CN111701021A - Nipa2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用 - Google Patents

Nipa2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明首先提供一种NIPA2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用。接着提供一种治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物制剂，包括所述的NIPA2过表达***和药学上可接受的载体。最终提供一种具体的治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物制剂，包括导入NIPA2基因编码序列的重组表达质粒GV141‑NIPA2、ROCK‑IN‑2抑制剂和药学上可接受的载体，且GV141‑NIPA2与ROCK‑IN‑2抑制剂重量比例为：1:1，其具有最佳的临床治疗效果。

Description

NIPA2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物 中的应用
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体地说，涉及一种NIPA2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用。
背景技术
据***预测，1990-2020年世界老龄人口平均年增速度为2.5％，同期我国老龄人口的递增速度为3.3％，到2020年我国65岁以上老龄人口将达1.67亿。随着人口老龄化，常见的代谢性疾病糖尿病和骨质疏松发病率逐年增长，带来沉重经济负担的同时，严重危害老年人身体健康。糖尿病和骨质疏松的病理机制存在密切联系，Wientroub S等在1980年首次提出糖尿病性骨质疏松(diabetic osteoporosis，DOP)的概念，即在糖尿病病理进程中出现骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加等病理改变，其带来的骨质疏松性疼痛、骨质疏松性骨折等严重降低了患者的生活质量。骨质疏松在1型及2型糖尿病中均有发现，但临床研究表明2型糖尿病患者骨质疏松性骨折风险较1型糖尿病患者增加1.7倍。此外，2型糖尿病性骨质疏松与典型骨质疏松中骨密度减低的病理表现不同，其骨骼主要病理表现为骨脆性增加，其病理机制并不明确。同时，公认的抗骨质疏松药物如双膦酸盐等，对2型糖尿病性骨质疏松治疗效果并不理想。骨质疏松病理改变的基础是成骨及破骨失衡，而骨脆性增加与成骨细胞功能异常密切相关。因此，对2型DOP中成骨细胞功能改变及其具体机制进行研究，并从中发现新的药物靶点是临床治疗2型DOP的迫切需求。
金属离子与成骨细胞功能的相关性已经得到广泛报道，且目前主要集中在铁离子引起的铁超载导致的氧化应激损伤。但铁离子主要储存于血液中，其在人体骨骼中的特异性并不强。而镁离子作为机体重要的二价金属离子之一，约 50-60％存在于骨骼中，在骨形成及骨能量代谢中扮演重要角色。Sidor P等研究证实全身镁离子缺乏会引起骨质疏松的发生，提示镁离子与骨质疏松密切相关。同时也有研究表明镁是许多酶的辅助因子,具有稳定DNA和RNA结构的作用，与成骨细胞和破骨细胞功能密切相关。此外，已有相关临床研究表明，2型糖尿病患者中存在镁离子缺乏情况。镁离子在人体细胞的内外转运是通过镁离子通道蛋白实现的。NIPA2(Non-imprinted in Prader-Willi/Angelman syndrome regionprotein 2)是目前发现唯一的高选择性镁离子通道蛋白，具有向细胞内转运镁离子的作用并对镁离子具有严格的专一性。
发明内容
