CN111700710B - 一种组织工程材料用模板及组织工程材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种组织工程材料用模板，包括依次设置的支撑体、防裸露层、网状纤维骨架层与保护层；且所述保护层上设置有镂空结构。与现有技术相比，采用本发明提供的模板制备组织工程材料时，防裸露层降解形成空隙最终可以使脱细胞基质材料包覆于网状纤维骨架内腔表面，减少纤维裸露，从而减少凝血成分附着；而网状纤维骨架可提供良好的力学性能，使组织工程材料具有良好的抗扭结性能、回弹性、抗***性能和穿刺闭合性及可缝合性；同时保护层可保护网状纤维骨架层结构，避免在培养制备材料时破坏骨架结构，且保护层上镂空结构的设置可使制备得到的组织工程材料具有外部脊梁，增强血管的缝合强度、***压和抗扭结能力，并加快与周围组织整合。

Description

一种组织工程材料用模板及组织工程材料
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种组织工程材料用模板及组织工程材料。
背景技术
心血管疾病是全球致死率最高的疾病，该疾病的发生常由于血管狭窄或阻塞导致血流减少和营养物质缺乏，从而使组织或器官受损，通常表现为冠心病、脑血管病、外周动脉疾病。据世界卫生组织预测，到2030年全世界每年死于心血管相关疾病的人数会增加到2330万。血管移植手术仍是治疗这类疾病常规手段，目前这类手术采集使用患者自体血管(如大隐静脉，两侧胸廓内动脉、桡动脉等)仍然是血管移植的金标准。但是由于自体血管已经被采集过或者长度、口径不匹配或者患有复杂的***血管病变而只能选择人工血管代替。
目前，人造血管通常是采用人工高分子材料进行制备，如聚苯二甲酸乙二醇酯膨体聚四氟乙烯/>制备成的血管直接植入人体，这种情况下人工高分子材料会与人体血液或组织直接接触，会产生一定的排异反应，导致血栓、炎症和内膜增生等情况，进而造成移植失败。
运用体内工程化方法可有效的构建人工血管，其基本原理是利用机体对植入物自发的免疫包裹反应。常规的方法是将管状物植入宿主皮下，待宿主完成组织包裹后即可得到体内工程化血管。该方法的优点是所致制备的血管由细胞和组织构成，具有良好的生物相容性，但由于缺少高分子材料的支撑，该血管力学性能欠佳，不能有效的维持管状结构，缝合难度大，而且植入动脉***易出现动脉瘤和缝合端狭窄。在先前的研究中，我们利用高分子材料在硅胶管表面制作纤维骨架，再将纤维骨架连同硅胶管作为模板植入动物皮下进行组织工程化，组织包裹形成后再进行脱细胞处理，得到了聚合物纤维骨架增强的组织工程血管，显著的改善了血管材料的力学性能，有效的解决了上述问题。此外，该方法制备的组织工程血管由于具有脱细胞基质，提高了血管材料的生物相容性，相比于单纯高分子材料构建人工血管减少了排异反应，在一定程度上提高了血管移植的成功率。但是在该工艺中，聚合物骨架每层纤维中纤维平行间距的均一性较差，因而导致骨架孔径不均一，进而造成血管成品率不高。此外，骨架的纤维结构也容易因为皮下植入手术操作或体外细胞培养导致结构破坏，降低血管成品率。并且在前期研究的基础上，我们还发现制备的聚合物骨架增强型组织工程血管外表面较为光滑，植入体内之后易发生滑动，与植入部位周围组织的整合速率有待提高，且前期制备的聚合物骨架增强型组织工程血管的内腔有部分骨架纤维裸露，会引起一定的凝血基质粘附。
发明内容
鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种组织工程材料用模板及组织工程材料；该模板制备的组织工程材料力学参数稳定，抗扭结能力佳，外表面粗糙防止体内滑动，易于与机体组织整合，且具有内腔无纤维裸露，不易引起血栓形成。
本发明提供了一种组织工程材料用模板，包括依次设置的支撑体、防裸露层、网状纤维骨架层与保护层；且所述保护层上设置有镂空结构；所述防裸露层包括生物可降解材料。
优选的，所述保护层的厚度为300～3000μm；所述镂空结构的宽度为500～3000μm。
优选的，所述镂空结构沿保护层方向成螺纹状、平行的直线或平行的曲线；相邻平行镂空结构之间的距离为500～3000μm。
优选的，所述防裸露层的厚度为50～500μm。
优选的，所述防裸露层包括合成高分子材料和/或天然高分子材料；所述合成高分子材料选自聚乙二醇(PEO)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))、聚对二氧六环己酮(PDS)与聚癸二酸甘油酯(PGS)中的一种或多种；所述天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种。
优选的，所述网状纤维骨架层的厚度为200～2000μm；所述网状纤维骨架层由纤维形成；所述纤维的直径为20～200μm；形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角为30°～110°。
优选的，所述组织工程材料用模板为组织工程血管用模板。
本发明还提供了一种组织工程材料，以上述的组织工程材料用模板为模板制备得到。
优选的，包括紧密贴合的内层、中层与外层；所述内层为脱细胞基质层；所述中层由网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质组成；所述外层为具有凸起结构的脱细胞基质；且所述内层的脱细胞基质层、中层的脱细胞基质与外层的脱细胞基质呈一体化设置。
本发明提供了一种组织工程材料用模板，其特征在于，包括依次设置的支撑体、防裸露层、网状纤维骨架层与保护层；且所述保护层上设置有镂空结构；所述防裸露层包括生物可降解材料。与现有技术相比，采用本发明提供的模板制备组织工程材料时，防裸露层降解形成空隙最终可以使脱细胞基质材料包覆于网状纤维骨架内腔表面，减少纤维裸露，从而减少血栓形成；而网状纤维骨架可提供良好的力学性能，使组织工程材料具有良好的抗扭结性能、回弹性、抗***性能和穿刺闭合性及可缝合性；同时保护层可保护网状纤维骨架层结构，避免在培养制备材料时破坏骨架结构，且保护层上镂空结构的设置可使制备得到的组织工程材料具有外部脊梁，增强血管的***压、抗扭结能力和缝合强度，也会因粗糙的外表面在体内植入后不易发生移动，加快与周围组织整合。
附图说明
图1为本发明提供的组织工程材料用模板的结构示意图；
图2为本发明提供的组织工程材料用模板支撑体的横截面示意图；
图3为本发明提供的组织工程材料用模板支撑层的纵截面示意图；
图4为利用本发明提供的组织工程材料用模板为模板制备组织工程材料的过程示意图；
图5为本发明对比例1～5提供的组织工程材料用模板的结构示意图；
图6为本发明实施例3及实施例8所制备的组织工程材料用模板中网状纤维骨架的扫描电镜图；
图7为本发明实施例3及对比例3得到的组织工程血管内表面的扫描电镜图；
图8为本发明实施例1得到的组织工程血管横切面H&E染色图片；
