CN111704727B - 一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶及制备方法及应用 - Google Patents

一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶及制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶及制备方法及应用，制备方法包括：在一定条件下进行氧化自聚合制备聚多巴胺溶液，将可得然多糖、聚多巴胺均匀分散后，加热至80℃后再冷却形成水凝胶，与多种成纤维细胞共培养显示良好的生物相容性，聚多巴胺能够调控可得然多糖水凝胶的微观结构，力学性能，溶胀性能和离子响应行为等，使杂化水凝胶能够用于成纤维细胞体外培养的组织工程材料，提供了一种多糖基水凝胶在组织工程中的体内应用方式。

Description

一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶及制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物支架领域，尤其是涉及一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶及制备方法及应用。
背景技术
组织工程学是一门结合工程学和生命科学的原理和方法的新兴学科。科学家们一直致力于研发出能够更好的模拟细胞为环境的三位支架材料。理想的细胞支架应当具有良好的生物相容性，降解性，三维立体多孔结构，具备一定的生物力学特性，并且能提供良好的细胞界面。细胞支架细胞支架材料的生物力学性质与化学环境是影响细胞生物学行为的两大重要因素。
支架材料的选择和优化是组织工程中尤为重要的环节。当前的支架材料主要分为人工合成高分子和天然生物材料。可得然多糖是一种细菌来源的天然多糖，因其优良的生物相容性已在食品化学中被广泛使用，有学者已经发表了其小分子药物，蛋白质，基因等递送的应用。聚多巴胺是一种仿贻贝天然生物材料，具有去除氧自由基、促进成骨等多种功能。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶及制备方法及应用。
为实现上述目的，本发明提供一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的制备方法，多巴胺单体溶解于pH＝13的氢氧化钠碱性溶液中，在25℃条件下搅拌12h，调节pH至8.5，配置聚多巴胺母液终浓度1-10mg/mL，将可得然多糖溶解于pH＝12的碱性溶液中，终浓度30mg/mL，将各组分均匀分散，加热至80℃后再冷却形成水凝胶，最终获得该多糖基杂化水凝胶。
进一步的，所述聚多巴胺母液终浓度1-5mg/mL。
本发明还提供上述可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的制备方法制备的可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶。
本发明还提供上述可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的应用，可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶用于制备细胞支架的应用。
作为本发明的一种应用方式，细胞支架为3D细胞培养支架。
作为本发明的一种应用方式，所述细胞支架为的孔隙直径为10-100μm。
作为本发明的一种应用方式，所述细胞支架为成纤维细胞培养支架。
作为本发明的一种应用方式，所述细胞支架为离子浓度响应调控型的细胞培养支架，所述离子为钠离子或镁离子或铝离子或钙离子中的一种。
作为本发明的一种应用方式，所述细胞支架为钙离子浓度响应调控型的骨细胞培养支架。
本发明具有如下优点：可得然多糖的物理成胶特性使其避免了有毒交联剂的使用，整体的制备过程简单，可得然极高的生物相容性，使其拥有成为细胞支架的天然优势，聚多巴胺是一种仿贻贝天然生物材料，可以显著增强材料的粘合性能，在制备可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶过程中，聚多巴胺可以调控水凝胶的理化特性，包括力学性能、溶胀性能，进而本发明提供了一种对成纤维细胞具有高生物相容性的、力学性能可调控的、用于细胞体外培养的组织工程材料，能够成为移植材料应用于体内。
附图说明
图1为本发明实施例的扫描电镜图片；
图2为本发明实施例水凝胶的流变性能结果；
图3为本发明实施例水凝胶的溶胀性能结果；
图4为牙周膜细胞(hPDLCs)在本发明实施例中水凝胶的细胞毒性结果图片；
图5为牙周膜细胞(hPDLCs)在本发明实施例中水凝胶的细胞活死荧光图片；
图6为小鼠成纤维细胞(L929)在本发明实施例水凝胶中的细胞毒性结果。
具体实施方式
下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。
实施例1：可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的制备
其制备方法步骤如下：
将多巴胺单体溶解于pH＝13的氢氧化钠碱性溶液中，在25℃条件下搅拌12h，调节pH至8.5，配置聚多巴胺母液终浓度1mg/mL，可得然多糖溶解于pH＝12的碱性溶液中，终浓度30mg/mL，混合后将各组分均匀分散，加热至80℃后再冷却形成水凝胶。
实施例2：可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的制备
其制备方法步骤如下：
将多巴胺单体溶解于pH＝13的氢氧化钠碱性溶液中，在25℃条件下搅拌12h，调节pH至8.5，配置聚多巴胺母液终浓度2mg/mL，可得然多糖溶解于pH＝12的碱性溶液中，终浓度30mg/mL，混合后将各组分均匀分散，加热至80℃后再冷却形成水凝胶。
实施例3：可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的制备
其制备方法步骤如下：
将多巴胺单体溶解于pH＝13的氢氧化钠碱性溶液中，在25℃条件下搅拌12h，调节pH至8.5，配置聚多巴胺母液终浓度4mg/mL，可得然多糖溶解于pH＝12的碱性溶液中，终浓度30mg/mL，混合后将各组分均匀分散，加热至80℃后再冷却形成水凝胶。
实施例4：可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的形态特征
其评估步骤如下：
