可以具有的平均长度不多于5000个核苷酸、不多于1000个核苷酸、不多于500个核苷酸、不多于200个核苷酸、不多于100个核苷酸、不多于50个核苷酸、不多于20个核苷酸，例如，约168个核苷酸。待扩增的DNA分子可以包括具有约100个和约220个核苷酸之间的长度的分子。线性双链DNA可以包括片段化的染色体DNA。这样的DNA片段可以具有大于5000个核苷酸的长度。

通常通过本领域熟知的分离方法将核酸与其它组分分离，所述方法包括但不限于在具有DNA或RNA结合活性的颗粒(诸如二氧化硅颗粒)上捕获；聚乙二醇沉淀和SPRI(固相可逆固定化)珠。

1.无细胞多核苷酸

本文公开的方法中使用的线性双链DNA可以包括无细胞DNA(“cfDNA”)。无细胞DNA是指没有被包封在细胞内的DNA。无细胞DNA可以是凋亡无细胞DNA。(图1，“凋亡无细胞DNA”。)凋亡cfDNA是指从死细胞或垂死细胞释放的DNA，例如，通过凋亡细胞死亡机制，其中DNA在核小体之间被切割，产生160-170bp的DNA片段，或者当DNA的切割不是在每个核小体之间产生时，产生160-170bp的倍数的DNA片段。这包括从正常细胞例如具有种系基因组的正常细胞释放的DNA。它还包括从癌细胞(例如恶性细胞)释放的DNA，也被称为循环肿瘤DNA或“ctDNA”。这种DNA通常携带与癌症相关的体细胞突变，例如癌基因或肿瘤抑制基因中的突变。凋亡cfDNA还包括母体循环中的胎儿DNA。无细胞DNA可以来源于多种不同体液中的任一种，包括但不限于血液、血浆、血清、CSF、尿液、唾液、泪滴、乳汁、***和滑液。凋亡cfDNA通常具有两个峰的尺寸分布；第一个单核小体峰在约110个至约230个核苷酸之间，模式为约168个核苷酸，而第二个小的二核小体峰在约240个至440个核苷酸之间。

无细胞DNA分子可以通过常规方法从体液诸如血液制备。用于此目的的商业试剂盒可从，例如，Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA,USA)、Active Motif(Carlsbad,CA,USA)和Qiagen(North Rhine-Westphalia,Germany)获得。通常，例如通过离心去除样品的细胞。将二氧化硅颗粒例如磁性二氧化硅珠添加至已经从中去除细胞的样品中。二氧化硅颗粒结合DNA。例如通过离心和/或施加磁力将颗粒与上清液分离。去除上清液并且洗涤颗粒。通过用乙醇稀释从颗粒中分离出无细胞DNA。

2.其他多核苷酸

在其它实施方案中，双链DNA分子包括例如从细胞分离的片段化的基因组DNA，或由RNA分子诸如mRNA、rRNA或tRNA分子的逆转录产生的双链cDNA分子。

3.末端修复

末端修复是指为具有3'和/或5'单链突出端的双链DNA分子提供粘性末端或平末端的过程。末端修复使双链DNA分子更适于与多核苷酸衔接子附接。可以通过粘性末端连接或平末端连接来附接。“粘性末端连接”是指两个双链多核苷酸的连接，其中每个双链多核苷酸具有与另一个3'突出端互补的3'突出端。粘性末端可以是，例如，单核苷酸突出端，诸如3'dA和3'dT，或更长的粘性末端，诸如限制性酶消化产生的突出端。“平末端连接”是指将一个双链多核苷酸连接至另一个双链多核苷酸的平末端。

在任一种情况下，对多核苷酸的修饰最初通常包括使分子平末端化(bluntending)。通常，这包括使用聚合酶来填充5'突出端和使用具有核酸外切酶活性的分子对3'突出端回切(chew back)。平末端化可以使用T4聚合酶和DNA聚合酶I克列诺片段的混合物来进行。克列诺片段具有填充5'突出端的5'-3'聚合酶活性和去除3'突出端的3'-5'核酸外切酶活性。T4 DNA聚合酶具有较低效的5→3聚合酶活性和较高效的3'-5'核酸外切酶活性。绿豆核酸酶也可以用来消除5'和3'突出端。T4多核苷酸激酶(“T4 PNK”)被用于使分子的5'链磷酸化并使3'链去磷酸化。用于进行DNA分子平末端化的试剂盒可从多种商业来源包括Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA,USA)和New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)获得。

在某些实施方案中，可以通过将末端3'脱氧腺苷核苷酸添加至DNA分子的方法对平末端化的多核苷酸进行dA加尾。该作用可以使用Taq聚合酶来进行。(图1，“末端修复的cfDNA(3'-dA突出端)”。)

可以通过附接单链衔接子在本文描述的方法中使用平末端化的分子或dA加尾的分子。

B.单链衔接子的附接

经末端修复和任选地dA加尾的多核苷酸可以与衔接子连接。衔接子是适于与靶分子附接的多核苷酸分子。通常，衔接子包含用于引发DNA链延伸的核苷酸序列。在本公开内容的某些方法中，衔接子是发夹衔接子。如本文使用的，术语“发夹衔接子”是指这样的单链核酸分子(例如，DNA)，其包含侧翼为第一区域和第三区域的第二区域。第一区域和第三区域具有足以彼此杂交的互补性(例如，95％、99％或100％的互补性)。第二区域与第一区域或第三区域不互补。衔接子可以具有25个和100个核苷酸之间的长度。第二区域的长度可以是，例如，4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或少于25个核苷酸。因此，发夹衔接子分子可以折叠回自身，形成包含双链末端和未杂交的单链内部区段的茎和环结构。根据应用，发夹衔接子可以包含3'dA突出端或平末端。参见，例如，图7和图8。

