CN111712513A - 双生病毒抗性植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有降低的野生型蛋白质表达的双子叶植物细胞、植物组织或植物，所述野生型蛋白质与SEQ ID NO具有至少75％的序列相同性。另外地，本发明涉及包含经修饰的蛋白质和/或截短的蛋白质的植物细胞、植物组织或植物，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1‑66和位置78‑308的位置上计算时，该经修饰的蛋白质和/或截短的蛋白质具有至少约75％的序列相同性，并且其中与表达无修饰或无截短的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，该经修饰的蛋白质增加了对双生病毒科的抗性。本发明还涉及编码经修饰的或截短的蛋白质的核酸构建体。另外地，本发明涉及用于产生植物细胞、植物组织或植物的方法，该植物细胞、植物组织或植物包含对双生病毒科抗性增加的经修饰的蛋白质。另外地，本发明涉及可通过本发明的方法获得的植物细胞、植物组织或植物。

Description

双生病毒抗性植物
技术领域
本发明涉及植物育种和分子生物学领域。本发明涉及携带赋予对双生病毒科(Geminiviridae)的抗性的突变的植物。
背景技术
昆虫传播的病毒引起一些对农作物植物最具破坏性和经济重要性的疾病。双生病毒是一类具有独特的双二十面体病毒颗粒的单链DNA病毒，其造成很多这些疾病。
双生病毒(Geminiviruses)包含具有以下特征的生物学上和遗传上多样的病毒科(双生病毒科)：测量为～18×30纳米的双准二十面体病毒颗粒(病毒体)和～2.9-5.2千碱基(kb)的小环状单链DNA基因组。基于基因组结构、***发育关系、昆虫载体和宿主范围，已经识别七个属：菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)、玉米线条病毒属(Mastrevirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)、番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)、伊朗甜菜曲顶病毒属(Becurtovirus)、芜菁曲顶病毒属(Turncurtovirus)和弯叶画眉草条纹病毒属(Eragrovirus)。双生病毒通常出现在复合侵染病害(disease complexes)中，并且单个植物可感染多种病毒。双生病毒基因组可经历高突变率、重组率和重配率以增加病毒多样性。它们的基因组由编码参与病毒复制、运动、传播和发病机制的5-7个蛋白质的一个(单粒(monopartite))或两个(双粒(bipartite))DNA组分组成。
在自然界中，双生病毒由韧皮部取食昆虫(包括各叶蝉、角蝉和粉虱种)传播。感染双生病毒的植物表现出广泛的症状，包括发育迟缓；畸变生长；以及单子叶植物中的叶条纹(streaking)和横纹(striation)，以及双子叶植物中的叶皱曲、卷曲、变形、金黄-浅绿-黄花叶/斑点、脉间黄化、黄叶斑和叶脉肿胀、紫化和黄化。
特别重要的是由粉虱(烟粉虱(Bemisia tabaci))传播的双生病毒(属于菜豆金色花叶病毒属)。这是植物病毒的最大属(就物种数量而言)，并且一些导致全世界蔬菜和纤维作物中许多破坏性疾病。管理菜豆金色花叶病毒属是困难的，因为它的粉虱载体种群可以达到巨大的数量。因此，培育抗菜豆金色花叶病毒属的作物提供了吸引人的、对环境无害的策略，以减少由病毒造成的产量损失。菜豆金色花叶病毒属可以具有双粒基因组(大部分来源于南美)，其中A组分编码5或6个蛋白质而B组分编码2个蛋白质，每个组分的大小为2.5-2.8kb，或者具有带有或不带有卫星DNA组分的编码6个蛋白质的单粒基因组。
菜豆金色花叶病毒属的一个实例是栽培番茄的最有破坏性的病毒之一的番茄黄曲叶病毒(TYLCV)。本领域先前已经表明，沉默番茄Pelo基因的表达使得转基因植物对TYLCV具有抗性(WO2014/045206；Lapidot et al,ANovel Route ControllingBegomovirus Resistance by the Messenger RNASurveillance Factor Pelota,PLoSGenetics(2015)11(10):e1005538)。然而，使番茄中Pelo基因的表达沉默也导致总产量的减少和果实大小的减小(Lapidot M等人，同上)。另外地，番茄Pelo基因的沉默可能提供对双生病毒科的单粒成员的抗性，但不提供对双粒双生病毒科成员的任何抗性(Hutton andScott,2015；
http://swfrec.ifas.ufl.edu/docs/pdf/veg-hort/tomato-institute/presentations/ti2015/ti2015_Hutt on.pdf)。因此，在番茄中沉默Pelo基因的应用似乎是有限的。
在辣椒中也出现双生病毒感染，这在亚洲的辣椒栽培中引起严重的问题。辣椒黄曲叶病毒(PYLCV)(De Barro et al.(2008)Avirus and its vector,pepper yellow leafcurl virus and Bemisia tabaci,two new invaders of Indonesia.BiologicalInvasions Vol 10(4),p411-433)和辣椒曲叶病毒(ChiLCV)的爆发已经破坏了作物，而在墨西哥和南部美国，混合感染有Huasteco黄脉病毒(Huasteco yellow vein virus,PHYVV)和辣椒金黄花叶病毒(Pepper Golden mosaic virus,PepGMV)的辣椒已经出现(Renteria-Canett等人，2011)。迄今为止，还没有在辣椒种质中鉴定到合适的抗性来源。
因此，双生病毒已经作为破坏性病原体出现，特别是在热带和亚热带，引起巨大的经济损失并威胁作物生产。由重新出现和新出现的双生病毒引起的流行病甚至在早期没有这些病毒的地区也变得频繁。由于植物材料的整体移动和粉虱载体的传染，预计病毒的传播会进一步增长。因此，本领域强烈需要对双生病毒显示抗性的植物变体。特别地，强烈需要抵抗双生病毒感染的辣椒植物。另外地，需要生产这种抗性植物的有效方法。
发明内容
在第一方面，本发明涉及具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物，其中野生型蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，并且其中优选地野生型蛋白质不在植物细胞、植物组织或植物中表达。
优选地，植物细胞、植物组织或植物与不具有所述野生型蛋白质的降低的表达的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，对双生病毒科的至少一个双粒成员具有增加的抗性。
优选地，植物细胞、植物组织或植物对双生病毒科的至少一个双粒成员和至少一个单粒成员具有增加的抗性。
优选地，本文所定义的植物细胞、植物组织或植物还表达经修饰的蛋白质，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，该经修饰的蛋白质具有至少约75％的序列相同性，并且其中
a)经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰；或
b)经修饰的蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质，
其中与表达无修饰或无截短的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，表达经修饰的蛋白质增加了对双生病毒科的抗性。
优选地，发芽势与表达无修饰的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物的发芽势保持相似。
在一个优选的实施方案中，修饰是缺失至少一个、两个或三个氨基酸残基，其中优选地，修饰是缺失SEQ ID NO：1的位置71、72或73的至少一个氨基酸残基。
优选地，修饰是缺失SEQ ID NO：1的位置71、72和73的氨基酸残基。
优选地，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-378的位置上计算时，包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰的经修饰的蛋白质具有至少95％的序列相同性。
在另一个实施方案中，包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰的经修饰的蛋白由包含与SEQ ID NO：4具有至少75％序列相同性的序列的核酸编码。
优选双生病毒属于菜豆金色花叶病毒属。
在一个优选的实施方案中，本文所定义的植物细胞、植物组织或植物是双子叶植物，优选选自辣椒属(Capsicum)、食用番茄(Solanum lycopersicum)、木薯(Manihotesculenta)、棉属(Gossypium)、葫芦科(Cucurbitaceae)(例如，西葫芦(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、甜瓜(Cucumis melo)和黄瓜(Cucumis sativus))、茄子(Solanum melongena)、咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)和豆科(Fabaceae)。
优选地，植物是辣椒属，优选地是一年生辣椒(Capsicum annuum)，并且其中修饰增加对辣椒黄曲叶印度尼西亚病毒(Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus)和/或辣椒曲叶病毒(Pepper Leaf Curl Virus)的抗性。
在第二方面，本发明涉及在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少75％序列相同性的经修饰的蛋白质，以及其中
i)经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰，并且其中优选地所述蛋白质具有SEQ ID NO：3的序列；或
ii)经修饰的蛋白质为具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质；并且其中优选地蛋白质具有SEQ ID NO：5的序列。
在第三方面，本发明涉及包含编码如本文所定义的蛋白质的序列的核酸。
在第四方面，本发明涉及包含如本文所定义的核酸的核酸构建体，其中核酸优选与用于在植物细胞中表达的启动子可操作地连接。
在第五方面，本发明涉及用于产生对双生病毒科具有增加的抗性的植物细胞、植物组织或植物的方法，其包含以下步骤：
i)提供植物细胞、植物组织或植物；
ii)降低野生型蛋白质的表达，其中所述蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，其中优选地不表达野生型蛋白质，
iii)选择具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物，优选其中不表达野生型蛋白质；和
iv)使所选择的植物再生。
优选地，步骤ii)通过修饰编码野生型蛋白质的基因来进行，产生编码经修饰的蛋白质的基因，所述经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰；或在编码经修饰的蛋白质的基因中，是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质。
在本发明的优选方法中，植物是双子叶植物，优选选自辣椒属、食用番茄、木薯、棉属、葫芦科、茄子、咖啡黄葵和豆科组成的组。
在进一步优选的方法中，双生病毒科属于菜豆金色花叶病毒属。
在第六方面，本发明涉及可通过如本文所定义的本发明的方法获得的植物。
在进一步的方面，本发明涉及用于在植物细胞、植物组织或植物中增加对双生病毒科的至少双粒成员的抗性的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)提供植物细胞、植物组织或植物；
ii)降低野生型蛋白质的表达，其中蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，其中优选地所述野生型蛋白质不表达；以及
iii)任选地，筛选植物细胞、植物组织或植物对双生病毒科的至少双粒成员的增加的抗性。
定义
在整个说明书和权利要求书中使用与本发明的方法、组合物、用途和其它方面相关的各种术语。除非另外指明，否则此类术语将给出其在本发明所属领域中的普通含义。其它具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式解释。尽管与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料可用于实施本发明的测试，但本文描述了优选的材料和方法。
实施本发明方法中使用的常规技术的方法对于本领域技术人员是明显的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中的常规技术的实践是本领域技术人员熟知的，并且例如在下列参考文献中讨论：Sambrook等人.Molecular Cloning.ALaboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；Ausubel等人.Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates；andthe series Methods in Enzymology,Academic Press,San Diego。
单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“细胞”包括两种或更多种细胞的组合等。不定冠词“一”或“一个”因此通常意指“至少一个”。
术语“和/或”是指其中一种或多种所述情况可单独或与至少一种所述情况组合出现，直至与所有所述情况组合出现的情形。
如本文所用，术语“约”用于描述和解释小的变化。例如，该术语可以指小于或等于±(+或-)10％，例如小于或等于±5％、小于或等于±4％、小于或等于±3％、小于或等于±2％、小于或等于±1％、小于或等于±0.5％、小于或等于±0.1％，或小于或等于±0.05％。另外，本文中有时以范围形式呈现量、比率和其它数值。应当理解，使用这种范围形式是为了方便和简洁，并且应当灵活地理解为包括明确指定为范围的界限的数值，而且还包括该范围内涵盖的所有单个数值或子范围，如同每个数值和子范围都被明确指定一样。例如，在约1至约200范围内的比率应当理解为包括明确列举的约1和约200的界限，还包括单独的比率，例如约2、约3和约4，以及子范围，诸如约10至约50、约20至约100等。
术语“包含”被解释为是包括性的和开放式的，而不是排他的。具体地，该术语及其变体意味着包括指定的特征、步骤或组分。这些术语不应被解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。
术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用并且是指由氨基酸链组成的分子，而不涉及特定的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，蛋白质的“片段”或“部分”仍可称为“蛋白质”。“分离的蛋白质”用于指不再处于其天然环境例如体外或重组细菌或植物宿主细胞中的蛋白质。
“植物”是指整个植物或植物的部分，诸如可从植物获得的细胞、组织或器官(例如花粉、种子、配子、根、叶、花、花芽、花药、果实等)，以及这些中的任何一种的衍生物和通过自交或杂交从这种植物衍生的后代。
“(一个或多个)植物细胞”包括原生质体、配子、悬浮培养物、小孢子、花粉粒等，它们或者是分离的或者是在组织、器官或生物体内。植物细胞可以是例如愈伤组织或分生组织的一部分。
用于培养植物的“类似条件”尤其是指除了其它之外使用类似的温度、湿度、营养和光照条件，以及类似的灌溉和昼/夜节奏。
术语“同源性”、“序列相同性”等在本文中可互换使用。序列相同性在本文中定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定。在本领域中，“相同性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配所确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二多肽的序列进行比较来确定。可以通过已知方法容易地计算“相同性”和“相似性”。
可以通过使用全局或局部比对算法将两个肽或两个核苷酸序列比对来确定“序列相同性”和“序列相似性”，这取决于两个序列的长度。优选使用全局比对算法(例如Needleman Wunsch)比对相似长度的序列，所述算法在整个长度上最佳地比对序列，而优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)比对基本上不同长度的序列。当序列(当通过例如GAP或BESTFIT程序使用默认参数进行最佳比对时)具有至少一定的最小序列相同性百分比(如下文定义)时，则可将其称为“基本上相同”或“基本上相似”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法来在两个序列的整个长度(全长)上比对这两个序列，从而最大化匹配的数目并最小化空位的数目。当两个序列具有相似的长度时，全局比对适合用于确定序列相同性。通常，使用GAP默认参数，其中空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，所使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS89,915-919)。可以使用以下来确定序列比对和百分比序列相同性的得分：计算机程序诸如GCG Wisconsin Package，版本10.3，可从Accelrys Inc.,9685Scranton Road，San Diego，CA92121-3752USA获得；或使用开源软件诸如在EmbossWIN版本2.10.0中的程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“water”(使用局部Smith Waterman算法)；使用与上述GAP相同的参数，或使用默认设置(对于‘needle’和‘water’两者，以及针对蛋白质和DNA比对两者，默认的空位开放罚分为10.0，而默认的空位延伸罚分为0.5；默认评分矩阵为针对蛋白质的Blossum62和针对DNA的DNAFull)。当序列具有基本上不同的全长时，优选局部比对，诸如使用Smith Waterman算法的局部比对。
可替代地，可以通过使用诸如FASTA、BLAST等算法检索公共数据库来确定百分比相似性或相同性。因此，本发明的核酸和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以检索公共数据库，以例如鉴定其它家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的BLASTn和BLASTx程序(2.0版)进行这种检索。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索(评分＝100，字长＝12)以获得与本发明的氧化还原酶核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTx程序进行BLAST蛋白质检索(评分＝50，字长＝3)以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的空位比对，可以使用Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各程序(例如，BLASTx和BLASTn)的默认参数。见国家生物技术信息中心主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
术语“核酸构建体”和“核酸载体”在本文中可互换使用，并且在本文中定义为由使用重组DNA技术产生的人造核酸分子。因此，尽管核酸构建体可以包含(部分)天然存在的核酸分子，但是术语“核酸构建体”和“核酸载体”不包括天然存在的核酸分子。
术语“基因”是指包含在细胞中转录成RNA分子(例如mRNA)的区域(转录区域)的DNA片段，该区域与合适的调节区域(例如启动子)可操作地连接。基因通常包含几个可操作连接的片段，诸如启动子、5’前导序列、编码区域和包含聚腺苷酸化位点的3'非翻译序列(3'末端)。“基因的表达”是指这样的过程，其中与适当的调节区域，特别是启动子可操作地连接的DNA区域被转录成RNA，该RNA具有生物活性，即能够被翻译成具有生物活性的蛋白质或肽。
“启动子”是指功能为控制一种或多种核酸转录的核酸片段。启动子片段相对于基因的转录起始位点的转录方向位于上游(5’)，并且通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、(一个或多个)转录起始位点的存在而进行结构鉴定，并且可以进一步包含任何其它DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和激活物蛋白质结合位点，以及本领域技术人员已知直接或间接作用以调节来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。
任选地，术语“启动子”还可以包括5’UTR区域(5’非翻译区域)(例如，本文中的启动子可以包括转录区域的翻译起始密码子上游的一个或多个部分，因为该区域可以在调节转录和/或翻译中具有作用)。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是生理学上调节(例如通过外部施用某些化合物)或发育上调节的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。
具体实施方式
本发明涉及具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物，其中野生型蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性。本发明人发现，与表达野生型蛋白质的其它方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，这样的植物细胞、组织或植物对双生病毒科具有增加的抗性。更特别地，本发明人发现修饰编码该野生型蛋白的基因，产生编码如本文进一步详述的经修饰的蛋白质的核酸序列，提供了针对双生病毒科的双粒成员和单粒成员的抗性。另外地，本发明人发现本文所定义的经修饰的蛋白质的表达保持了植物的发芽势。因此，本发明代表了作物保护的重要进步。
因此，在第一方面，本发明涉及具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物，其中所述蛋白质与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性。
野生型蛋白质在本文中定义为由通常(即天然)存在于植物细胞、植物组织或植物中的基因编码的蛋白质，并且，例如当它在自然中出现时在特定环境条件下在至少特定发育阶段中进行表达。因此，野生型蛋白质是在其天然环境中天然表达的蛋白质。另外地，如本文所理解的野生型蛋白质还可以是首先已被遗传失活(例如通过敲除蛋白质)然后将相同的蛋白质再引入植物细胞、植物组织或植物中的天然存在的蛋白质。即使这样的通常天然存在的蛋白质在先前被再引入植物中，它却因此被认为是野生型蛋白质。
优选地，野生型蛋白质与SEQ ID NO：1具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列相同性。在另一个实施方案中，野生型蛋白质包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。优选地，野生型蛋白质包含选自SEQ ID NO：1和11-18的序列或由选自SEQ ID NO：1和11-18的序列组成，甚至更优选地，包含选自SEQ ID NO：1和11-16的序列或由选自SEQ ID NO：1和11-16的序列组成。在一个实施方案中，野生型蛋白质不是SEQ ID NO：17和/或不是SEQ ID NO：18。
优选与对照植物中的表达水平相比表达降低。对照植物在本文中定义为其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物，该植物细胞、植物组织或植物未经修饰而具有降低的蛋白质表达，该蛋白质与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，例如，植物细胞、植物组织或植物具有蛋白质的野生型表达水平，优选如本文所定义的野生型蛋白质的野生型表达水平。另外地，对照植物也不表达本文所定义的经修饰的蛋白质。
