CN111705141B - 一种荧光定量pcr检测鉴定乳状耳形螺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种荧光定量PCR检测鉴定乳状耳形螺的方法，属于有害生物检测鉴定技术领域，应用特异性引物及探针对乳状耳形螺的分子特征进行识别，引物和探针序列如SEQ ID NO.1‑3所示。本发明方法能够快速、准确地检测鉴定乳状耳形螺，不仅具有特异性强、灵敏度高、耗时短、结果判定准确、操作简便的优点，而且无需PCR后处理，能有效避免假阳性和交叉污染。本发明为进出境粮食、种苗、木材、花卉等货物查验、农业生产、疾病预防控制及科学研究中快速精准鉴定乳状耳形螺提供了新的技术手段，对于制定技术性贸易壁垒措施，保护国内农业生产安全和人畜健康等方面，具有重要的现实意义。

Description

一种荧光定量PCR检测鉴定乳状耳形螺的方法
技术领域
本发明涉及一种荧光定量PCR检测鉴定乳状耳形螺的方法，属于有害生物检测鉴定技术领域，适用于进出境粮食、种苗、木材、花卉等货物查验、农业生产、疾病预防控制及科学研究中乳状耳形螺的快速精准鉴定。
背景技术
乳状耳形螺 Otala lactea (Müller, 1774) 隶属软体动物门Mollusca，腹足纲Gastropoda，肺螺亚纲Pulmonata，柄眼目Stylommatophora，大蜗牛科helicidae，耳形螺属 Otala Schumacher, 1817，是一种对农业生产和人畜健康危害极其严重的有害生物。乳状耳形螺原产于地中海东部沿岸，现已传播到世界上许多国家和地区，不但严重危害农林生产，造成重大经济损失，而且传播人畜共患寄生虫病，威胁人畜健康。2017年我国口岸检疫机关首次从西班牙进境货物中截获乳状耳形螺，风险分析表明该螺属于特别危险的物种，可在中国绝大部分地区适生，入侵风险极高。为防止有害生物入侵，保护国门生物安全，同年11月原国家质检总局发布《关于进口西班牙货物首次截获乳状耳形螺的警示通报》（质检动警【2017】第39号）。2018年农业部种植业管理司发布《关于动态调整我国进境植物检疫性有害生物有关意见的函》（农农植保【2018】1号），将乳状耳形螺增补列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。乳状耳形螺与其近似种散大蜗牛、盖罩大蜗牛、蠕虫尹氏蜗牛、亮大蜗牛等外观极为相似，单从贝壳形态上难以区别。再者乳状耳形螺的贝壳受外界地理环境、气候因素等的影响而常常发生变异，鉴定则更为困难。由于历史的原因，目前国内农林院校植保系既没有开设有害蜗牛方面的课程，也没有专业的研究力量，在农业有害蜗牛研究领域虽然有一些零星的报道，但基本上还是空白。由于乳状耳形螺缺乏有效的快速检测鉴定方法，进出境物种查验中常出现虚报瞒报的现象，严重危害国门生物安全以及人畜健康。乳状耳形螺检不了、检不准、检不快的技术难题亟待解决。随着分子生物学技术飞速发展，运用荧光定量PCR技术在反应体系中加入荧光染料，通过荧光信号的传递来反映DNA扩增量，可以实现快而准的检测鉴定。迄今为止，尚未见用于乳状耳形螺检测鉴定的荧光定量PCR技术。如果能设计出特异性引物及探针用荧光定量PCR扩增方法为乳状耳形螺的快速准确鉴定提供新的技术手段，这个难题就迎刃而解。本发明建立了一种荧光定量PCR方法检测鉴定乳状耳形螺的技术，以防止有害生物入侵，维护国门生物安全，保护农林生产及人畜健康。
发明内容
本发明针对传统形态学和普通PCR鉴定技术所存在的不足开展研究，旨在提供一种准确性好、灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简便的检测方法，应用于乳状耳形螺的快速检测鉴定。
本发明提供了一种荧光定量PCR检测鉴定乳状耳形螺的方法，所述方法是应用特异性引物及荧光探针对乳状耳形螺的分子特征进行识别，所述引物及荧光探针为：
上游引物为OLF：5’- TTCCGTGGATTTGGCTATTT -3’，
下游引物为OLR：5’- TGGTAATAGCACCCGCCAAA -3’，
荧光探针为OLP：5’-FAM- CGGTCACCAGGAGTCACTCTAGAACG –BHQ1-3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ1，
以上引物及探针浓度均为10μmol/L。