本发明的技术目的首先是提供NIPA2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用。镁离子转运蛋白NIPA2是2型糖尿病性骨质疏松病理进程中的重要影响因素，申请人发现在2型糖尿病微环境下NIPA2可以通过调控成骨细胞凋亡及线粒体自噬影响成骨能力。细胞自食(cell-in-cell)与细胞凋亡和自噬联系密切，其在骨质疏松研究中尚无报道。我们通过体内及体外实验发现，2型糖尿病性骨质疏松中成骨细胞NIPA2蛋白表达降低，成骨能力的各项生物学指标均下降。本发明通过质粒转染技术在小鼠膝关节注射NIPA2 过表达质粒后可以发现小鼠骨微结构得到改善。由此可见，2型糖尿病性骨质疏松成骨细胞内低镁可能是由于镁离子通道蛋白NIPA2表达降低导致的，并进一步介导了成骨细胞成骨能力下降，引起骨微结构改变。本发明通过一系列体内及体外实验，以NIPA2作为切入点，以cell-in-cell作为2型糖尿病性骨质疏松病理机制的补充，明确NIPA2通过cell-in-cell调控线粒体自噬影响成骨细胞功能的具体作用和机制。为临床2型糖尿病性骨质疏松治疗提供新的药物靶点。
进一步地，本发明提供可增加NIPA2表达的物质在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用。所述可增加NIPA2表达的物质或者方法，包括但不限于直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、 PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法等等。
其中一种优选的方法是，采用NIPA2过表达***，用于制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物。
据此，本发明进一步提供一种NIPA2过表达***，是在表达载体上导入NIPA2基因编码序列所获得的过表达NIPA2基因的重组表达载体；所述表达载体可以是真核表达载体。
优选的，所述真核表达载体是GV141质粒。在构建所述重组表达质粒 GV141-NIPA2时，用来扩增所述NIPA2基因编码序列的特异性引物序列是：
上游引物：5’-CAGTTATGGTCATTCATGCTCCAA-3’，如SEQ ID No.1所示；下游引物：5’-TTAATATCAAGGCCACAATGACCAC-3’，如SEQ ID No.2 所示。
接着，本发明再提供一种治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物制剂，包括所述的NIPA2过表达***和药学上可接受的载体。所述制剂优选为可注射的，例如溶液剂、混悬剂和/或乳剂。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、葡萄糖、盐水、或磷酸盐缓冲盐水、其合适的混合物和植物油。
本发明在研究过程中，还发现沉默NIPA2能够导致成骨细胞内cAMP水平降低，进而显著增加Rho/ROCK信号通路活性，同时促进CIC结构的形成。细胞自食(Cell-in-cell，CIC)的机制某种程度上类似于吞噬作用，分为同质细胞自食和异质细胞自食。经典的CIC启动机制有赖于Rho/ROCK信号通路的激活。 Rho和其效应分子ROCK活化后在细胞内极性分布，进而借助细胞连接蛋白 E-cadherin和P-cadherin以及肌动蛋白形成细胞间粘附连接并使Rho活性高的细胞侵入到邻近细胞中，形成CIC结构。2型糖尿病性骨质疏松中NIPA2的降低可以引起成骨细胞线粒体膜电位降低，进而导致线粒体自噬水平上调。同时，线粒体膜电位改变也是引起线粒体凋亡的重要因素，我们的研究也发现在2型糖尿病性骨质疏松中成骨细胞NIPA2降低并引起细胞凋亡。同时，在高糖环境下调控CIC可以引起成骨细胞线粒体功能改变。因此我们有理由相信，2型糖尿病病理环境下CIC引起成骨细胞自食性死亡的机制与线粒体自噬和凋亡相关，镁离子转运蛋白NIPA2降低通过cAMP/PKA/Rho/ROCK信号通路介导CIC结构形成，进而影响成骨细胞命运。所以，本发明又提供NIPA2过表达***与促进NIPA2过表达***作用的物质联用在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用。根据上述CIC作用机制，所述促进NIPA2过表达***作用的物质可以是ROCK抑制剂。优选的是，所述ROCK抑制剂是ROCK-IN-2(C18H13ClF2N5O)。
Figure RE-GDA0002623001310000041