优选地，对照植物包含编码通常存在于植物细胞、植物组织或植物中的野生型蛋白质的基因。优选地，对照植物细胞、组织或植物是辣椒属，优选一年生辣椒(C.annuum)、下垂辣椒(C.baccatum)、中国辣椒(C.chinense)、灌木状辣椒(C.frutescens)或茸毛辣椒(C.pubescens)。优选地，对照植物细胞、植物组织或植物是一年生辣椒，优选一年生辣椒品种Maor植物。该植物可以是一年生辣椒品种Maor M2植物。
在一个实施方案中，与对照植物相比，表达降低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或约100％。
可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法实现本文所定义的野生型蛋白质的表达降低。降低(例如敲低)野生型蛋白质表达的非限制性实例包括siRNA、表观遗传学沉默、基因组调节序列的修饰和/或编码野生型蛋白质的内源序列的至少一个等位基因(优选两个等位基因)的至少一个核苷酸的修饰或缺失。优选地，编码野生型蛋白质的序列与SEQID NO：2具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列相同性。
在一个优选的实施方案中，不表达野生型蛋白质，即表达被敲除。结果，在植物细胞中不再检测到野生型蛋白质。可以表达改变的、非功能性和/或截短的蛋白质来替代表达野生型蛋白质。可以通过本领域技术人员已知的任何常规手段实现敲除野生型蛋白质的表达。这样的常规方法包括，但不限于，修饰或缺失编码野生型蛋白质的所有内源序列的至少一个核苷酸。优选地，编码野生型蛋白质的序列与SEQ ID NO：2具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列相同性。可替代地或另外可通过修饰或(部分)缺失一个或多个调节序列来实现野生型蛋白质的缺乏。
修饰或缺失编码序列和/或调节序列的非限制性实例是使用CRISPR技术，诸如CRISPR-Cas或CRISPR-Cpf 1。
通过修饰基因组调控序列可以降低或敲除野生型蛋白质的表达。作为非限制性实例，可以通过遗传修饰与SEQ ID NO：8具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列相同性的序列来降低或敲除野生型蛋白质的表达。
遗传修饰可以是突变，诸如但不限于对一个或多个碱基对的***、缺失或取代中的至少一种，优选对至少约1-500、1-400、1-300、1-250、1-200、1-150、1-100、1-50、1-25、1-20、1-15或至少1-10个碱基对的***、缺失或取代中的至少一种。
在另一个实施方案中，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物具有降低的野生型蛋白质的表达，其中该野生型蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，并且其中该植物细胞、植物组织或植物具有对双生病毒科的增加的(病毒)抗性，并且其中优选地该双生病毒科属于菜豆金色花叶病毒属。
优选双生病毒科包括至少一个或多个单粒成员。优选地，双生病毒科包括至少一个或多个双粒成员。优选地，双生病毒科包括至少一个或多个单粒成员和双粒成员。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物，其中野生型蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，并且其中与不具有降低的所述野生型蛋白质表达的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，该植物细胞、植物组织或植物对双生病毒科的至少一个双粒成员具有增加的抗性。优选地，植物细胞、植物组织或植物对双生病毒科的至少一个双粒成员和至少一个单粒成员具有增加的抗性。优选地，野生型蛋白质不在植物细胞、植物组织或植物中表达。
优选地，双生病毒科的单粒成员和/或双粒成员是能够感染本文所述植物的病毒。
优选地，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物不表达野生型蛋白质。
优选地，双生病毒科包括单粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个或多个成员。优选地，双生病毒科包括双粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个或多个成员。优选地，双生病毒科包括单粒和双粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个或多个成员。
在一个实施方案中，单粒和/或双粒菜豆金色花叶病毒属是能够感染本文所述植物的病毒。
在一个实施方案中，如本文所定义的具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物是(或可获自)辣椒属，优选一年生辣椒，其中植物细胞、植物组织或植物对能够感染辣椒属植物的单粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个成员具有增加的抗性。对能够感染辣椒属植物的单粒菜豆金色花叶病毒属的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个成员的抗性可增加。
在另一个实施方案中，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物是(或可获自)辣椒属，优选一年生辣椒，并且其中植物细胞、植物组织或植物对能够感染辣椒属植物的单粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个成员具有增加的抗性，并且其中该植物细胞、植物组织或植物还对能够感染辣椒属植物的双粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个成员具有增加的抗性。对能感染辣椒属植物的单粒菜豆金色花叶病毒属的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个成员和/或对能感染辣椒属植物的双粒菜豆金色花叶病毒属的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个成员的抗性可增加。
在一个实施方案中，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物是(或可获自)辣椒属，优选一年生辣椒，并且该植物细胞、植物组织或植物对能够感染辣椒属植物的双粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个成员具有增加的抗性。对能够感染辣椒属植物的双粒菜豆金色花叶病毒属的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个成员的抗性可增加。
在一个实施方案中、能够感染辣椒属植物的单粒和/或双粒菜豆金色花叶病毒属的成员选自辣椒黄曲叶病毒、辣椒曲叶病毒、辣椒Huasteco黄脉病毒、辣椒金黄花叶病毒、辣椒黄曲叶印度尼西亚病毒、辣椒曲叶病毒、锡那罗亚番茄曲叶菜豆金色花叶病毒、辣椒曲叶拉合尔病毒、曲顶病毒、辣椒mild tigre病毒、辣椒曲叶孟加拉病毒、辣椒卷叶病毒、辣椒黄脉马里病毒、辣椒得克萨斯菜豆金色花叶病毒、辣椒金黄花叶菜豆金色花叶病毒；辣椒Huasteco菜豆金色花叶病毒；辣椒Huasteco bigeminivirus、辣椒Huasteco病毒、辣椒Huasteco黄脉菜豆金色花叶病毒、辣椒曲叶孟加拉菜豆金色花叶病毒、辣椒曲叶菜豆金色花叶病毒、辣椒mild tigre菜豆金色花叶病毒、辣椒mild tigre bigeminivirus和辣椒mild tigre geminivirus。
在一个优选的实施方案中，本发明的植物细胞、植物组织或植物对辣椒黄曲叶病毒、辣椒曲叶病毒、辣椒Huasteco黄脉病毒、辣椒金黄花叶病毒和/或辣椒黄曲叶印度尼西亚病毒中的至少一种具有增加的抗性。
优选地，本发明的植物细胞、植物组织或植物对辣椒黄曲叶病毒、辣椒曲叶病毒、辣椒Huasteco黄脉病毒和辣椒金黄花叶病毒中的至少一种具有增加的抗性。
优选地，本发明的植物细胞、植物组织或植物对辣椒黄曲叶病毒和辣椒曲叶病毒中的至少一种具有增加的抗性。
优选地，本发明的植物细胞、植物组织或植物对辣椒曲叶病毒，优选毒株M156(PLCV M156)、黄曲叶印度尼西亚病毒(PepYLCIV)、Huasteco黄脉病毒(PHYVV)、辣椒金黄花叶病毒和甜菜曲顶病毒(BCTV)中的至少一种具有增加的抗性。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物，其中蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，其中优选地不表达野生型蛋白质，并且其中植物细胞、植物组织或植物表达经修饰的蛋白质。优选地，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，经修饰的蛋白质具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列相同性的序列。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物，其中蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，其中优选地不表达野生型蛋白质，并且其中植物细胞、植物组织或植物表达当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时具有至少约75％序列相同性的蛋白质，并且其中蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰。在一个实施方案中，与表达未经修饰的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，经修饰的蛋白质的表达增加了对双生病毒科的抗性。
本文所定义的经修饰的蛋白质的表达可以由内源启动子控制，诸如但不限于控制本文所定义的野生型蛋白质表达的启动子。优选地，启动子与SEQ ID NO：8具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约100％的序列相同性。
优选地，包含修饰的蛋白质与SEQ ID NO：1具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，并且优选地，经修饰的蛋白质在其全长上与SEQ ID NO:1具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或约99％的序列相同性。优选地，该蛋白质与SEQ ID NO：1具有约99.2％的序列相同性。优选地，SEQ ID NO：1对应于NCBI登录号XP_016572281.1。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物，其中蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，并且其中优选地不表达野生型蛋白质。
植物、植物组织或植物细胞优选表达经修饰的蛋白质，该经修饰的蛋白质为截短的蛋白质。该截短的蛋白质可包含或由野生型蛋白质的N-末端序列，优选至少10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300或350个N-末端氨基酸组成。优选地，植物、植物组织或植物细胞表达与SEQ ID NO：1具有至少约75％序列相同性的经修饰的蛋白质，其中蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质。优选地，植物、植物组织或植物细胞表达经修饰的蛋白质，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，经修饰的蛋白质具有至少约75％的序列相同性，并且其中蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质。在一个实施方案中，与表达无截短的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，截短的蛋白质的表达增加了对双生病毒科的抗性。
优选地，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-298的位置上计算时，截短的蛋白质具有至少约75％的序列相同性，并且其中蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置的缺失的截短蛋白质，该位置选自299-378、300-378、301-378、302-378、303-378、304-378、305-378、306-378、307-378、308-378、309-378、310-378、311-378、312-378、313-378、314-378、315-378、316-378、317-378、318-378、319-378和320-378。优选地，当在对应于SEQID NO：1的位置1-66和位置78-304的位置上计算时，截短的蛋白质具有至少约75％的序列相同性，并且其中蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置的缺失的截短的蛋白质，该位置选自305-378、306-378、307-378、308-378、309-378、310-378、311-378、312-378和313-378。
优选地，截短是缺乏对应于SEQ ID NO：1的位置的氨基酸残基，该位置选自299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318或319直至并包括对应于SEQ ID NO：1的位置的氨基酸残基，该位置选自360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377和378。
优选地，截短是由于在编码截短的蛋白质的DNA分子中存在终止密码子。优选地，当在对应于位置1-915(优选位置1-924)的位置上计算时，在与SEQ ID NO：2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的DNA分子中存在终止密码子，并且其中终止密码子存在于对应于选自位置916-918、919-921、922-924、925-927、928-930、931-933和934-936的位置处。优选地，终止密码子存在于对应于SEQ ID NO：2的位置925-927的位置处。
优选地，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-308的位置上计算时，截短的蛋白质与SEQ ID NO：1具有至少75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。
优选地，经修饰的蛋白质仅包含如本文所定义的截短。
在一个优选的实施方案中，无修饰和/或无截短的蛋白质包含或由与野生型蛋白质相同的氨基酸序列组成。因此，野生型蛋白质可以是与没有如本文所定义的修饰的蛋白质相同的蛋白质。因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及表达经修饰的蛋白质的植物细胞、植物组织或植物，该经修饰的蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，并且其中蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰；或者经修饰的蛋白质为具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质，其中与表达无修饰或无截短的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，该修饰或截短提高了对双生病毒科的抗性，并且其中无修饰或无截短的蛋白质是蛋白质的野生型形式。优选地，表达经修饰的蛋白质的植物细胞、植物组织或植物不表达蛋白质的野生型版本。
如本文所定义的植物细胞、组织或植物可包含经修饰的蛋白质，其中经修饰的蛋白质i)在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，并且其中经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰，或ii)其中当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-308的位置上计算时，经修饰的蛋白质是具有至少75％序列相同性的截短的蛋白质，并且其中截短的蛋白质具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失。
可替代地，如本文所定义的植物细胞、组织或植物可包含至少两种不同的经修饰的蛋白质，其中i)一种经修饰的蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，并且其中经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰，和ii)当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-308的位置上计算时，经第二修饰的蛋白质为具有至少75％序列相同性的截短的蛋白质，并且其中截短的蛋白质具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失。
经修饰的蛋白质在本文中被理解为以下中的至少一种：
i)当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，具有至少约75％的序列相同性的蛋白质，并且其中经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰；和
ii)当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，具有至少约75％序列相同性的截短的蛋白质，并且其中截短的蛋白质具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失，除非文中清楚地指出，否则意指仅包含修饰的蛋白质或仅包含截短的蛋白质。
在一个实施方案中，与不表达经修饰的蛋白质的相同植物细胞、植物组织或植物(例如其它方面相同的植物)相比，包含经修饰的蛋白质的植物细胞、组织或植物对双生病毒科具有增加的抗性。优选地，表达经修饰的蛋白质的植物细胞、组织或植物在与其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物在相同的条件下生长。
在一个实施方案中，蛋白质包含在SEQ ID NO：1的位置68-76、69-75、70-74，优选地位置71-73处的一个或多个氨基酸残基的修饰。优选地，经修饰的蛋白质仅包含在SEQ IDNO：1的位置68-76、69-75、70-74，优选位置71-73处的一个或多个氨基酸残基的修饰。本文中一个或多个氨基酸修饰应理解为经修饰的蛋白质可在对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的残基中包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸修饰。因此，在SEQ ID NO：1的位置67、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77中的至少一个位置处存在修饰。
修饰可以是用不同的天然或非天然存在的氨基酸残基取代所述区域中的一个或多个氨基酸残基。因此，一个氨基酸残基可以被另一个天然或非天然存在的氨基酸残基取代。可替代地或另外地，在对应于SEQ ID NO：1的位置67、68、69、70、71、72、73、74、75、76和/或77的至少一个位置处的至少一个氨基酸残基可以被至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个天然或非天然存在的氨基酸残基取代。另外，修饰可以是使所述区域中的氨基酸残基缺失。例如，修饰SEQ ID NO：1的位置71处的氨基酸可以是缺失位置71处的氨基酸残基。
使用本领域技术人员已知的任何常规方法，可以容易地确定植物细胞、植物组织或植物是否对双生病毒科具有增加的抗性。
作为一个非限制性实例，可以在选择的受控条件(以便在对照植物中在一定时期后可以观察到至少一种疾病征兆)下通过将对照植物与具有降低的野生型蛋白质表达的植物进行比较来确定对双生病毒科的一个或多个成员的抗性增加，其中野生型蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性。这样的受控条件包括例如用一种或多种能够感染和/或侵染的双生病毒科病毒(诸如本文所定义的双生病毒科的一个或多个成员)感染侵染植物。
作为进一步的非限制性实例，可以通过在选择的受控条件(以便在对照植物中在一定时期后可以观察到至少一种疾病征兆)下将对照植物与提供有如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物进行比较来确定对双生病毒科的一个或多个成员的抗性的增加。这样的受控条件包括例如用一种或多种能够感染和/或侵染的双生病毒科病毒，诸如本文所定义的双生病毒科的一个或多个成员感染或侵染植物。
在一个实施方案中，具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达的植物对双生病毒科的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或所有成员具有增加的抗性。优选地，所述植物对双生病毒科的一个或多个双粒成员具有增加的抗性。
在另一个实施方案中，表达经修饰的蛋白质的植物具有针对双生病毒科的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50或所有成员具有增加的抗性。优选地，所述植物对双生病毒科的一个或多个双粒成员具有增加的抗性。
在所选择的受控条件下，对照植物优选显示出至少一种疾病征兆(即一种症状)。疾病症状是本领域技术人员熟知的。这些症状包括但不限于发育迟缓、畸变生长、叶皱曲、卷曲、变形、金黄-浅绿-黄花叶/斑点、脉间黄化、变色(例如黄叶斑)、叶脉肿胀、紫化和/或一定时期后黄化。该疾病的症状可包括至少叶片卷曲和/或变色。对照植物在一定时期后可以显示至少1、2、3、4、5、6、7或8种疾病征兆。可替代地，对照植物在一定时期后可显示不超过1、2、3、4、5、6、7或8种疾病征兆。
本文所用的一定时期优选为在对照植物中观察到至少一种、两种或三种疾病征兆之前的任何时期，并且该时期可取决于实验设置。可以由本领域技术人员容易地确定这样的时期。优选地，观察到至少一种、两种或三种疾病征兆之前的时期为至少约20、30、35、40、45、50、60或约70天。优选地，观察到症状前的时期为约2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月。
优选地，在如本文所定义的一定时期之后，与对照植物相比，具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达的植物将显示更少和/或减少的疾病征兆。
优选地，在如本文所定义的一定时期之后，与对照植物相比，包含如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物将显示更少的和/或减少的疾病征兆。
作为一个非限制性实例，具有降低的如在本文所定义的野生型蛋白质的表达的并且任选地，进一步包含如在本文所定义的经修饰的蛋白质的植物可显示出与对照植物相比的以下各项中的至少一种：减少的发育迟缓、畸变生长、叶皱曲、卷曲、变形、金黄-浅绿-黄花叶/斑点、脉间黄化、变色(例如黄叶斑)、叶脉肿胀、紫化和黄化。该疾病的症状可包括至少叶片卷曲和/或变色。可替代地或另外地，具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达的并且任选地，还包含本文所定义的经修饰的蛋白质的植物可以以与对照植物相似或相同的严重性显示本文所定义的一种或多种疾病征兆，然而，与对照植物相比，疾病的一种或多种征兆将在较晚的时期出现，例如疾病的一种或多种症状将有延迟。作为非限制性实例，与对照植物相比，可以存在至少1、2、3、4、5、6、7或8周的延迟。本领域技术人员知道如何选择合适的条件，诸如下文详述的实施例部分中使用的受控条件。
当植物对双生病毒科具有增加的抗性时，当植物经受双生病毒科的至少一个成员的感染时，其优选能够维持正常生长和/或正常发育，否则感染将导致植物的生长降低和/或发育降低。因此，可以通过比较植物来确定对双生病毒科的增加的抗性。作为非限制性实例，可以将具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达的并且任选地，进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质的一种植物与一种对照植物进行比较。可替代地或另外地，可以将具有降低的如在本文所定义的野生型蛋白质的表达的并且任选地，进一步表达如在本文所定义的经修饰的蛋白质的一组植物与一组对照植物进行比较。每组可以包含例如至少2、3、4、5、10、15、20、25、50或100个单独的植物。