所述荧光定量PCR反应体系总体积为25μL，其中2×Premix Ex TaqTM PCR（ProbeqPCR） 12.5μL，上、下游引物及探针各1μL，100ng/μL DNA模板3μL，ROXII 0.5μL，ddH2O 7μL。
所述荧光定量PCR反应的程序为：94℃预变性5min；94℃ 10s，60℃ 32s，40个循环；结束反应。
所述荧光定量PCR反应结束后根据扩增曲线判定结果，判定方法如下：在空白对照及阴性对照无 Ct 值且无扩增曲线条件下，当待测样品出现典型扩增曲线，且Ct值小于或等于35时，判定为乳状耳形螺；当Ct值等于40时，判定为非乳状耳形螺。若Ct值大于35且小于40时，应重新进行测试：Ct值等于40时，判定为非乳状耳形螺；Ct值小于40时，则判定为乳状耳形螺。
本发明的显著优点：本发明方法能够方便、快速、准确地检测鉴定乳状耳形螺。本发明为进出境货物查验、农业生产、疾病预防控制及科学研究中快速精准鉴定乳状耳形螺提供了新的技术手段，对于保护农林生产及人畜健康、维护国门生物安全具有重要意义。
本发明所提供的一种荧光定量PCR检测鉴定乳状耳形螺的方法具有以下有益效果：
1、特异性强：所采用的荧光引物及探针是针对乳状耳形螺的COI基因序列设计出的特异性引物及探针，一对特异性引物和一条特异性探针可以对靶目标进行双重控制，特异性强。
2、灵敏度高：对乳状耳形螺的检测灵敏度在DNA水平上可达到 10pg/μL。
3、结果判定准确直观：本发明所设计出的一种检测鉴定乳状耳形螺的特异性引物及探针，仅对乳状耳形螺进行检测，已经对近似种斑点耳形螺、散大蜗牛、森林葱蜗牛、花园葱蜗牛、盖罩大蜗牛、比萨茶蜗牛、蠕虫尹氏蜗牛、亮大蜗牛共计8种代表性蜗牛进行了测试验证，且PCR扩增结果可以在电脑上直接显示，无需其他额外步骤，因此结果判定准确直观。
4、操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要一台荧光定量PCR仪就能反应和检测，操作简单方便。
5、实用性好：当传统分类学方法难以鉴定乳状耳形螺时，本发明方法用分子生物学技术进行弥补，从而得到快速、准确、灵敏度高的检测乳状耳形螺的荧光定量PCR方法。因此本方法的实用性好，可满足对乳状耳形螺进行快速可靠的检测和鉴定的需要。
附图说明
图1为乳状耳形螺荧光定量PCR引物特异性试验结果。其中：曲线1为乳状耳形螺 Otala lactea (Müller, 1774)；曲线2为斑点耳形螺 Otala punctata (Müller, 1774)；曲线3为散大蜗牛 Helix aspersa；曲线4为森林葱蜗牛 Cepaea nemoralis；曲线5为花园葱蜗牛 Cepaea hortensis；曲线6为盖罩大蜗牛 Helix pomatia；曲线7为比萨茶蜗牛 Theba  pisana；曲线8为蠕虫尹氏蜗牛 Eobania vermiculata；曲线9为亮大蜗牛 Helix lucorum；曲线10为空白对照。
图2 为乳状耳形螺荧光定量PCR检测灵敏度试验结果。其中曲线1为100ng/μL；曲线2为10ng/μL；曲线3为1ng/μL；曲线4为100pg/μL；曲线5为10pg/μL；曲线6为1pg/μL；曲线7为10fg/μL；曲线8为10fg/μL；曲线9为1fg/μL；曲线10为空白对照。
具体实施方式
实施例1:乳状耳形螺荧光定量PCR引物特异性试验
1、材料的准备
供试蜗牛如下：乳状耳形螺；斑点耳形螺；散大蜗牛；森林葱蜗牛；花园葱蜗牛；盖罩大蜗牛；比萨茶蜗牛；蠕虫尹氏蜗牛；亮大蜗牛。
以上供试蜗牛系通过国内调查采集获得或全国口岸检疫中截获，经***国家软体动物检疫鉴定重点实验室确认后，置于-20℃保存备用。
2、荧光定量PCR方法的建立
2.1、引物的设计合成：基于乳状耳形螺COI基因序列，用引物设计软PrimerExpress3辅助设计和分析引物，经NCBI Blast 检验其特异性后，交由上海生工生物技术服务有限公司合成。经反复比对测试最终确定的最优引物如下：
上游引物为OLF：5’- TTCCGTGGATTTGGCTATTT -3’，
下游引物为OLR：5’- TGGTAATAGCACCCGCCAAA -3’，
荧光探针为OLP：5’-FAM- CGGTCACCAGGAGTCACTCTAGAACG –BHQ1-3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ1。