最优选的，所述NIPA2过表达***是导入NIPA2基因编码序列的重组表达质粒GV141-NIPA2，其与ROCK抑制剂(ROCK-IN-2)的重量比例为1:1具有更佳的临床治疗效果。
最后，本发明提供一种具体的治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物制剂，包括导入NIPA2基因编码序列的重组表达质粒GV141-NIPA2、ROCK-IN-2抑制剂和药学上可接受的载体，且GV141-NIPA2与ROCK-IN-2抑制剂重量比例为： 1:1。
附图说明
图1是2型糖尿病模型db/db小鼠骨组织镁离子变化结果，其中
A：镁离子荧光探针显示db/db小鼠及其对照组小鼠胫骨组织镁离子情况， *P＜0.05；
B：原子火焰分光光度法分析db/db小鼠及其对照组小鼠胫骨组织镁离子情况，*P＜0.05。
图2是db/db小鼠过表达NIPA2后骨微结构改变结果，其中
A：HE染色显示db/db小鼠过表达NIPA2后骨小梁密度，*p＜0.05；
B：micro-CT显示db/db小鼠过表达NIPA2后骨密度(BMD)、骨小梁体积/组织体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)及骨小梁厚度(Tb.Th)情况，*p 小于0.05。
图3是2型糖尿病db/db小鼠NIPA2表达降低结果，其中
A：免疫组化显示db/db小鼠骨组织NIPA2蛋白表达情况，*p＜0.05；
B：免疫荧光显示db/db小鼠骨组织中成骨细胞标记物OSX与NIPA2共定位情况，*p小于0.05；
C：Western-blot显示db/db小鼠骨组织NIPA2蛋白表达情况，*p＜0.05。
图4是高糖环境下NIPA2调控成骨细胞线粒体自噬结果，其中
A：Western-blot结果显示沉默及过表达NIPA2后线粒体自噬相关蛋白表达情况，*p＜0.05；
B：镁离子荧光探针显示沉默及过表达NIPA2后成骨细胞内镁离子情况，*p ＜0.05；
C：JC-1染色流式细胞仪检测沉默及过表达NIPA2后成骨细胞线粒体膜电位情况，*p＜0.05；
D:免疫荧光双染检测沉默及过表达NIPA2后线粒体自噬情况，*p＜0.05。
图5是NIPA2在2型糖尿病微环境下调控成骨细胞凋亡结果，其中
A：Western-blot结果显示晚期糖基化终末产物处理后，沉默及过表达NIPA2 导致自噬及凋亡相关蛋白表达变化，*p＜0.05；
B：镁离子荧光探针检测晚期糖基化终末产物处理后，沉默及过表达NIPA2 导致成骨细胞内镁离子水平变化，*p＜0.05；
C：流式细胞仪检测晚期糖基化终末产物处理后，沉默及过表达NIPA2成骨细胞凋亡水平变化，*p＜0.05。
图6是NIPA2与成骨细胞CIC的相关性结果，其中
A：免疫荧光显示沉默NIPA2后成骨细胞内CIC结构，*p＜0.05；
B：ELISA结果显示沉默NIPA2后成骨细胞内cAMP水平，*p＜0.05；
C:Western-blot结果显示沉默NIPA2后成骨细胞内Rho、ROCK蛋白表达水平，*p＜0.05。
图7是高糖环境下成骨细胞CIC与线粒体功能相关性结果，其中
A：Mito-tracker染色检测高糖环境下调控CIC后成骨细胞内线粒体情况， *p＜0.05；
B：Western-blot结果显示高糖环境下调控CIC后成骨细胞线粒体功能相关蛋白表达情况，*p小于0.05。
图8是载体GV141的结构图。
图9是尾静脉注射过表达GV141-NIPA2质粒后的Western-blot检测结果。
图10是尾静脉注射过表达GV141-NIPA2质粒后的免疫组化结果。
图11是应用NIPA2过表达质粒与ROCK抑制剂复方制剂按照10μg/kg体重静脉给药(1:1，3:1，1:3)，HE染色检测结果。
图12是应用NIPA2过表达质粒与ROCK抑制剂复方制剂按照10μg/kg体重静脉给药(1:1，3:1，1:3)，骨小梁密度检测结果，其中
横坐标：分组1：骨质疏松组；2：3:1给药组；3：1:1给药组；4：1:3给药组；纵坐标：骨小梁密度；
*表示与对照骨质疏松组相比具有统计学意义(P＜0.05)#表示与3:1给药及1:3给药组具有统计学意义(P＜0.05)。
具体实施方式
下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
