CN111699199A - 结合ox40的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种分离的与人OX40特异结合的单克隆抗体。还提供编码该抗体的核酸分子，以及用于表达该抗体的表达载体、宿主细胞和方法。本申请还提供包含该抗体的双特异性分子和药物组合物，以及使用本公开OX40抗体的治疗方法。

Description

结合OX40的抗体及其用途
技术领域
本公开涉及一种与人OX40特异结合的抗体或其抗原结合部分、及其制备和用途，尤其是其在治疗与OX40相关疾病中的用途，例如癌症和感染性疾病。
背景技术
T细胞共刺激受体OX40，也称为CD134、TNFRSF4和ACT35，是肿瘤坏死因子受体超家族的一员。它增强由TCR触发的T细胞反应，并主要表达在激活的T细胞，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和调节性T细胞(Treg)的表面(Redmond et al.，(2009)Crit.Rev.Immunol.29(3)：187-201；Jensen et al.，(2010)Semin.Oncol.37(5)：524-532)。不像CD28，OX40不在初始T细胞上表达，而是在抗原刺激后12小时至5-6天间出现表达高峰。其配体OX40L，以相同的方式，在抗原暴露后1-3天后在抗原提呈细胞表面上表达并被检测到(Willoughby et al.，(2017)MolImmunol 83：13-22)。
有报道称，与OX40L结合后，OX40信号通路增加细胞因子的产生，并加强CD4+和CD8+T细胞的增殖和存活(Weinberg et al.，(1998)，Semin Immunol 10(6)：471-480；Kjaergaard et al.，(2000)Cancer Res 60(19)：5514-5521；Willoughby et al.，(2017)，Mol Immunol.，83：13-22；Croft et al.，(2003)Cytokine Growth Factor Rev.14(3-4)：265-273)。体内实验表明，OX40L与OX40受体的结合改善携带如淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤、肠癌、乳癌和神经胶质瘤等肿瘤的小鼠的无瘤存活期(Aspeslagh et al.，(2016)Eur JCancer 52：50-66；Bell et al.(2016)Oral Oncol 52：1-10；Webb et al.，(2016)ClinRev Allergy Immunol 50(3)：312-332；Willoughby et al.，同上)。
OX40还在Treg发生和功能上起到重要作用。OX40信号通路在一些情况下加强Treg健全性和增殖，在肿瘤位点的OX40+ Treg呈更高水平(Piconese et al.，(2014)Hepatology 60(5)：1494-1507；Ruby et al.，(2009)J Immunol 183：4853-4857；Piconeseet al.，(2010)Eur J Immunol 40：2902-2913)。然而，高剂量的激动型OX40抗体成功地经凋亡程序降低Treg活性，从而阻断Treg介导的抑制效应(Voo et al.，(2013)Immunol.191(7)：3641-3650)。
因为上述的在免疫应答中的作用，OX40被认为是潜在的免疫疗法靶点。激活OX40信号通路的激动型OX40抗体已经用在临床前研究中，***和感染性疾病(Boettler etal.，(2012)PLoS Pathog.8(9)：e1002913；Jahan et al.，(2018)Neuro Oncol.10；20(1)：44-54)，而阻断OX40信号通路的拮抗型抗体则用于治疗自免疫疾病或炎性疾病。在使用小鼠源IgG1激动型OX40单克隆抗体的首个人类I期临床试验中，30例患有转移实体恶性肿瘤的患者中的12例，在接受一个疗程的治疗后，呈现肿瘤消退的迹象(Curti et al.(2013)Cancer Res 73(24)：7189-7198)。OX40抗体单疗法还与其他单克隆抗体、化疗和细胞因子相结合，用于改善疗效(Linch，McNamara et al.(2015)Front Oncol 5：34；Colombo etal.，(2017)，Clin Cancer Res 23(20)：5999-6001；Foote et al.，(2017)Cancer ImmunolRes 5(6)：468-479)。
尽管对于OX40-OX40L相互作用的结构性基础进行了深入研究，抗体是激动型还是拮抗型的决定性因素尚不清楚。存在对于具有所需药学特性的更多OX40抗体的需求。
发明内容
本公开提供一种分离的单克隆抗体，例如，与OX40(例如，人OX40和猴OX40)结合的小鼠源、人源、嵌合或人源化的单克隆抗体，或其抗原结合部分。其可以是激活OX40信号通路的激动型OX40抗体。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以用于多种用途，包括检测OX40蛋白，治疗和预防OX40相关疾病，例如癌症和感染性疾病。
因此，在一个方面，本申请涉及一种分离的与OX40结合的单克隆抗体(例如，人源化抗体)、或其抗原结合部分，含有重链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：1、3和6；(2)SEQ ID NOs：1、4和6；或(3)SEQ ID NOs：2、5和7的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
在一个方面，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其包含SEQ ID NOs：14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸序列，或包含与这些序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
在一个方面，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分含有轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中，CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQID NOs：8、10和12；或(2)SEQ ID NOs：9、10和11的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
在一个方面，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，其包含SEQ ID NOs：23、24、25、26、27或28，或包含与这些序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
在一个方面，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，各包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区，和轻链可变区CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：1、3、6、8、10和12；(2)SEQ IDNOs：1、4、6、8、10和12；或(3)2、5、7、9、11和13的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
在一个实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs：14和23；(2)SEQ IDNOs：15和24；(3)SEQ ID NOs：16和25；(4)SEQ ID NOs：17和26；(5)SEQ ID NOs：18和27；(6)SEQ ID NOs：18和28；(7)SEQ ID NOs：19和27；(8)SEQ ID NOs：19和28；(9)SEQ ID NOs：20和26；(10)SEQ ID NOs：21和27；(11)SEQ ID NOs：21和28；(12)SEQ ID NOs：22和27；或(13)SEQ ID NOs：22和28的氨基酸序列；或分别包含与这些序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
在一个实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，其中，重链恒定区和轻链恒定区分别包含SEQ ID NOs：29和30的氨基酸序列，或包含与这些序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，重链可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与OX40结合。
本申请的抗体在一些实施方式中包含经由二硫键连接的两条重链和两条轻链，或由经二硫键连接的两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列，其中重链可变区的C端与重链恒定区的N端连接，且轻链可变区的C端与轻链恒定区的N端连接，其中抗体与OX40结合。本申请的抗体可以是全长抗体，例如IgG1、IgG2或IgG4同种型。本申请的抗体可以包含κ恒定区。在其他实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或Fab‘2片段。
本申请的示例性抗体或其抗原结合部分与人和猴OX40特异结合，并阻断OX40-OX40L相互作用。本申请的抗体可以是激动型OX40抗体，激活OX40信号通路，促进T细胞共刺激以及相应地促进IL-2分泌和T细胞增殖。本申请的示例性抗体或其抗原结合部分具有与现有技术OX40抗体相当或更好的体内抗肿瘤效果。
本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团(例如，第二抗体)，该第二功能基团具有不同于本申请抗体或其结合部分的结合特异性。
本申请还提供组合物，其包含本申请的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子，以及药学上可接受的载体。
本申请还包括编码本申请抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。本申请还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备OX40抗体的方法，包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体。
另一方面，本申请提供一种增强受试者免疫应答的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请抗体或其抗原结合部分。在一些实施方式中，方法包括施用本申请的组合物、或双特异性分子。
在另一方面，本申请提供一种治疗受试者中感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请抗体或抗原结合部分。在一些实施方式中，该方法包括施用本申请的组合物、或双特异性分子。在一些实施方式中，可以与本申请抗体或其抗原结合部分一起施用其他抗感染药物，例如抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生物剂。
在另一个方面，本申请提供一种在受试者中预防、治疗或减缓癌症疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请抗体或其抗原结合部分。癌症可以是实体瘤或非实体瘤，包括但不限于，淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤、肠癌、乳癌、神经胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和肠腺癌。在一些实施方式中，该方法包括施用本申请的组合物、或双特异性分子。在一些实施方式中，至少一种其他抗癌抗体可以与本申请抗体或其抗原结合部分一起施用，例如PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体和/或CTLA-4抗体。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂，例如表阿霉素、奥沙利铂、和/或5-氟尿嘧啶(5-FU)。本申请的抗体可以是例如小鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
在一个实施方式中，本申请的癌症疾病治疗方法还包括施用OX40表达激活剂。OX40的表达优选在T细胞的表面。该OX40表达激活剂可以是TLR9配体，或者更具体地为非甲基化的CpG寡核苷酸。或者，OX40表达激活剂可以是血凝素-白细胞凝集素、或IL-2。
基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
附图描述
图1示出84个杂交瘤克隆的激动活性排名。
图2示出OX40抗体对OX40-OX40L相互作用的抑制性作用。
图3示出OX40抗体的激动活性。
图4示出OX40抗体参与在T细胞共刺激中，其中PBMC得自供体1(A)和供体2(B)。
图5示出嵌合OX40抗体对HEK293A细胞上表达的人OX40(A)或猴OX40(B)的结合力。
图6示出嵌合OX40抗体的激动活性。
图7示出嵌合OX40抗体对T细胞共刺激的作用，其中PBMC得自供体3。