衔接子通常还包含与DNA引发酶和/或引物延伸相容的内部核苷酸序列。例如，发夹衔接子可以包含引发酶/聚合酶识别序列，例如XTC，其中X代表核苷酸A、T、G或C，例如CTC、GTC或GTCC。引发酶/聚合酶识别序列可以位于衔接子的环(非互补)部分。它被TthPrimPol识别。在其他实施方案中，发夹衔接子包含扩增引物结合位点。

末端修复的dA加尾的双链多核苷酸可以在一端或两端与发夹衔接子附接。衔接子的末端优选地与双链多核苷酸的末端相容。因此，例如，dA加尾的双链多核苷酸被与dT加尾的发夹衔接子附接，或者平末端双链多核苷酸被与平末端发夹衔接子附接。附接通常用DNA连接酶诸如T4 DNA连接酶来进行。在某些实施方案中，发夹衔接子具有如图7中描绘的序列，即，[SEQ ID NO:1]、[SEQ ID NO:2]、[SEQ ID NO:3]或[SEQ ID NO:4]。

发夹衔接子和双链多核苷酸之间的连接产物是单链共价闭合的多核苷酸。参见，例如，图1(“衔接子连接”)。这样的多核苷酸也可以被描述为单链环状多核苷酸。如本文使用的，术语“共价闭合的DNA分子”是指没有游离的5'或3'末端的DNA分子。这样的分子也被称为“环状DNA”。因为它们具有互补的内部序列，这样的分子可以采取“哑铃”形状。在一端或两端侧接发夹衔接子的多核苷酸***片段被称为“加衔接子标签的多核苷酸”。

加衔接子标签的多核苷酸的集合被称为“核酸文库”。通常，在cfDNA的情况下，包含末端修复的DNA分子群体的核酸文库包含具有不同核苷酸序列的多核苷酸***片段。

单链共价闭合的多核苷酸可以通过本文公开的方法来扩增。

C.扩增

在某些实施方案中，单链共价闭合的多核苷酸的扩增包括使用DNA指导的引发酶/聚合酶诸如TthPrimPol、具有链置换活性的DNA聚合酶诸如Phi29，和修饰的或未修饰的脱氧核糖核苷酸。组合起来，这些试剂实现引发酶/聚合酶引发并且通过DNA聚合酶延伸的滚环扩增。此外，引发酶/聚合酶和DNA聚合酶的组合可以通过用引发酶/聚合酶和/或随机寡核苷酸引物对扩增的分子进行引发并且通过DNA聚合酶使引物延伸来实现多重链置换扩增。多重链置换扩增产生支链结构，因为DNA合成从扩增分子中的许多位置引发和延伸。

此外，通过将包含一个或更多个引发酶识别位点的发夹衔接子与对单链DNA具有DNA引发活性的引发酶诸如TthPrimPol和具有链置换活性的DNA聚合酶诸如Phi29以及脱氧核糖核苷三磷酸一起使用，可以在不使用寡核苷酸引物分子的情况下实现扩增。使用这些试剂，在多重链置换扩增期间产生高度支链化的结构。

1.引发酶/聚合酶

如本文使用的，术语“引发”是指在多核苷酸模板上产生寡核苷酸引物。

对于DNA扩增，引发酶/聚合酶可以是DNA指导的引发酶/聚合酶，诸如PrimPol酶。与大多数引发酶不同，PrimPol能够独特地用dNTP启始DNA链。有用的PrimPol包括尤其是嗜热栖热菌引发酶/聚合酶(“TthPrimPol”)和人类引发酶/聚合酶(“hsPrimPol”)。

嗜热栖热菌HB27引发酶/聚合酶被描述于，例如，2014年9月18日公布的WO 2014/140309(“Methods for amplification and sequencing using thermostableTthPrimPol”)中。它具有图18中示出的氨基酸序列[SEQ ID NO:10]。它具有NCBI Entrez数据库中的基因ID:NC_005835，蛋白WP_011173100.1。TthPrimPol可以以来自Expedeon(Cambridge,UK)的试剂盒商购获得。

人类PrimPol也被称为MYP22、CCDC111和Primpol1。它在NCBI Entrez数据库中具有基因ID:201973。

PrimPol可以是本文描述的任何PrimPol的相关物(relative)，包括以下：等位基因变体(天然存在的基因变体)、人工变体(包含对天然存在的基因或蛋白的一种或更多种遗传修饰，同时保留天然功能的基因或蛋白)、同源物(来自不同于指定属或种的另一个属或种的天然存在的基因，或相同的株(strain)或种中编码具有几乎相同折叠和功能的蛋白的不同基因)；种间同源物(在所讨论属或种的另一个属或种中存在的同源物)或种内同源物(在与所讨论的株或种相同的株或种中存在的同源物，例如，作为基因重复的结果)。PrimPol酶可以与SEQ ID NO:10的蛋白具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸序列同源性。

2.具有链置换活性的DNA聚合酶

扩增方法可以采用具有链置换活性的DNA聚合酶，例如与单链DNA强结合(例如优先于双链DNA)的聚合酶。链置换活性可用于置换DNA分子的杂交链，同时例如在发夹结构的环区域中的引物位置延伸。

可用于本文公开的方法的具有链置换活性的DNA聚合酶包括，例如，Phi29。Phi29DNA聚合酶可以从例如，New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)、ThermoFisherScientific(Waltham,MA,USA)和Expedeon(Cambridge,UK)商购获得。Phi29聚合酶可以产生高达100kb的DNA片段。该酶具有3'→5'核酸外切酶校对活性，并且提供与基于Taq DNA聚合酶的方法相比高达1000倍高的保真度。Phi29聚合酶可以作用于包含二级结构诸如发夹环的DNA。

在另一种实施方案中，DNA聚合酶可以是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)(Bst)聚合酶。

3.脱氧核糖核苷三磷酸

引物产生和引物延伸可以通过为引发酶/聚合酶和DNA聚合酶提供脱氧核糖核苷酸底物例如脱氧核糖核苷三磷酸来实现。通常，这些包括四种标准碱基，A、T、G和C。然而，在某些实施方案中，可以包括非天然核苷酸，诸如肌苷。在某些实施方案中，核苷酸可以带有标记，所述标记用于检测或捕获它们被掺入的多核苷酸。