下面结合附图对本发明做进一步描述。
本发明涉及的研究方法和实验手段：
1)小鼠的饲养
研究已经获得医院动物管理和使用委员会的批准。C57B6小鼠及db/db小鼠将购自专业生物技术公司(南京大学模式动物研究所)。小鼠在22℃±2°和12h 光照/12h黑暗循环条件下饲养和繁殖，小鼠可自由食用标准饲料和无菌水。
2)原代成骨细胞提取及培养
取小鼠胫骨后剔除肌肉、软组织及骨髓组织。使用α-MEM培养基冲洗并手机骨组织表面的成骨细胞。接种于10cm培养皿中，在添加了10％胎牛血清的α-MEM培养基中继续培养，孵育于5％CO2，33.5℃细胞培养箱中，每2天换液一次。
3)原子火焰分光光度法检测骨组织镁离子浓度
取小鼠胫骨由高氯酸与硝酸按1：4比例配置的消化液冷消化24小时后热消化30分钟至白色颗粒状。用1％硝酸溶液定容至5ml。使用原子火焰分光光度计测定镁离子含量。
4)镁离子荧光探针检测镁离子浓度
小鼠胫骨脱钙处理后制作石蜡切片，使用镁离子荧光探针Mag-Fura-2 AM、 20％Pluronic F-127与PBS配置成探针终浓度为5mM的负载液。孵育45分钟后使用双光子显微镜于370mm激发光下观察组织内镁离子情况。
5)免疫荧光
将骨组织石蜡切片脱蜡后置于载玻片，成骨细胞接种于激光共聚焦皿中。 4％多聚甲醛固定15分钟，0.5％Triton X-100通透化30分钟，5％BSA封闭1 小时后。一抗覆盖标本表面37℃孵育2小时，荧光二抗37℃避光孵育50分钟。激光共聚焦显微镜下观察样本。
6)HE染色
骨组织石蜡切片进行常规脱蜡、切片。使用HE染色试剂盒进行标准流程 HE染色后，进行光镜检测，低倍镜下观察骨小梁结构，高倍镜下观察CIC结构。
7)免疫组化
10μm的骨组织切片置于二甲苯中脱蜡，并在100％，95％，80％，75％梯度酒精中水化。柠檬酸钠缓冲液95℃处理15分钟进行抗原修复后，于3％过氧化氢中37℃处理15min灭活过氧化物酶。PBS冲洗三遍后，使用山羊血清封闭 37℃下封闭30分钟。加入一抗孵育4℃过夜。次日经PBS冲洗后，先使用SABC 工作液37℃孵育25分钟，再使用3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色液显示免疫反应。观察至染色达到要求后使用双蒸水中止显色，然后使用苏木精复染细胞核。使用梯度酒精脱水后，中性树脂封片后光学显微镜观察。
8)Western-blot
组织及细胞裂解后提取总蛋白，经SDS-PAGE电泳中进行分离后电转至 PVDF膜。、经过封闭、洗涤、一抗孵育、洗涤，随后加入偶联过氧化物酶的二抗孵育。洗涤后，加入过氧化物酶底物，通过化学发光法显影并观察。
9)Mason染色
小鼠胫骨组织制作硬组织切片，使用Mason染色试剂盒进行标准流程Mason 染色，光镜观察分析骨密度及骨小梁情况。
10)Micro-CT
将固定好的小鼠右侧胫骨纵向置于样品架中。扫描参数：1024×1024图像矩阵、积分时间为200毫秒，能量/强度为70kVp，114μA，8W。扫描完成后，选取胫骨近端3mm厚度松质骨作为感兴趣区域进行重建，并利用Micro-CT分析软件进行定量分析。具体分析参数为：骨密度(BMD)、骨小梁体积/组织体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)及骨小梁厚度(Tb.Th)。
11)碱性磷酸酶染色
将原代成骨细胞接种于60mm培养皿中，PBS洗涤后，加入BCIP/NBT染色液，孵育2小时后光镜下观察。
12)茜素红染色
将原代成骨细胞接种于60mm培养皿中，PBS洗涤后，95％酒精固定10分钟。PBS清洗细胞后，将茜素红染色液配制成40mM的工作液，室温孵育40分钟后光镜下观察视野内钙结节。
13)cAMP检测
将原代成骨细胞接种于96孔板中，加入Alexafluor标记的cAMP抗体工作液，37℃避光反应60分钟，加入检测复合物，37℃避光反应60分钟，使用荧光分光光度计检测吸光度。
14)线粒体耗氧量(OCR)检测
将细胞接种于24孔板中，Oligomycin、FCCP、rotenone+antimycin按照说明依次给药后，运用细胞能量代谢实时测定仪测定具体OCR值。
15)线粒体DNA检测