图8示出人源化OX40抗体对人、猴或小鼠OX40的结合力。嵌合和人源化71H8抗体与人(A)和猴(B)OX40结合但不结合小鼠OX40(C)，嵌合和人源化68C6抗体与人(D)和猴(E)OX40结合但不结合小鼠OX40(F)。
图9示出人源化OX40抗体对HEK293A细胞表面的人或猴OX40的结合力。嵌合和人源化68C6抗体与细胞表面的人(A)和猴(C)OX40结合，嵌合和人源化71H8抗体与细胞表面的人(B)和猴(D)OX40结合。
图10示出嵌合和人源化68C8抗体(A)、以及嵌合和人源化71H8抗体(B)的激动活性。
图11示出人源化OX40抗体对IL-2分泌(A)和CD4+T细胞增殖(B)的作用，其中使用供体4的PBMC。
图12示出人源化OX40抗体对IL-2分泌(A)和CD4+T细胞增殖(B)的作用，其中使用供体5的PBMC。
图13示出由SPR测量的嵌合或人源化OX40抗体对人OX40的结合亲和力。
图14示出人源化OX40抗体对四个重组OX40 ECD蛋白的结合力。
图15示出人源化OX40抗体对人OX40的结合特异性。
图16示出施用本申请人源化OX40抗体或对照剂的各组的平均(A)和个体(B)肿瘤体积，表明OX40抗体对肿瘤生长的体内抑制效果。
图17示出人源化OX40抗体对肿瘤浸润性CD8+T细胞增殖的体内效果。
具体实施方式
为确保更方便地理解本申请，首先定义一些术语。其他定义则贯穿于具体描述中。
术语“OX40”是指肿瘤坏死因子超家族的第四个成员。术语“OX40”包括变体、异体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人OX40特异的抗体可以在某些情况下与人以外的另一物种例如猴的OX40蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人OX40蛋白特异的抗体可以完全地对人OX40蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的OX40蛋白交叉反应。
术语“人OX40”是指具有来自于人的氨基酸序列的OX40蛋白，例如具有Genbank登录号为NP_003318(SEQ ID NO.：32)的人OX40的氨基酸序列。术语“猴OX40”和“小鼠OX40”分别指猴和小鼠的OX40序列，例如分别具有Genbank登录号为NP_001090870(SEQ ID NO.：34)和Genbank登录号为NP_035789(SEQ ID NO.：36)的氨基酸序列的那些。
本文中的术语“抗体”包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单个链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的称为框架区(FR)的区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫***细胞(例如，效应细胞)和传统补体***的第一组分(C1q)。
本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，OX40蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以经筛选，以与完整抗体相同的方式进行应用。
本文所用的“分离的抗体”意在指代基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与OX40蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合OX40蛋白之外抗原的抗体)。但是，特异结合人OX40蛋白的分离的抗体可能对其他抗原例如其他物种的OX40蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文所用的术语“小鼠源抗体”意在包括可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，该恒定区也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本公开的小鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变)。然而，术语“小鼠源抗体”不意在包括在小鼠框架序列中***得自另一哺乳动物物种的CDR序列的抗体。
术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指具有一些物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。
本文所用的术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人体内天然生成抗体的相似度的抗体。
术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
在本文中，“特异结合人OX40”的抗体是指与人OX40蛋白(还可能是来自一个或多个非人物种的OX40蛋白)结合但是不与非OX40蛋白实质性结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人OX40蛋白，即KD值为5.0x10-8M以下，更优选为1.0x10-8M以下，更优选为5.0x10-9M以下。
本文所用的术语“不实质性结合”蛋白或细胞是指，不与该蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与该蛋白或细胞结合，即结合蛋白或细胞的KD为1.0x 10-6M以上，更优选1.0x10-5M以上，更优选1.0x 10-4M以上，更优选为1.0x 10-3M以上，甚至更优选为1.0x 10-2M以上。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于靶向抗原的KD为1.0x 10-6M以下，更优选5.0x 10-8M以下，更优选1.0x 10-8M以下，甚至更优选为5.0x 10-9M以下，甚至更优选1.0x 10-9M以下。然而，对于其他抗体同种型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和性”结合是指抗体的KD为10-6M以下，更优选10-7M以下，甚至更优选10-8M以下。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。本文所用的术语“KD”是指解离常数，由Kd与Ka的比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体KD的方式是使用表面等离子共振，优选使用生物传感***例如BiacoreTM***。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指在一定暴露时间后引起基线与最大反应之间的50％反应的抗体浓度。
术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
术语“激动型OX40抗体”是指能够与OX40结合并激活或引发OX40信号通路从而促进T细胞增殖和存活的OX40抗体。而术语“拮抗型OX40抗体”是指阻断OX40信号通路的OX40抗体，从而纠正过度活跃的T细胞病理，可以用于治疗例如哮喘、肠炎和关节炎。
术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病或病症的严重程度的本申请抗体的量。治疗有效量应当放在被治疗的疾病背景下进行理解，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
本申请的多个方面在以下分段中更加具体地加以描述。
OX40抗体具有对人OX40的结合特异性以及其他有益的功能特征
本申请的示例性抗体或其抗原结合部分以高亲和力与人OX40特异结合，例如，KD值为1 x 10-8M以下。示例性的抗体或其抗原结合部分还有与猴OX40的交叉反应性，但不与小鼠OX40结合。
本申请的示例性抗体或其抗原结合部分是激活或引发OX40信号通路并参与T细胞共刺激的激动型OX40抗体，促进IL-2分泌和CD8+T细胞增殖。
本申请的示例性抗体或其抗原结合部分具有良好的体内抗肿瘤效应。在抗体施用停止后，肿瘤不会生长，甚至会完全消除。
优选的本申请抗体是单克隆抗体。此外，或者可选的，抗体可以是例如小鼠源的、嵌合的或人源化的单克隆抗体。
OX40单克隆抗体
本申请的示例性抗体是结构和化学特性在以下和实施例中描述的单克隆抗体。示例性OX40抗体的VH氨基酸序列为SEQ ID NOs：14、15、16、17、18、19、20、21或22。示例性OX40抗体的VL氨基酸序列为SEQ ID NOs：23、24、25、26、27或28。抗体的重链/轻链可变区的氨基酸序列总结于以下表1中，一些抗体具有相同的VH或VL。示例性的抗体还可以包含重链恒定区和轻链恒定区，分别具有如SEQ ID NOs：29和30所示的氨基酸序列，重链可变区的C端与重链恒定区的N端连接，轻链可变区的C端与轻链恒定区的N端连接。
表1中的重链可变区CDR和轻链可变区CDR由Kabat编码***确定。然而，如本领域已知的，CDR区也可以基于重链/轻链可变区序列，通过其他体系，例如Chothia、IMGT、AbM、或Contact编码***/方法确定。
与人OX40结合的其他OX40抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以与本申请抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当VH和VL(或其中的CDR)混合并配对时，特定VH/VL配对中的VH序列可以由结构近似的VH序列取代。相似地，优选特定VH/VL配对中的VL序列由结构近似的VL序列取代。
表1.重链/轻链可变区的氨基酸序列
Figure BDA0002618525580000091
68C8-VH0VL0、68C8-VH2VL2、68C8-VH2VL3、68C8-VH3VL2、68C8-VH3VL3、71H8-VH0VL0、71H8-VH2VL2、71H8-VH2VL3、71H8-vH3VL2、71H8-VH3vL3又分别称为68C8-HOL0、68C8-H2L2、68C8-H2L3、68C8-H3L2、68C8-H3L3、71H8-H0L0、71H8-H2L2、71H8-H2L3、71H8-H3L2、71H8-H3L3。
因此，在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区；以及
(b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一OX40抗体的VL，其中该抗体特异结合人OX40。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一OX40抗体的CDR，其中该抗体特异结合人OX40。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括OX40抗体的重链可变区CDR2以及其他结合人OX40的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一OX40抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。
此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)；Beiboer etal.，J.Mol.Biol.296：833-849(2000)；Rader et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)；Barbas etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)；Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)；Igarashiet al.，J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)；Polymenis andStoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)and Xu and Davis，Immunity 13：37-45(2000)；U.S.Pat.Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献均通过引用的方式全部并入本文。
在另一实施方式中，本申请的抗体包含OX40抗体的重链可变区的CDR2以及至少OX40抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一OX40抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够特异结合人OX40。优选这些抗体(a)竞争结合OX40；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本申请OX40抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含OX40抗体的轻链可变区CDR2，或者另一OX40抗体的轻链可变区CDR2，其中该抗体特异结合人OX40。在另一实施方式中，本申请的抗体可以包括OX40抗体的重链/轻链可变区CDR1，或另一OX40抗体的重链和/或轻链可变区CDR1，其中该抗体特异结合人OX40。
保守修饰
在另一实施方式中，本申请的抗体包含与本申请OX40抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.，(1993)Biochem 32：1180-8；deWildt et al.，(1997)Prot.Eng.10：835-41；Komissarov et al.，(1997)J.Biol.Chem.