图9为本发明实施例3及对比例8得到的组织工程血管的宏观图；
图10为本发明实施例3及对比例8得到的组织工程血管的回弹性检测图；
图11为本发明实施例9及对比例19得到的组织工程血管进行羊颈部动静脉造瘘后10天的内腔体式图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种组织工程材料用模板，包括依次设置的支撑体、防裸露层、网状纤维骨架层与保护层；且所述保护层上设置有镂空结构；所述防裸露层包括生物可降解材料。
参见图1，图1为本发明提供的组织工程材料用模板的结构示意图，其中1为支撑体，2为防裸露层，3为网状纤维骨架层，4为保护层；4a为保护层上设置的镂空结构。
本发明提供的组织工程材料用模板以支撑体决定制备的组织工程材料的整体形状；其作用是支撑网状纤维骨架层，使其在皮下或体外培养环境下能够保持形状；所述支撑体可根据所要制备的组织工程材料的用途进行选择，其可为平面结构，也可为管状结构；当所述支撑体为管状结构时，所述组织工程材料用模板为组织工程血管用模板；当所述支撑体为平面结构时，其优选采用硬质惰性医疗材料制成，更优选采用硅胶片、橡胶片、不锈钢板、尼龙板、聚氨酯片、聚己内酯片或聚苯乙烯中的一种或多种组成；当所述支撑体为管状结构时，参见图2与图3，图2为支撑体的横截面示意图；图3为支撑体的纵截面示意图，其可为实心结构，也可为空心结构，并无限制；当所述支撑体为实心结构时，其可为整体的实心结构，也可为双层结构，这是由于所述支撑体为高分子聚合物或硅胶或橡胶或尼龙制备时，模板在组织培养时与细胞相容性好，但当管径较大时，压力作用易导致其变形，需要在其中加入硬质内芯进行支撑，形成双层结构；所述支撑体的纵截面可为矩形，也可为梯形，还可为与血管壁形状相匹配的任意异形，如U型、Y型、弓状带分枝型等；当支撑体的纵截面为异形时，可利用如下方法获取：对需要进行血管移植部位的血管进行三维数据的获取，利用计算机软件将获取的血管尺寸三维数据构建相应的血管3D模型，打印出血管3D模型，即为所述异形支撑体。当所述支撑体为管状结构时，其外径优选为2～12mm，更优选为2～8mm；当所述支撑体为空心管状结构时，其优选采用医用硅胶、橡胶、尼龙、不锈钢、合金、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)(PLCL)共聚物等高分子聚合物材料中的一种或多种组成；当所述支撑体为实心管状结构时，其优选采用医用硅胶、橡胶、尼龙、不锈钢、合金、聚氨酯、聚己内酯、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)等高分子聚合物材料中的一种或多种制成；当所述支撑体为双层结构时，其外层可以采用医用硅胶、橡胶、尼龙、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)等高分子聚合物材料中的一种或多种组成，内层可采用医用硅胶、橡胶、尼龙、不锈钢、合金、聚氨酯(PU)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)等材料中的一种或多种组成。
所述支撑体上设置有防裸露层；所述防裸露层的厚度优选为50～500μm；在本发明提供的一些实施例中，所述防裸露层的厚度优选为50μm；在本发明提供的一些实施例中，所述防裸露层的厚度优选为200μm；在本发明提供的一些实施例中，所述防裸露层的厚度优选为250μm；在本发明提供的一些实施例中，所述防裸露层的厚度优选为100μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述防裸露层的厚度优选为500μm；所述防裸露层包括可降解材料，因此在利用组织工程材料用模板制备组织工程材料的过程中，防裸露层会降解，设置此层，可防止网状纤维骨架层与支撑体结合过于紧密，改善细胞向支撑体表面的迁移和生长，围绕支撑体分泌细胞外基质，使最终制备的血管材料无骨架纤维裸露；在本发明中，所述防裸露层优选包括合成高分子材料和/或天然高分子材料；所述合成高分子材料优选为聚乙二醇(PEO)、聚乙醇酸(PGA)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-4HB))与聚癸二酸甘油酯(PGS)中的一种或多种；所述天然高分子材料优选为纤维蛋白胶、明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种；所述支撑体上设置的防裸露层可通过静电纺丝，浇筑，喷涂，熔融纺丝，湿法纺丝，冷冻干燥，3D打印等技术制备。
所述防裸露层上设置有网状纤维骨架层；网状纤维骨架层具有独特的结构能够使最终制备的组织工程材料具有抗扭结，回弹性、可穿刺闭合性和提供必要的***强度及缝合强度；其孔隙可以满足细胞向骨架内部迁移生长的需要，填充骨架孔隙；所述网状纤维骨架层的厚度优选200～2000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的厚度优选为200μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的厚度优选为400μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的厚度优选为550μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的厚度优选为700μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述网状纤维骨架层的厚度优选为2000μm；所述网状纤维骨架层优选由纤维形成；其可通过静电纺丝、熔融纺丝、3D打印及纤维编织等方法制备得到；其中静电纺丝、熔融纺丝及3D打印中，可通过添加相位控制，提高网状纤维骨架每层纤维间的纤维间距平行性使骨架孔径均一性增加，也就是减少骨架平均孔径的标准偏差。
在本发明中，所述网状纤维骨架层优选采用熔融纺丝进行制备；