本领域技术人员充分知晓如何选择合适的条件以确定对双生病毒科增加的抗性以及如何测量感染征兆。作为非限制性实例，可通过肉眼检查例如变色和/或叶卷曲来测量对双生病毒科成员的抗性。
在一个实施方案中，通过对在用双生病毒科的至少一个成员感染后，优选在本文所定义的条件下，对变色的叶子的数目进行计数来确定对双生病毒科的至少一个成员的抗性。与如本文所定义的对照植物相比，在具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物中，变色的叶子的数目较少或缺乏(病毒诱导的)变色的叶子。
本领域技术人员知道如何评估病毒感染后叶子的变色。作为非限制性实例，可以通过目视检查或通过计数显示变色的叶子来确定变色的量。作为非限制性实例，如果叶子具有至少一个(病毒诱导的)变色的叶斑，则叶子被计数为变色的。可替代地，如果叶子具有至少2、3、4、5、6或7个病毒诱导的变色的叶斑，则叶子显示为变色。该变色的叶斑的直径可以优选地是至少10mm、25mm、50mm、1cm或至少5cm。在另一实施方案中，变色的叶斑的表面为至少10mm、25mm、50mm、1cm或至少5cm。
感染的对照植物可以具有病毒诱导的至少一种叶子的变色。可替代地，感染的对照植物具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个变色的叶。具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达的并且任选地，进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物优选不显示任何(病毒诱导的)变色的叶子。可替代地，与感染的对照植物的叶数相比，具有降低的所述野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达经修饰的蛋白质的植物可以具有更少的变色的叶子。优选地，(病毒诱导的)变色的叶子数小于感染的对照植物的变色的叶子数的80％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％。
可替代地或另外地，与具有本文所定义的野生型蛋白的降低的表达，并且任选地，进一步表达本文所定义的经修饰的蛋白质的叶子相比，对照植物的叶子具有更多的变色叶斑每个叶子。对照植物的所有叶子的变色程度可以与具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物的所有叶子的变色相比。可以通过视觉检查或通过计数如上文定义的变色的叶斑的数目并将叶斑的数目除以叶子的数目每株植物来确定所有植物叶子的变色程度。
可替代地或另外地，可以通过肉眼检查叶子卷曲来测量对双生病毒科成员的抗性。在一个实施方案中，优选在本文所定义的条件下，通过计数感染至少一个双生病毒科成员后卷曲的叶子的数目来确定针对双生病毒科的至少一个成员的抗性。与如本文所定义的对照植物相比，在具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物中，卷曲的叶子的数目较少或缺乏(病毒诱导的)卷曲的叶子。
本领域技术人员知道如何评估病毒感染后叶子的卷曲。作为非限制性实例，可以通过对卷曲的叶子的数目进行计数来确定卷曲的程度。感染的对照植物可以具有病毒诱导的至少一个叶子的卷曲。可替代地，感染的对照植物具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个卷曲的叶子。具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物优选地不显示任何(病毒诱导的)卷曲的叶子。可替代地，具有降低的如在本文所定义的野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达经修饰的蛋白质的植物与感染的对照植物的叶子的数目相比可以具有更少的卷曲的叶子。优选地，(病毒诱导的)卷曲的叶子数目小于感染的对照植物的变色的叶子数目的80％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％。
可以通过对无病植物的数目进行计数来确定抗性植物的百分比。在一个实施方案中，确定具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达经修饰的蛋白质的无病植物的数目。优选地，具有降低的本文所定义的野生型蛋白的表达并且任选地，进一步表达经修饰的蛋白质的植物暴露于至少一个双生病毒科成员，并且无病植物的数目是暴露于双生病毒科成员之前植物数目的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约100％。在另一个实施方案中，可以通过基于PCR检测双生病毒科的一个或多个成员来确定对双生病毒科的至少一个成员的抗性，诸如实施例2所述。
在一个实施方案中，可以在侵染的易感植物中确定双生病毒科的至少一个成员的相对滴度。另外地，可以在具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达的侵染的植物中确定双生病毒科的相同的至少一个成员的相对滴度，并且其中植物任选地进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质。从易感植物获得的滴度可与从具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质表达的植物获得的滴度相比较，并且其中植物任选地进一步表达经修饰的蛋白质。在一个优选的实施方案中，从易感植物获得的滴度设定为100％，优选地，从抗性植物获得的滴度与从易感植物获得的滴度相比为至多(不大于)约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.5％或约0.1％。
可以使用本领域已知的任何常规方法，包括但不限于基于qPCR的检测来确定相对滴度。
在一个实施方案中，可以如Scott等人(Introgression of resistance towhitefly-transmitted geminiviruses from Lycopersicon chilense to tomato)(1996),p.357-367.In:Gerling,D.and R.T.Mayer(eds.).Bemisia 1995：Taxonomy,biology,damage control,and management.Intercept Ltd.,Andover,Hants,UK)和/或Lapidot等人(Development of a Scale for Evaluation of Tomato yellow leaf curlvirus Resistance Level in Tomato Plants)”,Phytopathology(2006)96(12):1404-8.)描述的来确定对双生病毒科的至少一个家族成员的抗性。可以通过在0至4疾病严重性指数标度上对疾病严重性分级来测量抗性。例如，如果疾病严重程度评分为0，则认为植物具有抗性。该标度划分如表1所示。
表1：与双生病毒科抗性相关的疾病严重性。
评分 症状可见性 抗性
0 无症状 抗性
1 仅在密切观察时可见轻微症状 抗性
2 中度症状，仅在植物的一部分上，2-3米处可见 中度
3 整个植物的症状，植物的一些发育迟缓 症状/易感
4 整个植物症状严重，发育迟缓严重 症状/易感
在一个优选的实施方案中，当在相同条件下生长时，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的植物具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达本文所定义的经修饰的蛋白质，评分为0-2，优选0-1，其中至少约60％、70％、80％、90％或100％的对照植物评分为3-4。
在一个优选的实施方案中，当在相同条件下生长时，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的植物具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达本文所定义的经修饰的蛋白质，评分为3，其中至少约60％、70％、80％、90％或100％的对照植物评分为4。
在一个优选的实施方案中，当在相同条件下生长时，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的植物具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达本文所定义的经修饰的蛋白质，评分为2，其中至少约60％、70％、80％、90％或100％的对照植物评分为4。
在一个优选的实施方案中，当在相同条件下生长时，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的植物具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达本文所定义的经修饰的蛋白质，评分为1，其中至少约60％、70％、80％、90％或100％的对照植物评分为4。
在一个优选的实施方案中，当在相同条件下生长时，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的植物具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达本文所定义的经修饰的蛋白质，评分为0，其中至少约60％、70％、80％、90％或100％的对照植物评分为4。
在一个实施方案中，当在相同条件下生长时，至多约0％、1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％或至多约60％的植物具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达本文所定义的经修饰的蛋白质，评分为3或4，其中至少约90％、95％或100％的对照植物评分为3或4。
在另一个实施方案中，当在相同条件下生长时，至多约0％、1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％或至多约60％的植物具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达本文所定义的经修饰的蛋白质，评分为3或4，其中至少约90％、95％或100％的对照植物评分为3或4，并且其中至少1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％的植物具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达修饰的蛋白质，评分为0或1。
在另一个实施方案中，如例如Obaiah等人(2013)(Screening of some blackgram(Vignamungo(L.)Hepper)genotypes for resistance to yellow mosaic virus).Current Biotica7(1&2)：p96-100)所述通过以1-9的标度评定疾病严重性来确定对双生病毒科的至少一个成员的抗性，从而分类为“9”的植物完全易感，而那些分类为“1”的植物为无症状的，该文献通过引用并入本文。在一个优选的实施方案中，当在相同条件下生长时，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的植物具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达本文所定义的经修饰的蛋白质，评分为1-3，优选为1-2，其中至少约60％、70％、80％、90％或100％的对照植物评分为6-9，优选为7-9或8-9。
在另一个实施方案中，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物是具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达的植物细胞、植物组织或植物，并且任选地，还包含如本文所定义的经修饰的蛋白质，并且其中发芽势与表达无修饰的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物的发芽势保持相似。优选地，经修饰的蛋白质是对应于本文所定义的SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰。
术语“发芽势”或“发芽率”在本文中可以互换使用并且在本文中被定义为可能在给定期间发芽的特定植物物种、品种或种批的种子数目。它是发芽时间过程的量度，并且通常表示为百分比，例如85％的发芽率表明100个种子中约85个可能在给定的发芽期内在适当条件下发芽。当在本发明的上下文中使用时，具有降低的如在本文所定义的野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达如在本文所定义的经修饰的蛋白质的植物的发芽势优选地与对照植物的发芽势保持类似，对照植物例如是表达无修饰的该蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物。类似的发芽势在本文中优选理解为与对照植物的发芽百分比相比差异不超过约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％或20％的发芽百分比。优选地，将对照植物的种子和具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物的种子在相同条件下储存。优选地，对照植物的种子和具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达并且任选地，进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物的种子在给定的相同条件和/或相同发芽期下发芽。
在另一个实施方案中，本发明涉及具有降低的本文所定义的野生型蛋白质的降低的表达，并且任选地，还包含本文所定义的经修饰的蛋白质的植物细胞、植物组织或植物，其中至少一个修饰是在对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的位置处缺失一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置68-76、69-75、70-74，优选位置71-73的一个或多个氨基酸残基的缺失。本文中一个或多个氨基酸缺失应理解为经修饰的蛋白质可包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的残基的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸缺失。
在一个优选的实施方案中，修饰是缺失在本文所示位置处的至少一个、两个或三个氨基酸残基。优选地，修饰是缺失对应于SEQ ID NO：1的位置71、72或73的至少一个氨基酸残基。更优选地，修饰是缺失对应于SEQ ID NO：1的位置71、72或73的至少两个氨基酸残基，即缺失对应于位置71和72；72和73；或71和73的残基。甚至更优选地，修饰是缺失对应于SEQ ID NO：1的位置71、72和73的三个氨基酸残基。
在进一步的实施方案中，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66的位置上计算时，经修饰的蛋白质具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。另外地或可替代地，当在SEQ ID NO：1的位置78-378上计算时，如本文所定义的经修饰的蛋白质具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。
在又一个实施方案中，如本文所定义的经修饰的蛋白质由包含与SEQ ID NO：4具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的序列的核酸编码。因此，本文所定义的经修饰的蛋白质优选由包含与SEQ ID NO：4具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的序列的核酸表达。
在一个实施方案中，无修饰的蛋白质由与SEQ ID NO：2具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％，99％或100％序列相同性的核苷酸序列编码。由于无修饰的蛋白质可以是野生型蛋白质，因此无修饰的蛋白质的核苷酸序列可以对应于已经转化为cDNA的内源mRNA序列。
在一个实施方案中，编码如本文所定义的经修饰的蛋白质的核酸包含与SEQ IDNO：2具有至少约75％、80％、81.5％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.2％序列相同性的序列。另外地或可替代地，编码无修饰的蛋白质的核酸包含与SEQ ID NO：4具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％序列相同性的序列。在进一步的实施方案中，其中经修饰的蛋白质是截短的蛋白质，并且其中当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-308的位置上计算时，截短的蛋白质具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。
在又一个实施方案中，如本文所定义的经修饰的蛋白质是截短的蛋白质，并且由包含与SEQ ID NO：5具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的序列的核酸编码。因此，本文所定义的截短的蛋白质优选由包含与SEQID NO：6具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性的序列的核酸表达。
在另一个实施方案中，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，还包含如本文所定义的经修饰的蛋白质，其中经修饰的蛋白质增加对双生病毒科的(病毒)抗性，并且其中优选地双生病毒科是菜豆金色花叶病毒属。
在一个实施方案中，经修饰的蛋白质增加对单粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个或多个成员的抗性。在进一步的实施方案中，经修饰的蛋白质增加对单粒和双粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个或多个成员的抗性。优选地，如本文所定义的经修饰的蛋白质增加对菜豆金色花叶病毒属的至少一个或多个双粒成员的抗性。在一个实施方案中，单粒和/或双粒菜豆金色花叶病毒属是能够感染本文所述植物的病毒。优选地，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物纯合地编码本发明的经修饰的蛋白质。
在一个实施方案中，经修饰的蛋白质增加对单粒双生病毒科的至少一个或多个成员的抗性。
优选地，如本文所定义的经修饰的蛋白质增加对双生病毒科的至少一个或多个双粒成员的抗性。在进一步的实施方案中，经修饰的蛋白质增加对单粒和双粒双生病毒科的至少一个或多个成员的抗性。在一个实施方案中，双生病毒科的单粒和/或双粒成员是能够感染本文所述的植物的病毒。
优选地，表达如本文所定义的经修饰的蛋白质的植物细胞、植物组织或植物是双子叶作物。术语“双子叶的”和“双子叶植物”在本文中可以互换使用。优选地，双子叶作物选自辣椒属、食用番茄、大豆、木薯、棉属、葫芦科、茄子、咖啡黄葵、豆科和拟南芥属(Arabidopsis)。
本发明不限于任何特定的植物细胞、植物组织或植物。在本文理解为，本发明同样适用于其它植物细胞、植物组织或植物，即，本文详述的任何提及“辣椒属”的同样适用于任何其它双子叶作物，优选还适用于大豆、食用番茄、木薯、棉属、葫芦科、茄子、咖啡黄葵、豆科和拟南芥属中的至少一种。优选地，本文详述的任何提及“辣椒属”的同样适用于大豆、木薯、棉属和葫芦科的至少一种。优选地，本文详述的任何提及“辣椒属”的同样适用于至少木薯和棉属。在一些实施方案中，如本文详述的提及“辣椒属”的不适用于食用番茄和拟南芥属。
在本文中应理解，当本文所定义的本发明应用于食用番茄时，野生型蛋白质优选与SEQ ID NO：18具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列相同性，当本发明应用于木薯时，野生型蛋白质优选与SEQ ID NO：12具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列相同性，当本发明应用于棉属时，野生型蛋白质优选与SEQ ID NO：13和14中的至少一个具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列相同性，当本发明应用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)时，野生型蛋白质优选与SEQ ID NO：17具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列相同性，当本发明应用于葫芦科时，野生型蛋白质优选与SEQ ID NO：11具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列相同性，当本发明应用于大豆时，野生型蛋白质优选与SEQ ID NO：15和16中的至少一个具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的序列相同性。
本文还应当理解，当本文所定义的本发明应用于食用番茄时，野生型蛋白质优选由与SEQ ID NO：26具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列相同性的序列编码，当本发明应用于木薯时，野生型蛋白质优选由与SEQ ID NO：20具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列相同性的序列编码，当本发明应用于棉属时，野生型蛋白质优选由与SEQ ID NO：21和22中的至少一个具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列相同性的序列编码，当本发明应用于拟南芥时，野生型蛋白质优选由与SEQ ID NO：25具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列相同性的序列编码，当本发明应用于葫芦科时，野生型蛋白质优选由与SEQ ID NO：19具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列相同性的序列编码，当本发明应用于大豆时，野生型蛋白质优选由与SEQ ID NO：23和24中的至少一个具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％序列相同性的序列编码。
在一个实施方案中，植物细胞、植物组织或植物是辣椒属植物或可获自辣椒属植物，优选地植物细胞、植物组织或植物是辣椒属植物细胞、植物组织或植物。优选地，植物细胞、植物组织或植物是一年生辣椒、下垂辣椒、中国辣椒、灌木状辣椒或茸毛辣椒或可获自一年生辣椒、下垂辣椒、中国辣椒、灌木状辣椒或茸毛辣椒。更优选地，植物细胞、植物组织或植物是或可获自一年生辣椒。
类似地，在一个实施方案中，植物细胞、植物组织或植物是或可获自棉属植物，优选地，植物细胞、植物组织或植物是棉属植物细胞、植物组织或植物。优选地，植物细胞、植物组织是陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)、亚洲棉(G.arboretum)或草棉(G.herbaceum)。优选地，植物细胞、植物组织或植物是或可获自陆地棉。
在一个实施方案中，植物细胞、植物组织或植物是或可获自葫芦科植物，优选植物细胞、植物组织或植物是葫芦科植物细胞、植物组织或植物。优选地，植物细胞、植物组织或植物是或可获自西葫芦、南瓜、甜瓜或黄瓜。更优选地，植物细胞、植物组织或植物是或可获自西葫芦。
在一个实施方案中，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物是(或可获自)辣椒属，优选一年生辣椒。优选地，植物具有降低的如本文所定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，进一步表达如本文所定义的经修饰的蛋白质，并且经修饰的蛋白质增加对能够感染辣椒属植物的单粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个成员的抗性。经修饰的蛋白质可增加对能够侵染辣椒属植物的单粒菜豆金色花叶病毒属的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个成员的抗性。