272：26864-26870；Hall et al.，(1992)J.Immunol.149：1605-12；Kelley and O′Connell(1993)Biochem.32：6862-35；Adib-Conquy et al.，(1998)Int.Immunol.10：341-6and Beers et al.，(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43。
因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(a)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(b)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(c)重链可变区CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且
(e)该抗体特异结合人OX40。
本申请的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人OX40的高亲和力，以及引发对OX40表达细胞的ADCC或CDC的能力。
在多个实施方式中，抗体可以是例如小鼠源、人源、嵌合或人源化抗体。
本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。
基因修饰的抗体
本申请的抗体可以以具备本申请OX40抗体的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个框架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，框架区经修饰成提供人源化的抗体。此外，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。
在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的框架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(Riechmannet al.，(1998)Nature 332：323-327；Jones et al.，(1986)Nature 321：522-525；Queenet al.，(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86：10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的VH和VL CDR序列，它们可以含有不同的框架序列。
这样的框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.，(1991)，同上；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox et al.，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7 HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12 HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109，NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。
通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschμl et al.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。
用于本申请抗体的优选框架序列是结构上与本申请抗体所用的框架序列相似的那些。VH CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该框架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的框架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的框架区中。例如，在一些情况下，将框架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类的可变区修饰是将VH和/或VLCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。
因此，在另一实施方式中，本申请提供分离的OX40单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)VH CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VL CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
本申请的基因改造抗体包括在VH和/或VL的框架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。通常而言，这些框架修饰用来降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于得到抗体的种系序列的框架残基。这些残基可以通过将抗体框架序列与得到抗体的种系序列相比较而识别出来。
另一类的框架修饰包括对框架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
此外，作为框架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本申请的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本申请的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。
在一个实施方式中，CH1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
另外地，或者可选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化***改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化***的细胞在领域中已知，且可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系通过在CHO/DG44细胞中使用两种替换载体定向破坏FUT8基因而制备(参见美国专利公开20040110704和Yamane-Ohnuki et al.，(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，EP1,176,195记载了FUT8基因功能破坏的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，从而在该细胞系中表达的抗体通过降低或消除α-1，6键相关酶而表现出低岩藻糖基化。EP 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡糖胺添加岩藻糖的酶活性，或者不具有这种酶的活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。WO 03/035835描述了CHO变体细胞系，Lec13细胞，其具有降低的向Asn(297)-相关糖添加岩藻糖的能力，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见Shields et al.，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如WO 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。WO 99/54342公开了一种细胞系，其基因改造成表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII))，从而在基因改造细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其引起抗体增强的ADCC活性(Umana et al.，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-L-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(Tarentino et al.，(1975)Biochem.14：5516-23)。
本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。抗体可以PEG化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体PEG化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的抗体是去糖基化的抗体。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本申请的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。
抗体的物理特性
本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其不同类别。
例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala and Morrison(2004)JImmunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.，(2000)Mol Immunol 37：697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选OX40抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。
在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
各抗体将具有独特的等电点(pI)，基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选OX40抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。
编码本申请抗体的核酸分子
在另一方面，本申请提供编码本申请抗体的重链和/或轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。
本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。
优选的本申请核酸分子包括编码OX40单克隆抗体的VH和VL序列或CDR的那些。一旦获得了编码VH和VL的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VH或VL的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。
编码VH区的分离DNA可以通过可操作地连接VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。
编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接VL编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段连接，从而VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中VH和VL区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty etal.，(1990)Nature 348：552-554)。
本申请单克隆抗体的制备
本申请的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。
制备本申请单克隆抗体的转染瘤的生成
本申请的抗体还可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA***一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子***，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.，(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。
抗体轻链基因和抗体重链基因可以***到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过***到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而VH与载体中的CH可操作地连接，VL与载体中的CL可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。
优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别在使用NSO骨髓瘤细胞时，另一优选的表达***是GS基因表达***，记载于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。
双特异性分子
另一方面，本申请涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体的配体)相连接的一种或多种本申请抗体的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。因此，本文所用的术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
在实施方式中，除Fc结合特异性和OX40结合特异性外，双特异性分子还具有第三特异性。第三特异性可以是针对增强因子(EF)，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合并从而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，增强因子抗体可以与细胞毒性T细胞(例如，通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40或ICAM-1)或其他免疫细胞结合，引起增强的针对靶细胞的免疫应答。