所述网状纤维骨架层中的纤维由本领域技术人员熟知的纤维即可，并无特殊的限制，本发明所述网状纤维骨架层中的纤维优选由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚癸二酸甘油酯(PGS)与聚乙二醇(PEO)中一种或多种形成；所述纤维的直径优选为20～200μm，更优选为20～100μm；在本发明提供的一些实施例中，所述纤维的直径优选为20μm；在本发明提供的一些实施例中，所述纤维的直径优选为40μm；在本发明提供的一些实施例中，所述纤维的直径优选为60μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述纤维的直径优选为100μm；形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为30°～110°；在本发明提供的一些实施例中，所述形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为30°；在本发明提供的一些实施例中，所述形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为50°；在本发明提供的一些实施例中，所述形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为60°；在本发明提供的另一些实施例中，所述形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角优选为110°；所述网状纤维骨架层的孔径平均值的标准偏差优选为5～30μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的孔径平均值的标准偏差优选为5μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的孔径平均值的标准偏差优选为12μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的孔径平均值的标准偏差优选为21μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述网状纤维骨架层的孔径平均值的标准偏差优选为30μm；所述网状纤维骨架层的平均孔径优选为75～500μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的平均孔径优选为75μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的平均孔径优选为105μm；在本发明提供的一些实施例中，所述网状纤维骨架层的平均孔径优选为220μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述网状纤维骨架层的平均孔径优选为500μm；所述网状纤维骨架纤维平行间距的平行性决定了同一组织工程材料不同位置的孔径的均一性，进而决定了该材料不同位置抗***性能的均一程度。通过限定纤维编织的交叉角、纤维直径及孔径均一性，也就是提高纺丝的精度，避免出现纤维间距过大/过小造成的骨架孔径的不均一，进而导致血管材料不合格率增高，提高孔径均一性可以使血管的成品合格率大幅提升；同时通过网状纤维骨架结构的优化和控制(壁厚、纤维直径、孔径、厚度、交叉纤维的角度)，对血管的力学性能和细胞迁移性进行控制，达到人造血管“金标准”。
所述网状纤维骨架层上设置有保护层；通过设置保护层能够防止动物皮下埋置操作或体外接种细胞及体外培养过程对骨架结构的破坏，并且能够控制组织工程材料的厚度，保证所制备组织工程材料壁厚的均一性；所述保护层的厚度优选为300～3000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述保护层的厚度优选为300μm；在本发明提供的一些实施例中，所述保护层的厚度优选为500μm；在本发明提供的一些实施例中，所述保护层的厚度优选为1000μm；在本发明提供的另一些实施例中，所述保护层的厚度优选为3000μm；保护层的厚度决定着组织工程材料表面凸起的高度；当所述支撑层为管状结构时，所述保护层的内径与支撑层、防裸露层及网状纤维骨架层形成的管状结构的外径相匹配；所述保护层上设置有镂空结构；通过镂空结构裸露出网状纤维骨架层；所述镂空结构的宽度优选为500～3000，更优选为500～2000μm；所述镂空结构沿保护层的径向切面的形状可为矩形、梯形、正方形或其他任意形状；镂空结构沿着所述保护层的径向切面的形状决定着组织工程材料外壁凸起的外型；所述镂空结构沿保护层方向优选呈螺纹状、平行的直线或平行的曲线；即当支撑体为管状结构时，保护层上的镂空结构呈螺纹状；当支撑体为平面状时，保护层上的镂空结构呈平行的直线或平成的曲线结构；所述保护层相对的两端不含有镂空结构，从而使保护层保持整体的一个结构；相邻平行镂空结构之间即相邻的两个螺纹之间、两条平行的直线或曲线之间的距离优选为500～3000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为500μm；在本发明提供的一些实施例中，所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为1000μm；在本发明提供的一些实施例中，所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为1500μm；在本发明提供的一些实施例中，所述相邻平行镂空结构之间的距离优选为3000μm；保护层上设置镂空结构，尤其是螺旋状镂空结构，能够在保证细胞有效迁移的前提下，在组织工程材料外形成如螺旋状的“凸起”，能够增强组织工程材料的抗扭结性能、抗***性能及缝合强度，并且能够防止组织工程材料在植入人体内后发生滑动，使之更易于与植入部位周围组织相整合。
采用本发明提供的模板制备组织工程材料时，防裸露层降解形成空隙，从而使细胞能够在空隙中迁移、生长并分泌细胞外基质，脱细胞处理后即有脱细胞基质材料包覆于网状纤维骨架的内腔表面，减少纤维裸露，从而减少凝血成分附着；而网状纤维骨架可提供良好的力学性能，使组织工程材料具有良好的抗扭结性能、回弹性、抗***性能和穿刺闭合性及可缝合性；同时保护层可保护网状纤维骨架层结构，避免在培养制备材料时破坏骨架结构，且保护层上镂空结构的设置可使制备得到的组织工程材料具有外部脊梁，抗扭结性能、抗***性能及缝合强度得到提升，也会因粗糙的表面在体内更为稳定，加快与植入部位周围组织的整合。
本发明还提供了一种组织工程材料，以上述的组织工程材料用模板为模板制备得到；所述制备的方法优选为组织工程培养；所述组织工程培养可为皮下植入培养，也可为体外培养；所述体外培养可为体外静态培养，也可为体外动态培养；在本发明中可根据支撑层的结构选择不同的培养方法，如体外动态培养，支撑层需为空心结构，优选为弹性聚氨酯(PU)、聚(丙交酯-己内酯)(PLCL)、硅胶、橡胶中的一种或几种混合制成的空心结构，这些材料有弹性，能够响应液体压力而搏动；其他培养方法则无此限制；在进行皮下植入培养时，组织工程材料用模板保护层上的镂空结构可以满足细胞向模板内部迁移、生长的需要，从而使细胞填充防裸露层降解后产生的空隙、网状纤维骨架的孔隙和保护层上的镂空部位；对于体外细胞培养，其上的镂空结构可起到促进氧气、营养物质和细胞代谢废物交换的作用。