在另一个实施方案中，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物是(或可获自)辣椒属，优选一年生辣椒，并且其中所述植物具有降低的如本文定义的野生型蛋白质的表达，并且任选地，还表达如本文定义的修饰的蛋白质，并且所述修饰的蛋白质增加对能够感染辣椒属植物的单粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个成员的抗性，并且其中经修饰的蛋白质还增加对能够感染辣椒属植物的双粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个成员的抗性。经修饰的蛋白质可以增加对能够感染辣椒属植物的单粒菜豆金色花叶病毒属的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个成员和/或能够感染辣椒属植物的双粒菜豆金色花叶病毒属的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个成员的抗性。
在一个实施方案中，根据本发明的植物细胞、植物组织或植物是(或可获自)辣椒属，优选一年生辣椒，并且经修饰的蛋白质增加了对能够感染辣椒属植物的双粒菜豆金色花叶病毒属的至少一个成员的抗性。经修饰的蛋白质可以增加对能够感染辣椒属植物的双粒菜豆金色花叶病毒属的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个成员的抗性。
在一个实施方案中，能够感染辣椒属植物的单粒和/或双粒菜豆金色花叶病毒属的成员选自辣椒黄曲叶病毒、辣椒曲叶病毒、辣椒Huasteco黄脉病毒、辣椒金黄花叶病毒、辣椒黄曲叶印度尼西亚病毒、辣椒曲叶病毒、锡那罗亚番茄曲叶菜豆金色花叶病毒属、辣椒曲叶拉合尔病毒、曲顶病毒、辣椒mild tigre病毒、辣椒曲叶孟加拉病毒、辣椒卷叶病毒、辣椒黄脉马里病毒、辣椒得克萨斯菜豆金色花叶病毒、辣椒金色花叶菜豆金色花叶病毒；辣椒Huasteco菜豆金色花叶病毒；辣椒Huasteco bigeminivirus、辣椒Huasteco病毒、辣椒Huasteco黄脉菜豆金色花叶病毒、辣椒曲叶孟加拉菜豆金色花叶病毒、辣椒曲叶菜豆金色花叶病毒、辣椒mild tigre菜豆金色花叶病毒、辣椒mild tigre bigeminivirus和辣椒mild tigre geminivirus。
在一个优选的实施方案中，本发明的植物细胞、植物组织或植物对辣椒黄曲叶病毒、辣椒曲叶病毒、辣椒Huasteco黄脉病毒、辣椒金黄花叶病毒和/或辣椒黄曲叶印度尼西亚病毒中的至少一种具有增加的抗性。
优选地，经修饰的蛋白质增加对辣椒黄曲叶病毒、辣椒曲叶病毒、辣椒Huasteco黄脉病毒、辣椒金黄花叶病毒中的至少一种的抗性。
在一个优选的实施方案中，如本文所定义的经修饰的蛋白质增加了对辣椒黄曲叶病毒、辣椒曲叶病毒、辣椒Huasteco黄脉病毒、辣椒金黄花叶病毒和/或辣椒黄曲叶印度尼西亚病毒中的至少一种的抗性。在更优选的实施方案中，经修饰的蛋白质增加了对辣椒黄曲叶病毒、辣椒曲叶病毒、辣椒Huasteco黄脉病毒和辣椒金黄花叶病毒中的至少一种的抗性。在甚至更优选的实施方案中，经修饰的蛋白质增加了对辣椒黄曲叶病毒和/或辣椒曲叶病毒的抗性。
优选地，如本文所定义的经修饰的蛋白质增加了对辣椒曲叶病毒，优选毒株M156(PLCV M156)、黄曲叶印度尼西亚病毒(PepYLCIV)、Huasteco黄脉病毒(PHYVV)、辣椒金黄花叶病毒和甜菜曲顶病毒(BCTV)中的至少一种的抗性。
在第二方面，本发明涉及如本文所定义的经修饰的蛋白质。
在一个实施方案中，经修饰的蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列相同性，并且包含对应于如本文所定义的SEQ IDNO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰。
优选地，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，经修饰的蛋白质具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列相同性，并且其中经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰。优选地，当在如本文所定义的植物细胞、植物组织或植物中表达时，与表达无修饰的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，经修饰的蛋白质增加了对双生病毒科的抗性。
优选地，经修饰的蛋白质不包含UniProt序列A0A068TUH6或由UniProt序列A0A068TUH6组成。另外地或可替代地，经修饰的蛋白质不包含WO2014/045206中公开的SEQID NO：9或10或由WO2014/045206中公开的SEQ ID NO：9或10组成。
优选地，经修饰的蛋白质包含与SEQ ID NO：3具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约100％序列相同性的氨基酸序列。优选地，该蛋白质包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。如本文所定义的经修饰的蛋白质可以是分离的蛋白质或蛋白质可以存在于细胞中，例如存在于如本文所定义的植物细胞中。优选地，经修饰的蛋白质存在于辣椒属细胞中。如本文所定义的经修饰的蛋白质可以由存在于细胞中的核酸表达。优选地，核酸存在于例如稳定整合到细胞的基因组中。
在进一步的实施方案中，经修饰的蛋白质是截短的蛋白质。优选地，经修饰的蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约60％、70％、75％、80％、81％或81.5％的序列相同性。优选地，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-308的位置上计算时，经修饰的蛋白质具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列相同性，并且其中经修饰的蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质。
优选地，当在如本文所定义的植物细胞、植物组织或植物中表达时，与表达无截短的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，经修饰的蛋白质增加了对双生病毒科的抗性。优选地，经修饰的蛋白质包含与SEQ ID NO：5具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约100％序列相同性的氨基酸序列。
优选地，该蛋白质包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列或由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。
在第三方面，本发明涉及包含编码本发明第二方面的经修饰的蛋白质的序列的核酸。
优选地，所述核酸包含与SEQ ID NO：4具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约100％序列相同性的核苷酸序列。可替代地，所述核酸包含与SEQ ID NO：6具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约100％序列相同性的核苷酸序列。
优选地，表达本文所定义的经修饰的蛋白质的核酸存在于本文所定义的植物细胞、植物组织或植物中。例如通过瞬时转染质粒可以将核酸瞬时引入植物细胞。可替代地或另外地，该核酸可以稳定地存在于植物细胞的基因组中。作为非限制性实例，核酸可以稳定地整合到植物细胞的基因组中。可替代地或另外地，该核酸可以是经修饰的内源核酸，即被修饰以编码如本文所定义的经修饰的蛋白质的内源核酸。优选地，内源核酸在一个或多个位置被修饰，使得所编码的蛋白质在对应于SEQ ID NO：1的位置69-77的氨基酸残基处被修饰。优选地，与SEQ ID NO：2具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约100％序列相同性的内源编码序列被修饰成与SEQ ID NO：4或SEQID NO：6具有至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约100％序列相同性的编码序列，优选地被修饰成具有SEQID NO：4或SEQ ID NO：6的序列。
优选地，由所述经修饰的编码序列表达的蛋白质与SEQ ID NO：3具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或约100％的序列相同性。可替代地，由所述经修饰的序列表达的蛋白质可与SEQ ID NO：5具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或约100％的序列相同性。
在进一步的实施方案中，本发明涉及与SEQ ID NO：7具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约99.5％序列相同性的核酸，并且其中序列在对应于SEQ ID NO：7的位置5972或5973的位置处具有修饰，导致外显子4之前的功能失调的受体剪接位点。SEQID NO：7是包含本文所定义的野生型蛋白质的编码序列的基因组序列。优选地，位置5973处的鸟苷被修饰成腺苷。优选地，由所述经修饰的序列表达的蛋白质是包含一个或多个如本文所定义的氨基酸的修饰(例如缺失)的蛋白质。优选地，由所述经修饰的序列表达的蛋白质与SEQ ID NO：3具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或约100％的序列相同性。
另外地，本发明涉及与SEQ ID NO：7具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约99.5％序列相同性的核酸，并且其中序列包含如本文所定义的早期终止密码子。由所述序列表达的经修饰的蛋白质优选为本文所定义的截短的蛋白质。优选地，由所述经修饰的序列表达的蛋白质与SEQ ID NO：5具有至少约85％、90％、95％、98％、99％或约100％的序列相同性。
在第四方面，本发明涉及包含如本文所定义的核酸的核酸构建体。优选地，核酸与用于在细胞中表达的转录调节元件可操作地连接。优选地，转录调节元件是启动子元件。因此，在一个实施方案中，核酸构建体包含如本文所定义的核酸，其可操作地连接至用于在细胞，诸如细菌细胞或植物细胞中表达的启动子。优选地，根据本发明的核酸与用于在植物细胞中表达的启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件以功能关系连接。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，它是“可操作地连接”。例如，如果启动子或更确切的转录调节序列影响编码序列的转录，则其可操作地连接至编码序列。可操作地连接可意味着被连接的DNA序列是邻接的。
在本发明的上下文中，本文所定义的核酸优选以功能关系与启动子元件连接。用于在植物细胞中表达的启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。优选地，启动子是组成型启动子。用于在植物细胞中表达的启动子在本文中被理解为在植物或植物细胞中有活性的启动子，即启动子具有在植物或植物细胞内驱动转录的一般能力。
本文所定义的经修饰的蛋白质的表达可以由内源启动子控制，诸如但不限于控制本文所定义的野生型蛋白质表达的启动子。优选地，启动子与SEQ ID NO：8具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约100％的序列相同性。
在第五方面，本发明涉及用于产生对双生病毒科具有增加的抗性的植物细胞、植物组织或植物的方法。优选地，该方法包含降低本文所定义的野生型蛋白质的表达的步骤。优选地，该方法包含引入本文所定义的经修饰的蛋白质的表达的步骤。
在一个实施方案中，该方法包含以下步骤
i)提供植物细胞、植物组织或植物；和
ii)降低野生型蛋白质的表达，其中蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性。优选地，该方法包含敲除野生型蛋白质的表达的步骤。
优选地，该方法生成植物细胞、植物组织或植物，该植物细胞、植物组织或植物对菜豆金色花叶病毒属的单粒和/或双粒双生病毒科成员，优选单粒和/或双粒成员中的至少一种或多种具有增加的抗性。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法提供植物细胞、植物组织或植物。所提供的植物细胞、植物组织或植物可以是野生型细胞、组织或植物。可替代地，植物细胞、植物组织或植物可以是或可以衍生自栽培种和/或可以是或可以衍生自经遗传修饰的细胞、组织或植物。优选地，所提供的植物细胞、植物组织或植物是如本文所定义的细胞、组织或植物。优选地，植物是双子叶植物，优选选自辣椒属、食用番茄、木薯、棉属、葫芦科、茄子、咖啡黄葵和豆科。优选地，植物细胞、组织或植物是(或可获得自)辣椒属植物。
可以使用本领域已知的任何常规方法实现降低或消除(敲除)本文所定义的野生型蛋白质的表达，包括但不限于siRNA、表观遗传沉默和/或引入基因组突变。例如可以在野生型蛋白质的编码区中和/或在控制野生型蛋白质表达的调节元件中引入突变。突变可以包括一个或多个核苷酸的改变或缺失。取消野生型蛋白质表达的突变可以构成野生型蛋白质编码序列的至少约50％、75％或100％的缺失。可以使用本领域已知的基因组编辑工具，诸如CRISPR技术，例如使用CRISPR-Cas或CRISPR-Cpf1来实现敲除如本文定义的野生型蛋白的表达。
在一个实施方案中，该方法还包含引入本文所定义的经修饰的蛋白质的表达的步骤。优选地，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，经修饰的蛋白质具有至少约75％的序列相同性，并且其中：
a)该蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰；或
b)该蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质。
在一个实施方案中，可以将编码经修饰的蛋白质的核苷酸序列引入植物以引入蛋白质的表达。可以使用本领域已知的任何常规方法将表达本文所定义的经修饰的蛋白质的核苷酸序列引入植物细胞中。作为非限制性实例，这可以通过直接转化方法，诸如植物组织的农杆菌转化、微粒轰击、电穿孔、转染或本领域技术人员已知的许多方法中的任一种发生。类似地，可以通过渗入(introgression)经修饰的蛋白质来进行本文所定义的经修饰的蛋白质的引入表达。这种育种技术是本领域技术人员熟知的。可以通过本领域技术人员已知的许多技术之一直接转化进植物，并且所选择的方式对于本发明的实践不是关键的。用于将表达载体引入本领域技术人员可获得的植物组织的方法是不同的并且将取决于所选择的植物。转化多种植物物种的程序是熟知的并且在整个文献中有描述。
在一个实施方案中，根据本发明的方法引入了经修饰的蛋白质的表达，该经修饰的蛋白与SEQ ID NO：1具有至少75％的序列相同性，并且包含对应于SEQ ID NO：1的位置68-76、69-75、70-74，优选位置71-73的一个或多个氨基酸残基的修饰。一个或多个氨基酸修饰意指经修饰的蛋白质可以在对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的残基中包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸修饰。在优选的实施方案中，根据本发明的方法引入了包含修饰的蛋白质的表达，该修饰是在感兴趣的蛋白质中缺失一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，该方法包含引入在SEQ ID NO：1的位置68-76、69-75、70-74，优选位置71-73处包含一个或多个氨基酸残基缺失的蛋白质。本文中一个或多个氨基酸缺失应理解为与SEQ ID NO：1相比，在对应于位置67-77的残基中，经修饰的蛋白质可包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸缺失。在一个优选的实施方案中，修饰是缺失至少一个、两个或三个氨基酸残基。优选地，修饰是缺失SEQ IDNO：1的位置71、72或73处至少一个氨基酸残基。更优选地，修饰是缺失SEQ ID NO：1的位置71、72或73处的至少两个氨基酸残基：甚至更优选地，修饰是缺失SEQ ID NO：1的位置71、72或73处的至少3个氨基酸残基。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包含引入经修饰的蛋白质的表达的步骤，其中经修饰的蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质。
可替代地或另外地，通过修饰编码野生型蛋白质的内源编码核苷酸序列来引入经修饰的蛋白质的表达。优选地，内源编码序列与SEQ ID NO：2具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约100％的序列相同性。优选地，内源核苷酸序列是存在于植物细胞的基因组中的编码序列。基因组序列可与SEQ ID NO：7具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或约100％的序列相同性，并且可以被修饰以表达如本文所定义的经修饰的蛋白质。
在一个实施方案中，修饰内源编码序列以表达如本文所定义的经修饰的蛋白质，例如在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％序列相同性的蛋白质，其中蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰，并且其中与表达无修饰的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，修饰增加了对双生病毒科的抗性。
内源序列的修饰可以是缺失和/或修饰至少一个核苷酸。例如，可以在对应于SEQID NO：2的位置201-231的至少一个位置处修饰内源编码序列。可替代地或另外地，可以在对应于SEQ ID NO：2的位置201-231的位置处修饰至少两个或三个核苷酸。作为非限制性实例，缺失至少3个核苷酸或缺失3个核苷酸的子集。例如，在对应于SEQ ID NO：2选自位置201-203、204-206、207-209、210-212、213-215、216-218、219-221、222-224、225-227和228-231的位置处，可以缺失至少3个核苷酸。
可替代地或另外地，可以修饰内源基因组核苷酸序列以改变剪接位点，即改变供体和/或受***点的序列。优选地，剪接位点的修饰导致本文所定义的经修饰的蛋白质的表达。作为非限制性实例，在受***点可能存在突变，优选地，修饰在外显子1、2、3、4、5、6上游的受***点处，优选地在外显子4的上游。
优选地，供体和/或受***点的突变导致替代供体或受***点的使用。作为非限制性实例，外显子4上游的受***点的突变可以导致外显子4的编码序列中的受***点的使用(如在图1中例示的)。外显子4上游受***点的突变优选导致在外显子4的5’末端缺失9个核苷酸。
供体或受***点的突变可以是缺失核苷酸或修饰供体或受***点内的核苷酸。作为非限制性实例，突变可以是从一个核苷酸至另一个核苷酸的修饰，例如G至A的转变。
可以使用本领域已知的任何常规方法修饰或缺失一个或多个内源核苷酸。作为非限制性实例，可以使用CRISPR技术，例如使用CRISP-Cas9或CRISPR-Cpf1进行修饰或缺失。
在一个实施方案中，修饰内源序列以表达如本文所定义的经修饰的蛋白质，例如当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-308的位置上计算时具有至少约75％的序列相同性的蛋白质，并且其中经修饰的蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质，并且其中与表达无截短的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，修饰增加了对双生病毒科的抗性。
可以使用本领域技术人员已知的任何常规方法引入导致终止密码子的突变。作为非限制性实例，可以使用随机诱变引入突变。可替代地，可以使用基因组编辑工具，诸如CRISPR-技术来引入突变。
如本文所定义的用于产生对双生病毒科具有增加的抗性的植物细胞、植物组织或植物的方法可进一步包含步骤iii)选择表达经修饰的蛋白质的植物细胞、植物组织或植物。
可以使用本领域技术人员已知的任何常规方法确定经修饰的蛋白质的表达。这些方法包括检测转录物(例如mRNA)或检测蛋白质。用于检测转录物的非限制性实例包括例如：PCR、q-PCR和Northern印迹。用于检测经修饰的蛋白质的存在的非限制性实例包括例如Western印迹。该方法可以进一步包含将该植物组织或植物细胞再生为植物的步骤。
该方法可以进一步包含例如产生表达如在本文所定义的经修饰的蛋白质的植物细胞、植物组织或植物的后代的步骤。该方法可以包含从已经表达如在本文所定义的经修饰的蛋白质的植物产生种子的另外的步骤。该方法可以进一步包含，例如，使种子生长为对双生病毒科具有增加的抗性的植物。
该方法可进一步包含，例如，测试对双生病毒科具有增加的抗性的植物、植物组织或植物细胞。用于测试对双生病毒科的抗性的方法包含但不限于通过叶子的经典接种或携带双生病毒科的粉虱来侵染植物，并且例如在侵染后3-8周检查植物的疾病症状。本文描述的本发明的另外的方面涉及由如本文所定义的对双生病毒科具有增加的抗性的植物产生的种子。
本文描述的本发明的另外的方面涉及从种子生长或从植物细胞再生的植物，其包含如本文所定义的本发明的蛋白质、如本文所定义的本发明的核酸和/或如本文所定义的本发明的构建体。
在本文所描述的本发明的另外的方面涉及具有对如在本文指定的双生病毒科增加的抗性的植物的后代，即包含如本文所定义的本发明的蛋白质、如本文所定义的本发明的核酸和/或如本文所定义的本发明的构建体，其中后代可以通过自交或育种和选择获得，其中所选择的后代保留了亲本植物的对双生病毒科的增加的抗性和/或保留了如本文所述的经修饰的蛋白质的表达。
本发明的另一方面涉及通过本文详述的方法获得的或可获得的植物，其包含本文所定义的本发明的蛋白质、本文所定义的本发明的核酸和/或本文所定义的本发明的构建体。
在另一方面，本发明涉及用于增加植物细胞、植物组织或植物中对双生病毒科的抗性的方法，其中该方法包含以下步骤：
i)提供植物细胞、植物组织或植物；
ii)降低野生型蛋白质的表达，其中蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，其中优选地不表达野生型蛋白质。
优选地，针对双生病毒科的至少一个双粒成员的抗性增加。
优选地，针对双生病毒科的至少一个双粒成员和至少一个单粒成员的抗性增加。
该方法可进一步包含步骤iii)引入经修饰的蛋白质的表达，当在对应于SEQ IDNO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，该修饰蛋白具有至少约75％的序列相同性，并且其中优选地
a)经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰；或
b)经修饰的蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质，
iii)选择表达经修饰的蛋白质的植物细胞、植物组织或植物；和
iv)使所选择的植物再生，
其中优选通过修饰编码野生型蛋白质的内源核苷酸序列来引入经修饰的蛋白质的表达。
优选地，与本文所定义的对照植物相比，对双生病毒科的抗性增加。
优选地，双生病毒科是双生病毒科的至少双粒成员。优选地，双生病毒科是双生病毒科的双粒成员。
该方法可以进一步包含筛选植物细胞、植物组织或植物对增加的抗性的步骤。本领域已知的任何筛选方法可用于筛选植物细胞、植物组织或植物，诸如但不限于下文实施例部分中的方法。
本发明还涉及用于增加植物细胞、植物组织或植物中对双生病毒科的抗性的载体的用途，其中载体减少或敲除本文所定义的野生型蛋白质的表达。优选地，野生型蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少75％的序列相同性。
优选地，载体包含或编码靶向野生型蛋白质的转录物的一种或多种siRNA和/或一种或多种miRNA。
优选地，载体还包含本文所定义的核酸，其中核酸包含编码本文所定义的经修饰的蛋白质的序列。载体优选包含调节元件以控制经修饰的蛋白质的表达。
优选地，与本文所定义的对照植物相比，对双生病毒科的抗性增加。
优选地，双生病毒科是双生病毒科的至少双粒成员。优选地，双生病毒科是双生病毒科的双粒成员。
可替代地或另外地，该载体可以编码gRNA-CRISPR-CAS复合物，其中该复合物减少或敲除如在本文所定义的野生型蛋白质的表达。
本发明进一步涉及用于增加植物细胞、植物组织或植物中对双生病毒科的抗性的gRNA-CRISPR-CAS复合物的用途，其中该复合物减少或敲除如在本文所定义的野生型蛋白质的表达。优选地，野生型蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少75％的序列相同性。