双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al，同上；Cao and Suresh，Bioconjugate Chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van Spriel et al.，Immunology Today，21(8)，391-397(2000)。
药物组合物
在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的一种或多种抗体，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上有效的成分，例如另一抗体或药物。本申请的药学组合物也可以在与例如另一抗癌剂、另一抗炎剂或抗微生物剂的联合疗法中进行施用。
药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro，ed.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中有教导。
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、***、直肠、舌下、或局部外用。
药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。
与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。通常而言，以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分，优选为约0.1％-约70％，最预选为约1％-约30％的有效成分。
给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。
对于抗体的施用，剂量可以为约0.001-100mg/kg宿主体重，更常见的为0.01-5mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。示例性的治疗方案涉及每周施用一次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、3个月一次、或3-6个月一次。本申请OX40抗体的优选给药方案包括静脉内施用，1mg/kg体重或3mg/kg体重，抗体以以下给药时间表中的一个进行给药：(i)每四周给药六次，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，之后1mg/kg体重每三周一次。在一些方法中，剂量调整成实现约1-1000μg/ml的血药浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。
“治疗有效剂量”的本申请OX40抗体优选地引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加、或对感病性引起的损伤或无能的预防能力。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效剂量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。
药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、透皮贴剂、和微胶囊递送***。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。
在一些实施方式中，本申请的单抗可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本申请的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685；Umezawaet al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038；Bloeman et al.，(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais et al.，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180；Briscoeet al.，(1995)Am.J.Physiol.1233：134；Schreier et al.，(1994)J.Biol.Chem.269：9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本申请的用途和方法
本申请的抗体或其抗原结合部分(组合物、和双特异性分子)具有多种体外和外内应用，涉及例如癌症的治疗和/或预防。抗体可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长。
考虑到本申请OX40抗体的抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本申请提供抑制受试者中肿瘤细胞生长和存活的方法，包括向该受试者施用本申请的抗体，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本申请抗体治疗的肿瘤的非限制性例子包括但不限于淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤、肠癌、乳癌、神经胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和肠腺癌，不管是原发癌还是转移癌。此外，难治的或复发的恶性肿瘤可能可以用本申请的抗体抑制。
在另一方面，本申请提供一种治疗受试者中感染性疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请抗体或抗原结合部分。可以与本申请抗体或其抗原结合部分一起施用其他抗感染药物，例如抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗寄生物剂。
总体而言，本申请的抗体可以用来增强受试者的免疫应答。
本申请的这些和其他方法在以下进一步讨论。
联合疗法
另一方面，本申请提供本申请OX40抗体(或其抗原结合部分)与一种或多种能有效抑制受试者中肿瘤生长的其他抗体一起施用的联合疗法。在一个实施方式中，本申请提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用OX40抗体以及一种或多种其他抗体，例如LAG-3抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体和/或CTLA-4抗体。在某些实施方式中，受试者是人。
本申请还提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用OX40抗体和OX40表达激活剂。OX40的表达优选在T细胞的表面。OX40表达激活剂可以是TLR9配体，或具体为非甲基化CpG寡核苷酸。或者，OX40表达激活剂可以是血凝素-白细胞凝集素、或IL-2。
OX40信号通路激活可另外与标准癌症治疗结合。例如，OX40信号通路激活可以与CTLA-4和/或LAG-3和/或PD-1阻断、以及化疗相结合。例如，化疗剂可以与OX40抗体一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。例如，表阿霉素、奥沙利铂、和5-FU可以施用给接受OX40抗体疗法的患者。
任选地，OX40与一种或多种其他抗体(例如，CTLA-4抗体和/或LAG-3抗体和/或PD-1抗体)的组合还可以与免疫原性剂结合，免疫原型剂为例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖分子)、和转染有表达免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He et al.，(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性例子包括黑色素瘤抗原肽，例如gp100肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1、和/或酪氨酸酶、或转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。
其他可以与OX40抗体联合的疗法包括但不限于白介素2(IL-2)施用、放疗、手术或激素去除。
本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。
此外，如果进行按序进行多次联合疗法施用，则在各施用时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。
本申请还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为限制性的。所有附图和在本申请中通篇引用的所有参考文献、Genebank序列、专利和公开专利申请都通过引用的方式明确地并入本文。
实施例
实施例1稳定表达人、猴或小鼠OX40的HEK293A细胞株的构建
使用HEK293A细胞(南京科佰公司，中国)来构建过表达人、猴或小鼠OX40的稳定细胞系。简单而言，合成人、猴或小鼠OX40的cDNA序列(SEQ ID NOs：31、33和35，分别编码氨基酸序列SEQ ID NOs：32、34和36)，并克隆到pLV-EGFP(2A)-Puro载体的EcoRI和BamHI位点之间。根据Lipofectamine 3000试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)的说明书，经pLV-EGFP(2A)-Puro-OX40与psPAX和pMD2.G质粒的共转染，在HEK-293T细胞(南京科佰公司，中国)中产生慢病毒。共转染三天后，从各个HEK-293T细胞的细胞培养基(DMEM培养基(Cat#：SH30022.01，Gibco)，补充有10％FBS(Cat#：FND500，Excell))中收获慢病毒。最后，用慢病毒转染HEK293A细胞，得到稳定表达人、猴、或小鼠OX40的HEK293A细胞，即HEK293A/hOX40、HEK293A/rhOX40、和HEK293A/muOX40。转染的HEK293A细胞培养在含有0.2μg/ml嘌呤毒素(Cat#：A11138-03，Gibco)的培养基(DMEM+10％FBS)中7天。人OX40和猴OX40的表达通过FACS使用市售可得的抗人OX40抗体(PE-抗人OX40抗体，Cat#：350003，批次号：B228541，Biolegend，美国)进行确认。相似地，小鼠OX40的表达通过市售可得的抗小鼠OX40抗体(PE-抗小鼠OX40抗体，Cat#no.：119409，批次号B229283，Biolegend，美国)经FACS确证。
实施例2产生针对人OX40的单抗的示例性杂交瘤细胞系的生成
小鼠抗人OX40单克隆抗体(mAb)通过略加修改的常规杂交瘤融合技术而产生。
接种
20只BALB/C小鼠(北京维通利华，中国)按照以下表2中的方案接种重组人OX40(ECD)-hFc(Cat#：10481-H08H，批次号LC11AP2001，义翘神州，中国)和/或猴OX40-hFc(Cat#：90846-C08H，批次号MB110C1803，义翘神州，中国)。人OX40(ECD)-hFc蛋白和猴OX40-hFc用等体积的完全Freund佐剂(Cat#：F5881-10*10ML，批次号：SLBV0593，Sigma，美国)、不完全Freund佐剂(Cat#：F5506-6*10ML，批次号：SLBR3892V，Sigma，美国)或PBS进行超声乳化。
每次加强免疫后1周，从每只小鼠体内取50μl血清，经ELISA检测滴度，使用重组人OX40-his(Cat#：10481-H03H，义翘神州，中国)和猴OX40-his(Cat#：90846-C08H，义翘神州，中国)。还通过使用实施例1中制备的过表达人、猴、和小鼠OX40的HEK293A细胞经FACS进行滴度确定。
基于最后一次加强之后的ELISA和FACS分析，血清滴度较高的7只小鼠被选出用于杂交瘤细胞系制备。
表2.接种方案
Figure BDA0002618525580000221
示例性杂交瘤细胞系的生成
通过略加修改的常规杂交瘤融合技术制备示例性杂交瘤细胞系。
在细胞融合前，各个所选的小鼠腹腔注射溶于PBS的人OX40(ECD)-hFc进行免疫加强一次，剂量为每只小鼠50μg。4天后，将小鼠处死，收集脾脏，在PBS中制备成单细胞混悬液。脾细胞用DMEM培养基(Cat#：SH30243.01B，Hyclone)清洗3次。处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0(CRL-1581，ATCC)与小鼠脾细胞按1∶4的比例混匀。细胞清洗2次，通过PEG(Cat#：P7181，Sigma)进行细胞融合。融合后的细胞用DEME培养基清洗3次，并重悬在细胞生长培养基中(RPMI 1640(Cat.C22400500CP，Gibco)，补充有10％FBS和1X HAT(H0262，Sigma))。将细胞混悬液在96孔培养板上铺板，每孔200μl，5×104细胞每孔，细胞置于37℃、10％CO2的潮湿孵育箱中孵育7天。在第7天时，将成长培养基换成补充有10％FBS和1X HAT(H0137，Sigma)的新鲜培养基。2-3天以后，经ELISA和FACS筛选杂交瘤细胞。
通过ELISA筛选杂交瘤细胞系
首先通过高通量ELISA结合检测来筛选与人OX40结合的杂交瘤克隆。与人OX40结合的杂交瘤克隆进一步测试其与猴或小鼠OX40交叉反应的能力。
对于ELISA检测，用100μl/孔人OX40-his(0.5μg/ml，Cat#：10481-H03H，义翘神州，中国)、猴OX40-his(0.5μg/ml，Cat#：90846-C08H，义翘神州，中国)或小鼠OX40-his(0.5μg/ml，Cat#：E3350-B1707，中美冠科，中国)包被96孔ELISA板，室温过夜。板用PBST缓冲液(PBS+0.05％吐温20)清洗3遍，用200μl封闭液(PBS，含1％BSA、1％山羊血清、和0.05％吐温20)室温封闭2小时，用PBST清洗3遍。之后，杂交瘤细胞培养上清用稀释缓冲液(PBS，含1％BSA、1％山羊血清、0.01％吐温20)稀释10倍，加到板中，100μl每孔。室温孵育1小时后，板用PBST清洗3遍，每孔加入100μl山羊抗小鼠Fc-HRP(1∶5000，Cat#：A9309-1ml，Sigma，美国)。室温孵育1小时后，板用PBST清洗3遍，每孔加入80μl TMB。5-10分钟后，每孔加入80μl 0.16M硫酸终止显色，用SpectraMaxR i3X(Molecμlar Devies，美国)进行OD450读数。
经上述ELISA检测，识别出209个与人和猴OX40有特异结合的杂交瘤克隆。
通过FACS筛选杂交瘤细胞系