在本发明中，优选具体采用以下方法制备：将所述组织工程材料用模板植入动物皮下，或将种植有细胞的所述组织工程材料用模板置于培养液中，于生物反应器中进行培养；使细胞向所述网状纤维骨架层迁移生长，直至长满所述保护层的镂空部位，网状纤维骨架的纤维孔隙与所述防裸露层降解形成的空隙；取出，去除保护层与支撑层，即可得到组织工程材料；所述种植的细胞优选为成纤维细胞、平滑肌细胞与干细胞分化来的平滑肌细胞中的一种或多种；当采用体外动态培养时，优选调节生物反应器中培养基的流速使压力为10～200mmHg；所述培养优选在37℃，20％O2、5％CO2条件下进行培养。
更优选地，在去除保护层与支撑体后，优选进行脱细胞处理步骤，得到组织工程材料，即所述组织工程材料包括紧密贴合的内层、中层与外层；所述内层为脱细胞基质层；所述中层由网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质组成；所述外层为具有凸起结构的脱细胞基质；且所述内层的脱细胞基质层、中层的脱细胞基质与外层的脱细胞基质呈一体化设置。
所述脱细胞处理优选采用SDS法或液氮冻融法。
优选地，所述SDS法包括如下步骤：将样品浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上室温摇晃12h，之后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的SDS冲洗干净，然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/LCaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将得到的产物置于无菌的PBS中，4℃保存。
优选地，所述液氮冻融法包括如下步骤：将样品于液氮中速冻20s，室温解冻60s，重复5遍，之后用无菌的生理盐水冲洗4-5遍，将细胞残渣冲洗干净。然后将材料置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将制得的产物置于无菌的PBS中，4℃保存。
参见图4，图4为本发明提供的组织工程材料用模板通过组织培养时制备组织工程血管时的过程示意图，其中1为支撑体，2为防裸露层，3为网状纤维骨架层，4为保护层；4a为保护层上设置的镂空结构，5为填充模板的细胞和细胞外基质，5a为填充于模板保护层镂空部位的细胞和细胞外基质，5b为填充于模板防裸露层降解产生的空隙的细胞和细胞外基质，5c为填充于模板网状纤维骨架层纤维孔隙的细胞和细胞外基质，6为所制备血管的脱细胞基质，6a为所制备血管外层的凸起的脱细胞基质，6b为所制备血管的脱细胞基质内层，6c为所制备血管中层填充于网状纤维骨架层纤维孔隙的脱细胞基质。在培养过程中，防裸露层(2)被降解，在支撑体(1)与网状纤维骨架层(3)之间形成空隙，然后保护层的沟槽(4a)、网状纤维骨架(3)的孔隙及防裸露层(2)降解形成的空隙均被细胞与细胞外基质(5)填充，然后去掉保护层(4)及支撑体(1)，进行脱细胞处理后切掉无凸起结构的部分即可得到具有脱细胞基质内层(6b)、中层纤维骨架填充有脱细胞基质(6c)、外层具有凸起的脱细胞基质(6a)的组织工程血管，且所述内层的脱细胞基质层(6b)、中层的脱细胞基质(6c)与外层的凸起脱细胞基质(6a)呈一体化设置。
按照本发明，脱细胞处理后得到的组织工程材料优选还负载有生物活性物质，可提高生物工程材料的通畅性；所述生物活性材料优选通过共价或物理吸附负载在组织工程材料上；所述生物活性物质的种类优选为肝素与水蛭素中的一种或2种混合种。
在本发明中，制成得到的组织工程材料优选为组织工程血管或组织工程补片；当所述组织工程材料为组织工程补片时，可用于血管补片、疝气补片、心脏补片、膀胱补片、尿道补片或肠补片。
本发明得到的组织工程材料中网状纤维骨架主要起到提良好力学性能的作用，使组织工程材料具有良好的抗扭结性、可回弹性、抗***性、穿刺闭合性以及可缝合性；复合在网状纤维骨架上的脱细胞基质整体上提供了良好的生物相容性，能够促进血管组织再生和与植入部位组织的整合，根据脱细胞基质位置的不同，其作用也有所划分，填充于骨架间隙的细胞外基质也起到了有效阻碍血液和生物大分子渗漏作用，位于最内层覆盖网络纤维骨架上的一层脱细胞基质能够减少纤维裸露，降低血栓形成的风险，位于组织工程材料最外层的凸起的螺旋状的脱细胞基质，提供了粗糙的表面，有利于组织工程材料在体内的稳定，促进与周围组织整合的作用，此外也能提高组织工程材料抗扭结、抗***强度和缝合强度；并且，本发明制备的组织工程材料还可负载抗凝物质，提高通畅性，不容易发生急性凝血。
本发明提供的组织工程材料不仅满足植入部位所需的特定力学要求，而且生物相容性好，有利于细胞粘附性和生长，可用于临床上的血管替换，血管旁路建立或动静脉造瘘。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种组织工程材料用模板及组织工程材料进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
该实施例提供的组织工程材料用模板为组织工程血管模板，其由内到外包括支撑体即内芯、防裸露层、网状纤维骨架层、保护层即外套；所述保护层上设置有镂空结构；所述保护层设置在所述网状纤维骨架层外部，所述保护层内径与所述网状纤维骨架层外径相匹配。
模板制备过程包括如下步骤：
1.选取硅胶管作为支撑体，外径为2mm，内径1mm；支撑体的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以PDS：明胶＝1:2(质量比)为原料，采用旋涂法在硅胶管表面制备生物可降解层。向上述硅胶管中***适宜口径的不锈钢棒作为接收棒，将其与旋转电机相连。以六氟异丙醇作为溶剂，PDS：明胶＝1:2(质量比)作为溶质，配制浓度为0.3g/ml的涂覆溶液，采用14G针头，按照15ml/h的注射速度用注射器将涂覆液挤出涂覆在以转速为150r/min旋转、水平移动速度为2mm/s的硅胶管外壁上，针头到硅胶管外壁的距离为5mm，针头竖直向下正对硅胶管轴心。完成涂层后，将涂覆有PDS/明胶混合物的硅胶管置于通风橱中待溶剂挥发完成后置于真空泵中抽除残留溶剂，即可在硅胶管表面得到50μm厚的PDS/明胶防裸露层。
3.以聚己内酯(PCL)为原材料，利用熔融纺丝技术在上述防裸露层表面形成网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为20μm，所述纤维间的交叉角度是30°，所述网状纤维骨架层的厚度是200μm。熔融纺丝的具体方法为：将上述接收棒与旋转电机相连；PCL置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于210℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以20G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为10mm，PCL熔体的流速为0.1ml/h，接收棒的旋转速度设置为300r/min，平移速度设置为7mm/s。纺丝接收厚度是200μm。