4.滚环扩增

滚环扩增是一种扩增共价闭合的DNA分子诸如单链共价闭合的DNA分子的方法。用引物例如引发酶/聚合酶提供的引物来引发模板DNA分子。DNA聚合酶围绕闭合的DNA分子对引物进行引物延伸。聚合酶置换杂交的拷贝，并且继续围绕模板进行多核苷酸延伸，以产生串联的扩增产物。

5.多重置换扩增

多重置换扩增是一种等温的、非基于PCR的DNA扩增方法，其中引物从模板分子被延伸产生这样的分子，这些分子本身通过引物延伸被引发和复制，以产生支链样结构。当引物从一个DNA分子模板延伸到支链区域中时，支链被彼此置换。在某些实施方案中，MDA采用随机六聚体作为引物在原始模板及其扩增拷贝的多个位点引发扩增。多重链扩增在例如2011年4月21日公布的WO2011/047307A1(“Multiple Displacement Amplification”)中有进一步描述。聚合使引物在多个引发位点延伸。

在所公开的方法的某些实施方案中，用引发酶/聚合酶诸如TthPrimPol来实现引发。在这种情况下，引发包括提供脱氧核糖核苷三磷酸作为试剂。在某些实施方案中，脱氧核糖核苷酸是未修饰的。在其他实施方案中，脱氧核糖核苷酸可以通过附接标记物例如荧光分子来修饰。如本文使用的，术语“标记”是指被附接至诸如核酸分子的分子的化学部分。可检测的标记包括，例如，荧光标记、发光标记、酶标记、比色标记诸如胶体金或有色玻璃或塑料珠以及放射性标记。

参考图2，在本文公开的方法中，提供了单链共价闭合的核酸分子模板(“经预处理以在两端添加发夹衔接子的cfDNA”)。提供了引发酶/聚合酶，诸如TthPrimPol，并且其识别发夹衔接子中的识别位点，并且通过合成引物引发聚合。(“TthPrimPol发夹识别和引物合成”。)具有结合单链核酸分子的偏好和链置换活性的DNA聚合酶通过滚环扩增和多重置换扩增的组合来扩增模板。滚环扩增提供了串联分子，该串联分子基于互补序列折叠回自身形成双链区段。这些折叠还包括包含引发酶/聚合酶识别位点的衔接子序列。引发酶/聚合酶在串联分子上合成引物，这些引物继而通过DNA聚合酶延伸。结果是原始模板分子通常以支化的方式指数性扩增。(“通过新的引发事件导致的链置换和指数性滚环扩增”。)

6.其他扩增方法

本文考虑了扩增单链共价闭合的DNA分子的其他方法。

在一种方法中，不是用引发酶/聚合酶引发聚合，而是用随机序列引物引发扩增。例如，随机序列引物可以是包含一组简并序列的六聚体。扩增可以通过多重置换扩增来继续。

在另一种方法中，对单链共价闭合的DNA分子的扩增通过简并寡核苷酸引发的(DOP)-PCR来进行。(DOP)-PCR使用单一引物进行PCR(而不是正向和反向引物)。该引物通常是一种寡聚物，具有约22个碱基，中间具有六个核苷酸的简并区，例如CGACTCGAGNNNNNNATGTGG[SEQ ID NO:9]。该简并区是包含四种DNA核苷酸中的任一种的随机序列。DOP-PCR程序的前五个步骤是非特异性扩增步骤。简并引物连同低退火温度将在整个基因组的多个位置处引起随机退火。在PCR期间，延伸将从这些引物发生并且产生长片段。

在另一种方法中，对单链共价闭合的DNA分子的扩增通过引物延伸预扩增(PEP)来进行。引物延伸预扩增(PEP)使用随机/简并引物和低PCR退火温度。引物的长度可以是例如约15个核苷酸。

在另一种方法中，对单链共价闭合的DNA分子的扩增通过接头-衔接子PCR(LA-PCR)来进行。在LA-PCR中，用MseI消化双链DNA，留下TA突出端，以进行衔接子退火和后续连接。使用与衔接子互补的单一引物通过PCR扩增整个样品。

在另一种方法中，对单链共价闭合的DNA分子的扩增通过使用热稳定的DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和高度连续性链置换DNA聚合酶(例如，Phi29聚合酶或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)聚合酶)的任何组合来进行。一种这样的方法是基于多次退火和成环的扩增循环(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycle，MALBAC)。MALBAC是一种非指数性全基因组扩增方法。在MALBAC中使用的引物允许扩增子具有互补末端，所述互补末端形成环，抑制指数性拷贝。

D.DNA测序

如本文使用的，术语“高通量测序”是指对数千个核酸分子同时或几乎同时测序。高通量测序有时被称为“下一代测序”或“大规模平行测序”。高通量测序的平台包括但不限于大规模平行标签测序(MPSS)、Polony测序、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、Ion Torrent半导体测序、DNA纳米球测序、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序(PacBio)和纳米孔DNA测序(例如，Oxford Nanopore)。

本文描述的方法可以用于但不限于全基因组测序、外显子组测序和扩增子测序。在凋亡cfDNA包括来自整个基因组的序列的程度上，本文描述方法的扩增产物代表全基因组扩增物。然而，可以对被扩增的分子本身进行特定扩增子的扩增。使用针对基因组中的基因序列的诱饵的序列捕获可以用于分离扩增的代表外显子的分子。通过将mRNA逆转录成双链cDNA，可以产生扩增的转录组以进行测序。