对这209个杂交瘤克隆进一步筛选其与HEK293A细胞表达的人、猴或小鼠OX40的结合能力。简单而言，将实施例1制备的100,000个HEK293A/人OX40细胞、HEK293A/猴OX40细胞、或者HEK293A/小鼠OX40细胞在96孔板的各孔铺板，将杂交瘤细胞培养上清用稀释缓冲液(PBS，加上1％BSA、1％山羊血清、0.01％吐温20)稀释10倍，加入到板中，100μl每孔。4℃孵育1个小时后，板用FACS溶液(PBS+1％BSA+0.01％吐温20)清洗3遍。之后，细胞用FACS溶液重悬，向板加入500倍稀释的APC山羊抗小鼠IgG(Cat#：405308，BioLegen，美国)。4度孵育1小时后，板用PBS清洗3遍，用FACS检测仪(BD)监测细胞荧光。
基于上述FACS筛选，得到177个对HEK293A/人OX40细胞以及HEK293A/猴OX40细胞有高结合力而不与HEK-293A/小鼠OX40细胞结合的阳性克隆。
产生OX40抗体的示例性杂交瘤克隆的亚克隆
将177个杂交瘤克隆进行2轮亚克隆。在亚克隆过程中，选出各母克隆的多个亚克隆(n＞3)，并经上述的ELISA和FACS检测进行选择并确证。经该过程选出的亚克隆确定为产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。最终得到84个对人和猴OX40呈现出高结合力的亚克隆(每个母克隆得自一个亚克隆)。
通过HEK-Blue活性检测筛选杂交瘤细胞系
将该84个亚克隆在96孔板中铺板，并培养5天。收集上清进行HEK-Blue活性检测，以识别对人OX40有激动活性的OX40抗体。
简单而言，通过用表达人OX40-CD40融合蛋白(SEQ ID NO.：37)的慢病毒(如实施例1般制备)侵染HEK-Blue null 1_v细胞(InvivoGen，圣地亚哥，美国)来构建表达人OX40-CD40融合蛋白的HEK-Blue报告细胞系(称为HEK-Blue/OX40)，之后用10μg/ml的嘌呤毒素进行筛选。
对于HEK-Blue报告***检测，将40000个HEK-Blue/OX40细胞重悬在200μl培养基(DMEM培养基(Cat#：SH30243.01，Hyclone，USA)+10％FBS(Cat#：FND500，Excell，中国)+10μg/ml嘌呤霉素(Cat#：A11138-03，GIBCO，USA)+100μg/mlNormocinTM(Cat#：ant-nr-2，Invivogen，USA)+100μg/ml博来霉素(Cat#：ant-Zn-5，Invivogen，USA)中，于96孔板铺板，并于37℃培养过夜。第二天，各孔加入200μl DMEM培养基，替换原培养基。7小时后，用200μL每孔的HEK-Blue检测缓冲液(Cat#：hb-det3，批次号：HKB-3903，Invivogen，US)替换各孔中的DMEM培养基。将1ml杂交瘤细胞培养上清与20μl蛋白G琼脂糖珠子(Cat#：SC-2002，SantaCruz Biotechnology，US)室温孵育30分钟，以富集抗体，且将富集的抗体加至上述HEK-Blue/OX40细胞。得到的混合物在37℃、5％CO2下孵育，直至显出合适的蓝色。用SpectraMax酶标仪(SpectraMaxR i3X，Molecμlar Devices，美国)测定OD650。新鲜的杂交瘤培养基用作阴性对照，OX40L(Cat#：13127-H01H，Sinobiological，中国)，OX40的天然配体和激活剂，用作阳性对照。
如图1所示，47个克隆显示出不同程度的OX40激动活性。
实施例3示例性OX40单克隆抗体的纯化
基于上述的HEK-Blue检测，选择33个具有高HEK-Blue活性的克隆(见以下表3)，进行进一步的研究。将33个所选克隆的单克隆抗体进行纯化。简单而言，各个亚克隆的杂交瘤细胞在T175细胞培养瓶中生长，各个培养瓶含100ml新鲜无血清培养基(Cat#：12045-076，Gibco，美国)和1％HT补充液(Cat#：11067-030，Gibco)。细胞培养物在37℃、5％CO2的培养箱中培养10天。收集细胞培养物，3500rpm离心5分钟，并使用0.22μm滤膜进行过滤，除去细胞碎片。单克隆抗体之后通过使用预平衡的蛋白-A亲和柱(Cat#：17040501，批次号：10252250，GE，美国)来纯化，用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-pH3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在PBS缓冲液(pH 7.0)中，并使用NanoDrop仪器确定抗体浓度。
通过使用κ和λ-小鼠快速分型试剂盒(Cat#：26179，Thermal，美国)和小鼠单克隆抗体分型试剂(Cat#：IS02-1KT，Sigma，美国)，根据制造商的操作手册，来确定各个纯化抗体的同种型。所选的33个最好的克隆的分型结果和表达滴度总结在表3中。
表3.OX40抗体的同种型和表达滴度
克隆 同种型 表达滴度(mg/l) 克隆 同种型 表达滴度(mg/l)
69A9 IgG1κ 2.6 204F7 IgG2b，κ 8.568
26D9 IgG2bκ 22 285A2 IgG2a，κ 2.184
68C8 IgG1κ 12.2 276F12 IgG2a，κ 4.264
6A12 IgG1κ 4.3 299B3 IgG1，κ 4.908
71H8 IgG1κ 11.3 222A11 IgG1，κ 11.450
96B9 IgG1κ 1.0 295E10 IgG1，κ 6.850
190A7 IgG1κ 13.547 262F2 IgG1，κ 10.900
118D7 IgG2bκ 11.756 295D8 IgG1.κ 19.200
143D6 IgG1κ 1.929 279H4 IgG2a，κ 5.250
185A12 IgG2aκ 14.190 253E9 IgG1，κ 3.064
134G4 IgG2aκ 2.318 270E9 IgG1，κ 22.836
192E4 IgG1κ 1.135 278G9 IgG1，κ 2.501
186G4 IgG1κ 2.150 253G5 IgG2a，κ 5.302
137A12 IgG2aκ 33.978 287G7 IgG2a，κ 6.720
147H2 IgG1κ 10.967 274F1 IgG2a，κ 7.248
136B8 IgG2aκ 26.433 268D2 IgG2a，κ 4.308
118A7 IgG2aκ 31.311
实施例4纯化的示例性OX40单克隆抗体与人和猴OX40结合
纯化的OX40单克隆抗体首先通过ELISA检测来确定其与重组人、猴或小鼠OX40蛋白的结合亲和力。
ELISA板用500ng/ml(实施例2中使用的)人OX40-his 4℃包被过夜。孔用200μl封闭液(PBS，含有1％BSA、1％山羊血清、0.05％吐温20)室温下封闭2小时，然后向各孔加入100μl梯度稀释的OX40抗体(起始浓度40μg/ml)，室温孵育1小时。板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍，加入5000倍稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(Cat#：A9309-1ml，Simga，美国)，室温孵育1小时。板用新鲜配制的Ultra-TMB(Cat#no.：555214，BD，美国)室温显色5分钟。用SpectraMaxRi3X(Molecular Devies，美国)在450nm读取吸光度。
33个OX40单克隆抗体对猴或小鼠OX40的物种交叉反应性进一步通过直接ELISA进行测试。简单而言，将500ng/ml猴OX40-his或小鼠OX40-his(实施例2中所使用的)包被于96孔ELISA板，并与100μl梯度稀释的OX40抗体(起始浓度40μg/ml)孵育。之后使用HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(Cat#：A9309-1ml，Sigma，美国)。MEDI0562和RG7888，具有人IgG1/κ恒定区的参照OX40抗体，使用分别在专利申请US2016/0137740A1和WO2015/15 3513 A1中公开的氨基酸序列制备而成。
这些结合测试的EC50值总结在表4中。可以看到，所有33种抗体均与猴OX40交叉反应而不与小鼠OX40交叉反应。
表4. 33种OX40单抗对人、猴、或小鼠OX40的结合力
Figure BDA0002618525580000251
实施例5示例性OX40单克隆抗体与HEK293A细胞表达的人和猴OX40结合
为进一步确定示例性OX40抗体是否与HEK293A细胞表达的人、猴或小鼠OX40结合，分别使用稳定过表达人、猴或小鼠OX40的HEK293A细胞(见实施例1)进行基于细胞的FACS结合检测。简单而言，将105个HEK293A细胞在96孔板的各孔上铺板，并向板加入梯度稀释的OX40抗体。4℃孵育1个小时后，板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的APC耦合的山羊抗小鼠IgG(Cat#：405308，BioLegen，美国)。4℃孵育1小时后，板用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD)监测细胞荧光。如表5所示，所有33个OX40单克隆抗体示出与人和猴OX40的高结合力，但是不结合小鼠OX40(数据未显示)。
表5.OX40抗体与人和猴OX40的结合亲和力
Figure BDA0002618525580000261
实施例6示例性OX40抗体抑制人OX40-OX40L相互作用
对纯化的抗人OX40抗体进一步测试其阻断人OX40L与人OX40结合的能力。简单而言，96孔ELISA板用500ng/ml的人OX40-his(实施例2中使用的)4℃包被过夜。板用200μl封闭液(PBS+2％BSA)室温封闭2小时。之后向孔加入梯度稀释的OX40抗体(起始浓度为40μg/m1)，室温孵育1小时，然后加入100μl的2μg/ml的人OX40L-hFc(Cat#：13127-H01H，义翘神州，中国)。室温孵育1小时后，板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗3遍，向各孔加入抗人IgGFC-HRP(1∶5000，Cat#：A0170-1ML，Simga，美国)，室温孵育1小时。板用PBST洗3遍，向各孔加入80μl TMB。5-10分钟后，向各孔加入80μl 0.16M硫酸来终止反应，之后用SpectraMaxRi3X(Molecμlar Devies，美国)测定OD450。
4个代表性克隆的结果显示在图2中。所有抗体(包括6A12、26D9、68C8和71H8)均阻断人OX40-OX40L相互作用，OX40与OX40L的结合(OD450值)随着OX40抗体浓度的增加而降低。MEDI0562和RG7888在此用作阳性对照。
实施例7示例性OX40抗体的激动活性的确定
为确定所选的OX40抗体是否具有激动活性，进行HEK-Blue活性检测。简单而言，将实施例2制备的HEK-Blue/OX40细胞孵育在DMEM培养基(Cat#：SH30243.01，Hyclone，美国)+10％FBS(Cat#：FND500，Excell，中国)+10μg/ml嘌呤霉素(Cat#：A11138-03，GIBCO，美国)+100μg/ml NormocinTM(Cat#：ant-nr-2，Invivogen，美国)+100μg/ml博来霉素(Cat#：ant-Zn-5，Invivogen，美国)。将四万(40,000)个HEK-Blue/OX40细胞在96孔检测板的各孔中重悬于200μl培养基中，37℃培养。在孵育过夜(约12小时)后，用200μl新鲜DMEM培养基替换培养基。7小时后，将各孔的DMEM培养基替换成100μl/孔HEK Blue检测缓冲液(美国Cat#：hb-det3，Invivogen，美国)，其中含有各种浓度的OX40抗体(从100μg/ml到0.002ng/ml)。细胞于37℃孵育，直至显出合适的蓝色。使用SpectraMaxR酶标仪(SpectraMaxR i3X，MolecμlarDevices，美国)测定OD650的吸光值。MEDI0562和RG7888在此用作阳性对照。
这33个抗体在功能性HEK-Blue检测中显示出不同程度的激动活性。EC50值总结在以下表6中，代表性单抗的激动活性显示在图3中。一些抗体，例如68C8和71H8，比两个对照具有更低的EC50值，即更高的激动活性。
表6.OX40抗体的激动活性
抗体 EC<sub>50</sub>ng/mL) 抗体 EC<sub>50</sub>(ng/mL) 抗体 EC<sub>50</sub>(ng/mL)
69A9 860.3 186G4 71.37 295D8 99.54
26D9 469.1 137A12 256.1 279H4 3076
68C8 86.59 147H2 41.32 253E9 325
6A12 273.8 136B8 1179 270E9 227.4
71H8 49.38 118A7 118.2 278G9 76.3
96B9 395.8 204F7 408.4 253G5 131.6
190A7 46.52 285A2 518.1 287G7 209.8
118D7 107.2 276F 3251 274F1 905.5
143D6 56.25 299B3 436.7 268D2 13400
185A12 80.32 222A11 141.8 MEDI0562 309.9
134G4 919.6 295E10 98.03 RG7888 120.6
192E2 47.13 262F2 105.8
实施例8抗原表位竞争
使用竞争ELISA检测来进行抗原表位竞争。简单而言，96孔板用5μg/ml的MEDI0562或RG7888于4℃包被过夜。这些孔用200μl封闭缓冲液(PBS，含有1％BSA、1％山羊血清、0.05％吐温20)室温封闭2小时。人OX40-his(Cat#：10481-H03H，Sino Biological，CN)稀释成0.5μg/ml，并加入板中，室温孵育1小时。ELISA板用PBST清洗3遍，纯化抗体稀释为1μg/ml，加入各孔，室温孵育1小时。ELISA板用PBST洗3遍后向各孔加入20000倍稀释的抗小鼠Fc-HRP(Cat#：A9309-1MC，Simga，美国)，室温孵育1小时。板用新鲜配制的Ultra-TMB(Cat#：TMB-S-003，Huzhou Yingchuang，中国)室温显色5分钟，并在Thermo Multiscan FC上于450nm测定吸光度(OD450)。
表7.通过竞争ELISA进行的表位竞争
Figure BDA0002618525580000281
结果总结在表7中，Y和N表示与参照抗体竞争或不竞争。具有最高激动性的两个抗体68C8和71H8可能与MEDI0562-hFc以及RG7888-hFc结合相同或相似的表位。
实施例9示例性激动型OX40抗体促进T细胞共刺激
为进一步确定OX40抗体的激动活性，进行人原代T细胞共刺激检测。简单而言，两个健康人供体血样中的PBMC通过梯度密度离心而获得。CD4+记忆T细胞通过InvitrogenDynabeads Untouched人CD4+T细胞分离试剂盒(Cat#：11346D，Thermal FisherScientific，美国)，根据制造商的说明书，从PBMC中分离出来。