4.本实施例中的支撑体为硅胶管，其壁厚为0.5mm，且内径为1mm，其本身支撑性较强，因此，骨架主体制备完毕后抽出硅胶管中的不锈钢棒，仅保留硅胶管作为支撑体。
5.以PCL为原材料，通过3D打印(Allevi3，Allevi，America)技术制备保护层，所述保护层两端为无镂空的结构，中部为螺纹状的镂空结构。
6.将上述保护层套置于所制备的纤维骨架外部，并确保骨架完全处于镂空部位，将橡胶棒做成塞子，堵在保护层的两端，防止皮下埋植或体外细胞培养过程中纤维骨架在保护层内部发生移动。
实施例1中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括组织工程血管的制备方法，具体如下：
1.将上述制备的组织工程血管模板整体植入羊皮下，60天后取出。
2.取出所述血管模板后，去除保护层和支撑体，切除血管两个末端无凸起螺纹的部分，再进行脱细胞处理。
脱细胞处理步骤采用SDS法：将样品浸泡于1％SDS溶液中，置于摇床上室温摇晃12h，之后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的SDS冲洗干净，然后将其置于无菌的DNase和RNase混合溶液中(酶液体系为40ml，其缓冲液由0.2mol/L MgCl2，0.2mol/L CaCl2和0.1mol/L pH为6.4的Tris-HCl以及超纯水配制而成，DNase的浓度是50U/ml，RNase的浓度为1U/ml)，于摇床上室温摇晃24h，随后用无菌的生理盐水将组织包裹物上残留的DNase和RNase冲洗干净，最后将得到的产物置于无菌的PBS中。
3.脱细胞处理后再进行交联肝素，即可得到相应的组织工程血管。用去离子水配制无菌的pH5.6浓度为0.05M的MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲溶液，然后用MES配制交联反应液，反应液中各组分浓度为：EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)2.0mg/ml；NHS(N-羟基丁二酰亚胺1.2mg/ml；肝素钠2.0mg/ml。之后进行交联反应，首先将脱细胞产物浸泡于pH5.6浓度为0.05M的MES缓冲溶液中20分钟，然后将反应液置于37℃反应10分钟以活化羧基，10分钟之后将脱细胞的产物从MES缓冲液中取出，直接放入反应液中，37℃轻轻摇动(20～40rpm/min)4小时。之后用0.1M无菌Na2HPO4(含1％PS)连续洗材料2小时，接着用无菌的4M NaCl 60～80rpm/min 4℃连续洗24小时；之后用无菌水(含1％PS)60～80rpm/min4℃连续洗24小时。最后将材料置于无菌PBS溶液中，4℃保存备用。
实施例2：
模板制备过程包括如下步骤：
1.以外径为4mm，内径为2mm的聚氨酯管作为支撑体，支撑体的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以PLGA和PEO为原材料，采用高压静电纺丝技术在聚氨酯管表面制备防裸露层，具体方法为：向上述聚氨酯管中***适宜口径的不锈钢棒来作为接收棒，以三氯甲烷：甲醇＝5:1(体积比)作为溶剂，PLGA：PEO＝1:1(质量比)作为溶质，配制浓度为0.28g/ml的电纺液，采用20G针头，设置流速为8mL/h，在电纺针头施加16kV的直流电压，采用接地的不锈钢板作为导电接收板，将接受棒置于导电接收板与针头之间，且与导电接收板距离1cm，导电板与针头距离为8cm。使纤维在向导电板聚集过程中被聚氨酯管所收集，收集厚度为200μm的PLGA/PEO复合的防裸露层。
3.以聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)为原材料，利用熔融纺丝技术，在防裸露层表面形成第一网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为40μm，所述纤维间的交叉角度是50°，所述网状纤维骨架层的厚度是400μm。熔融纺丝的具体方法为：将步骤2中得到的设置有防裸露层的聚氨酯管套在不锈钢棒上作为接收棒，并与旋转电机相连；PLCL置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于220℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以20G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为13mm，熔体的流速为0.25ml/h，接收棒的旋转速度设置为200r/min，平移速度设置为18mm/s。纺丝接收厚度为400μm。
4.将聚氨酯管中的不锈钢棒抽出，***适宜尺寸的硅胶棒以起到支撑作用。
5.以PCL为原材料，通过3D打印(Allevi3，Allevi，America)技术制备保护层，所述保护层两端为无镂空的结构，中部为螺纹状的镂空结构。
6.将上述保护层套置于所制备的纤维骨架外部，并确保骨架完全处于镂空部位，将橡胶棒做成塞子，堵在保护层的两端，防止皮下埋植或体外细胞培养过程中纤维骨架在保护层内部发生移动。
实施例2中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括组织工程血管的制备方法，具体过程同实施案例1，此处不再赘述。
实施例3：
1.以外径为5mm，内径为3mm的硅胶管作为支撑体，支撑体的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以P(3HB-co-4HB)和PEO为原材料，采用高压静电纺丝技术，在硅胶管表面制备防裸露层，具体方法为：向上述硅胶管中***适宜口径的不锈钢棒上作为接收棒，以三氯甲烷：甲醇＝5:1(体积比)作为溶剂，P(3HB-co-4HB)：PEO＝1:0.5(质量比)作为溶质，配制浓度为0.3g/ml的电纺液，采用19G针头，设置流速为8mL/h，在针头施加14kV的直流电压，采用接地的不锈钢板作为导电接收板，将硅胶管置于导电接收板与针头之间，且与导电接收板距离1cm，导电板与针头距离为11cm，接收棒以100r/min的转速旋转，在导电接收板前接收静电纺丝喷出的纤维，收集厚度为250μm的P(3HB-co-4HB)/PEO防裸露层。