优选地，gRNA-CRISPR-CAS复合物中的gRNA将CRISPR-CAS引导至编码本文所定义的野生型蛋白质的基因，优选内源基因。优选地，野生型蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少75％的序列相同性。
优选地，与本文所定义的对照植物相比，对双生病毒科的抗性增加。
优选地，双生病毒科是双生病毒科的至少双粒成员。优选地，双生病毒科是双生病毒科的双粒成员。
本发明还涉及用于增加植物细胞、植物组织或植物中对双生病毒科的抗性的如本文所定义的经修饰的蛋白质的用途。优选地，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，经修饰的蛋白质具有至少约75％的序列相同性，并且其中优选地
a)经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰；或
b)经修饰的蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质，
优选地，与本文所定义的对照植物相比，对双生病毒科的抗性增加。
优选地，双生病毒科是双生病毒科的至少双粒成员。优选地，双生病毒科是双生病毒科的双粒成员。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的或可获得的植物的植物部分和植物产物，其中植物部分和/或植物产物包含如本文所定义的本发明的蛋白质、如本文所定义的本发明的核酸和/或如本文所定义的本发明的构建体。这样的部分和/或产物可以是种子或果实和/或由其衍生的产物。这样的部分、产物和/或由其衍生的产物也可以是非繁殖材料。
附图说明
图1.dTP基因的内含子-外显子边界预测，可以修饰内源核苷酸序列以改变剪接位点，导致使用替代的受***点。上图显示未经修饰的野生型dTP基因的内含子-外显子边界预测。下图显示了外显子4上游修饰的实例，其中修饰导致在外显子4的5’末端处缺失9个核苷酸。
图2.甜菜曲顶病毒易感性。BCTV在未感染或感染BCTV的Col-0和SALK_124403.21.45x植物中的相对滴度。在T-DNA植物中没有病毒复制发生。
图3.通过dTP互补的甜菜曲顶病毒易感性。BCTV在未感染或感染BCTV的Col-0和SALK_124403.21.45x植物中的相对滴度。
实施例
方法
使用随机诱变引入突变。鉴定了在dTP基因(SEQ ID NO：1)中携带修饰的Maor M1辣椒植物，在这些植物中进一步验证了两种修饰。不希望受理论的束缚，认为如SEQ ID NO：3所示的修饰导致剪接位点的改变，而如SEQ ID NO：5所示的修饰引入终止密码子。将携带SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示修饰的植物的经验证的M1芽繁殖以收获种子。验证(通过Sanger测序)M1植物是否存在所报道的修饰。收获这些突变体植物的M2种子并生长。选择纯合的M2植物用于种子繁殖，并且在那些种子中生长M3植物。
辣椒曲叶病毒株M156为单粒病毒。黄曲叶印度尼西亚病毒(PepYLCIV)为双粒病毒。Huasteco黄脉病毒为双粒病毒，而辣椒金黄花叶病毒(PGMV)为双粒病毒。
实施例1
将选择的纯合dTP突变的辣椒种子(一年生辣椒；栽培种Maor)播种在具有盆栽土的托盘中，并移植到岩棉块中。平行地，生长非突变的易感Maor对照和另外的易感辣椒植物(商业品种)。所有植物在受控温室中生长。3周后，每周一次在(一片或多片)叶子上使用经典接种法用辣椒卷叶病毒株M156(PLCV M156)侵染植物3次。最后一次侵染3周后进行病毒症状存在的最终评估。将症状分为两类，在新出现的叶子中存在病毒症状与抗性(缺乏症状)的比较(结果在表2中呈现)。
表2.辣椒曲叶病毒抗性百分率
种子 植物数目 症状 抗性 ％抗性
dTP_Q309*(009-14) 6 0 6 100
dTP_Q309*(009-16) 8 0 8 100
dTP_Δ_N71-E73(010-5) 10 0 10 100
dTP_Δ_N71-E73(010-12) 12 0 12 100
Maor对照 12 11 1 8
易感品种 6 6 0 0
实施例2
将选择的纯合dTP突变的辣椒种子(一年生辣椒；栽培种Maor)播种在200孔细胞盘(26×26mm)中，并移植到50孔细胞盘(50×50mm)中。使植物在无昆虫的分开受控的温室中生长。12周后，将具有几个叶子的分生组织嫁接到试验植物上，该试验植物的茎在第2真叶和第3真叶之间被切割。试验植物之前被辣椒黄曲叶印度尼西亚病毒(PepYLCIV)侵染。在移植成功2个月后评价症状。通过目测检查将症状分为两类，在新出现的叶子中存在病毒症状与缺乏病毒症状，并在表3中呈现。
表3.辣椒黄曲叶病毒感染时无症状植物
Figure BDA0002550094270000351
Figure BDA0002550094270000361
另外地，通过基于PCR的检测方法确定病毒滴度。使用对PepYLCIV特异的qPCR引物确定PepYLCIV的相对滴度。将突变型植物的易感野生型Maor背景中PepYLCIV的水平设定为100％，随后与表达SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的侵染的植物的病毒滴度进行比较。结果见表4。
表4：PepYLCIV滴度。
植物基因型 相对滴度PepYLCIV
dTP_Q309*(SEQ ID NO:5) 1.37％
dTP_Δ_N71-E73(SEQ ID NO:3) 2.33％
Maor对照(SEQ ID NO:1) 100％
实施例3
分析了SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的修饰对发芽的影响。在M2阶段，预期dTP基因中的任何修饰以孟德尔方式分离(即预期所有植物的25％携带纯合状态的突变等位基因)。然而，对于携带SEQ ID NO：5所示修饰的植物，观察到偏斜分离：仅15.7％的发芽植物对于如SEQ ID NO：5所示的修饰是纯合的。使纯合突变体M2植物生长以获得自交的M3种子。这些M3种子的播种导致非常少的发芽幼苗(～4％)。
相反，携带SEQ ID NO：3的植物在M2期的分离是正常的，观察到27.5％的纯合突变等位基因。M3种子发芽百分比为48％。因此，鉴定了提供双生病毒抗性的等位基因，但其不受极低发芽百分比的阻碍。结果总结在表5中。
表5：发芽百分比
Figure BDA0002550094270000362
实施例4
将选择的纯合dTP突变的辣椒种子(一年生辣椒；栽培种Maor)播种在具有盆栽土的托盘中并移植到土壤中。平行地，生长未突变的Maor作为对照。所有植物在受控温室中生长。12周后，用携带双粒辣椒Huasteco黄脉病毒(PHYVV)的粉虱侵染植物。Hutton等人(Hortscience 47(3):324–327.2012)已经描述了带病毒粉虱的侵染。简而言之，将经过子叶阶段3周的幼苗(2-3片叶子)在生长室中暴露于带病毒粉虱2周。接种后，通过用杀虫皂和用Admire(吡虫啉)处理植物来杀死粉虱，并将植物移植到田地/温室中。最后评价最后感染40天后病毒症状的存在。植物被分为3类，抗性(R)、中度(I)或易感(S)。使用常规PCR进一步评价无症状植物样品中PHYVV的存在。结果呈现在表6中。
表6：
种子 植物数目 易感 中度 抗性
dTP_Δ_N71-E73(010-16) 5 0 2 3
dTP_Δ_N71-E73(010-16) 4 1 0 3
Maor对照 7 7 0 0
实施例5
将选择的纯合dTP突变的辣椒种子(一年生辣椒；栽培种Maor)播种在具有盆栽土的托盘中，并移植到具有盆栽土的盆中。平行地，生长非突变的易感对照Maor、另外的易感对照Monet和Yolo Wonder以及抗性对照。所有植物在非受控温室中生长。将植物用携带实施例4中所述的双粒辣椒Huasteco黄脉病毒(PHYVV)和辣椒金黄花叶病毒(PGMV)的粉虱侵染。最后评价最后感染40天后病毒症状的存在。将植物分为4类。
表7：
种子 植物数目 症状 中度 抗性 ％抗性
dTP_Δ_N71-E73 19 4 12 3 15.8
dTP_Q309* 2 1 0 1 50
Maor对照 32 8 24 0 0
易感对照(Monet) 81 13 64 4 4.9
易感对照(Yolo wonder) 16 11 5 0 0
对照(抗性) 57 0 16 41 71.9
实施例6
为了测试未突变和dTP突变变体的发芽百分比，将突变植物(SEQ ID NO：4或SEQID NO：6纯合)与未诱变的Maor植物杂交。随后使相应的F1(杂合的)自花受精以获得F2种子，其分离出包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的预期的变体。播种40粒分离的F2种子，并确定发芽百分比。提取发芽幼苗的DNA，并使用标准基因型分型技术确定纯合dTP突变、杂合和纯合WT之间的比率。与包含SEQ ID NO：4的植物相比，当预期正常分离为1：2：1时，可以在衍生自包含SEQ ID NO：6的种子的发芽的F2植物中观察到偏斜的分离，其中分离偏斜有利于dTP的野生型等位基因而不是纯合的突变体等位基因的杂合度，表明表达由SEQ ID NO：5表示的蛋白质的截短的植物具有不希望的多效作用，导致降低的发芽百分比。在SEQ ID NO：3纯合的突变体植物中将观察不到这些不希望的作用。
实施例7
为了测试dTP基因的削弱的表达或蛋白质的改变是否导致拟南芥属对双生病毒的抗性增加，进行了以下实验。拟南芥的种子获自Nottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC)，其在dTP基因中携带T-DNA***(AT4G27650)。获得两个SALK T-DNA***品系：SALK_121667.17.55x和SALK_124403.21.45x。选择dTP基因中T-DNA***纯合的植物，并在盆栽土中生长3周。随后，用表达来自二元质粒的甜菜曲顶病毒(BCTV)的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染植物。使土壤杆菌生长过夜并使用小规格(22-25)注射器施用至各拟南芥植物的若干叶子的叶子柄。该单粒双生病毒已显示感染大量(作物)植物，包括拟南芥属。在感染后10天内出现疾病症状(叶子卷曲)，但为了确定野生型(Col-0)和T-DNA拟南芥属植物中的病毒滴度，对分离自受感染和未感染植物材料的DNA进行QPCR。使用以下引物检测BTCV：BCTV1：CTACACGAAGATGGGCAACCT(SEQ ID NO：9)和BCTV2：TGACGTCGGAGCTGGATTTAG(SEQ ID NO：10)(描述于Luna等人,2017-Journal of GeneralVirology 2017；98:2607–2614)。图2显示野生型拟南芥属(Col-0)中的BCTV感染导致病毒复制和疾病。相反，BCTV感染dTP基因中的T-DNA***品系不会引起病毒复制，也不会引起疾病。
随后的实验旨在证明来自其他作物物种的同源蛋白质在抗双生病毒方面具有相似的功能。为此，鉴定了作物同系物(下表8)。
表8：dTP蛋白质在不同物种之间的氨基酸相同性矩阵。
Figure BDA0002550094270000391
经鉴定，这些同源基因被克隆并转化至拟南芥属T-DNA品系。由35S启动子驱动该编码序列的表达。对过表达dTP的作物同系物的转基因拟南芥品系进行BCTV感染，并与表达35S：GUS构建体的dTP中的T-DNA***品系比较。图3显示互补品系的相对病毒滴度。对BCTV显示易感性的品系表明在这些品系中表达的特定作物同系物能够补充dTP功能，因此可以被修饰以在这些作物中产生对双生病毒具有抗性的植物。特别地，图3显示了来自木薯、西葫芦、辣椒、拟南芥属和棉花的dTP的互补。显然，在T-DNA植物中没有发生病毒复制。与dTP的作物同系物互补的T-DNA品系显示增加的易感性，表明这些基因/蛋白质在它们各自的作物植物中具有相似的功能。
表9.SEQ ID NOs dTP核苷酸和氨基酸序列
氨基酸序列(SEQ ID NO) 核苷酸序列(SEQ ID NO)
辣椒 1 2
西葫芦 11 19
木薯 12 20
棉花 13 21
棉花 14 22
大豆 15 23
大豆 16 24
拟南芥属 17 25
食用番茄 18 26
序列表
<110> 主基因有限公司
<120> 双生病毒抗性植物
<130> P6072394PCT
<150> EP17209603.4
<151> 2017-12-21
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 378
<212> PRT
<213> Capsicum annuum
<400> 1
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Ala Asp Pro Ser Val Ser Ala Asp Leu Ala Val Val Leu Met Gln Glu
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Gly Leu Ala His Ile Leu Leu Ile Gly Lys Ser Leu Thr Ile Thr Arg
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Ser Arg Ile Glu Thr Ser Ile Pro Arg Lys His Gly Pro Ala Ile Ala
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His Ile Leu Leu Ile Gly Lys Ser Leu Thr Ile Thr Arg Ser Arg Ile
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Lys Gln Leu Arg Pro Ile Ile Glu Asn Lys Ser Arg Ile Leu Leu Val
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His Thr Thr Ser Gly Tyr Lys His Ser Leu Lys Glu Val Leu Asp Ala
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Ala Cys Tyr Gly Pro Lys His Val Glu Val Ala His Glu Arg Met Ala
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ccagagttgc aacaactata ggggtattaa gttgttgagt cacactatga agatttggga 1980
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ttagctgatt gcatctgttc caaagctggg gggaagaata gttttaggcc tactcaatcc 4740
caaaaaccat ctcatggggt gaggattgtc caagaccaca taagagggtc catcccacac 4800
cgatgtgtga cactgacacc accggcgctc ccaagactag acatctgaaa cttagataat 4860
ataacttagg ggcccaacac ttggtaacca agattatgat gggcccaagt ctgaaccatg 4920
tttaaaatgg acctcgggcc taactcaacc cccaatgctc caatagctaa cttatgaggt 4980
gaagcttgcc caagaacaaa ttaggagacc aagcgtccca tctactaccg atgtgggaat 5040
ctaacccccc ctgcatgcac aggccggcaa actgaggtgt ggacaataga caattgggat 5100
gcaacatcag gtaaactgag aagtgtgatg attcatgagg tgaggatggc ccaagaggct 5160
aagaccatat aagtacatcc cacaccgatg tgggatacgg accccattct gtagttgtgg 5220
agatagggat ttggtcatgg tacagccaga tagcctttgg tttctcaagt gttggctctg 5280
tgagtacctc atatcgcctt ggggttcaat gaacaatctg aggctattta tatgccattg 5340
ctttgaagat taagcgcttc tgggtgcttg ttgtcgattg tattaggaga ccacaagtat 5400
gactctaatc aatcaagtgg acatttctgg tgttaaggtg ttcctgaagt gacagatgtc 5460
tgctatatga ttacaaatga atagaataga agatgccaag acttggacaa atgtgaactg 5520
caataacttt tagatattga aacggcagat ttgaaggaat catcttctca tggcctttta 5580
tctgcattgt gatcaggtgt gagcctgggt tagaacttga tcttagcttc cagtgtaagg 5640
tgttttaaga gaaattgaaa gataaactta gaaatcaatt aactatagag aaaatttttc 5700
tactaaagca tggagaggag acacttcttt gtcattcttt tccaatgtgg tcgagatgaa 5760
gggtttgggg gttgtttgat gaaatttgag gatatcaata caacctttat atgaaatata 5820
caagatagat ttgcacgtag caatgctcct ttcccaacga atcacattaa atgtgtcatt 5880
tggaaaacaa gaaatagata gtactctttc taggttttca tttgagtgtt ttccatttca 5940
atattgtata atataattaa tttggtgttg tagaatattg agtatgacaa agaaggttct 6000
gccttgcgta ttcgtgggaa gaatatcctg gagaatgaac atgtaaaggt gtgtgttctt 6060
caactaaatc tgtctggata aattctttgc tttgatgctg caaccaaaat ctctaattac 6120
gtttattgca gataggcgct tttcacactc tggaaattga gccacacaga ccttttgtgc 6180
taagaaaggt agaatactgt cttttgattt ggttagcaaa tctatgagca tcttgtttga 6240
ttaaatttta gtcttatctg aacagctttg attttatacg aaagtttaca tataaatcag 6300
ctctgacttg gattatctga tttaggtggt ctgggactca ctggcacgag aggttcttcg 6360
tcaagctgct ggtatgtttc acattgcact ttaacaaaat tatactttta tttgtttaag 6420
tgttgccatt aacattatct gcaatattaa gcgttttagt tcgtaccctt acttttcgtc 6480
catggcttat caagttttac agcctgtaga tacttctttt tagtacatgg atagattaat 6540
aatcaattga cataattgtt aaactgcttt ataggtgcat tagtctcgga tagcttgttt 6600
cagtgtaggt gtgttttagc ctttattttt gcagaggttc tctactccgc tcaagcactt 6660
gcagtgagaa cataattatt ttctgcaatt tcgtgtgtgt tacagagtgc tgttgaacac 6720
ttgatctgat acgaagtttc tgtacataat tgatgatgtt acagccatat tgattctaac 6780
atggatacgt ggttttgtac tgctcttaga ttaccgtttc attaagctga atccactttt 6840
tcttattttg atgattcaga tccttctgta agtgctgatc tggctgttgt tctgatgcaa 6900
gaaggattgg cacacatact tcttattggt aaaaggtaag cttgacaatc tgataatcct 6960
ttttgatacg agttttaaac aaattttgag catctccttt tcttttattt aaacgagatc 7020
aataatttta aaggcgaatg aggatgtccg aatttctatt gcagaattgt atgaaaggtt 7080
aaggctgagt tactagattg tctagcataa ttttgtctta tatacttgtt actgttgtgt 7140
tagcagcttg actattactc gttctcgtat agagacttct ataccacgca agcatggacc 7200
agcaattgca ggttatgata aggtatgtct ccttttgttt cagcttttgt attatttaat 7260
tattttgaag atgaaatctc agtgaaattg agttcttaac tttgatttgc aggcgttaaa 7320
taagttcttt ggcaatgttc tacaggtagt ctctgccagc tttcttgatg tttgcttaat 7380
ctctataagc aatatgttac agactgacag gttcttattt ctgttgcagg cctttgtcag 7440
gcatgttgat ttcaaagtag ttcgctgtgc tgtgattgca agtccaggat tcaccaaggt 7500
attttttgtt tttggtttcg ttttgtaaag ttacactctt ggctagtcat tctttaatgc 7560
tatgttacaa cagatagagc atgcatgtct aattatatct gtaccgtaca tatattaatt 7620
cagttgagat attcaattcc ttttgggttg aatatgtagg atcaatttca tcgtcacctg 7680
ttgttagaag ccgagaggaa gcagctaaga cctataatag aaaataaatc acgcatactt 7740
cttgtccata caacctcagg atacaagtaa gcccttttgt aaaaataacc ttcaatattt 7800
gtctatttgt agttgatatg tatgacttat gatgtgcaat gcttgtccag ttcggttgtt 7860
taagcccaat ttttttttct ggttcacaga catagtttga aagaggttct ggatgcccca 7920
aacgtaatga atatgataaa agatacaaaa gctgccaaag aggtacttta cattatgact 7980
cttgctcaac ttaatatgac ctttattcaa tatgcttatg tttgtttatg tctttttctt 8040
actcttcgag aattacagtt tcttcgtctc ttccaatctt aatcaggttc aagctctaaa 8100
ggaatttttc aacatgcttt caaatgttag gttctatcct tgatctttat gttgtatttg 8160
tatgtttctt aatagctttg ggatatttca gtctctttca tatgctaaga gtacaaccag 8220
attgcttggt tttgaatttt gtttgcttgc tctttttggt gtttagttcg gctctctgtt 8280
accttgggtt ctgtggaagg cctgagagtt tcaaatgaaa gtctagatgt ttcactatgc 8340
atgacggata ttcctgttta aggagatcaa ggtggactaa tttgaaaatt ttcaacatga 8400
acagacgtag tgttataatg ggcagcgggt gatattgtta tctccgtgtt tgcctttttc 8460
agtcctttct accaattgaa tactgaaaat tcatttgcaa caacaatata cccgcttgtt 8520
acataattta gggatgttat aggtatagag gtcttttgca agagtgattg cctgtttgaa 8580