CD4+T细胞重悬于完全RPMI培养基，调整细胞密度为1.0×106/ml。加入终浓度分别为2μg/ml和20IU/ml的血凝素-白细胞凝集素(PHA-L，Cat#：L1668-5MG，sigma)和重组人IL-2(Cat#：202-ILR，R&D)，细胞在37℃、5％CO2的潮湿组织培养箱中培养2天，以激活T细胞并上调OX40。
收集上述激活的人CD4+T细胞，用完全RPIM培养基清洗3遍，并将细胞密度调整成2×105活细胞/ml。板用5μg/ml CD3抗体(OKT3，Cat#：GMP-10977-H001，义翘神州，中国)和梯度稀释的OX40抗体于4℃包被过夜。板用PBS清洗并用含1％BSA的PBS于37℃封闭90分钟。板用PBS清洗，向各孔加入150μl上述CD4+T细胞(30000每孔)。细胞在板中37℃孵育3天，取100μl细胞培养上清用于IL-2分泌测量，使用IL-2检测试剂盒(R&D，美国)。两个参照抗体，MEDI0562和RG7888，即两个已知的激动型OX40抗体，用作阳性对照。HEL抗体(Cat.#：LT12031，LifeTein，LLC，US)作为阴性对照。
如图4所示，单克隆抗体68C8和71H8促进T细胞的共刺激，并以剂量依赖的方式增加IL-2的分泌。
实施例10示例性嵌合OX40抗体的表达和纯化
选取3个抗体(6A12、71H8和68C8)进行进一步的测试。通过标准PCR法，使用文献中提及的引物组(Juste et al.，(2006)，Anal Biochem，1；349(1)：159-61.)，从杂交瘤细胞中克隆3个所选的候选抗体的可变区序列。通过将编码重链可变区和人IgG1恒定区的序列或者编码轻链可变区和人K恒定区的序列(重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs：29和30)***到pCDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，美国)的限制性酶切位点XhoI/BamHI来构建表达载体，其中可变区的C端与恒定区的N端连接。可变区的氨基酸SEQID编码总结在表1中。
将表达载体经PEI转染至HEK-293F细胞(Cobioer，NJ，中国)。具体而言，HEK-293F细胞在Free StyleTM 293表达培养基(Cat#：12338-018，Gibco)中培养，并用聚乙烯亚胺(PEI)将表达载体转染至细胞，DNA与PEI的比例是1∶3，每毫升细胞培养液中加入1.5μgDNA。转染后的HEK-293F细胞在37℃、5％CO2的培养箱中以120RPM转速培养。10-12天后，收集上清，按照实施例3所述纯化单克隆抗体。
实施例11示例性嵌合OX40单克隆抗体与HEK293A细胞表达的人或猴OX40结合
根据实施例5的方法步骤，对3个嵌合OX40抗体检测其与实施例1制备的HEK293A/人OX40细胞和HEK293A/猴OX40细胞的结合力。
如图5所示，嵌合抗体与人和猴OX40均有高亲和力。6A12、71H8和68C8嵌合抗体与HEK293A/人OX40细胞的EC50分别是177.1ng/ml、144ng/ml和133.9ng/ml，而它们与HEK293A/猴OX40细胞的结合EC50分别是882.7ng/ml、151.3ng/ml和80.65ng/ml。
实施例12示例性OX40嵌合单克隆抗体具有激动活性且促进T细胞共刺激
根据实施例7和实施例9的方法步骤，对嵌合抗体检测其对OX40信号通路激活和T细胞共刺激的作用。如图6和图7所示，三个嵌合抗体表现出与其母单抗相似的功能活性。
实施例13示例性OX40抗体的人源化
基于上述相关的功能界定和检测，挑选两个候选抗体，68C8和71H8，进行人源化和进一步研究。小鼠源抗体的人源化通过已确立的CDR移植法(美国专利5,225,539，通过引用的方式全部并入本文)进行，具体描述如下。
为选出鼠源抗体68C8和71H8的人源化受体框架，将68C8和71H8的轻链和重链可变区序列与NCBI网站的人免疫球蛋白基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对。选择与68C8和71H8同源度最高的人种系IGVH和IGVK作为人源化受体。对于抗体68C8和71H8，所选择的人重链受体为IGHV1-46*01，所选择的人轻链受体为IGKV1-33*01。
对68C8和71H8的可变结构域进行三维结构模拟，以确定可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架残基，从而设计在人源化抗体中设计回复突变。所选结构模板分别与68C8和71H8具有相同类型的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2、和H-CDR3经典环状结构。利用所选择的结构模板，通过用人重链和轻链的受体框架代替小鼠框架而构建结构模型。随后进行三维结构建模，以鉴定出可能对维持CDR环状结构或重链和轻链接触面起重要作用的关键框架残基。当鼠源抗体与人受体在框架的某一位点上拥有相同残基时，保留人种系残基。另一方面，当鼠源抗体与人种系受体在框架的某一位点上拥有不同的残基时，通过结构模拟来评价该残基的重要性。如果小鼠源抗体框架中的残基被发现与CDR残基相互作用并对CDR残基产生硬性，那么该残基就会回复突变为鼠源残基。
表8.用于抗体结构模拟的结构模板
Figure BDA0002618525580000301
在上述结构建模的基础上，68C8重链鉴定出5个潜在的回复突变(A40R、K43Q、M48I、M70L、E72V)，轻链鉴定出4个潜在的回复突变(A43T、P44V、F71Y、Y87F)。对于71H8，重链鉴定出6个潜在的回复突变(D27Y、A40R、K43Q、M48I、M70L、E72V)，轻链鉴定出4个潜在的回复突变(A43T、P44V、F71Y、Y87F)。
如表1所总结的，针对68C8，共设计出三个人源化重链可变区和三个人源化轻链可变区，共得到5个人源化抗体。相似地，对于71H8，共设计出三个人源化重链可变区和三个人源化轻链可变区，共得到5个人源化抗体。
化学合成编码人源化重链和轻链可变区以及人IgG1/K恒定区的序列，并利用BamHI和Xho I限制性酶切位点克隆到pCDNA3.1(+)表达载体(Invitrogen，美国)中，其中重链可变区的C端与人IgG1恒定区的N端连接，而轻链可变区的C端与人κ恒定区的N端连接。所有表达构建均经DNA测序证实。根据实施例10的方法步骤，用载体转染HEK293F表达***(Invitrogen，美国)，并瞬时表达10个人源化OX40抗体(71H8 5个，68C8 5个)。人源化抗体按照实施例3所述进行纯化。
实施例14示例性人源化OX40抗体与人或猴OX40结合
根据实施例2中的方法步骤，对人源化OX40抗体进一步测试其与人、猴或小鼠OX40的结合力。
如图8所示，所有的人源化抗体均保留有与人和猴OX40的结合力，但是不与小鼠OX40结合，与其鼠源母抗体以及嵌合抗体一致。
实施例15示例性人源化OX-40抗体与HEK-293A细胞表达的人或猴OX40结合
根据实施例5中所述的FACS分析的方法步骤，对人源化OX40抗体进一步其与HEK293A/人OX40细胞或HEK293A/猴OX40细胞的结合力。
如图9所示，所有的人源化OX40抗体都显示出对HEK293A/人OX40细胞和HEK293A/猴OX40细胞的高亲和力，与其鼠源母抗体以及嵌合抗体一致。
实施例16示例性人源化OX40抗体对OX40信号通路有激动性
如实施例7所述，经HEK-Blue检测，对人源化抗体检测其对OX40信号通路的激活力。两个参照抗体，RG7888和MEDI0562，用作阳性对照。如图10所示，所有的人源化抗体均激活OX40信号通路。
实施例17示例性人源化抗体促进T细胞共刺激
根据实施例9中的方法步骤，对人源化抗体进一步分析其在T细胞共刺激的作用。除IL-2分泌外，还检测了OX40抗体对CD4+T细胞增殖的作用。
根据制造商的说明书，将从两个健康人供体血样分离的经(PHA和IL-2)预激活的人原代CD4+T细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Cat#：C34554I，Invitrogen，美国)进行标记，改动之处在于使用2.5μM的CFSE，且孵育于37℃进行10分钟。在标记后，将细胞重悬于RPMI完全培养基(RPMI+10％FBS)中，并将细胞密度调整成1.5×105活细胞/ml。板用5μg/ml的CD3抗体(OKT3，Cat#：GMP-10977-H001，义翘神州，中国)和梯度稀释的OX40抗体4℃包被过夜。板用PBS清洗并用含1％BSA的PBS 37℃封闭90分钟。板用PBS清洗，每孔加入150μlCD4+T细胞(30000个每孔)。细胞于37℃孵育3天，之后进行FACS分析。OX40抗体RG7888和MEDI0562、以及HEL抗体(Cat.#：LT12031，LifeTein，LLC，美国)用作对照。如图11和图12所示，所有的人源化OX40抗体均增强T细胞活性，剂量依赖性地提高IL-2分泌、促进T细胞增殖。
实施例18示例性嵌合或人源化OX40抗体对人OX40的亲和力
通过BIAcoreTM 8K仪器(GE Life Sciences，美国)，使用SPR检测来确定嵌合或人源化OX40抗体对人OX40的结合亲和力。简单而言，将100-200反应单位(RU)的人OX40-his蛋白(Cat#：10481-H03H，批次号：MA08MA3003，义翘神州，中国)耦联到CM5生物芯片(Cat#：BR-1005-30，GE Life Sciences)，随后用1M氨基乙醇封闭未反应基团。梯度稀释抗体，浓度从0.3μM到10μM，以30μL/分钟注入到SPR反应缓冲液(HBS-EP缓冲液，pH7.4，Cat#：BR-1006-69，GE Life Sciences，美国)中。结合力计算时，扣减空白对照的RU。使用1∶1 Langmuir结合模型(BIA评估软件，GELife，Sciences)，计算结合速率(ka)和解离速率(kd)。平衡解离常数KD以kd/ka比例计算得到。SPR确定的抗体结合曲线如图13所示，嵌合或人源化抗体的结合亲和力列在表9中。OX40抗体RG7888和MEDI0562用作该检测中的对照。
表9.OX40抗体对人OX40的结合亲和力
抗体 k<sub>a</sub> k<sub>d</sub> K<sub>D</sub>
MEDI0562 8.63E+4 1.54E-4 1.79E-9
RG7888 3.22E+5 1.76E-6 5.49E-12
68C8 3.93E+05 7.35E-05 1.87E-10
68C8-H0L0 4.1E+05 1.84E-03 4.49E-09
68C8-H2L2 2.07E+05 1.05E-03 5.07E-09
68C8-H2L3 4.73E+5 9.27E-4 1.96E-9
68C8-H3L2 1.65E+05 1.57E-03 9.55E-09
68C8-H3L3 2.03E+05 8.21E-04 4.04E-09
71H8 5.25E+05 8.28E-05 1.58E-10
71H8-H0L0 2.97E+05 2.74E-03 9.21E-09
71H8-H2L2 3.58E+05 1.72E-03 4.81E-09
71H8-H2L3 4.34E+5 1.98E-3 4.57E-9
71H8-H3L2 2.34E+05 8.71E-03 3.72E-08
71H8-H3L3 3.25E+05 2.07E-03 6.36E-09
实施例19示例性人源化OX40抗体的抗原表位鉴定
通过ELISA检测人源化OX40抗体的结合表位。
OX40胞外结构域(ECD)包含4个半胱氨酸富集结构域(CRD)，分别为CRD1、CRD2、CRD3和CRD4。基于OX40的结构，构建了4个重组OX40蛋白，即全长OX40 ECD(含CRD1/2/3/4，SEQ ID NO.：38)、截短体1-mFc(含CRD2/3/4，SEQ ID NO.：39)、截短体2-mFc(含CRD/3/4，SEQ ID NO.：40)和截短体3-mFc(含CRD/4，SEQ ID NO.：41)。所有这些蛋白在N端连有信号肽(SEQ ID NO.：42)，用于蛋白分泌，在C端连有mFc标签(SEQ ID NO.：43)，用于ELISA检测。合成DNA序列，并克隆到pcDNA3.1载体中。重组蛋白的表达和纯化根据实施例10中的方法步骤进行。按照实施例2所述的方法步骤进行ELISA检测，来评估单抗对重组OX40蛋白的结合力。OX40抗体RG7888和MEDI0562用作对照。
如图14所示，所有的抗体均与全长OX40 ECD-mFc、截短体1-mFc以及截短体2-mFc结合，但是不与截断体3-mFc结合。结果表明，抗体68C8H2L3和71H8 H2L3抗体以及两个参照抗体均与位于CRD3/4的表位结合。
实施例20示例性人源化OX40抗体与人OX40特异结合
根据实施例2所述的方法步骤，通过ELISA检测来确定OX40抗体与人OX40的结合特异性，在检测中与人TNFRSF家族中具有同源氨基酸序列的其他成员做比较。
研究了OX40抗体与人CD40-his(TNFRSF5，Cat#：10774-H08H，义翘神州，中国)、人HVEM-mFc(TNFRSF14，Cat#：HVM-H5255，ACRO，中国)、人4-1BB(TNFRSF9，Cat#：41B-H522a，ACRO，中国)、人NGFR(TNFRSF16，Cat#：13184-H08H，义翘神州，中国)、人DR6(TNFRSF21，Cat#：10175-H08H，义翘神州，中国)、和人RANK(TNFRSF11，Cat#：RAL-H5240，ACRO，义翘神州，中国)的结合亲和力。
如图15所示，68C8-H2L3和71H8-H2L3不与CD40(TNFRSF5)、HVEM(TNFRSF14)、4-1BB(TNFRSF9)、NGFR(TNFRSF16)、DR6(TNFRSF21)或RANK(TNFRSF11)结合，表明68C8-H2L3和71H8-H2L3与OX40特异结合。
实施例21示例性人源化OX40单克隆抗体具有体内抗肿瘤效果
通过在具有人OX40的转基因小鼠(GemPharmatech Co.Ltd，中国)中植入MC38小鼠肠腺癌而建立动物模型，在该模型总研究抗体68C8-H2L3和71H8-H2L3的体内抗肿瘤活性。各小鼠在第0天在一侧腹部皮下注射1×106MC38细胞。待肿瘤长到80mm3时，动物随机分成五组，每组8只。动物在第5、8、12、15和18天腹腔注射68C8-H2L3、71H8-H2L3、对照抗体或PBS，10mg/kg/天。
随时间追踪肿瘤大小，每三天测量体积。用卡尺测量肿瘤(宽和长)，通过公式TV＝(长x宽)2/2计算肿瘤体积。在抗体使用组的肿瘤达到3.5cm3前停止实验。用单因素方差分析来确定肿瘤体积差异。