通过本文公开的方法扩增的DNA具有双链DNA的特性。这至少部分是由于折叠回自身的链内的互补性。相应地，可以如人们可制备天然双链DNA那样制备扩增的DNA以进行测序。文库制备方法取决于测序平台和测序方法两者。例如，可以调整测序平台以用于短读段(诸如Illumina或Ion Torrent)，或者长读段(诸如PacBio或Oxford Nanopore)。测序方法包括靶向测序、全外显子组测序或全基因组测序。例如，为了使用Illumina进行全基因组测序，人们可以将DNA剪切(酶促地或机械地)至适于测序规格的长度(例如，单末端或成对末端读段和选定长度(150个核苷酸，250个核苷酸等))。剪切后，使用包含适于进行测序的衔接子的试剂盒制备文库。相比而言，当使用长读段全基因组测序例如PacBio和OxfordNanopore时，建议第一步骤使用T7核酸内切酶来消除来源于所有MDA方法产生的多重置换扩增机制的多支链DNA结构。否则，根据测序平台遵循不同的文库制备方法。在靶向方法中，使用PCR来扩增某些感兴趣的区域，这些感兴趣的区域将是随后唯一被测序的区域。

V.试剂盒

本文还提供了用于进行本文公开的方法的试剂盒。如本文使用的，术语“试剂盒”是指意图一起使用的物品(item)的集合。

本文公开的某些试剂盒包括2个、3个、4个、5个、6个、7个选自以下的成分：(1)PrimPol酶(例如，TthPrimPol)；(2)DNA聚合酶(例如，Phi29)；(3)单链发夹衔接子；(4)一种或更多种用于dsDNA末端修复的酶(例如，T4 DNA聚合酶、克列诺片段和/或Taq聚合酶)；(5)一种或更多种用于DNA连接的酶；(6)dNTP；(7)增强剂，例如增加DNA连接效率的增强剂，例如聚乙二醇；(8)反应缓冲液和(9)用于与任何前面提及的成分一起使用的缓冲液。试剂盒可以包括容纳这些试剂的容器。试剂盒可以包括容纳试剂的容器。可以将容器本身放置在运送容器中。容器可以通过亲手递送或通过公共承运人诸如国家邮政***或送货服务诸如FedEx来运送。试剂盒还可以包括用于将收集的血液运送至中心设施的容器，诸如盒或袋。试剂盒通常还可以包括使用说明书以及用于数据分析和解释的软件。

实施例

实施例1：根据本公开内容在DNA两端添加发夹允许通过TruePrime多重置换扩增来有效地扩增短DNA分子

在图3中示出了通过PCR扩增获得的对短DNA分子(200bp)的扩增。末端修复和dA加尾反应以及发夹衔接子的添加使得TruePrime能够有效地扩增短DNA输入物。

在DNA1中存在单一的EcoRI酶限制性识别位点，允许我们获得单一单元的扩增物质(参见图4)，证明了图2中示出的扩增机制。

实施例2：TruePrime滚环扩增显示出与基于随机合成引物的MDA方法相比更特异性的靶分子扩增

在图5中示出了通过PCR扩增和进行本公开内容的程序：末端修复、dA加尾、发夹衔接子连接和滚环扩增而获得的短DNA分子(200bp)的扩增。滚环扩增可以使用两种独立制备的DNA样品作为底物(Prep 1和Prep2)，用TthPrimPol(TruePrime)或随机合成引物(RP)触发扩增来进行。当使用随机引物时，扩增产量高得多(参见图5上部)。然而，通过限制性酶消化对相同量的扩增DNA(500ng)的分析揭示，TruePrime(基于TthPrimPol)产生了比随机引物更多的靶分子(236bp)，可能是由于引物二聚体的扩增，这是基于随机合成引物的MDA方法的一个熟知的缺点。

实施例3：根据本公开内容在DNA两端添加发夹允许通过TruePrime多重置换扩增来有效地扩增从50bp至最多1250bp的DNA分子

在图6中示出了通过PCR扩增获得的范围为从50bp至最多1250bp(50bp、100bp、150bp、200bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp和1250bp)的DNA分子的扩增。末端修复和dA加尾反应以及发夹衔接子的添加使得TruePrime能够有效地扩增不同的DNA分子。

实施例4：TthPrimPol DNA引发酶效率取决于衔接子的发夹序列。

在图7中示出了所测试的不同的发夹衔接子。所有的衔接子均具有自身互补序列，允许分子自我杂交形成发夹。在每种情况下，发夹序列和长度不同。

在图8中示出了TthPrimPol的DNA引发酶活性，在TruePrime中，该酶负责使用具有不同的发夹尺寸和序列的衔接子为Phi29 DNA pol合成DNA引物。衔接子1显示出最高的活性，这可以从产生的DNA引物的量以及几乎完全没有未被掺入的标记的核苷酸(G*)来推断，这突出了使用该分子的DNA引发酶活性的效率。令人惊讶的是，含有更易接近的TthPrimPol识别序列(3'CTCC 5')⁴⁶的其他三种衔接子显示出更少的活性，尤其是在衔接子2的情况下。衔接子1显示出最高的活性和最短的序列，因此它成为用于cfDNA扩增工作流程的最佳候选物。

实施例5：本方法导致了对来自癌症患者的无细胞DNA样品的非常有效的扩增。

在知情同意的情况下，本研究招募了48名癌症患者。使用Streck无细胞DNA BCT管抽取10ml血液。立即通过双旋转离心方案分离3ml pf血浆，以避免来自有核血细胞的基因组DNA污染。使用金标准的cfDNA纯化试剂盒(Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒)，从1ml血浆样品中纯化无细胞DNA。通过Qubit定量在每种情况下获得的不同的产量(范围为从0.12ng/12至最多21.6ng)。使用Bioanalyzer HS试剂盒分析无细胞DNA的尺寸谱，以证实感兴趣的凋亡无细胞DNA分子(尺寸～160-170bp)的存在并且不存在其他较长的DNA分子。

在每种情况下，遵循本公开内容的cfDNA扩增的工作流程(步骤在图9的左侧部分中示出)处理1ng的cfDNA；即从末端修复、dA加尾和衔接子1连接的步骤开始。之后，使用TruePrime技术来扩增所得样品(15μl)。在图9(右侧部分)中示出了所获得的扩增产量。所有无细胞DNA样品均被有效地扩增。