3.以聚己内酯(PCL)为原材料，利用熔融纺丝技术，在上述防裸露层表面形成第一网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为60μm，所述纤维间的交叉角度是50°，所述网状纤维骨架层的厚度是550μm。熔融纺丝的具体方法为：将步骤2中得到的设置有P(3HB-co-4HB)/PEO防裸露层的硅胶管套在直径3.8mm的不锈钢棒上作为接收棒，并与旋转电机相连；PCL置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于210℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以17G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为15mm，PCL熔体的流速为0.7ml/h，接收棒的旋转速度设置为180r/min，平移速度设置为21mm/s。纺丝接收厚度为550μm。
4.将硅胶管中的不锈钢棒抽出，***适宜尺寸的硅胶棒以起到支撑作用。
5.以PCL为原材料，通过3D打印(Allevi3，Allevi，America)技术制备保护层，所述保护层两端为无镂空的结构，中部为螺纹状的镂空结构。
6.将上述保护层套置于所制备的纤维骨架外部，并确保骨架完全处于镂空部位，将橡胶棒做成塞子，堵在保护层的两端，防止皮下埋植或体外细胞培养过程中纤维骨架在保护层内部发生移动。
实施例3中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括组织工程血管的制备方法，具体过程同实施案例1，此处不再赘述。
实施例4：
模板制备过程包括如下步骤：
1.以外径为6mm，内径为4mm的尼龙管作为支撑体，支撑体的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以PDS和明胶为原材料，采用喷涂技术，在尼龙管表面制备防裸露层，具体方法为：向上述尼龙管中***适宜口径的不锈钢棒来作为接收器，将上述接收器浸入到以10mMTris缓冲液(pH8.5)配制的2mg/mL的多巴胺溶液中24h，在尼龙管表面形成粘附层。将PDS：明胶＝1:1(质量比)溶解到六氟异丙醇中，制成0.3g/ml的喷涂溶液。采用气泵喷枪以0.2mL/s的流速将溶液垂直喷涂到旋转的尼龙管上，在尼龙管表面收集厚度为100μm的PDS和明胶复合的防裸露层。
3.以PCL为原材料，采用熔融纺丝技术，在防裸露层表面形成网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为100μm，所述纤维间的交叉角度是60°，所述网状纤维骨架层的厚度是700μm。熔融纺丝的具体方法为：将步骤2中得到的设置有防裸露层的尼龙管套在不锈钢棒上作为接收棒，并与旋转电机相连；PCL置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于210℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以15G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为17mm，PCL熔体的流速为2.4ml/h，接收棒的旋转速度设置为150r/min，平移速度设置为27mm/s。纺丝接收厚度为700μm。
4.将尼龙中的不锈钢棒抽出，***适宜尺寸的硅胶棒以起到支撑作用。。
5.以PCL为原材料，通过3D打印(Allevi3，Allevi，America)技术制备保护层，所述保护层两端为无镂空的结构，中部为螺纹状的镂空结构。
6.将上述保护层套置于所制备的纤维骨架外部，并确保骨架完全处于镂空部位，将橡胶棒做成塞子，堵在保护层的两端，防止皮下埋植或体外细胞培养过程中纤维骨架在保护层内部发生移动。
实施例4中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括组织工程血管的制备方法，具体过程同实施案例1，此处不再赘述。
实施例5：
模板制备过程包括如下步骤：
1.以外径为8mm的不锈钢棒作为支撑体，支撑体的外径决定了制备得到的组织工程血管的内径。
2.以透明质酸为原材料，采用冷冻干燥技术，在不锈钢表面制备防裸露层，具体方法为：用蒸馏水作为溶剂，配制25mg/ml的透明质酸溶液，在不锈钢圆棒外固定模具，使不锈钢表面与模具间的距离为500μm，将透明质酸溶液灌注到不锈钢圆棒与模具之间后将其置于-80℃冷冻24h，随后真空冷冻干燥72h。去除模具后，即可在不锈钢圆棒表面获得厚度为500μm的透明质酸防裸露层。
3.以PLA为原材料，利用熔融纺丝技术，在上述防裸露层表面形成第一网状纤维骨架层，网状纤维骨架层的纤维直径为100μm，所述纤维间的交叉角度是110°，所述网状纤维骨架层的厚度是2000μm。熔融纺丝的具体方法为：以步骤2中得到的直径为8mm的载有防裸露层的不锈钢圆柱体作为接收棒，并与旋转电机相连；PLA置于热熔器包裹的封闭的不锈钢注射器中，于240℃下加热1h后进行纺丝；不锈钢注射器配以15G不锈钢针头，注射器针头与接收棒的距离为19mm，PLA熔体的流速为10ml/h，接收棒的旋转速度设置为120r/min，平移速度设置为72mm/s。纺丝接收厚度为2000μm。
4.以PCL为原材料，通过3D打印(Allevi3，Allevi，America)技术制备保护层，所述保护层两端为无镂空的结构，中部为螺纹状的镂空结构。
5.将上述保护层套置于所制备的纤维骨架外部，并确保骨架完全处于镂空部位，将橡胶棒做成塞子，堵在保护层的两端，防止皮下埋植或体外细胞培养过程中纤维骨架在保护层内部发生移动。
实施例5中得到的模板的具体参数见表1。
本实施例中，除上述模板制备过程外，还包括组织工程血管的制备方法，具体过程同实施案例1，此处不再赘述。
实施例1～5所述的组织工程血管用模板的具体参数请见下表1：
表1实施例1～5中组织工程血管用模板的参数表
实施例6～10
实施例6～10与实施例1～5顺序对应，每个实施例的区别仅仅在于在制备网状纤维骨架时启用了相位控制，既在每层纺丝过程的折返点，利用相位控制装置重新定位，通过控制步距角和脉冲个数精确控制单程起始位置的角位移量，使纤维在支撑体上保持等距分布，进而提高纤维骨架孔径的均一性，使所得网状纤维骨架的平均孔径的标准偏差减少，具体区别见下表2参数选择表。
表2实施例6～10中组织工程血管用模板的参数
对比例1～5
对比例1～5与实施例1～5顺序对应，区别仅仅在于并未设置防裸露层，参见图5，图5为对比例1～5制备的组织工程血管用模板的结构示意图，其中1为支撑体，2为网状纤维骨架层，4为保护层，4a为保护层上设置的镂空结构。具体区别见下表3参数选择表。
表3对比例1～5中组织工程血管用模板的参数条件
对比例6～10
对比例6～10与实施例1～5顺序对应，区别仅仅是在未设置保护层，具体区别见下表4对比例参数选择表。
表4对比例6～10中组织工程血管用模板的参数
对比例11～15
对比例11～15与实施例1～5顺序对应，区别仅仅是在并未设置保护层，同时未设置防裸露层，具体区别见下表5对比例参数选择表.