提取原代成骨细胞DNA，设计并使用线粒体DNA相关引物，两步法进行实时定量PCR检测，根据ct值计算线粒体DNA含量。
16)线粒体膜电位检测
配制JC-1工作液，PBS清洗细胞面后，以不含EDTA胰酶消化各组细胞，收集细胞悬液1000rpm反复漂洗、离心2-3次，重悬于0.5ml无血清培养基中，加入0.5ml的JC-1工作液，细胞培养箱中37℃继续孵育20min。孵育结束后，4
下600g离心3分钟，收集细胞后用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤细胞2次后，用JC-1染色缓冲液(1×)重悬，用于流式细胞仪检测。
17)线粒体超氧化物生成检测
原代成骨细胞接种于激光共聚焦皿中，PBS清洗细胞后加入1ml MitoSOX 工作液，细胞培养箱中37℃孵育10分钟，用37℃的HBSS液洗涤三次，加入细胞培养基，使用激光共聚焦显微镜观察。
18)线粒体荧光探针染色
Mito-tracker原液按照1：2000比例稀释，作为探针负载液。接种于激光共聚焦皿中的原代成骨细胞使用PBS清洗一遍后，加入探针负载液，37℃孵育30 分钟。PBS再次清洗后，激光共聚焦显微镜观察线粒体。
本发明研究包括体内及体外实验研究。
实验例1.体内实验研究NIPA2，CIC与2型糖尿病性骨质疏松的相关性
1、应用2型糖尿病模型db/db鼠并构建NIPA2沉默及过表达模型，应用镁离子荧光探针及原子火焰分光光度法检测其骨组织内镁离子水平。
2、应用2型糖尿病模型db/db鼠并构建NIPA2沉默及过表达模型，激光共聚焦显微镜确定CIC类型，免疫荧光、HE染色等观察CIC结构及数量，检测 CIC关键蛋白Rho、ROCK表达。发现2型糖尿病中NIPA2对CIC的调控作用。
3、对2型糖尿病模型鼠及NIPA2沉默及过表达模型鼠进行骨微结构检测，探究NIPA2、CIC与2型糖尿病性骨质疏松的相关性。
具体技术方案是：
使用8-10周龄的2型糖尿病模型鼠db/db小鼠以及对照组C57B6小鼠，胫骨周围注射质粒制备NIPA2沉默及过表达模型，具体分组如下：对照组，db/db 组，db/db+NIPA2沉默组，db/db+NIPA2过表达组。使用常规饲料饲养至12周龄骨成熟后，取小鼠胫骨，进行如下实验：
1)液氮研磨后使用原子火焰分光光度法检测其镁离子浓度。小鼠胫骨脱钙包埋后切片，使用镁离子荧光探针染色，双光子显微镜检测镁离子浓度。
2)骨组织石蜡切片，荧光三染e-cadherin、CD45(白细胞膜标记物)及CD68 (巨噬细胞膜标记物)，DAPI染核后观察其共定位情况，研究其研究CIC的具体类型及各类型CIC结构数量。HE染色观察CIC结构及数量。免疫组化(石蜡切片)及Western-blot(液氮研磨骨组织后提取骨组织蛋白)检测CIC关键蛋白 Rho及ROCK表达。
3)硬组织切片后Mason染色观察骨微结构，Micro-CT评价骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度骨微结构参数，HE染色观察骨小梁形态及数量。
实验结果：
1、2型糖尿病模型db/db小鼠骨组织镁离子变化
通过镁离子荧光探针及原子火焰分光光度法对db/db小鼠及对照组C57B6 小鼠胫骨骨组织中镁离子检测，发现db/db小鼠骨组织中镁离子显著降低(图1)。
2、db/db小鼠沉默及过表达NIPA2后骨微结构改变
使用质粒过表达NIPA2后db/db小鼠骨小梁密度(图2A)及骨微结构(图 2B)明显改善。
实验例2.体内实验确定NIPA2调控的CIC是否是影响2型糖尿病动物模型骨微结构的关键因素
1)应用2型糖尿病模型db/db鼠构建NIPA2过表达模型，使用CIC激动剂及抑制剂处理后激光共聚焦显微镜、HE染色法观察其骨组织中CIC的结构及数量，检测CIC关键蛋白Rho、ROCK表达变化。
2)应用2型糖尿病模型db/db鼠构建NIPA2过表达模型，使用CIC激动剂及抑制剂处理后Mason染色观察其骨微结构改变，Micro-CT评估骨质条件，HE 染色观察骨小梁结构改变。
具体技术方案是：