实施例6：本方法导致了对来自癌症患者的无细胞DNA样品的非常灵敏的扩增。

在图10中示出了本公开内容的工作流程的极佳的灵敏度和效率，其从皮克的无细胞DNA开始实现了微克范围的DNA扩增产量。很明显的是输入量和观察到的扩增产量之间是呈比例的。

实施例7：短读段(Illumina)和长读段(Oxford Namothole MiniON)全基因组测序证实了扩增凋亡无细胞DNA的方法工作流程的可行性和效率。

对来自结肠癌患者(T3N1aM0)的4ng无细胞DNA一式两份地进行本公开内容的cfDNA扩增的工作流程。

长读段(Oxford Nanopore MinION)全基因组测序：在制备文库之前，用T7核酸内切酶I预处理每种扩增的无细胞DNA 1500ng，以消除多支链的DNA结构。使用连接ID测序试剂盒SQK-LSK108，并且遵循使用SQK-LSK 108的MinION装置的ID基因组DNA测序方案。流动池运行48小时。

分析来自Oxford Nanopore MinION运行的序列，并且测试发夹衔接子序列[SEQID NO:1]的出现。尽管测序质量不高，但发夹衔接子[SEQ ID NO:1]的序列可见于几乎每一个读段和具有高度相似性的分开的序列片段(通过对这些片段的BLAST证实，这些片段具有作为命中的(hit)相同遗传区域)中。

在图11中示出了由发夹衔接子序列[SEQ ID NO:1]分开的片段相对于MinION读段的长度的高度相关性。

短读段(Illumina)全基因组测序：用Covaris剪切每种扩增的无细胞DNA 1000ng，以获得500bp片段。使用AMPure珠来纯化经剪切的DNA，并且使用NxSeq AmpFREE Low DNALibrary试剂盒(Lucigen)来制备文库。通过PCR来添加双索引，并且在Illumina HiSeq2500中使用成对末端读段(2x 150bp)对样品测序。

在图12中示出了覆盖率和拷贝数变异(CNV)检测结果。来自同一个患者的两个样品的覆盖率看起来几乎相同且高度均匀，CNV图也是如此，其中除了单个部分(singleparts)外，两个样品具有相同的倍性组成。通过CLC Genomics Workbench分析读段，合并成一个读段，并且然后再在发夹的位置处分开。发夹序列可见于几乎所有的合并读段中。将再次分开的和人工产生的新的成对读段与人类基因组比对，并且分析覆盖率统计量、再现性和CNV含量。

在图13中以不同的分辨率示出了来自一名患者的两个样品的覆盖率图。几乎相同的扩增和几乎相同的来自测序后处理的结果是值得注意的。实施例8：扩增子测序证实了扩增凋亡无细胞DNA的方法工作流程的可行性和效率。

对来自三名不同的结肠癌患者(T3/4)的26.7ng、84ng和150ng无细胞DNA进行本公开内容的cfDNA扩增工作流程，分别获得15μg、17μg和20μg。在Ion Proton^TM测序***中，使用Ion Proton^TM芯片，使用带有用于多重化的标签分子条形码的Oncomine^TM结肠cfDNA测定对来自每名患者的20ng未扩增的cfDNA和50ng扩增的cfDNA测序。使用Ion Chef^TM***来制备文库。使用Torrent Suite软件进行读段比对，并且使用CLC软件用以下设置进行变异调用(variant calling)：倍性＝2。忽略覆盖率高于＝1000000的位置。将调用局限于靶区域＝Oncomine_Colon_cfDNA.03062017。设计_BED。忽略被破坏的配对＝否。忽略非特异性匹配＝读段。最小覆盖率＝10。最小计数＝2。最小频率(％)＝1.0-35.0。基础质量过滤器(base quality filter)＝否。读段方向过滤器＝否。相关读段方向过滤器＝否。读段位置过滤器＝否。去除pyro-错误变异(pyro-error variant)＝否。创建跟踪＝是。创建注释表＝否。

以从35％至1％的不同频率对单核苷酸变异、多核苷酸变异、***和缺失进行变异调用。在图14中示出了在每名患者中检测到的注释的和未注释的变异的数目，对每个病例比较扩增的和未扩增的cfDNA样品。

在这三个病例中，不依赖于突变等位基因频率阈值，在扩增的样品中检测到变异比未扩增的样品中多。另外，扩增的样品的注释的变异的数目也高于未扩增的样品。

在图15中示出了在两个不同的等位基因频率(1％和35％)获得的第一个患者的结果，并且来自同一患者的扩增的样品比未扩增的cfDNA样品的临床相关变异的数目更高。对于1％的频率，在扩增的样品中检测到30个临床相关(ClinVar)突变，而在未扩增的样品中仅检测到14个。来自这14个中的10个也在扩增的样品中被检测到。对于35％的频率，在未扩增的样品中检测到3个ClinVar突变。这3个和2个另外的ClinVar突变可见于扩增的物质中。

在图16中示出了在两个不同的等位基因频率(1％和35％)获得的第二个患者的结果，并且来自同一患者的扩增的样品比未扩增的cfDNA样品的临床相关变异的数目更高。对于1％的频率，在扩增的样品中检测到31个ClinVar突变，而在未扩增的样品中仅检测到13个。来自这13个中的10个也在扩增的样品中被检测到。

在图17中示出了在两个不同的等位基因频率(1％和35％)获得的第三个患者的结果，并且来自同一患者的扩增的样品比未扩增的cfDNA样品的临床相关变异的数目更高。对于1％的频率，在扩增的样品中检测到26个ClinVar突变，而在未扩增的样品中仅检测到16个。来自这16个中的13个也在扩增的样品中被检测到。

因此，在扩增子测序之前使用本公开内容的程序增加了分析的灵敏度，使得能够检测到更多临床相关变异。

示例性实施方案

本发明的示例性实施例包括以下：

1.一种扩增DNA的方法，所述方法包括：a)提供线性双链DNA分子；b)将单链衔接子附接至所述线性双链DNA分子的两端以产生单链共价闭合的DNA分子；以及c)通过(i)滚环扩增和(ii)多重置换扩增以单次操作扩增所述单链共价闭合的DNA分子。