表5对比例11～15中组织工程血管用模板的参数
对比例16～20
对比例16～20与实施例6～10顺序对应，区别仅仅是未设置防裸露层，具体区别见下表6对比例参数选择表。
表6对比例16～20中组织工程血管用模板的参数条件
对比例21～25
对比例21～25与实施例6～10顺序对应，区别仅仅是在并未设置保护层，具体区别见下表7对比例参数选择表。
表7对比例21～25中组织工程血管用模板的参数条件
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对比例26～30
对比例25～30与实施例6～10顺序对应，区别仅仅是在并未设置保护层，同时未设置防裸露层，具体区别见下表8对比例参数选择表。
表8对比例26～30中组织工程血管用模板的参数条件
脱细胞基质填充检测：
将实施例1～10及对比例1～30所制备的血管进行脱细胞基质填充情况的检测，具体方法如下：
1.内腔脱细胞基质覆盖检测：所制备的组织工程血管经冷冻干燥后，利用扫描电子显微镜观察血管内腔脱细胞基质覆盖和纤维裸露情况。
2.纤维骨架脱细胞基质填充情况检测：所得的组织工程血管经石蜡脱水包埋后，进行石蜡切片，对切片进行H&E染色，通过显微镜(Leica DM4 B)观察纤维骨架的孔隙填充脱细胞基质的情况。
3.保护层镂空部位脱细胞基质填充情况检测：肉眼观察。
得到扫描电子显微镜图片如图6～图7所示；得到H&E染色图片如图8所示；得到其肉眼相机的宏观图像如图9所示。
由图6扫描电子显微镜(SEM)图片可以看出，在纤维骨架制备过程中未启用相位控制所得实施例3的网状纤维骨架中纤维间距平行性差，孔径不均一，而启用相位控制后所制备的得实施例8的网状纤维骨架中纤维间距平行性佳，孔径均一。
由图7SEM图片可以看出，设置有防裸露层的实施例3内腔完全被脱细胞基质所覆盖，内腔无纤维裸露，而对比例3未设置防裸露层内腔仅部分被脱细胞基质所覆盖，内腔出现纤维裸露情况。
由图8H&E染色图片可以看出，实施例1所制备的组织工程血管内腔具有完全的脱细胞基质内层，且纤维骨架中的孔隙已经完全被脱细胞基质填充。(白色虚线为防裸露层和网状纤维骨架层的分界线，左上方为防裸露层)
由图9可以看出，实施例3设置的保护层具有螺旋的镂空结构，使最终所制备的组织工程血管外部具有凸起的螺旋状脱细胞基质结构，而对比例8未设置保护层，其所最终所制备的组织工程血管外部较为光滑，无凸起的螺旋状脱细胞基质结构。
上述脱细胞基质填充检测结果见下表9：
表9脱细胞基质填充检测结果
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由上述检测数据可知：
1、设置相位控制，提高纤维骨架孔径均一性，并未对细胞迁移和细胞外基质填充产生影响，最终获得的所有血管的纤维骨架均被脱细胞基质所填充。
2、设置防裸露层在皮下埋植过程中会降解。随着降解的发生，产生的空腔会被细胞组织所替代，经脱细胞处理后所得血管的内腔会被脱细胞基质所覆盖，保证最终组织工程血管内腔不会有纤维裸露。
3、设置外套，最终可以在组织工程血管外壁产生与镂空结构形状相对应的凸起的脱细胞基质结构。
物理性能检测：
将实施例1～10及对比例1～30所制备的组织工程血管进行如下方面的物理性能检测，具体检测项目及方法如下：
1.利用模板所制备血管的成品检测：用拇指和食指从一端到另一端轻捏，并轻微揉搓血管，如果血管有部位出现易塌陷或易扭曲的情况(此类情况常由纺丝过程造成的网状纤维骨架层纤维间孔径不均一所导致)，或是肉眼可见的纤维出现不均一结构(此类情况多为皮下埋植过程造成的网状纤维骨架层结构破坏所引起，脱细胞处理后血管材料变白且略有透明，可以透过脱细胞基质看到网状纤维骨架层的大致结构)即为不合格血管，并计算利用模板所制备血管的成品率。以下测试均使用合格血管进行检测。
2.扭结半径检测：将样品放置在半径规上，逐渐减小半径规的半径直到血管样品出现微小的管道变窄或扭结，记录此时半径规的半径即为样品的扭结半径。
3.***强度检测：小心地将适宜大小球囊放进所得血管样品中，球囊通过导管与三通接口连接，三通接口的另外两个接口分别连接压力记录装置和加压装置，通过加压装置向球囊加压使血管膨胀，直至血管破裂，记录血管样品破裂的压力值，并通过压力换算后以mmHg为测量结果单位。
4.缝合强度检测：沿轴向截取一段血管样品，以6-0缝线在血管一端的边缘以下2mm处穿过血管壁，缝合成一个半环，缝合线末端固定于拉力机的夹具上，血管样品的另一端固定于拉力机的另一夹具上，以50mm/min速度拉伸缝合线。记录将缝线从血管壁中拉出的拉力大小。缝合强度以N为单位计算。
5.回弹性检测：用镊子夹捏血管样品2秒后立即松开镊子，用肉眼观察血管是否可恢复到原有的形貌。
得到回弹性检测图像如图10所示，实施例3与对比例8所制备的组织工程血管无论有无外部凸起结构，血管中的纤维骨架结构均能使所制备的血管有良好的可回弹性。
得到物理性能检测结果见表10；
表10物理性能检测结果
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由上述检测数据可知：
1、相位控制能够提高了纤维骨架孔径的均一性，进而提高了组织工程材料的成品率，也提高了所制备的合格血管的平均***强度，所有检测合格血管的平均***强度均大于1600mmHg，满足作为人工血管使用的要求。
2、设置保护层使组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构脱细胞基质，减少了组织工程血管的扭结半径，既提高了组织工程血管的抗扭结性能。
3、设置保护层使组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构脱细胞基质，能够提高所制备血管的缝合强度
4、缝合强度检测显示所有类型血管的缝合强度的平均值均大于2N，文献报道缝合强度大于1.7N既可满足移植需求，因此所有血管具有良好的缝合强度。
5、纤维骨架的结构良好，使所有类型的检测血管均具有可回弹性。
血管动物体内植入检测：