cgccctccct cagcgtattt catgaattgt gatactaatt ggataaatat gatgccactt 8640
ttcatgcttt cggaagcaac taagaaggat aacacctttt tttaaaagct tttttcccct 8700
ctttcaagaa ttcctcgcaa taaatgtatg gcgtgtccct tttaccgcat ctcttaacat 8760
atatatgaat gagcttcacc atgtatgaag tttactccca ctagtcaatc taaagatacc 8820
tgtagtgtgt tccttcccgg atacttatgg aagtttttgt tactctattg ggccttctct 8880
aggatcctga tcgtgcatgc tatggaccaa agcatgttga agttgctcac gagcgaatgg 8940
ctatccagac acttctcatt accgacgagc tctttaggtg agtatcttat tttccctggt 9000
tgaacgaatg ggctttacga gcaataaaaa ttaaactgca tatagcttga cagtaatttg 9060
caactctttt ggcatgcttg gcttttaaaa ttgccatcgt tggtgcatag gatttggcaa 9120
tttcattgtt cttcatatgt gaaatcaatt atatattttt cgatttcact catttcctgt 9180
atatagttgg tcgattgttc atgaggaata tctaacttct tttgatctgt tgacaggagt 9240
tctgatgtag aaacgaggaa aaagtatgcc aatctggttg attcagtcaa ggattccggt 9300
ggtactgcac tcattttctc atcaatgcac gtttcaggag aacgtgagta tatttagtta 9360
cttcctgtta atttccttgt cggaatttat tttagttggc ccctagtaat gctttgaatc 9420
gtatttcctt gtccgttcac atgttcattt tcgcattctc actttacaat ctttttcctt 9480
cctacgagca cacgttgcat atttggttac gctgattata acttatggtt gggaacacag 9540
aactgacaca gctaaccggc attgctgcaa tccttcgttt tcctttgccg gagctggaag 9600
acattgagat gtga 9614
<210> 8
<211> 3000
<212> DNA
<213> Capsicum annuum
<400> 8
taaatataac acatagatta attattatta tctttttatc taccatcttt agcacattat 60
tacatattag taaaattaat taggagaaaa agaaaagata tcacaacata tctttattgt 120
cttcacaaat tcttaatttt gtaggttgca tgagtatgac tcttcacttc ttcatgtata 180
tatatatata tatatttcat aaccagttga agaaaaatta ttaacatata ataaatagat 240
aaaataaatt agttagttaa aataaattaa atacacaaaa aaaaaagtat tattcacata 300
aaaattcaaa taatttttcc ttcgtctttc ctgaataaac aatttagata attattaata 360
taatatcaag ttctatgttt aatagttata atatttttat tacacttata ctaaccaaag 420
taactattag aaaaaaagaa gcaatttgat ctatacatga ttctatttat tatttcttga 480
gtgctcacaa gtatagtaat cacatttttt tttctagata attttaacgc aagtaggcca 540
atttagttga gcatgtggta acctcgatca cctgaaaaat tttgaataac atctcacaaa 600
ataaaacaat caacttagac catttctttt aacatgtact ttgacgtgga tatacttttt 660
actattacta tctttactat ctttgataaa aaatgatgca aaattaatac tattcataat 720
ataggtatat aagtatactt aaaaaaatgt gaccaaacac ataaaagatg caaagaaata 780
ttttgaagat aaaatttttc ttacctttat tttgtctttt ttttttcaca ctttggttta 840
ttcacaagtt atatggtgat ggaggagaga aaggataatc ttgaataaaa aatttcatga 900
aataaactat gaatttacac aggcaaaata gggggatatc ataaggtgtc ataaacttat 960
aaattaaatt tgggggttat gaagattaaa atattgaatt tattgatatt attgagagta 1020
taattaaaga tgtgagttat aaataattat ctttattaaa gatatttaat ataaaaagaa 1080
aaaataacta aaataatcac aaaaaaaaga agataaatag taagataata aatggcagcc 1140
cataactctc tattattact gcatcttcat ggaacaactc accttgagtg ttgggctagc 1200
ctcaagcaat gaatattaag tgaccctctg tttctaaaat aaaatttgga caaatatata 1260
tctctaacta aaaaaggata caattttgct tgaatttgaa agtttaataa gtgaaacttt 1320
agtatgattt cggattgcaa cgtttaggaa caaattcaaa agtttaaatt tttattaatt 1380
caaatttcag aaaaattcat gaaattcaat atttttgttg attcaaacac caaaacaatt 1440
catgaaattt gatgttttta aaaaataatg ccactgtgag agttgactta agaagcaacc 1500
tgccataaaa cttagtcgac agcctcagct agccatttat aacaaatcaa tgtaaacttt 1560
ttaaacatca aaatccaaaa aatttcgtgg agtttaaaat aactatcaca aacgaaatat 1620
attcttttag ttataatatc tcttttgaat ttaattatat ctccttcggg tttcaacttg 1680
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aaccccaaaa agacggggga acggaaagta agaaaacaaa agtggctcca aaagatagag 2040
acatgattta caagaaaaac tacacatcta taatactatg aacctatagg gcatactatt 2100
attaggctaa taaggtaaat gtatacaaga atcgttgaaa gttacttgat gaaagcagca 2160
actggaacaa caactttgct aagcataatt tgatatggtg atgaagaaga gaaaggataa 2220
tcttgaatga aattttcatg aaacaaacta taaatttata taggcaaaat gaaggaatac 2280
cataaggtgt cataaactta taaattaaat tttggggtta tgaagattaa aaggttgaat 2340
ttattgatat tattaagagt ataattgaag gtatgagtta taaataatta tatttattaa 2400
agacattaaa tataaaaaga agaaaaatat tcaaatataa ggaaaaaaat gacccagaaa 2460
accacaaaat agataaatag tattggaggc ctctaagaca tgccacatag gattgtctta 2520
gagtttcctt tatatatata ttgattgtaa gatttttttt tttgaatttt gtaataaaaa 2580
taaataaatt aaatgaatat tgagaattaa catgatgatt attaaagttt taaaatttta 2640
aaaggacaaa aataaaaaaa tatgactaat ttatatatat tttttaatat gtgtgtcaaa 2700
ttctaataat ttaattattt taaaatggaa gaagtatatt ttattttatt tttctaatat 2760
aacactacat cgcgatcctt ttccaattag attctatatg ctatttttat tcttacggtg 2820
cttacgttat tttttcatta tttttccaat tgtttagtat ttgaccttaa tatacgatag 2880
tcttggaaaa aaacaaaaaa aactacacat acaagaacac tccaaccttt aaacctgcaa 2940
cttcccatca aactgaagca aatctcttac aaaaaaagaa ccaattttta ataattaaat 3000
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
ctacacgaag atgggcaacc t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
tgacgtcgga gctggattta g 21
<210> 11
<211> 358
<212> PRT
<213> Cucurbita pepo
<400> 11
Met Lys Ile Val Arg Lys Gln Leu Asp Gln Asn Gly Ser Gly Ser Val
1 5 10 15
Lys Met Val Pro Leu Asp Ser Asp Asp Leu Trp His Ala Phe Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Pro Gly Asp Thr Val Met Ala Val Thr Val Arg Lys Val Ile
35 40 45
Arg Glu Met Ala Ser Gly Gly Arg Asp Ala Glu Arg Val Lys Leu Lys
50 55 60
Leu Glu Ile Lys Val Glu Glu Ile Gly Ala Tyr His Thr Leu Glu Leu
65 70 75 80
Glu Leu His Arg Pro Phe Val Leu Arg Lys Asp Val Trp Asp Ser Phe
85 90 95
Ala Leu Asp Val Leu His Gln Ala Ser Gly Met Phe Leu Asp Pro Ala
100 105 110
Ala Ser Ala Asp Leu Ala Val Val Leu Met Gln Glu Gly Leu Ala His
115 120 125
Val Ile Leu Val Gly Lys Ser Met Thr Ile Thr Arg Ala Arg Ile Glu
130 135 140
Thr Ser Ile Pro Arg Lys His Gly Ser Ala Ile Ala Gly Tyr Glu Ser
145 150 155 160
Ala Leu Asn Lys Phe Phe Glu Asn Val Leu Gln Ala Phe Leu Lys His
165 170 175
Val Asp Phe Lys Val Val Arg Cys Ala Val Ile Ala Ser Pro Gly Phe
180 185 190
Thr Lys Asp Gln Phe His Arg His Leu Leu Leu Glu Ala Glu Arg Arg
195 200 205
Gln Leu Arg Pro Ile Ile Glu Asn Lys Ser Arg Ile Ile Leu Thr His
210 215 220
Thr Thr Ser Gly Tyr Lys His Ser Leu Arg Glu Val Leu Asp Ala Ser
225 230 235 240
Asn Val Met Asn Met Ile Lys Asp Thr Lys Ala Ala Gln Glu Val Arg
245 250 255
Ala Leu Lys Asp Phe Phe Thr Met Leu Ser Asn Glu Pro Asp Arg Ala
260 265 270
Cys Tyr Gly Pro Lys His Val Glu Val Ala His Glu Arg Met Ala Ile
275 280 285
Gln Thr Leu Leu Ile Thr Asp Asp Leu Phe Arg Asn Asn Asp Ile Thr
290 295 300
Glu Arg Gln Lys Tyr Val Asn Leu Val Asp Ser Val Lys Asp Ser Gly
305 310 315 320
Gly Thr Val His Ile Phe Ser Ser Met His Val Ser Gly Glu Gln Leu
325 330 335
Ala Gln Ile Thr Gly Ile Ala Ala Ile Leu Arg Phe Pro Leu Pro Glu
340 345 350
Leu Glu Asp Ile Glu Met
355
<210> 12
<211> 378
<212> PRT
<213> Manihot esculenta
<400> 12
Met Lys Ile Thr Arg Arg Asn Leu Val Pro Asp Gly Pro Gly Ser Val
1 5 10 15
Lys Met Thr Pro Val Asp Ser Asp Asp Leu Trp Phe Val Tyr Asn Leu
20 25 30
Ile Ser Pro Gly Asp Ser Val Met Ala Asp Thr Val Arg Lys Val Leu
35 40 45
Arg Glu Ala Ala Ser Gly Gly Arg Asp Ala Glu Arg Val Arg Leu Lys
50 55 60
Leu Glu Ile Lys Val Glu Thr Val Asp Tyr Asp Lys Val Gly Ala Ala
65 70 75 80
Leu Arg Ile Arg Gly Lys Asn Ile Leu Glu Asn Glu Tyr Val Lys Ile
85 90 95
Gly Ala Phe His Thr Leu Glu Leu Glu Leu Gln Arg Pro Phe Val Leu
100 105 110
Arg Lys Glu Val Trp Asp Ser Met Ala Leu Asp Val Leu Asn Gln Ala
115 120 125
Ser Asp Pro Gly Ala Ser Ala Asp Leu Ala Val Val Leu Met Gln Glu
130 135 140
Gly Leu Ala His Ile Leu Leu Val Gly Lys Ser Val Thr Thr Thr Arg
145 150 155 160
Ser Arg Ile Glu Thr Ser Ile Pro Arg Lys His Gly Pro Ala Ile Ala
165 170 175
Gly Tyr Glu Ser Ala Leu Asn Lys Phe Phe Glu His Val Leu Gln Ala
180 185 190
Phe Leu Lys His Ile Asp Phe Ser Val Ile Arg Cys Ala Val Ile Ala
195 200 205
Ser Pro Gly Phe Thr Lys Asp Gln Phe His Arg His Leu Leu Leu Glu
210 215 220
Ala Glu Arg Arg Gln Leu Arg Pro Ile Ile Glu Asn Lys Ser Arg Ile
225 230 235 240
Val Leu Val His Thr Ser Ser Gly Tyr Lys His Ser Leu Arg Glu Val
245 250 255
Leu Asp Ala Pro Asn Val Met Asn Met Ile Lys Asp Thr Lys Ala Ala
260 265 270
Gln Glu Val Arg Ala Leu Glu Asp Phe Phe Asn Met Leu Ser Asn Asp
275 280 285
Pro Ala Arg Ala Cys Tyr Gly Pro Lys His Val Glu Val Ala His Glu
290 295 300
Arg Met Ala Val Gln Thr Leu Leu Ile Thr Asp Asp Leu Phe Arg Asn
305 310 315 320
Ala Asp Ile Pro Thr Arg Gln Lys Tyr Ile Asn Leu Val Asn Ser Val
325 330 335
Lys Gly Ser Gly Gly Thr Ala His Ile Phe Ser Ser Met His Val Ser
340 345 350
Gly Glu Gln Leu Ala Gln Leu Thr Gly Ile Ala Ala Ile Leu Arg Phe
355 360 365
Pro Leu Pro Asp Leu Glu Asp Ile Glu Met
370 375
<210> 13
<211> 377
<212> PRT
<213> Gossypium hirsutum
<400> 13
Met Lys Val Val His Arg Asp Leu Val Pro Asn Gly Pro Gly Ser Val
1 5 10 15
Lys Met Ile Pro Val Asp Ser Glu Asp Leu Trp Phe Ala Tyr Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Thr Gly Asp Trp Val Met Ser Arg Thr Val Arg Lys Val Leu
35 40 45
Arg Glu Thr Ala Gly Gly Arg Asp Ala Glu Arg Val Ala Leu Lys Leu
50 55 60
Glu Ile Lys Val Glu Ala Ile Asp Tyr Asp Lys Glu Gly Ser Val Leu
65 70 75 80
Arg Ile Arg Gly Lys Asn Thr Leu Glu Asn Glu His Val Lys Ile Gly
85 90 95
Gln Phe His Thr Leu Glu Leu Glu Leu Gln Arg Pro Phe Val Leu Arg
100 105 110
Lys Lys Ile Trp Asp Ser Leu Ala Leu Asp Val Leu Arg Gln Ala Ser
115 120 125
Asp Pro Gly Ala Ser Ala Asp Leu Ala Val Val Leu Met Gln Glu Gly
130 135 140
Leu Ala Asn Ile Leu Leu Val Gly Lys Ser Met Thr Ser Thr Arg Ser
145 150 155 160
Arg Ile Glu Thr Ser Ile Pro Arg Lys His Gly Pro Ala Ile Ala Gly
165 170 175
Tyr Glu Ser Ala Leu Lys Lys Phe Phe Glu Asn Val Leu Gln Ala Phe
180 185 190
Leu Lys His Val Asp Phe Asn Val Val Arg Cys Ala Val Ile Ala Ser
195 200 205
Pro Gly Phe Thr Lys Glu Gln Phe His Arg His Leu Met Leu Glu Ala
210 215 220
Glu Arg Arg Gln Leu Arg Pro Ile Ile Glu Asn Lys Ser Arg Ile Ile
225 230 235 240
Leu Val His Thr Ser Ser Gly Tyr Lys His Ser Leu Arg Glu Val Leu
245 250 255
Asp Ala Pro Asn Val Met Ser Met Ile Lys Asp Thr Lys Ala Ala Gln
260 265 270
Glu Val Arg Ala Leu Lys Asp Phe Phe Asn Met Leu Ser Asn Asp Pro
275 280 285
Ala Arg Ala Cys Tyr Gly Pro Lys His Val Glu Ile Ala His Glu Arg
290 295 300
Met Ala Val Gln Thr Leu Leu Ile Thr Asp Asp Leu Phe Arg Asn Ser
305 310 315 320
Asp Val Ile Thr Arg Gln Lys Tyr Val Ser Leu Val Asn Ser Val Lys
325 330 335
Asn Ser Gly Gly Thr Ala His Ile Phe Ser Ser Met His Val Ser Gly
340 345 350
Glu Gln Leu Ala Gln Leu Thr Gly Ile Ala Ala Ile Leu Arg Phe Pro
355 360 365
Leu Pro Asp Leu Glu Asp Ile Glu Met
370 375
<210> 14
<211> 377
<212> PRT
<213> Gossypium hirsutum
<400> 14
Met Lys Val Val His Arg Asp Leu Val Pro Asn Gly Pro Gly Ser Val
1 5 10 15
Lys Met Ile Pro Val Asp Ser Glu Asp Leu Trp Phe Ala Tyr Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Thr Gly Asp Trp Val Met Ala Arg Thr Val Arg Lys Val Leu
35 40 45
Arg Glu Thr Ala Gly Gly Arg Asp Ala Glu Arg Val Ala Leu Lys Leu
50 55 60
Glu Ile Lys Val Glu Ala Ile Asp Tyr Asp Lys Glu Gly Ser Val Leu
65 70 75 80
Arg Ile Arg Gly Lys Asn Thr Leu Glu Asn Glu His Val Lys Ile Gly
85 90 95
Gln Phe His Thr Leu Glu Leu Glu Leu Gln Arg Pro Phe Val Leu Arg
100 105 110
Lys Lys Ile Trp Asp Ser Leu Ala Leu His Val Leu Arg Gln Ala Ser
115 120 125
Asp Pro Gly Ala Ser Ala Asp Leu Ala Val Val Leu Met Gln Glu Gly
130 135 140
Leu Ala Asn Ile Leu Leu Val Gly Lys Ser Met Thr Ser Thr Arg Ser
145 150 155 160
Arg Ile Glu Thr Ser Ile Pro Arg Lys His Gly Pro Ala Ile Ala Gly
165 170 175