2.如实施方案1所述的方法，其中所述线性双链DNA分子包括凋亡无细胞DNA分子，所述凋亡无细胞DNA分子例如，具有小于480bp、小于320bp或在约140bp和180bp之间(例如，平均约160bp)的尺寸。

3.如实施方案1所述的方法，其中提供所述线性双链DNA包括将染色体DNA片段化。

4.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述线性双链DNA源自来自哺乳动物的一种或更多种体液，所述一种或更多种体液例如选自CSF、血液、血浆、血清、腹水、尿液、唾液、泪滴、乳汁、***和滑液。

5.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中提供所述线性双链DNA包括从生物样品的其他细胞组分中分离所述线性双链DNA。

6.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中提供所述线性双链DNA包括末端修复和/或dA加尾。

7.如实施方案5所述的方法，其中末端修复使用T4多核苷酸激酶(PNK)、T4 DNA聚合酶、克列诺片段和T4 DNA聚合酶大片段中的一种或更多种来进行。

8.如实施方案5所述的方法，所述方法包括使用Taq聚合酶进行dA加尾。

9.如前实施方案中任一项所述的方法，其中所述衔接子包含单链DNA分子。

10.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述衔接子具有发夹结构。

11.如前实施方案中任一项所述的方法，所述方法包括附接具有以下序列的衔接子：5'TAACATTTGTTGGCCACTCAGGCCAACAAATGTTAT3'[SEQ ID NO:1]。

12.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述衔接子包含引发酶/聚合酶识别序列。

13.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中附接衔接子包含平末端连接或粘性末端连接。

14.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法包括：

提供凋亡无细胞DNA分子；

对所述无细胞DNA分子进行末端修复和dA加尾；以及

将包含dT突出端的发夹衔接子连接至末端修复的dA加尾的无细胞DNA分子。

15.如前实施方案中任一项所述的方法，其中扩增通过引发酶/聚合酶来引发。

16.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中扩增通过嗜热栖热菌引发酶/聚合酶(TthPrimPol)来引发。

17.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中扩增通过具有序列SEQ ID NO:10的TthPrimPol来引发。

18.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中扩增通过人类引发酶/聚合酶(HsPrimPol)来引发。

19.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中扩增用随机合成的引物(例如，长度通常为3个至8个核苷酸的随机序列，诸如六聚体)来引发

20.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中扩增包括使用具有链置换活性的聚合酶进行链延伸。

21.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中扩增包括使用Phi29聚合酶进行链延伸。

22.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中扩增包括引发酶启动的多重置换扩增。

23.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法包括使用引发酶/聚合酶在所述DNA上产生引物，并且使用具有链置换活性的聚合酶来延伸所述引物。

24.如实施方案23所述的方法，其中所述引发酶/聚合酶包括TthPrimPol，并且所述聚合酶包括Phi29聚合酶。

25.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法还包括：d)对扩增的DNA测序。

26.如实施方案25所述的方法，其中测序包括将所述扩增的DNA片段化，并且将测序平台特异性衔接子附接至片段化的DNA。

27.如实施方案25所述的方法，其中对选定的序列(扩增子)、外显子组、转录组或全基因组进行测序。

28.如实施方案25所述的方法，所述方法还包括：e)检测被测序的、扩增的DNA中的一种或多于一种遗传变异。

29.如前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法还包括对扩增的DNA定量。

30.一种扩增DNA的方法，所述方法包括：a)提供线性双链DNA分子；b)对所述DNA分子进行末端修复和dA加尾；c)将发夹衔接子连接至末端修复的dA加尾的DNA分子，以产生加衔接子标签的DNA分子；以及d)通过(i)滚环扩增和(ii)多重置换扩增(“MDA”)来扩增所述加衔接子标签的DNA分子。

31.如实施方案30所述的方法，其中扩增包括使用Phi29 DNA聚合酶和随机合成的引物进行随机引发的MDA。

32.如实施方案30所述的方法，其中扩增包括用引发酶/聚合酶(例如，TthPrimPol)来引发。

33.一种扩增DNA的方法，所述方法包括：a)提供线性双链DNA分子；b)将单链衔接子附接至所述线性双链DNA分子的两端以产生单链共价闭合的DNA分子；以及c)通过热稳定的DNA聚合酶例如Taq聚合酶、随机引物或简并引物和任选的连接酶的任何组合来扩增所述单链共价闭合的DNA分子。

34.如实施方案33所述的方法，其中扩增包括简并寡核苷酸引发的PCR(DOP-PCR)、接头-衔接子PCR(LA-PCR)、引物延伸预扩增PCR(PEP-PCR-/I-PEP-PCR)及其变化形式。

35.一种扩增DNA的方法，所述方法包括：a)提供线性双链DNA分子；b)将单链衔接子附接至所述线性双链DNA分子的两端以产生单链共价闭合的DNA分子；以及c)使用热稳定的DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和高度连续性链置换DNA聚合酶(例如，Phi29聚合酶或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)聚合酶)的任何组合来扩增所述单链共价闭合的DNA分子。

36.如实施方案35所述的方法，其中扩增包括基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。

37.一种试剂盒，所述试剂盒包括：(a)引发酶/聚合酶；

(b)具有链置换活性的聚合酶；(c)脱氧核糖核苷三磷酸和(d)单链发夹衔接子。

38.如实施方案37所述的试剂盒，其中所述引发酶/聚合酶是TthPrimPol。

39.如实施方案37所述的试剂盒，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。

40.如实施方案37所述的试剂盒，其中所述单链衔接子具有以下序列：5'TAACATTTGTTGGCCACTCAGGCCAACAAATGTTAT 3'[SEQ ID NO:1。

41.如实施方案37所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括：d)选自以下的一种、两种或三种成分：(i)一种或更多种用于dsDNA末端修复的酶(例如，T4 DNA聚合酶、克列诺片段和/或Taq聚合酶)；(ii)一种或更多种用于DNA连接的酶；(iii)任选地，增加DNA连接效率的试剂；(iv)反应缓冲液；和(v)与任何前述成分一起使用的缓冲液。