使用8-10周龄的2型糖尿病模型鼠db/db小鼠以及对照组C57B6小鼠，胫骨周围注射NIPA2沉默及过表达质粒及CIC激动剂(Pentanoic acid)、CIC抑制剂(ROCK inhibitor-2)。具体分组如下：db/db组，db/db+NIPA2过表达组， db/db+NIPA2过表达+CIC激动剂组，db/db+NIPA2沉默+CIC抑制剂组。使用常规饲料饲养至12周龄骨成熟后，取小鼠胫骨，进行如下实验：
1)骨组织石蜡切片，荧光染色后激光共聚焦显微镜观察CIC数量。HE染色观察CIC结构及数量。免疫组化(石蜡切片)，及Western-blot(液氮研磨骨组织后提取骨组织蛋白)检测CIC关键蛋白Rho及ROCK表达。
2)硬组织切片后Mason染色观察骨微结构，Micro-CT评价骨密度、骨小梁数量、骨小梁厚度骨微结构参数，HE染色观察骨小梁形态及数量。
实验结果：
NIPA2在2型糖尿病性骨质疏松中调控成骨细胞线粒体自噬，2型糖尿病小鼠中NIPA2含量显著降低，低表达的NIPA2通过PGC1α/FoxO3a信号通路上调成骨细胞内线粒体自噬水平。
1、2型糖尿病db/db小鼠NIPA2表达降低，如图3所示。
2、高糖环境下NIPA2调控成骨细胞线粒体自噬，如图4所示。
实验例3.体外实验确定2型糖尿病性骨质疏松中NIPA2通过调控CIC影响成骨细胞功能的作用
1)使用db/db鼠原代成骨细胞构建NIPA2沉默及过表达细胞模型，激光共聚焦显微镜观察CIC结构及数量，检测CIC关键蛋白Rho、ROCK表达情况。
2)在NIPA2沉默及过表达的基础上应用CIC激动剂及抑制剂，使用ALP 染色，茜素红染色等观察成骨细胞成骨能力，WB检测成骨细胞功能相关蛋白 ALP、Collagen I、RUNX2、OPG、OCN表达水平。探究2型糖尿病性骨质疏松中NIPA2介导的CIC变化对成骨细胞成骨能力的调控作用。
具体技术方案是：
使用8-10周龄的2型糖尿病模型鼠db/db小鼠及对照组C57B6小鼠，取股骨及胫骨，去除软组织及骨髓组织，提取骨组织表面的原代成骨细胞。
1)依照如下分组：对照组，db/db组，db/db+NIPA2沉默组，db/db+NIPA2 过表达组。分别培养原代成骨细胞72小时后。荧光双染细胞骨架及细胞核，激光共聚焦显微镜观察CIC结构及数量；Western-blot检测CIC关键蛋白Rho、 ROCK表达变化。
2)在上述分组基础上应用CIC激动剂及抑制剂，培养原代成骨细胞72小时后。ELISA法及染色法检测成骨功能蛋白ALP变化，Western-blot法检测成骨功能相关蛋白ALP、Collagen I、RUNX2、OPG、OCN表达水平。使用成骨诱导培养基诱导成骨细胞分化后，茜素红染色观察钙结节数量。
实验结果：
NIPA2在2型糖尿病微环境下调控成骨细胞凋亡。2型糖尿病微环境下， NIPA2低表达可以引起成骨细胞凋亡，如图5所示。
实验例4.体外实验明确NIPA2对CIC的调控机制及CIC通过线粒体途径影响成骨细胞功能的具体机制
1)取db/db鼠原代成骨细胞，构建NIPA2沉默及过表达细胞模型，检测 cAMP/PKA信号通路变化，使用通路激动剂及抑制剂后激光共聚焦观察CIC结构及数量，WB检测CIC关键蛋白Rho、ROCK变化。
2)在上述细胞模型基础上应用CIC激动剂及抑制剂，流式细胞仪检测线粒体膜电位变化，电镜、激光共聚焦显微镜观察线粒体自噬情况，WB检测线粒体自噬关键蛋白PINK1、Parkin及线粒体功能相关蛋白TOMM20、COX4l1、ATP synβ、PGC1α、NRF1、TFAM，MitoSOX线粒体超氧化物、线粒体DNA检测线粒体功能，Mito-tracker荧光染色观察线粒体形态及数量。明确CIC对线粒体自噬及线粒体功能的调控作用。
3)使用线粒体自噬激动剂及抑制剂后，进行细胞凋亡检测，ALP染色，茜素红染色等观察成骨细胞成骨能力，WB检测成骨细胞功能相关蛋白ALP、 Collagen I、RUNX2、OPG、OCN表达水平。确定CIC介导的线粒体自噬改变线粒体功能最终影响成骨细胞成骨能力。
具体技术方案是：
使用8-10周龄的2型糖尿病模型鼠db/db小鼠，取股骨及胫骨，去除软组织及骨髓组织，提取骨组织表面的原代成骨细胞。具体实验如下：
1)依照如下分组：db/db组，db/db+NIPA2沉默组，db/db+NIPA2过表达组。分别培养原代成骨细胞72小时后。ELISA法检测细胞内cAMP变化。Western-blot 法检测PKA、p-PKA、Rho、ROCK蛋白表达。