在第20天，各组取4只小鼠用于T细胞分析，其他小鼠继续成活，肿瘤大小测量，直至第60天。小鼠处死后立马收集肿瘤，并放置在含有胶原酶的Hanks缓冲液中。将肿瘤剪成小块，并在含胶原酶的Hanks缓冲液中37℃和轻缓震摇中孵育30分钟。之后，向各样品加入10ml RPMI 1640+10％FBS，终止胶原酶活性，保持免疫细胞的活力。将样品通过70μm细胞滤膜(Cat#：352350，Corning)，并放置在新管中。样品离心成团，重悬到PBSF缓冲液中(PBS+2％FBS)，细胞密度为1×107细胞/ml。样品用PBSF缓冲液清洗2遍，然后加入抗CD45(抗小鼠CD45抗体，Brilliant Violet 785TM，Cat#：103149，Biolegend，美国)和抗CD8(APC抗小鼠CD8a抗体，Cat#：100712，Biolegend，美国)的荧光抗体混合物。将所得的混合物4℃孵育半小时。细胞用PBSF缓冲液清洗2遍，然后经FACS仪器(BD)分析。
如图16所示，与阴性对照组相比，OX40抗体的治疗显著地抑制肿瘤生长，尽管个体反应不同。在抗体停止施用后，在(施用71H8H2L3组的)所有小鼠或(施用68C8H2L3组的)大部分(8只中的6只)中观察到肿瘤生长抑制。此外，在第60天，经71H8H2L3抗体处理的组中，在所有剩余的4只小鼠中均观察到完全消退(CR)，而在其他抗体施用组仅在一半小鼠中观察到CR。此外，如图17所示，抗体71H8H2L3和68C8H2L3均显著地增加CD8+CD45+细胞。
示例性抗体的重链/轻链可变区氨基酸序列总结如下。
Figure BDA0002618525580000331
Figure BDA0002618525580000341
Figure BDA0002618525580000351
尽管本申请已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本公开不限于这些实施方式，且以上描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修改方式和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式进一步全部并入本文。
序列表
<110> 北京天广实生物技术股份有限公司
<120> 结合OX40的抗体及其用途
<130> 55556 00013
<150> US16/254,624
<151> 2019-01-23
<160> 43
<170> PatentIn版本3.5
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Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Asn Glu Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Leu Arg Pro Tyr Tyr Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 71H8-VL
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 68C8-VL
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6A12-VL
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 68C8, 71H8-LV0
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 68C8, 71H8-VL2
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 68C8, 71H8-VL3
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL
<400> 30
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 31
<211> 834
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
atgtgcgtgg gcgcccgccg cctgggccgc ggcccctgcg ccgccctgct gctgctgggc 60
ctgggcctga gcaccgtgac cggcctgcac tgcgtgggcg acacctaccc cagcaacgac 120
cgctgctgcc acgagtgccg ccccggcaac ggcatggtga gccgctgcag ccgcagccag 180
aacaccgtgt gccgcccctg cggccccggc ttctacaacg acgtggtgag cagcaagccc 240
tgcaagccct gcacctggtg caacctgcgc agcggcagcg agcgcaagca gctgtgcacc 300
gccacccagg acaccgtgtg ccgctgccgc gccggcaccc agcccctgga cagctacaag 360
cccggcgtgg actgcgcccc ctgccccccc ggccacttca gccccggcga caaccaggcc 420
tgcaagccct ggaccaactg caccctggcc ggcaagcaca ccctgcagcc cgccagcaac 480
agcagcgacg ccatctgcga ggaccgcgac ccccccgcca cccagcccca ggagacccag 540
ggcccccccg cccgccccat caccgtgcag cccaccgagg cctggccccg caccagccag 600
ggccccagca cccgccccgt ggaggtgccc ggcggccgcg ccgtggccgc catcctgggc 660
ctgggcctgg tgctgggcct gctgggcccc ctggccatcc tgctggccct gtacctgctg 720
cgccgcgacc agcgcctgcc ccccgacgcc cacaagcccc ccggcggcgg cagcttccgc 780
acccccatcc aggaggagca ggccgacgcc cacagcaccc tggccaagat ctaa 834
<210> 32
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 33
<211> 834
<212> DNA
<213> 猕猴（Macaca mulatta）
<400> 33
atgtgcgtgg gcgcccgccg cctgggccgc ggcccctgcg ccgccctgct gctgctgggc 60
ctgggcctga gcaccaccgc caagctgcac tgcgtgggcg acacctaccc cagcaacgac 120
cgctgctgcc aggagtgccg ccccggcaac ggcatggtga gccgctgcaa ccgcagccag 180
aacaccgtgt gccgcccctg cggccccggc ttctacaacg acgtggtgag cgccaagccc 240
tgcaaggcct gcacctggtg caacctgcgc agcggcagcg agcgcaagca gccctgcacc 300
gccacccagg acaccgtgtg ccgctgccgc gccggcaccc agcccctgga cagctacaag 360
cccggcgtgg actgcgcccc ctgccccccc ggccacttca gccccggcga caaccaggcc 420
tgcaagccct ggaccaactg caccctggcc ggcaagcaca ccctgcagcc cgccagcaac 480
agcagcgacg ccatctgcga ggaccgcgac ccccccccca cccagcccca ggagacccag 540
ggcccccccg cccgccccac caccgtgcag cccaccgagg cctggccccg caccagccag 600
cgccccagca cccgccccgt ggaggtgccc cgcggccccg ccgtggccgc catcctgggc 660
ctgggcctgg ccctgggcct gctgggcccc ctggccatgc tgctggccct gctgctgctg 720
cgccgcgacc agcgcctgcc ccccgacgcc cccaaggccc ccggcggcgg cagcttccgc 780
acccccatcc aggaggagca ggccgacgcc cacagcgccc tggccaagat ctaa 834
<210> 34
<211> 277
<212> PRT
<213> 猕猴（Macaca mulatta）
<400> 34
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Lys Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ala Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Pro Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Ala
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Met Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala Pro Lys Ala Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Ala Leu Ala Lys Ile
275
<210> 35
<211> 819
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 35
atgtacgtgt gggtgcagca gcccaccgcc ctgctgctgc tgggcctgac cctgggcgtg 60
accgcccgcc gcctgaactg cgtgaagcac acctacccca gcggccacaa gtgctgccgc 120
gagtgccagc ccggccacgg catggtgagc cgctgcgacc acacccgcga caccctgtgc 180
cacccctgcg agaccggctt ctacaacgag gccgtgaact acgacacctg caagcagtgc 240
acccagtgca accaccgcag cggcagcgag ctgaagcaga actgcacccc cacccaggac 300
accgtgtgcc gctgccgccc cggcacccag ccccgccagg acagcggcta caagctgggc 360
gtggactgcg tgccctgccc ccccggccac ttcagccccg gcaacaacca ggcctgcaag 420
ccctggacca actgcaccct gagcggcaag cagacccgcc accccgccag cgacagcctg 480
gacgccgtgt gcgaggaccg cagcctgctg gccaccctgc tgtgggagac ccagcgcccc 540
accttccgcc ccaccaccgt gcagagcacc accgtgtggc cccgcaccag cgagctgccc 600
agccccccca ccctggtgac ccccgagggc cccgccttcg ccgtgctgct gggcctgggc 660
ctgggcctgc tggcccccct gaccgtgctg ctggccctgt acctgctgcg caaggcctgg 720
cgcctgccca acacccccaa gccctgctgg ggcaacagct tccgcacccc catccaggag 780
gagcacaccg acgcccactt caccctggcc aagatctaa 819
<210> 36
<211> 272
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 36
Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr
20 25 30
Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met
35 40 45
Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys
65 70 75 80
Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr
85 90 95
Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg
100 105 110
Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro
115 120 125
Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu
165 170 175
Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val
180 185 190
Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro
195 200 205
Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu
210 215 220
Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp
225 230 235 240
Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr
245 250 255
Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile
260 265 270
<210> 37
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人OX40-CD40融合蛋白
<400> 37
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly
210 215 220
Ile Leu Phe Ala Ile Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala
225 230 235 240
Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu
245 250 255
Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val