42.如前述实施方案中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括：(a)用于分离凋亡无细胞DNA的试剂。

43.一种DNA文库，所述DNA文库包含加衔接子标签的单链共价闭合的DNA分子的群体，其中每个DNA分子包含第一区域、第二区域、第三区域和第四区域，其中所述第二区域和所述第四区域彼此互补，并且所述第一区域和所述第三区域彼此不互补。

44.如实施方案43所述的DNA文库，其中，所述第一区域和所述第三区域具有相同的序列。

45.如实施方案43或实施方案44所述的DNA文库，其中所述第二区域和所述第四区域包含基因组DNA的区段，例如，凋亡cfDNA。

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如本文使用的，除非另外指定，否则以下含义适用。措辞“可以”用于允许性的含义(即，意指有可能)，而非强制性的含义(即，意指必须)。措辞“包括/包含(include)”、“包括/包含(including)”和“包括/包含(includes)”等意指包括/包含但不限于。单数形式“一(a)”、“一(a)”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，述及“成分(an element)”包括两个或更多个成分的组合，尽管对于一个或更多个成分使用了其他术语和措辞，诸如“一个或更多个”。除非另外指明，否则术语“或”是非排他性的，即，涵盖“和”和“或”两者。在修饰语和序列之间的术语“……中的任一个”意指修饰语修饰序列中的每一个成员。因此，例如，措辞“至少1、2或3中的任一个”意指“至少1、至少2或至少3”。

应当理解，本说明书和附图并不意图将本发明受制于所公开的特定形式，而是相反，意图覆盖落入由所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的所有修改、等同形式和替代形式。根据本说明书，本发明的各方面的进一步修改和替代实施方案对于本领域技术人员将是明显的。因此，本说明书和附图仅应被解释为说明性的，并且是为了教导本领域技术人员进行本发明的一般方式的目的。应理解，本文示出和描述的本发明的形式应被认为是实施方案的实例。本文说明和描述的成分和物质可以被替换，组成部分(part)和过程可以颠倒或省略，并且本发明的某些特征可以被独立使用，所有这些对了解本发明说明书的益处的本领域技术人员来说都将是明显的。在不脱离如随附权利要求书描述的本发明的精神和范围的情况下，可以对本文描述的成分进行改变。本文使用的标题仅为了组织的目的，并不意味着用来限制本说明书的范围。

序列表

<110> Expedeon有限公司

<120> 用于扩增凋亡无细胞DNA和其他短DNA片段的方法和试剂盒

<130> EXP16541PCT

<150> US62589074

<151> 2017-11-21

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 衔接子1

<400> 1

taacatttgt tggccactca ggccaacaaa tgttat 36

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 衔接子2

<400> 2

taacatttgt tggccttcct cttggccaac aaatgttat 39

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 衔接子3

<400> 3

taacatttgt tggccttttc ctcttttggc caacaaatgt tat 43

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 衔接子4

<400> 4

taacatttgt tggccttttt tttcctcttt tttttggcca acaaatgtta t 51

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 衔接子5

<400> 5

taacatttgt tggccactca ggccaacaaa tgttat 36

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 衔接子6

<400> 6

taacatttgt tggccttcct cttggccaac aaatgttat 39

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 衔接子7

<400> 7

taacatttgt tggccttttc ctcttttggc caacaaatgt tat 43

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 衔接子8

<400> 8

taacatttgt tggccttttt tttcctcttt tttttggcca acaaatgtta t 51

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的(artificial)

<220>

<223> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(15)

<223> n为a、c、g或t

<400> 9

cgactcgagn nnnnnatgtg g 21

<210> 10

<211> 293

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)

<400> 10

Met Arg Pro Ile Glu His Ala Leu Ser Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Gly

1 5 10 15

Val Leu Pro Leu Arg Pro Gly Gly Lys Glu Pro Leu Gly Lys Leu Val

20 25 30

Pro His Gly Leu Lys Asn Ala Ser Arg Asp Pro Ala Thr Leu Glu Ala

35 40 45

Trp Trp Arg Ser Cys Pro Arg Cys Gly Val Gly Ile Leu Pro Gly Pro

50 55 60

Glu Val Leu Val Leu Asp Phe Asp Asp Pro Glu Ala Trp Glu Gly Leu

65 70 75 80

Arg Gln Glu His Pro Ala Leu Glu Ala Ala Pro Arg Gln Arg Thr Pro

85 90 95

Lys Gly Gly Arg His Val Phe Leu Arg Leu Pro Glu Gly Val Arg Leu

100 105 110

Ser Ala Ser Val Arg Ala Ile Pro Gly Val Asp Leu Arg Gly Met Gly

115 120 125

Arg Ala Tyr Val Val Ala Ala Pro Thr Arg Leu Lys Asp Gly Arg Thr

130 135 140

Tyr Thr Trp Glu Ala Pro Leu Thr Pro Pro Glu Glu Leu Pro Pro Val

145 150 155 160

Pro Gln Ala Leu Leu Leu Lys Leu Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg

165 170 175

Pro Ser Trp Gly Ala Val Gly Thr Ala Ser Pro Lys Arg Leu Gln Ala

180 185 190

Leu Leu Gln Ala Tyr Ala Ala Gln Val Ala Arg Thr Pro Glu Gly Gln

195 200 205

Arg His Leu Thr Leu Ile Arg Tyr Ala Val Ala Ala Gly Gly Leu Ile

210 215 220

Pro His Gly Leu Asp Pro Arg Glu Ala Glu Glu Val Leu Val Ala Ala

225 230 235 240

Ala Met Ser Ala Gly Leu Pro Glu Trp Glu Ala Arg Asp Ala Val Arg

245 250 255

Trp Gly Leu Gly Val Gly Ala Ser Arg Pro Leu Val Leu Glu Ser Ser

260 265 270

Ser Lys Pro Pro Glu Pro Arg Thr Tyr Arg Ala Arg Val Tyr Ala Arg

275 280 285

Met Arg Arg Trp Val

290

Claims

1.一种扩增DNA的方法，所述方法包括：

a)提供线性双链DNA分子；

b)将单链衔接子附接至所述线性双链DNA分子的两端以产生单链共价闭合的DNA分子；以及

c)通过(i)滚环扩增和(ii)多重置换扩增，以单次操作扩增所述单链共价闭合的DNA分子。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述线性双链DNA分子包括凋亡无细胞DNA分子，所述凋亡无细胞DNA分子例如，具有小于480bp、小于320bp或在约140bp和180bp之间(例如，平均约160bp)的尺寸。