2)在上述分组基础上，应用CIC激动剂及抑制剂，培养原代成骨细胞72 小时后。进行线粒体DNA检测、线粒体耗氧量检测(OCR)、线粒体超氧化物生成检测(MitoSOX)、JC-1染色后流式细胞仪检测线粒体膜电位变化、线粒体荧光探针Mito-tracker染色后激光共聚焦显微镜观察线粒体数量及形态、Western-blot检测线粒体功能相关蛋白TOMM20、COX4l1、ATP synβ、PGC1α、 NRF1及TFAM。Mito-tracker及LC3荧光双染后激光共聚焦显微镜观察线粒体自噬情况，WB检测线粒体自噬关键蛋白PINK1、Parkin表达。
实验结果：
1、NIPA2与成骨细胞CIC的相关性
申请人在成骨细胞内沉默NIPA2发现CIC结构显著增多(图6A)，cAMP 显著降低(图6B)，CIC关键通路Rho/ROCK激活(图6C)。
2、高糖环境下成骨细胞CIC与线粒体功能相关性
申请人在高糖环境下使用ROCK激动剂与抑制剂调控成骨细胞CIC，发现 CIC可以抑制线粒体活性(图7A)，并改变线粒体功能相关蛋白表达(图7B)。
实验例5：重组表达质粒GV141-NIPA2的构建及其应用
一、重组表达质粒GV141-NIPA2的构建
1.目的基因获取
(1)引物设计：根据Gene Bank中NIPA2基因序列，采用Primer 5.0软件设计引物，上游引物：5’-CAGTTATGGTCATTCATGCTCCAA-3’(如SEQ ID No.1 所示)，下游引物：5’-TTAATATCAAGGCCACAATGACCAC-3’(如SEQ ID No.2 所示)。
(2)片段的获取：将10％FBS DMEM/F12培养基培养的hFOB1.19细胞采用Trizol裂解，提取细胞总RNA并定量，而后反转录合成cDNA，采用PCR 的方法获得NIPA2目的片段，反应体系为:10mg/L模板5μL，100μmol/L上下游引物各1μL，5×缓冲液5μL，2500U/L DNA聚合酶0.5μL，2.5mmol/L dNTP Mix 2μL，RNase-free H2O 12.5μL。反应条件:94℃，3min；98℃，15s；56℃，50s；72℃，1min，共35循环；72℃，7min。经凝胶回收试剂盒回收待用。
2.质粒构建
1)载体酶切:将上述PCR产物和载体GV141(如图8所示)分别经限制性内切酶XhoI、EcoRI双酶切后凝胶回收片段，将纯化后的线性载体和目的基因产物通过连接酶连接，连接体系为:10mg/L载体3μL，10mg/L产物片段 4μL，350 000U/L T4连接酶1μL，10×缓冲液1μL，RNase-free H2O 1μL，总体积为10μL，4℃过夜连接。
(2)挑取阳性克隆:将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细菌中，在氨苄青霉素抗性培养皿中涂板筛选阳性克隆，随机挑取8个阳性菌落并在LB培养基中扩增。以随机挑取的8个阳性克隆少许菌落为模板，上游引物设计在PCR 扩增的目的片段上，下游引物设计在载体骨架上。
二、重组表达质粒GV141-NIPA2的过表达NIPA2效果
尾静脉注射过表达GV141-NIPA2质粒1天后，取C57小鼠胫骨骨组织液氮研磨后提取骨组织蛋白进行Western-blot检测发现NIPA2过表达质粒相较于对照组NIPA2表达明显升高。如图9所示，Western-blot结果显示，NIPA2过表达质粒转染后小鼠骨组织中NIPA2蛋白表达显著升高(*p＜0.05)。
尾静脉注射过表达GV141-NIPA2质粒1天后，取C57小鼠胫骨骨组织进行免疫组化检测显示骨组织中NIPA2过表达质粒可以显著提升小鼠骨组织中 NIPA2表达。如图10所示，免疫组化结果显示，NIPA2过表达质粒可以显著提高小鼠骨组织中NIPA2蛋白表达量。
三、骨质情况改善实验
应用GV141-NIPA2过表达质粒与ROCK抑制剂复方制剂按照10μg/kg体重静脉给药(1:1，3:1，1:3)取小鼠胫骨组织进行生物力学检测，分析骨组织最大载荷、刚度、弹性模量等生物力学指标(见表1)。发现NIPA2过表达质粒与 ROCK抑制剂按照1:1比例给药对于骨质疏松治疗效果最佳。其中ROCK抑制剂为：ROCK-IN-2(C18H13ClF2N5O)。