Tyr Glu Ser Ala Leu Lys Lys Phe Phe Glu Asn Val Leu Gln Ala Phe
180 185 190
Leu Lys His Val Asp Phe Asn Val Val Arg Cys Ala Val Ile Ala Ser
195 200 205
Pro Gly Phe Thr Lys Asp Gln Phe His Arg His Leu Met Leu Glu Ala
210 215 220
Glu Arg Arg Gln Leu Arg Pro Ile Ile Glu Asn Lys Ser Arg Ile Ile
225 230 235 240
Leu Val His Thr Ser Ser Gly Tyr Lys His Ser Leu Lys Glu Val Leu
245 250 255
Asp Ala Pro Asn Val Met Ser Met Ile Lys Asp Thr Lys Ala Ala Gln
260 265 270
Glu Val Arg Ala Leu Lys Asp Phe Phe Asn Met Leu Ser Asn Asp Pro
275 280 285
Ala Arg Ala Cys Tyr Gly Pro Lys His Val Glu Val Ala His Glu Arg
290 295 300
Met Ala Val Gln Thr Leu Leu Ile Thr Asp Asp Leu Phe Arg Asn Ser
305 310 315 320
Asp Val Ile Thr Arg Gln Lys Tyr Val Gly Leu Val Asn Ser Val Lys
325 330 335
Asn Ser Gly Gly Thr Ala His Ile Phe Ser Ser Met His Val Ser Gly
340 345 350
Glu Gln Leu Ala Gln Leu Thr Gly Ile Ala Ala Ile Leu Arg Phe Pro
355 360 365
Leu Pro Asp Leu Glu Asp Ile Glu Met
370 375
<210> 15
<211> 379
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 15
Met Lys Ile Val Arg Lys Asp Leu Val Pro Asn Gly Pro Gly Ser Val
1 5 10 15
Lys Met Val Ala Val Asp Ser Asp Asp Leu Trp Phe Ala Tyr Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Pro Gly Asp Ser Val Met Ala Val Thr Val Arg Lys Val Leu
35 40 45
Arg Glu Ala Ala Ser Gly Gly Arg Glu Ala Glu Arg Val Lys Leu Lys
50 55 60
Leu Glu Ile Lys Val Gln Glu Leu Ala Asp Tyr Asp Lys Glu Gly Ser
65 70 75 80
Ile Leu Arg Val Arg Gly Lys Asn Ile Leu Glu Asn Glu Tyr Val Lys
85 90 95
Ile Gly Ala Phe His Thr Leu Glu Leu Glu Leu Gln Arg Pro Phe Val
100 105 110
Leu Arg Lys Asp Val Trp Asp Ser Leu Ala Leu Glu Val Leu Gln Gln
115 120 125
Ala Ser Asp Pro Gly Ala Ser Ala Asp Leu Ala Val Val Leu Met Gln
130 135 140
Glu Gly Leu Ala His Ile Leu Leu Val Gly Arg Ser Met Thr Val Thr
145 150 155 160
Arg Ser Arg Ile Glu Thr Ser Ile Pro Arg Lys His Gly Pro Ala Ile
165 170 175
Ala Gly Tyr Glu Lys Ala Leu Asp Lys Phe Phe Gln Asn Val Leu Gln
180 185 190
Ala Phe Leu Lys His Ile Asp Phe Asn Val Val Arg Cys Ala Val Ile
195 200 205
Ala Ser Pro Gly Phe Thr Lys Asp Gln Phe His Arg His Leu Phe Leu
210 215 220
Glu Ala Glu Arg Arg Gln Leu Arg Pro Ile Ile Glu Asn Lys Ser Arg
225 230 235 240
Ile Ile Leu Val His Thr Ser Ser Gly Tyr Lys His Ser Leu Lys Glu
245 250 255
Val Leu Asp Ala Pro Asn Val Met Ser Leu Ile Lys Asp Thr Lys Ala
260 265 270
Ala Gln Glu Val Arg Val Met Lys Asp Phe Tyr Asp Met Leu Ser Asn
275 280 285
Asp Pro Ser Arg Ala Cys Tyr Gly Met Lys His Val Glu Val Ala Asn
290 295 300
Glu Arg Leu Ala Val Gln Thr Leu Leu Ile Thr Asp Glu Leu Phe Arg
305 310 315 320
Asn Ser Asp Ile Ala Thr Arg Lys Lys Tyr Val Asn Leu Val Asn Ser
325 330 335
Val Lys Asp Ser Gly Gly Ser Val His Val Phe Ser Ser Met His Val
340 345 350
Ser Gly Glu Gln Leu Ala Gln Ile Ser Gly Ile Ala Ala Ile Leu Arg
355 360 365
Phe Pro Leu Pro Asp Leu Glu Asp Ile Glu Met
370 375
<210> 16
<211> 379
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 16
Met Lys Ile Val Arg Arg Asp Leu Val Pro Asn Gly Pro Gly Ser Val
1 5 10 15
Lys Met Val Ala Val Asp Ser Asp Asp Leu Trp Phe Ala Tyr Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Pro Gly Asp Ser Val Met Ala Val Thr Val Arg Lys Val Leu
35 40 45
Arg Glu Ala Ala Asn Gly Gly Arg Glu Ala Glu Arg Val Lys Leu Lys
50 55 60
Leu Glu Ile Lys Val Glu Glu Leu Ser Asp Tyr Asp Lys Glu Gly Ser
65 70 75 80
Ile Leu Arg Val Arg Gly Lys Asn Ile Leu Glu Asn Glu Tyr Val Lys
85 90 95
Ile Gly Ala Phe His Thr Leu Glu Leu Glu Leu Gln Arg Pro Phe Val
100 105 110
Leu Arg Lys Asp Val Trp Asp Ser Leu Ala Leu Glu Val Leu Gln Gln
115 120 125
Ala Ser Asp Pro Gly Ala Ser Ala Asp Leu Ala Val Val Leu Met Gln
130 135 140
Glu Gly Leu Ala His Ile Leu Leu Val Gly Arg Ser Met Thr Val Thr
145 150 155 160
Arg Ser Arg Ile Glu Thr Ser Ile Pro Arg Lys His Gly Pro Ala Ile
165 170 175
Ala Gly Tyr Glu Lys Ala Leu Asp Lys Phe Phe Gln Asn Val Leu Gln
180 185 190
Ala Phe Leu Lys His Ile Asp Phe Asn Val Val Arg Cys Ala Val Ile
195 200 205
Ala Ser Pro Gly Phe Thr Lys Asp Gln Phe His Arg His Leu Phe Leu
210 215 220
Glu Ala Glu Arg Arg Gln Leu Arg Pro Ile Ile Glu Asn Lys Ser Arg
225 230 235 240
Ile Ile Leu Val His Thr Ser Ser Gly Tyr Lys His Ser Leu Lys Glu
245 250 255
Val Leu Asp Ala Pro Asn Val Met Ser Leu Ile Lys Asp Thr Lys Ala
260 265 270
Ala Gln Glu Val Arg Val Met Lys Asp Phe Tyr Asp Met Leu Ser Asn
275 280 285
Asp Pro Ser Arg Ala Cys Tyr Gly Met Lys His Val Glu Val Ala Asn
290 295 300
Glu Arg Leu Ala Val Gln Met Leu Leu Ile Thr Asp Glu Leu Phe Arg
305 310 315 320
Asn Ser Asp Ile Ala Thr Arg Lys Lys Tyr Val Asn Leu Val Asn Ser
325 330 335
Val Lys Asp Ser Gly Gly Ser Val His Val Phe Ser Ser Met His Val
340 345 350
Ser Gly Glu Gln Leu Ala Gln Ile Ser Gly Ile Ala Ala Ile Leu Arg
355 360 365
Phe Pro Leu Pro Asp Leu Glu Asp Ile Glu Met
370 375
<210> 17
<211> 378
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 17
Met Lys Ile Val Arg Arg Asp Phe Val Arg Asn Gly Pro Gly Ser Val
1 5 10 15
Lys Met Val Ala Glu Asp Ser Asp Asp Leu Trp Tyr Ala Tyr Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Val Gly Asp Ser Val Met Ala Val Thr Phe Arg Lys Val Gln
35 40 45
Arg Glu Ile Pro Gly Gly Gly Arg Asp Ser Glu Arg Val Lys Leu Lys
50 55 60
Leu Glu Val Gln Val Glu Glu Val Asp Tyr Asp Lys Asp Gly Ser Val
65 70 75 80
Leu Arg Ile Arg Gly Lys Asn Ile Leu Glu Asn Glu His Val Lys Ile
85 90 95
Gly Ala Phe His Thr Leu Glu Leu Glu Leu Lys Arg Pro Phe Val Leu
100 105 110
Arg Lys Glu Met Trp Asp Ser Met Ala Leu Asp Thr Leu Lys Gln Ala
115 120 125
Ser Asp Pro Ala Ala Ser Ala Asp Leu Ala Val Val Leu Met Gln Glu
130 135 140
Gly Leu Ala Gln Ile Phe Leu Val Gly Arg Ser Val Thr Ser Ser Arg
145 150 155 160
Ala Arg Ile Glu Thr Ser Ile Pro Arg Lys His Gly Pro Ala Ile Ala
165 170 175
Gly Tyr Glu Ser Ala Leu Lys Lys Phe Phe Glu Asn Val Leu Gln Ala
180 185 190
Phe Val Lys His Val Asp Phe Ser Val Val Arg Cys Ala Val Val Ala
195 200 205
Ser Pro Gly Phe Thr Lys Asp Gln Phe His Arg His Leu Leu Leu Glu
210 215 220
Ala Glu Arg Arg Gln Leu Arg Pro Ile Ile Glu Asn Lys Ser Arg Ile
225 230 235 240
Ile Leu Val His Thr Asn Ser Gly Tyr Arg His Ser Leu Gly Glu Val
245 250 255
Leu His Ala Pro Asn Val Met Asn Met Ile Lys Asp Thr Lys Ala Ala
260 265 270
Lys Glu Val Lys Ala Leu Asn Asp Phe His Asn Met Leu Ser Thr Glu
275 280 285
Pro Asp Arg Ala Cys Tyr Gly Pro Lys His Val Glu Val Ala Asn Glu
290 295 300
Arg Met Ala Ile Gln Thr Leu Leu Ile Thr Asp Glu Leu Phe Arg Asn
305 310 315 320
Ser Asp Val Lys Thr Arg Lys Lys Tyr Val Asn Leu Val Glu Ser Val
325 330 335
Lys Asp Ser Gly Gly Asp Ala Phe Ile Phe Ser Ala Met His Val Ser
340 345 350
Gly Glu Gln Leu Ala Gln Leu Thr Gly Ile Ala Ala Leu Leu Arg Phe
355 360 365
Pro Leu Pro Glu Leu Glu Asp Ile Glu Met
370 375
<210> 18
<211> 378
<212> PRT
<213> solanum lycopersicum
<400> 18
Met Lys Ile Val Arg Arg Asp Phe Val Pro Asp Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ile Ile Pro Glu Glu Ala Asp Asp Leu Trp Val Ala Tyr Asn Leu
20 25 30
Ile Ala Glu Gly Asp Thr Val Leu Ala Val Thr Val Arg Lys Val Leu
35 40 45
Arg Glu Ala Ala Ser Gly Gly Arg Asp Ala Glu Arg Val Lys Leu Lys
50 55 60
Leu Glu Ile Lys Val Glu Asn Val Glu Tyr Asp Lys Glu Gly Ser Ala
65 70 75 80
Leu Arg Ile Arg Gly Lys Asn Ile Leu Glu Asn Glu His Val Lys Ile
85 90 95
Gly Ala Phe His Thr Leu Glu Ile Glu Gln His Arg Pro Phe Val Leu
100 105 110
Arg Lys Val Val Trp Asp Ser Leu Ala Arg Glu Val Leu Arg Gln Ala
115 120 125
Ser Asp Pro Ser Ala Ser Ala Asp Leu Ala Val Val Leu Met Gln Glu
130 135 140
Gly Leu Ala His Ile Leu Leu Ile Gly Lys Ser Val Thr Ile Thr Arg
145 150 155 160
Ser Arg Ile Glu Ser Ser Ile Pro Arg Lys His Gly Pro Ala Ile Ala
165 170 175
Gly Tyr Asp Lys Ala Leu Asn Lys Phe Phe Asp Asn Val Leu Gln Ala
180 185 190
Phe Val Lys His Val Asp Phe Lys Val Val Arg Cys Ala Val Ile Ala
195 200 205
Ser Pro Gly Phe Thr Lys Asp Gln Phe His Arg His Leu Leu Leu Glu
210 215 220
Ala Glu Arg Lys Gln Leu Arg Pro Ile Ile Glu Asn Lys Ser Arg Ile
225 230 235 240
Ile Leu Val His Thr Thr Ser Gly Tyr Lys His Ser Leu Lys Glu Val
245 250 255
Met Asp Ala Pro Asn Val Met Thr Met Ile Lys Asp Thr Lys Ala Ala
260 265 270
Lys Glu Val Gln Ala Leu Lys Asp Phe Phe Asn Met Leu Ser Asn Asp
275 280 285
Pro Asp Arg Ala Cys Tyr Gly Pro Lys His Val Glu Val Ala His Glu
290 295 300
Arg Leu Ala Ile Gln Thr Leu Leu Ile Thr Asp Glu Leu Phe Arg Ser
305 310 315 320
Ser Asp Val Glu Thr Arg Lys Lys Tyr Ala Asn Leu Val Asp Ser Val
325 330 335
Lys Asp Ser Gly Gly Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Met His Val Ser
340 345 350
Gly Glu Gln Leu Asn Gln Leu Thr Gly Ile Ala Ala Ile Leu Arg Phe
355 360 365
Pro Leu Pro Glu Leu Glu Asp Ile Glu Met
370 375
<210> 19
<211> 1077
<212> DNA
<213> Cucurbita pepo
<400> 19
atgaagatcg tacgcaaaca gcttgatcag aatgggtctg gtagtgtcaa gatggtgcca 60
cttgattcag atgatctatg gcatgcgttc aatttgattg ctccgggaga cactgttatg 120
gctgtcaccg ttaggaaagt catcagagag atggcttctg gaggaagaga tgcagaacga 180
gtgaaactca agctagaaat aaaagttgag gagatagggg cttaccatac tttagaactt 240
gagctgcatc ggccatttgt tttgagaaag gatgtttggg actcttttgc tctagatgta 300
cttcatcaag cctctggtat gtttctggat cctgctgcta gtgctgactt ggccgtggtt 360
ttaatgcaag aaggattagc acatgttatt cttgtcggaa aaagtatgac aattactcga 420
gctcgaatcg aaacttcaat tcctcgcaag catgggtcag ccattgctgg ttatgagtcg 480
gccttgaata aattcttcga gaatgtttta caggctttct tgaagcatgt tgattttaaa 540
gtggtacgct gtgcagtgat agctagtcct ggatttacca aggatcagtt ccatcggcac 600
ttattattgg aagctgaaag aagacagcta agacctatta tcgagaacaa atcccgcata 660
attctaacac atacaacctc aggatacaag catagtttac gagaggtttt ggatgcttca 720
aatgtcatga atatgataaa agacactaaa gcagctcaag aggtgcgagc tctaaaggat 780
ttctttacca tgctctctaa tgagccagac cgtgcttgtt atggaccaaa acacgtggag 840
gttgcccatg aacgaatggc tattcaaacg cttctcatta ctgatgatct cttcaggaat 900
aatgatataa cggagcgaca aaaatacgtc aatttggtcg attcagttaa ggattcaggt 960
ggcaccgttc atatattttc atccatgcac gtctctggag agcaactcgc tcagataact 1020
ggaattgcag caatccttcg atttcctctg ccggaactcg aggacataga gatgtaa 1077
<210> 20
<211> 1137
<212> DNA
<213> Manihot esculenta
<400> 20
atgaagatca cacgaagaaa cctcgtgccg gacggccccg gtagtgtcaa gatgacgcca 60
gtcgattcag atgatctttg gttcgtttat aatttgatat ctccgggtga ttcggttatg 120
gcggatactg tcaggaaagt tttgagagag gcggcgtccg gtgggagaga tgctgaaaga 180
gtgaggctga agttggaaat aaaagttgag actgtagatt atgataaagt tggggctgcc 240
ttgcgaattc gcggaaagaa tattttggag aatgaatatg taaagattgg agcatttcac 300
actttagagt tagagctgca acgccctttt gttttgagaa aggaagtttg ggactcaatg 360
gcattagatg tactcaatca agcctctgat cccggtgcaa gtgctgatct tgctgtggtt 420
ttaatgcaag aaggacttgc acacatctta cttgtcggta aaagcgtgac aactactcga 480
tcaaggatag agacttcaat tcctcgaaag catggccctg ccattgctgg ttatgaatcg 540
gcattgaata agttctttga gcatgtttta caggctttcc taaagcatat tgatttcagt 600
gtcattcggt gtgcggtgat tgcaagccct ggtttcacta aggatcagtt tcatcgtcac 660
ttattgttgg aggcagagag gagacagctg agacccatta ttgagaacaa gtcacgcata 720
gtgctcgtgc atacaagctc aggatataag catagcttga gggaggttct tgatgcccca 780
aatgttatga acatgattaa agacactaag gcagcacaag aggttcgagc actcgaggat 840
ttctttaaca tgctttcaaa tgatccagct cgtgcatgct atggaccaaa gcatgtagag 900
gttgcccatg aacgcatggc tgtccaaact cttctcatca cagatgatct tttcagaaat 960
gccgatatac caacgaggca gaagtacatc aatctagtca actcagtgaa gggttcaggg 1020
ggcactgctc atatattttc atcaatgcat gtctcagggg agcaattggc gcaattgacc 1080