3.如权利要求1所述的方法，其中提供所述线性双链DNA包括将染色体DNA片段化。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述线性双链DNA源自来自哺乳动物的一种或更多种体液，所述一种或更多种体液例如选自CSF、血液、血浆、血清、腹水、尿液、唾液、泪滴、乳汁、***和滑液。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中提供所述线性双链DNA包括从生物样品的其他细胞组分中分离所述线性双链DNA。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中提供所述线性双链DNA包括末端修复和/或dA加尾。

7.如权利要求5所述的方法，其中末端修复使用T4多核苷酸激酶(PNK)、T4 DNA聚合酶、克列诺片段和T4 DNA聚合酶大片段中的一种或更多种来进行。

8.如权利要求5所述的方法，所述方法包括使用Taq聚合酶进行dA加尾。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述衔接子包含单链DNA分子。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述衔接子具有发夹结构。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括附接具有以下序列的衔接子：5'TAACATTTGTTGGCCACTCAGGCCAACAAATGTTAT3'[SEQ ID NO:1]。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述衔接子包含引发酶/聚合酶识别序列。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中附接衔接子包含平末端连接或粘性末端连接。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括：

提供凋亡无细胞DNA分子；

对所述无细胞DNA分子进行末端修复和dA加尾；以及

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增通过引发酶/聚合酶来引发。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增通过嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)引发酶/聚合酶(TthPrimPol)来引发。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增通过具有序列SEQ ID NO:10的TthPrimPol来引发。

18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增通过人类引发酶/聚合酶(HsPrimPol)来引发。

19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增用随机合成的引物(例如，随机六聚体序列)来引发。

20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增包括使用具有链置换活性的聚合酶进行链延伸。

21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增包括使用Phi29聚合酶进行链延伸。

22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增包括引发酶启动的多重置换扩增。

23.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括使用引发酶/聚合酶在所述DNA上产生引物，并且使用具有链置换活性的聚合酶来延伸所述引物。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述引发酶/聚合酶包括TthPrimPol，并且所述聚合酶包括Phi29聚合酶。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括：

d)对扩增的DNA测序。

26.如权利要求25所述的方法，其中测序包括将所述扩增的DNA片段化，并且将测序平台特异性衔接子附接至片段化的DNA。

27.如权利要求25所述的方法，其中对选定的序列(扩增子)、外显子组、转录组或全基因组进行测序。

28.如权利要求25所述的方法，所述方法还包括：

e)检测被测序的、扩增的DNA中的一种或多于一种遗传变异。

29.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括对扩增的DNA定量。

30.一种扩增DNA的方法，所述方法包括：

a)提供线性双链DNA分子；

b)对所述DNA分子进行末端修复和dA加尾；

c)将发夹衔接子连接至末端修复的dA加尾的DNA分子，以产生加衔接子标签的DNA分子；以及

d)通过(i)滚环扩增和(ii)多重置换扩增(“MDA”)来扩增所述加衔接子标签的DNA分子。

31.如权利要求30所述的方法，其中扩增包括使用Phi29 DNA聚合酶和随机合成的引物进行随机引发的MDA。

32.如权利要求30所述的方法，其中扩增包括用引发酶/聚合酶(例如，TthPrimPol)来引发。

33.一种扩增DNA的方法，所述方法包括：

a)提供线性双链DNA分子；

c)通过热稳定的DNA聚合酶例如Taq聚合酶、随机引物或简并引物和任选的连接酶的任何组合来扩增所述单链共价闭合的DNA分子。

34.如权利要求33所述的方法，其中扩增包括简并寡核苷酸引发的PCR(DOP-PCR)、接头-衔接子PCR(LA-PCR)、引物延伸预扩增PCR(PEP-PCR-/I-PEP-PCR)及其变化形式。

35.一种扩增DNA的方法，所述方法包括：

a)提供线性双链DNA分子；

c)使用热稳定的DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和高度连续性链置换DNA聚合酶(例如，Phi29聚合酶或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(Bst)聚合酶)的任何组合来扩增所述单链共价闭合的DNA分子。

36.如权利要求35所述的方法，其中扩增包括基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。

37.一种试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)引发酶/聚合酶；

(b)具有链置换活性的聚合酶；

(c)脱氧核糖核苷三磷酸；和

(d)单链发夹衔接子。

38.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述引发酶/聚合酶是TthPrimPol。

39.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。

40.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述单链衔接子具有以下序列：5'TAACATTTGTTGGCCACTCAGGCCAACAAATGTTAT 3'[SEQ ID NO:1。

41.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括：

d)选自以下的一种、两种或三种成分：

(i)一种或更多种用于dsDNA末端修复的酶(例如，T4 DNA聚合酶、克列诺片段和/或Taq聚合酶)；

(ii)一种或更多种用于DNA连接的酶；

(iii)任选地，增加DNA连接效率的试剂；

(iv)反应缓冲液；和

(v)与任何前述成分一起使用的缓冲液。

42.如前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括：

(a)用于分离凋亡无细胞DNA的试剂。

44.如权利要求43所述的DNA文库，其中，所述第一区域和所述第三区域具有相同的序列。

45.如权利要求43或权利要求44所述的DNA文库，其中所述第二区域和所述第四区域包含基因组DNA的区段，例如，凋亡cfDNA。