根据以往动物实验的经验，实施例1，6和对比例1，6，11，16，21，26制备的血管口径为2mm，应该进行大鼠腹主动脉移植；实施例2，7和对比例2，7，12，17，22，27制备的血管口径为4mm，应该进行比格犬颈动脉移植；实施例3，8和对比例3，8，13，18，23，28制备的血管口径为5mm，应该进行羊(约30kg)颈动脉移植；实施例4，9和对比例4，9，14，19，24，29制备的血管口径为6mm；应该进行羊(约50kg)颈部动静脉造瘘；实施例5，10和对比例5，10，15，20，25，30制备的血管口径为8mm，应该进行比格犬腹主动脉移植。但是，本着动物实验的“3R”原则(减少、优化、替代原则)，在能够说明有益效果的前体下，尽量减少动物的使用。为此，本发明仅选择犬颈动脉移植和羊颈部动静脉造瘘模型对相关口径血管进行检测，原因如下：1.犬颈动脉移植是大动物血管移植实验，相比于小动物(大鼠腹主动脉移植)更具有代表性，所使用的血管尺寸也更贴近临床使用情况，所得结果更具有意义。2.犬颈动脉移植所使用的是4mm口径的血管，是典型的小口径人工血管，对于小口径人工血管来说，口径越小越容易出现血栓和内膜增生等问题，而导致移植失败，因此4mm口径的血管比5mm口径血管和8mm口径的血管跟更能反映血管性能。3.羊颈部动静脉造瘘不同于上述其他3个动物血管移植模型，造瘘是将人工血管与动脉和静脉相连，用于血液透析使用，可检测植入人工血管的穿刺闭合性，而其他3个动物血管移植模型均是将人工血管进行动脉与动脉的连接，不可用于检测血管的穿刺闭合性，因此需要保留羊颈部动静脉造瘘模型。
血管进行犬颈动脉移植和羊颈部动静脉造瘘后的检测主要包括：血栓发生率，通畅率，穿刺闭合性能和与周围组织整合速度，具体如下：
1.动物选择：实施例2，7和对比例2，7，12，17，22，27制备的血管口径为4mm，进行比格犬颈动脉移植，植入血管长度为4cm；实施例4，9和对比例4，9，14，19，24，29制备的血管口径为6mm，进行羊(约50kg)颈部动静脉造瘘，植入血管长度为7～10cm。对于犬，每只动物进行双侧颈动脉血管移植，每组血管每个时间点重复4个样品；对于羊，每只动物进行单侧颈部动静脉造瘘，以防止动物出现心衰，每组血管每个时间点重复4个样品。
2.与周组织整合速度检测：于术后10天时间点，麻醉动物后取材，并对取材过程中植入血管与周围组织的整合情况进行分析。植入血管与周围组织易于分离即为尚未整合；植入血管与周围组织不易分离，且无发炎，肿胀迹象即为整合完毕。
3.血栓情况检测：对于术后10天时间点取出的组织工程血管，通过体式显微镜检测内腔有无血栓形成。根据血栓的严重程度分别计算轻微血栓发生率(未堵塞)和堵塞血流血栓发生率。
4.通畅性检测：于移植1个月后麻醉动物，利用彩色多普勒超声(M9，迈瑞，中国)对血管通畅性进行评判。
5.穿刺闭合性检测：于1个月时间点，麻醉羊后，以16G透析针对进行羊颈部动静脉造瘘的组织工程血管进行穿刺，见血液流出后拔出穿刺针，并立即用无菌脱脂棉按压止血，同时开启计时器，待按压结束后，确认在无需按压的情况没有血液从穿刺孔流出，停止计时，记录时间，该时间为穿刺止血时间以反映血管的穿刺止血性能，以分钟为结果单位。
得到实施例9和对比例19制备的组织工程血管的进行羊颈部动静脉造瘘后10天的血管内腔体式图，如图11所示。
由图11体视显微镜图片可以看出，实施例9所制备的血管进行动静脉造瘘10天后部分血管内腔会有轻微血栓形成，但是大部分血管内腔无任何血栓形成，且无阻塞血流的严重血栓形成，而对比例19所制备的血管进行动静脉造瘘10天后部分血管内腔已经出现严重血栓，阻塞血流，表明血管内层有脱细胞质层覆盖，减少了内腔纤维裸露，有助于减少血栓形成。
得到血管动物体内植入检测结果见表11：
表11血管移植检测结果
由上述检测数据可知：
1、设置防裸露层所产生的脱细胞基质内层，减少了内腔纤维骨架的裸露，抑制了血栓的发生。
2、通过相位控制提高骨架纤维孔径的均一度能够减少穿刺后按压止血的时间，提高血管穿刺闭合性。
3、设置保护层使组织工程血管外壁形成螺纹凸起结构脱细胞基质，有助于提高血管与周围组织的整合速度。
4、上述结果意外的发现组织工程血管外层凸起的螺纹状脱细胞基质有助能够减少穿刺后按压止血的时间，提高血管穿刺闭合性。

Claims (7)

1.一种组织工程材料用模板，其特征在于，包括依次设置的支撑体、防裸露层、网状纤维骨架层与保护层；且所述保护层上设置有镂空结构；所述防裸露层包括生物可降解材料；所述保护层在组织培养后，脱细胞处理前被去掉；
所述镂空结构沿保护层方向成螺纹状的线、平行的直线或平行的曲线；相邻平行镂空结构之间的距离为500～3000 μm；
所述保护层的厚度为300～3000 μm；所述镂空结构的宽度为500～3000 μm；
所述防裸露层的厚度为50～500 μm。
2.根据权利要求1所述的组织工程材料用模板，其特征在于，所述防裸露层包括合成高分子材料和/或天然高分子材料；所述合成高分子材料选自聚乙二醇、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)、聚对二氧六环己酮与聚癸二酸甘油酯中的一种或多种；所述天然高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸与纤维蛋白胶中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的组织工程材料用模板，其特征在于，所述网状纤维骨架层的厚度为200～2000 μm；所述网状纤维骨架层由纤维形成；所述纤维的直径为20～200 μm；形成网状纤维骨架层的纤维的交叉角为30°～110°。
4.根据权利要求1所述的组织工程材料用模板，其特征在于，所述网状纤维骨架层孔径平均值的标准偏差控制在5～30 μm。
5.根据权利要求1所述的组织工程材料用模板，其特征在于，所述组织工程材料用模板为组织工程血管用模板。
6.一种组织工程材料，其特征在于，以权利要求1～5任意一项所述的组织工程材料用模板为模板制备得到。
7.根据权利要求6所述的组织工程材料，其特征在于，包括紧密贴合的内层、中层与外层；所述内层为脱细胞基质层；所述中层由网状纤维骨架与填充在网状纤维骨架中的脱细胞基质组成；所述外层为具有凸起结构的脱细胞基质；且所述内层的脱细胞基质层、中层的脱细胞基质与外层的脱细胞基质呈一体化设置。
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