设置对照组，可得然多糖溶解于pH＝12的碱性溶液中，终浓度30mg/mL，加热至80℃后再冷却形成水凝记为CP0；将实施例1-3制备的水凝胶分别记为CP1、CP2、CP3。
取CP0、CP1、CP2、CP3水凝胶，去离子水浸泡12h达到溶胀平衡后，液氮迅速冷冻，冻干机冻干样品12h，然后喷金，扫描电镜观察。
图1结果所示，随着聚多巴胺浓度升高，杂化水凝胶的孔径逐渐减小。聚多巴胺对水凝胶支架的微观结构有调控作用。
实施例5：可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的流变性能结果
其评估步骤如下：
设置对照组，可得然多糖溶解于pH＝12的碱性溶液中，终浓度30mg/mL，加热至80℃后再冷却形成水凝记为CP0；将实施例1-3制备的水凝胶分别记为CP1、CP2、CP3。
取CP0、CP1、CP2、CP3水凝胶，使用流变仪测量耗损模量。图2结果显示，随着聚多巴胺浓度的升高，凝胶的力学性能逐渐加强优化，呈现聚多巴胺浓度相关性，在应用时，根据不同使用环境来选择不同的力学性能的凝胶。
实施例6：可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的溶胀性能结果
其评估步骤如下：
设置对照组，可得然多糖溶解于pH＝12的碱性溶液中，终浓度30mg/mL，加热至80℃后再冷却形成水凝记为CP0；将实施例3制备的水凝胶记为CP3。
取CP0、CP3水凝胶，在去离子水中浸泡至溶胀平衡，按时间取点，测量最初的质量与每个相应时间点的质量。按照公式：(Mt-M0)/M0；Mt为对应时间点的重量，M0为最初的质量。
另外取CP0、CP3水凝胶，在1.5％的氯化钠，氯化镁和氯化铝溶液中分别再次进行溶胀实验。较高的溶胀更容易导致三维支架的坍塌，图3结果显示，相比于可得然多糖水凝胶，杂化水凝胶显示出较低的溶胀性能，体系更加稳定。并且，溶胀性能在钠镁铝离子溶液中显示出不同，展现着离子响应行为。聚多巴胺和金属离子之间的螯合，较强的相互作用压缩了结构，水凝胶网络进一步缩小。
该水凝胶在不同价态的离子中展现出响应性的溶胀行为。不同价态的离子与聚多巴胺链发生二次交联，使水凝胶聚合物链的缠绕紧密程度发生改变，理化性能等也发生了相应的变化。因此，本发明所构筑的水凝胶支架，可通过改变离子的价态和浓度等，来调控、改善凝胶的理化性能，成为更适合细胞培养的基质：如该水凝胶细胞作为成骨细胞支架时，可以通过吸附/释放钙离子，来调控成骨细胞的粘附和分化。
实施例7：可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的生物相容性评估结果
其评估步骤如下：
设置对照组，可得然多糖溶解于pH＝12的碱性溶液中，终浓度30mg/mL，加热至80℃后再冷却形成水凝记为CP0；将实施例3制备的水凝胶记为CP3。
取CP0、CP3水凝胶，制备凝胶样品1∶1体积比浸出液，取出浸出液后以1∶10加入胎牛血清。
将人牙周膜细胞铺板96孔板，密度5×103个/mL。过夜培养后，加入CP0，CP3浸出液共培养，并设置空白对照将人牙周膜细胞直接在胎牛血清铺板96孔板培养。1，3，5天使用CCK-8是试剂盒测试细胞增殖活性。人牙周膜细胞铺板于激光共聚焦皿，密度5×103个/mL。过夜培养后，加入CP0，CP3浸出液共培养，1，3，5天使用Calcein-AM/PI活死染色剂染色，激光共聚焦观察。图4结果显示，1，3，5天杂化水凝胶相对于对照组和CP0组都具有至少80％的细胞活性，图5中显示荧光染色以活细胞最多，基本不见死细胞，细胞形态呈现梭形纺锤样成纤维细胞，本申请制备对人牙周膜细胞的生物毒性低，具有较高的生物相容性。
另外将小鼠成纤维细胞(L929)铺板96孔板，密度104个/mL。过夜培养后，加入CP0，CP3浸出液共培养。1，3，5天使用CCK-8是试剂盒测试细胞增殖活性，结果如图6所示，可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶能够促进成纤维细胞的增殖。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的制备方法，其特征在于：多巴胺单体溶解于pH＝13的氢氧化钠碱性溶液中，在25℃条件下搅拌12h，调节pH至8.5，配置聚多巴胺母液终浓度1-10mg/mL，将可得然多糖溶解于pH＝12的碱性溶液中，终浓度30mg/mL，将各组分均匀分散，加热至80℃后再冷却形成水凝胶，最终获得多糖基杂化水凝胶。
2.一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的制备方法，其特征在于：所述聚多巴胺母液终浓度1-5mg/mL。
3.一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶，其特征在于，所述凝胶为根据权利要求1或2所述的一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的制备方法制备的凝胶。
4.一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的应用，其特征在于，根据权利要求3所述的一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶在制备细胞支架中的应用。
5.根据权利要求4所述的一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的应用，其特征在于，所述细胞支架为3D细胞培养支架。
6.根据权利要求4所述的一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的应用，其特征在于，所述细胞支架为的孔隙直径为10-100μm。
7.根据权利要求4所述的一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的应用，其特征在于，所述细胞支架为成纤维细胞培养支架。
8.根据权利要求4所述的一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的应用，其特征在于，所述细胞支架为离子浓度响应调控型的细胞培养支架，所述离子为钠离子或镁离子或铝离子或钙离子中的一种。
9.根据权利要求8所述的一种可得然多糖/聚多巴胺杂化水凝胶的应用，其特征在于，所述细胞支架为钙离子浓度响应调控型的骨细胞培养支架。
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