表1生物力学检测结果
Figure RE-GDA0002623001310000151
表1所示，各分组小鼠胫骨组织生物力学检测结果，*表示与对照骨质疏松组相比具有统计学意义(P＜0.05)#表示与3:1给药及1:3给药组具有统计学意义(P＜0.05)。
如表1所示：给药组小鼠骨组织最大载荷、刚度、弹性模量均优于骨质疏松组，其中1:1给药组各生物力学指标最佳。
接着应用NIPA2过表达质粒与ROCK抑制剂复方制剂按照10μg/kg体重静脉给药(1:1，3:1，1:3)，HE染色检测骨质疏松小鼠胫骨近端骨小梁情况，评估骨质疏松程度，效果如图11和图12所示。由此也可见NIPA2过表达质粒与 ROCK抑制剂按照1:1比例给药，对于骨质疏松治疗效果最佳。
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。
序列表
<110> 中国医科大学
<120> NIPA2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用
<130> YRI20200049
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagttatggt cattcatgct ccaa 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaatatcaa ggccacaatg accac 25

Claims (13)

1.NIPA2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用。
2.增加NIPA2表达的物质在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用。
3.NIPA2过表达***在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用。
4.一种NIPA2过表达***，其特征在于，是在表达载体上导入NIPA2基因编码序列所获得的过表达NIPA2基因的重组表达载体；所述表达载体是真核表达载体。
5.根据权利要求4所述的NIPA2过表达***，其特征在于，所述真核表达载体是GV141质粒。
6.根据权利要求5所述的NIPA2过表达***，其特征在于，在构建所述重组表达载体时，用来扩增所述NIPA2基因编码序列的特异性引物序列是：
上游引物：5’-CAGTTATGGTCATTCATGCTCCAA-3’，如SEQ ID No.1所示；下游引物：5’-TTAATATCAAGGCCACAATGACCAC-3’，如SEQ ID No.2所示。
7.一种治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物制剂，其特征在于，包括权利要求4所述的NIPA2过表达***和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述制剂为可注射的。
9.NIPA2过表达***与促进NIPA2过表达***作用的物质联用在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述促进NIPA2过表达***作用的物质是ROCK抑制剂。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述ROCK抑制剂是ROCK-IN-2。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述NIPA2过表达***是导入NIPA2基因编码序列的重组表达质粒GV141-NIPA2，其与ROCK抑制剂的重量比例为：1:1。
13.一种治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物制剂，其特征在于，包括导入NIPA2基因编码序列的重组表达质粒GV141-NIPA2、ROCK-IN-2抑制剂和药学上可接受的载体，且GV141-NIPA2与ROCK-IN-2抑制剂重量比例为：1:1。
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