260 265 270
Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys
275 280 285
Glu Ser Arg Ile Ser Val
290
<210> 38
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 全长OX40-ECD
<400> 38
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg
20 25 30
Cys Cys His Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser
35 40 45
Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn
50 55 60
Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu
65 70 75 80
Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr
85 90 95
Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro
100 105 110
Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp
115 120 125
Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His
130 135 140
Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg
145 150 155 160
Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg
165 170 175
Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly
180 185 190
Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Ala Lys Thr
195 200 205
Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr
210 215 220
Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu
225 230 235 240
Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His
245 250 255
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser
260 265 270
Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn
275 280 285
Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro
290 295 300
Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser
305 310 315 320
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
325 330 335
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp
340 345 350
Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr
355 360 365
Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser
370 375 380
Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
385 390 395 400
Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
405 410 415
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr
420 425 430
Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr
435 440 445
Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln
450 455 460
Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met
465 470 475 480
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys
485 490 495
Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu
500 505 510
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
515 520 525
Lys
<210> 39
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40截短体1-mFc
<400> 39
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser
20 25 30
Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu
35 40 45
Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg
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Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys
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Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr
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210 215 220
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
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275 280 285
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Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
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Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
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Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
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Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
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Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
450 455 460
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<211> 450
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<220>
<223> OX40截短体2-mFc
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275 280 285
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Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr
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His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
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<223> 信号肽
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Val His Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mFc标签
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Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
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Ser Pro Gly Lys

Claims (18)

1.一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，其结合肿瘤坏死因子受体OX40，包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，该轻链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中重链CDR1区、CDR2区和CDR3区，以及轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs：1、3、6、8、10和12；(2)SEQ ID NOs：1、4、6、8、10和12；或(3)SEQ ID NOs：2、5、7、9、11和13所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含与SEQ IDNOs：14、15、16、17、18、19、20、21或22具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO：23、24、25、26、27或28具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含与(1)SEQ ID NOs：14和23；(2)SEQ ID NOs：15和24；(3)SEQ ID NOs：16和25；(4)SEQ ID NOs：17和26；(5)SEQ ID NOs：18和27；(6)SEQ ID NOs：18和28；(7)SEQ ID NOs：19和27；(8)SEQ ID NOs：19和28；(9)SEQ ID NOs：20和26；(10)SEQ ID NOs：21和27；(11)SEQ ID NOs：21和28；(12)SEQ ID NOs：22和27；或(13)SEQ ID NOs：22和28具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，还包含与所述重链可变区相连的重链恒定区以及与所述轻链可变区相连的轻链恒定区，其中所述重链恒定区包含与SEQ IDNO：29具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含与SEQ ID NO：30具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其(a)与人或猴OX40结合；(b)阻断OX40-OX40L相互作用；(c)不与小鼠OX40结合；(d)促进T细胞共刺激；(e)促进IL-2分泌；和(f)促进CD8+T细胞增殖。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其为小鼠源、嵌合或人源化抗体。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其为IgG1、IgG2或IgG4同种型。
9.一种双特异性分子，包含权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
10.一种药物组合物，包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
11.一种宿主细胞，包含编码权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分的多核苷酸。
12.权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其用于治疗癌症疾病。
13.根据权利要求12所述的用于治疗癌症疾病的抗体或其抗原结合部分，其中所述癌症疾病为实体瘤或非实体瘤。
14.根据权利要求13所述的用于治疗癌症疾病的抗体或其抗原结合部分，其中所述癌症疾病选自淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤、肠癌、乳癌、神经胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、肠腺癌。
15.根据权利要求12所述的用于治疗癌症疾病的抗体或其抗原结合部分，其中权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分与免疫刺激抗体、共刺激抗体、化疗剂、和/或OX40表达激活剂一起施用。
16.根据权利要求15所述的用于治疗癌症疾病的抗体或其抗原结合部分，其中所述OX40表达激活剂为非甲基化的CpG寡核苷酸、血凝素-白细胞凝集素、和/或IL-2。
17.根据权利要求15所述的用于治疗癌症疾病的抗体或其抗原结合部分，其中所述免疫刺激抗体选自PD-1抗体、PD-L1抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、STAT3抗体和ROR1抗体。
18.根据权利要求15所述的用于治疗癌症疾病的抗体或其抗原结合部分，其中所述共刺激抗体为CD137抗体或GITR抗体。
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