ggcattgctg ccatacttcg atttccgctg ccagacctgg aagacattga gatgtaa 1137
<210> 21
<211> 1134
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 21
atgaaggtcg tacaccgaga cctagttccc aatggccctg gcagcgtcaa gatgatacca 60
gtggattcag aggatctctg gtttgcttac aatttgatag ctactgggga ttgggttatg 120
tctcgaaccg tcaggaaagt tctaagggag acagccggtg gaagagatgc agagcgtgtt 180
gccctgaagt tggaaataaa agtcgaggcc atagattatg acaaagaagg atctgtcttg 240
cgtataaggg gaaagaacac cttggagaat gagcatgtta agataggaca attccatact 300
ctcgaacttg agcttcagcg accttttgtt ttaagaaaga aaatatggga ctcattggca 360
ttagatgttc tccgacaggc ctctgatcct ggtgcgagtg cagatctggc tgtggtacta 420
atgcaagaag ggctagcaaa tattttactt gttggtaaaa gtatgacaag tacccgttca 480
cggattgaaa cttcaattcc tcgtaagcat ggacctgcca ttgctggtta tgaatcggct 540
ttgaagaagt tctttgagaa tgttctacag gctttcctca aacatgtgga tttcaatgtt 600
gttcgctgtg ctgttattgc tagtcctggc ttcacaaagg aacagttcca tcgtcatctt 660
atgttggagg cagaaagaag acaattgagg ccaattattg agaataagtc gcgaataatt 720
cttgttcata caagctccgg atataagcat agtttgagag aagtcttgga tgccccaaat 780
gttatgagca tgataaaaga caccaaagca gcgcaagagg tccgagcact caaggatttc 840
ttcaacatgc tttcaaatga tccggcacgt gcatgctacg gaccaaaaca tgtggagatt 900
gcccatgagc gaatggcagt tcaaacactt cttattaccg acgatctctt caggaattcg 960
gacgtaatta cgaggcaaaa gtatgtcagt ttggtgaact ccgttaagaa ttcggggggc 1020
actgctcaca ttttttcgtc tatgcacgta tcaggggaac aactggcaca gctgaccggc 1080
attgcggcaa tccttcgttt ccctcttccg gatctggaag acatcgaaat gtag 1134
<210> 22
<211> 1134
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 22
atgaaggtcg tacaccgaga cctagttccc aatggccctg gcagcgtcaa gatgatacca 60
gtggattcag aggatctctg gtttgcttac aatttgatag ctactgggga ttgggttatg 120
gctcgaactg tcaggaaagt tctaagggag acagccggtg gaagagatgc agagcgtgtt 180
gccctgaagt tggaaataaa agtcgaggcc atagattatg acaaagaagg atctgtcttg 240
cgtataaggg gaaagaacac cttggagaat gagcatgtta agataggaca attccatact 300
ctcgaacttg agcttcagcg accttttgtt ttaagaaaga aaatatggga ctcattggca 360
ttacatgttc tccggcaggc ctctgatcct ggtgcgagtg cagatctggc tgtggtacta 420
atgcaagaag ggctagcaaa tattttgctt gttggtaaaa gtatgacaag tacccgttca 480
cggattgaaa cttcaattcc tcgtaagcat ggacctgcca ttgctggtta tgaatcggct 540
ttgaagaagt tctttgagaa tgttctacag gctttcctca aacatgttga tttcaatgtt 600
gttcgctgtg ctgttattgc tagtcctggc ttcacaaagg accagttcca tcgtcatctt 660
atgttggagg cagaaagaag acaattgagg ccaattattg agaataagtc gcgaataatt 720
cttgtacata ctagctccgg atataagcat agtttgaaag aagtcttgga tgccccaaat 780
gttatgagca tgataaaaga caccaaagca gcgcaagagg tccgagctct caaggatttc 840
ttcaacatgc tttcaaatga tccggcacgt gcatgctacg gaccaaaaca tgtggaggtt 900
gcccatgagc gaatggcagt tcaaacactt cttattaccg acgatctctt caggaattcg 960
gatgtaatta cgaggcaaaa gtatgtcggt ttggtgaact ctgttaagaa ttcggggggc 1020
actgctcaca ttttttcgtc tatgcacgta tcaggggaac aactggcaca gctgaccggc 1080
attgcggcaa tccttcgttt ccctcttccg gatctggaag acatcgaaat gtag 1134
<210> 23
<211> 1140
<212> DNA
<213> Glycine max
<400> 23
atgaagatcg ttcggaaaga cctcgtaccc aatggacctg gcagcgttaa gatggttgca 60
gtggattcgg atgatctctg gtttgcgtat aacctgatag ctcccggaga ctctgtcatg 120
gccgttactg tcaggaaggt tctaagagaa gctgctagtg gcggacggga agcagaacgc 180
gtcaagctca aattggaaat taaagtccaa gagcttgctg attatgacaa agaaggttct 240
attttacgtg ttcgcggaaa gaacattttg gagaatgaat atgtcaagat aggagctttt 300
catactttag aactcgaact gcagcgcccg tttgtgctca gaaaggatgt ttgggattct 360
ttggctttgg aggtactaca gcaggcctct gatcctggtg caagtgctga tctagccgtg 420
gtgttgatgc aagaaggatt agcccatatc ctccttgttg gtagaagtat gactgttact 480
cgttcgcgga tagaaacatc aattcctcgc aaacatgggc ctgcaattgc tggttatgag 540
aaagctttgg ataagttctt tcagaatgtt ttgcaggctt tcttgaaaca tatagatttc 600
aacgtggttc gttgtgctgt aattgcaagt ccaggattta caaaggatca gtttcaccgt 660
cacttatttt tggaggcaga acgaagacag ttgcgaccta ttattgaaaa taaatcacgc 720
atcattcttg tgcatacaag ttcaggatac aaacatagct taaaggaggt tttggatgct 780
ccaaatgtca tgagtttaat aaaagatact aaagcagcac aagaggttcg agttatgaag 840
gatttctacg acatgctttc aaatgatcca tcacgtgctt gttatggaat gaaacatgtt 900
gaggttgcca atgaacgact agctgtacaa acgcttctca ttacggatga gcttttcagg 960
aattcagata tagcaacaag aaaaaagtat gttaacttgg tcaactctgt taaggattca 1020
ggaggctctg tccatgtatt ttcgtccatg catgtctctg gagaacaact agcccagata 1080
agtggcattg ctgcaattct tcgatttcct ctccctgatc ttgaagacat tgagatgtga 1140
<210> 24
<211> 1140
<212> DNA
<213> glycine max
<400> 24
atgaagatcg ttcggagaga cctagtacct aatggacctg gcagcgttaa gatggtggca 60
gtggattcgg atgatctctg gtttgcgtat aacttgatag ctcccggaga ctctgtcatg 120
gccgttactg tcaggaaggt tctaagagaa gctgctaatg gcggacggga agcagaacgc 180
gtcaagctca aattggaaat taaagtcgaa gagctttctg attatgacaa agaaggttct 240
attttgcgtg ttcgtggaaa gaacattttg gagaatgaat atgtcaagat tggagcattt 300
catactttag aactcgaact gcagcggccg tttgtgctca gaaaggatgt ttgggattct 360
ttggctttgg aggtactaca gcaggcctcc gatcctggtg caagtgctga tctagcagtg 420
gtgttgatgc aagaaggatt agcccatatc ctccttgttg gtagaagtat gactgttact 480
cgttcgcgga tagaaacatc aattcctcgc aaacatgggc ctgcaattgc tggttatgag 540
aaagctttgg ataagttctt tcagaatgtt ttgcaggctt tcttgaaaca tatagatttc 600
aatgtggttc gttgtgctgt aattgcaagt ccaggattta caaaggatca gtttcaccgt 660
cacttatttt tggaagcaga acgaagacag ttgcgaccta ttattgaaaa caaatcccgc 720
atcattcttg tgcatacaag ttcaggatat aagcatagtt taaaggaggt tttggatgct 780
ccaaatgtca tgagtttgat aaaagatact aaagcagcac aagaggttcg agttatgaag 840
gatttctacg acatgctttc aaatgatcca tcacgtgctt gttatggaat gaaacatgtt 900
gaggttgcca atgaacgact agctgtacaa atgcttctca ttacggatga gcttttcagg 960
aattcagata tagcaacaag aaaaaagtat gttaacttgg tcaactctgt taaggattca 1020
gggggctctg tccatgtatt ttcgtccatg catgtctctg gagaacaact agcccagata 1080
agtggcattg ctgcgattct tcggtttcct ctccctgatc ttgaagacat tgagatgtga 1140
<210> 25
<211> 1137
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 25
atgaagatcg ttcgcaggga ttttgttcgt aatggacccg gaagcgttaa gatggtggca 60
gaggactctg atgatctctg gtatgcttat aacttgattg ctgtgggcga tagtgtaatg 120
gctgtcactt tcagaaaagt tcagagagag atacctggtg ggggaagaga ctctgaacgt 180
gttaaactga agctggaagt acaagttgag gaggtggact atgacaaaga cggatctgtt 240
ttgcgcatac gtggcaaaaa tatcctggag aatgagcacg taaagattgg tgcattccat 300
actttggaac ttgagctgaa acgacctttt gtgttgagaa aggaaatgtg ggactcaatg 360
gctcttgata cactcaaaca ggcctcagat cccgctgcta gtgctgatct agctgtagtt 420
ctaatgcaag aaggactggc acaaatcttc cttgtgggca gaagtgtgac aagtagccgt 480
gcacgaatag aaacatccat tcctaggaag catggacctg caattgctgg ttacgagtct 540
gctttgaaga aattttttga gaatgttctg caggcctttg tgaaacatgt tgacttcagt 600
gtcgttcgct gtgcagtagt tgcaagtccc ggcttcacaa aggatcagtt tcatcgccac 660
ttattgttgg aagcagaaag aagacaactg agacctatta ttgagaataa atcacgtata 720
atattggtgc acacaaactc tggatataga catagcctgg gtgaggttct ccatgccccc 780
aacgtgatga atatgataaa agatacaaaa gcagcaaaag aggtcaaagc tctcaatgat 840
tttcacaaca tgctttcaac tgaaccagat cgggcatgct atggaccaaa acacgtggaa 900
gttgcaaatg aacgaatggc aattcaaacg cttctcataa cggacgagct tttcaggaat 960
tctgacgtga aaacaaggaa gaagtatgtg aatttggtgg agtcggtaaa agattcggga 1020
ggagatgctt ttatattttc ggcgatgcat gtgtcaggag aacaattggc acagctgact 1080
ggaatagcag ctcttctcag gttcccttta ccagaactcg aagacattga gatgtaa 1137
<210> 26
<211> 1137
<212> DNA
<213> Solanum lycopersicum
<400> 26
atgaagattg ttcgtagaga ctttgttcct gatggttctg gtagtgtaaa gataattcca 60
gaagaagctg atgatctatg ggttgcttat aatctgatag ctgaaggtga tactgtatta 120
gctgttactg ttaggaaggt cctgagggaa gctgcttctg gaggaagaga tgctgaacga 180
gtgaaactga aattggaaat taaagttgag aatgtggagt atgacaaaga aggttctgcc 240
ttgcgtattc gcgggaagaa tattctggag aatgaacatg taaagatagg ggcctttcac 300
actctggaaa ttgagcaaca cagacctttt gtgctaagaa aggtggtctg ggactcactg 360
gcacgggagg ttcttcgtca agcttctgat ccatctgcaa gtgctgatct ggctgtggtt 420
ctgatgcaag aaggattggc acacattctt cttattggta aaagtgtgac tatcacccgt 480
tctcgtatag agtcttctat accgcgcaag catggaccgg ctattgcagg ttatgataag 540
gcgttaaata aattctttga caatgttcta caggcctttg tcaagcatgt tgatttcaaa 600
gtagttcgct gtgctgtgat tgcaagtcca ggattcacca aggatcagtt tcatcgtcac 660
ctgttgttgg aagccgagag gaagcaacta agacctataa tagaaaataa gtcacgcata 720
attcttgtcc atacaacctc gggatacaaa catagtttga aagaggttat ggatgcccca 780
aatgtaatga ctatgataaa agatacaaaa gctgccaaag aggttcaagc cctaaaggat 840
tttttcaaca tgctttcaaa tgatcctgat cgtgcatgct atggaccaaa gcatgttgaa 900
gttgcccatg agcgtctggc tattcagaca cttctcatta ctgacgagct ctttaggagt 960
tctgatgtag aaacgaggaa aaagtatgct aatttggtcg attcagtcaa ggattcaggt 1020
ggtactgctc tcattttctc gtcaatgcat gtctccggag aacaattgaa tcagctaacc 1080
ggcattgctg caatccttcg ttttcctttg ccggagctgg aagacattga gatgtga 1137

Claims (16)

1.一种具有降低的野生型蛋白质表达的植物细胞、植物组织或植物，其中所述野生型蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，其中优选地所述野生型蛋白质不在所述植物细胞、植物组织或植物中表达，并且其中与不具有降低的所述野生型蛋白质表达的其他方面相同的对照植物细胞、植物组织或植物相比，所述植物细胞、植物组织或植物对双生病毒科(Geminiviridae)的至少一个双粒成员具有增加的抗性。
2.根据权利要求1所述的植物细胞、植物组织或植物，其中所述植物细胞、植物组织或植物对所述双生病毒科的至少一个双粒成员和至少一个单粒成员具有增加的抗性。
3.根据权利要求1或2所述的植物细胞、植物组织或植物，其中所述双生病毒科是菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的植物细胞、植物组织或植物，其中所述植物细胞、植物组织或植物是双子叶植物，优选选自辣椒属(Capsicum)、食用番茄(Solanumlycopersicum)、木薯(Manihot esculenta)、棉属(Gossypium)、葫芦科(Cucurbitaceae)、茄子(Solanum melongena)、咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)和豆科(Fabaceae)。
5.根据权利要求4所述的植物细胞、植物组织或植物，其中所述植物是辣椒属，优选一年生辣椒(Capsicum annuum)，并且其中所述降低的野生型蛋白质表达增加了对辣椒黄曲叶印度尼西亚病毒和/或辣椒曲叶病毒的抗性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的植物细胞、植物组织或植物，其中所述植物细胞、植物组织或植物进一步表达经修饰的蛋白质，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，所述经修饰的蛋白质具有至少约75％的序列相同性，并且其中
a)所述经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰；或
b)所述经修饰的蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质，
其中与表达无修饰或无截短的蛋白质的其他方面相同的植物细胞、植物组织或植物相比，表达所述经修饰的蛋白质增加了对双生病毒科的抗性。
7.根据权利要求6所述的植物细胞、植物组织或植物，其中所述修饰是缺失至少一个、两个或三个氨基酸残基，其中优选地，所述修饰是缺失SEQ ID NO：1的位置71、72或73处的至少一个氨基酸残基。
8.根据权利要求6-7所述的植物细胞、植物组织或植物，其中当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-378的位置上计算时，权利要求6的次项a)所定义的蛋白质具有至少95％的序列相同性。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的植物细胞、植物组织或植物，其中权利要求6的次项a)所定义的所述经修饰的蛋白质由包含与SEQ ID NO：4具有至少75％序列相同性的序列的核酸编码。
10.一种经修饰的蛋白质，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，其与SEQ ID NO：1具有至少75％的序列相同性，并且其中
i)所述蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰，并且其中优选地所述蛋白质具有SEQ ID NO：3的序列；或
ii)所述经修饰的蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质，并且其中优选地所述蛋白质具有SEQ ID NO：5的序列。
11.一种核酸，其包含编码权利要求10所定义的蛋白质的序列。
12.一种核酸构建体，其包含权利要求11所定义的核酸，其中所述核酸优选与用于在植物细胞中表达的启动子可操作地连接。
13.一种用于在植物细胞、植物组织或植物中增加对双生病毒科的至少双粒成员的抗性的方法，其中所述方法包含以下步骤：
i)提供植物细胞、植物组织或植物；
ii)降低野生型蛋白质的表达，其中所述蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，其中优选地不表达所述野生型蛋白质，以及
iii)任选地，筛选所述植物细胞、植物组织或植物对双生病毒科的至少双粒成员的增加的抗性。
14.一种用于产生对双生病毒科具有增加的抗性的植物细胞、植物组织或植物的方法，所述方法包含以下步骤
i)提供植物细胞、植物组织或植物；
ii)降低野生型蛋白质的表达，其中所述蛋白质在其全长上与SEQ ID NO：1具有至少约75％的序列相同性，其中优选地不表达所述野生型蛋白质；
iii)任选地，引入经修饰的蛋白质的表达，当在对应于SEQ ID NO：1的位置1-66和位置78-308的位置上计算时，所述经修饰的蛋白质具有至少约75％的序列相同性：并且其中
a)所述经修饰的蛋白质包含对应于SEQ ID NO：1的位置67-77的一个或多个氨基酸残基的修饰；或
b)所述经修饰的蛋白质是具有对应于SEQ ID NO：1的位置309-378的缺失的截短的蛋白质，
其中优选通过修饰编码所述野生型蛋白质的内源核苷酸序列来引入所述经修饰的蛋白质的表达，
iv)任选地，选择表达所述经修饰的蛋白质的植物细胞、植物组织或植物；以及
v)再生所述植物。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述植物是双子叶植物，优选选自辣椒属、食用番茄、木薯、棉属、葫芦科、茄子、咖啡黄葵和豆科，和/或其中优选地，所述双生病毒科是菜豆金色花叶病毒属。
16.一种可通过权利要求13-15中任一项的方法获得的植物。
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