2.2、DNA提取：TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒提取，按使用说明书操作提取DNA。用核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度，最后用TE溶液将DNA稀释至100ng/μL，置于-20℃保存备用。
2.3、荧光定量PCR扩增反应体系：总体积为25μL，其中2×Premix Ex TaqTM PCR（Probe qPCR） 12.5μL，上、下游引物及探针各1μL，100ng/μL DNA模板2μL，ROXII 0.5μL，ddH2O 7μL。混匀后放入荧光定量PCR扩增仪中进行扩增，引物及探针浓度均为10μmol/L。
2.4、荧光定量PCR两步法扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃ 10s，60℃ 35s，40个循环；结束反应。
2.5、特异性试验结果：只有乳状耳形螺在荧光定量PCR仪上出现典型的扩增曲线，且Ct值小于35，其他样品均未出现典型的扩增曲线，说明本方法可用于乳状耳形螺的特异性检测（图1）。
实施例2：乳状耳形螺荧光定量PCR 检测灵敏度试验
采用10倍浓度系列稀释法将实施例1中提取的乳状耳形螺DNA原液（100ng/μL）稀释成10ng/μL、1ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1fg/μL的不同浓度梯度。
荧光定量PCR扩增反应体系：总体积为25μL，其中2×Premix Ex TaqTM PCR（ProbeqPCR） 12.5μL，上、下游引物及探针各1μL，100ng/μL DNA模板2μL，ROXII 0.5μL，ddH2O 7μL。混匀后放入荧光定量PCR扩增仪中进行扩增，引物及探针浓度均为10μmol/L。
荧光定量PCR两步法扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃ 10s，60℃ 35s，40个循环；结束反应。
灵敏度试验结果：当DNA浓度为 10 pg/μL时仍有扩增曲线出现，表明此方法具有较高的灵敏度，检测灵敏度可达到 10 pg/μL（图2）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州海关技术中心
<120> 一种荧光定量PCR检测鉴定乳状耳形螺的方法
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttccgtggat ttggctattt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggtaatagc acccgccaaa 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggtcaccag gagtcactct agaacg 26

Claims (1)

1.一种荧光定量PCR检测鉴定乳状耳形螺的方法，其特征在于：所述方法是应用特异性引物及荧光探针对乳状耳形螺的分子特征进行识别，所述引物及荧光探针为：
上游引物为OLF：5’- TTCCGTGGATTTGGCTATTT -3’，
下游引物为OLR：5’- TGGTAATAGCACCCGCCAAA -3’，
荧光探针为OLP：5’-FAM- CGGTCACCAGGAGTCACTCTAGAACG –BHQ1-3’，5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是BHQ1，
以上引物及探针浓度均为10μmolL；
所述荧光定量PCR反应体系总体积为25μL，其中2×Premix Ex TaqTM PCR（ProbeqPCR）12.5μL，上、下游引物及探针各1μL，100ngμL DNA模板2μL，ROXII 0.5μL，ddH2O 7μL；所述荧光定量PCR反应的程序为：95℃预变性5min；95℃ 10s，60℃ 32s，40个循环；结束反应；
所述荧光定量PCR反应结束后根据扩增曲线判定结果，判定方法如下：在空白对照及阴性对照无 Ct 值且无扩增曲线条件下，当待测样品出现典型的扩增曲线，且Ct值小于或等于35时，判定为乳状耳形螺；当Ct值等于40时，判定为非乳状耳形螺；当Ct值大于35且小于40时，重新进行测试：当Ct值等于40时，判定为非乳状耳形螺；Ct值小于40时，则判定为乳状耳形螺。
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