CN111690035A - 一种提高抗菌肽产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制品相关技术领域，具体涉及一种提高抗菌肽产量的方法。本发明主要是通过将鲜萝卜磨碎、过滤获得提取液，向其中加入纤维素酶，促进剂，鼠尾草提取物，并进一步浓缩，过柱，干燥所得。本发明提供的方法，可以显著提高抗菌肽的产量，且浓缩后抗菌肽与纤维素酶组成融合蛋白，后续容易析出，有效降低了操作难度，为抗菌肽的获得及有效应用提供了有力保障。

Description

一种提高抗菌肽产量的方法
技术领域
本发明属于生物制品相关技术领域，具体涉及一种提高抗菌肽产量的方法。
背景技术
抗菌肽是生物体先天免疫***的重要组成部分，它们从广泛的生物体中分离得到，包括细菌、植物和动物。在过去的20年里，随着抗菌肽的不断被发现，抗菌肽的数量在快速的增长，它们的广谱抗菌活性也在被深入的研究。植物抗菌肽是从植物中分离得到的，与其他生命形式的抗菌肽存在许多不同点。常见的植物抗菌肽类型包括硫堇、植物防御素、橡胶蛋白、Knottins、脂转移蛋白和Snakins。由于病原微生物对抗生素的耐药性不断增强，因此迫切需要找到可以替代传统抗生素的药剂。植物抗菌肽具有广泛的生物活性，包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、杀虫和抗癌，所以它们有希望成为治疗由病原体引起动物和人类感染的药物的候选者。植物抗菌肽发挥生物活性的机制是我们研究的重要方向，有助于找到治疗疾病的新疗法。
同时，植物抗菌肽是一类对细菌、真菌等微生物有抑制或杀灭作用的小分子多肽，它能被细菌、真菌或物理的、化学的刺激所诱导，有些抗菌肽甚至在植物体内能组成性的表达。从化学结构来看，植物抗菌肽主要包括硫堇、植物防卫素、脂转移蛋白和橡胶素类等，它们抗菌能力强，有较好的耐热性，抗菌机理独特，在农业、医药及食品等领域有着广泛的应用前景。
目前，国内外研究者大多是通过细胞培养，进一步分离所得，这种方法本身具有制备过程复杂，成本高的缺点，而且，通过细胞分离抗菌肽，并不能完全将抗菌肽成功分离出来，会造成大量的抗菌肽浪费，且最终获得的抗菌肽纯度也不高，容易导致杀菌效果降低，因此，关于如何提高抗菌肽的产量并保证其纯度仍需进一步的研究。
基于此，中国专利申请CN110105437A公开了一种分离植物抗菌肽的方法、植物抗菌肽及植物抗菌肽的用途，这种方法是通过对黑芝麻进行超声处理，并经液相色谱分离所得，虽然提高了抗菌肽的稳定性，然而，所获得的抗菌肽产量仍然不高，而且，这样提取出的抗菌肽纯度也低，影响了抗菌肽的杀菌效果。
综上所述，现有技术中普遍存在抗菌肽产量低，制备过程复杂，成本高，抗菌肽纯度低，导致杀菌效果低的缺点。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺点，本发明提供了一种提高抗菌肽产量的方法。这种方法可以显著提高抗菌肽的产量，且浓缩后抗菌肽与纤维素酶组成融合蛋白，后续容易析出，有效降低了操作难度，为抗菌肽的获得及有效应用提供了有力保障。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种提高抗菌肽产量的方法，包括如下步骤：
S1、取鲜萝卜75～100g，用捣碎器捣碎，然后用纱布过滤，除去杂质，收集滤出液，得萝卜提取液；
S2、向步骤S1所得提取液中加入促进剂及鼠尾草提取物，用玻璃棒搅拌均匀，得混合物I；
S3、向步骤S2所得混合物I中加入醋酸溶液，于超声波发生仪中进行超声处理25～30min，然后用纱布过滤，收集滤出液，得提取液；
S4、将步骤S3制得的提取液于65～75℃的条件下水浴加热15～25min，然后降低至室温25℃，离心，取上清液，得混合液I；
S5、将步骤S4所得混合液I进行透析、浓缩，得反相色谱样品，经反相高效液相色谱进一步分离，即可。
优选地，步骤S2中的促进剂由蔗糖脂肪酸酯、纤维素酶、生物素按重量比1～1.5：10～13：3～5组成。
优选地，步骤S2中的促进剂由蔗糖脂肪酸酯、纤维素酶、生物素按重量比1.3：12：4组成。
优选地，步骤S2中各成分的加入量为：促进剂0.5～0.8g，鼠尾草提取物0.3～0.5g。
优选地，步骤S3中所述醋酸溶液的体积分数为8～10％，加入量为350～450mL。
优选地，步骤S3中所述超声处理的过程为：调节超声波发生仪的功率为350～400W，频率为50kHZ，进行超声处理。
优选地，步骤S4中所述的离心过程为于9000～10000rpm的转速下，离心10～15min。
优选地，步骤S5中所述的透析时间为36～58h。
优选地，步骤S5中所述的经反相高效液相色谱进一步分离的具体过程为：
(1)将所得反相色谱样品利用反相色谱柱进行反相高效液相色谱分离，所述反相色谱柱为C4硅胶柱；
(2)分离后，用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，得洗脱样品；
(3)将步骤(2)所得洗脱样品经减压浓缩，即得。
优选地，步骤(2)所述含有三氟乙酸的双蒸水中三氟乙酸的含量为0.2～0.3％，所述含有三氟乙酸的乙腈中，三氟乙酸的含量为2～3％，乙腈的含量为97～98％。
称取获得的抗菌肽样品1mL溶于水解瓶中，过甲酸处理，加1mL盐酸于110℃的温度下水解24h，水解物经UPLC测定，发现抗菌肽为As-AFP2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
QRPSGTWSGVCGNNNACKNQCIRLEKARHG-SCNYVFPAHKCICYFPC(SEQ ID NO.1)
本发明中，在提取鲜萝卜中的抗菌肽的过程中，加入了促进剂，在提取过程中，纤维素酶与抗菌肽形成融合蛋白，这样抗菌肽就是以融合蛋白的形式被分离，同时，本发明还意外发现，促进剂中的生物素与鼠尾草提取物相互作用，可以促进融合蛋白的分离，在最终除去纤维素酶的过程中，起到良好的辅助作用，大大提高了抗菌肽的产量；将蔗糖脂肪酸酯、纤维素酶、生物素按一定的重量比混合，还有效提高了最终获得的抗菌肽纯度，大大提高了其抗菌性能。
与现有技术相比，本发明提供的提高抗菌肽产量的方法具有如下优势：
(1)本发明提供的提高抗菌肽产量的方法，加入了促进剂，在提高抗菌肽产量的同时，还有效提高了抗菌肽的纯度，提高了其抗菌性能；
(2)本发明提供的提高抗菌肽产量的方法，制备过程简单，融合蛋白中的抗菌肽容易分离；
(3)本发明提供的提高抗菌肽产量的方法，提供了一种新的从植物中提取抗菌肽的方法，有效降低了生产成本，为抗菌肽的进一步应用提供了有力保障。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
实施例1一种提高抗菌肽产量的方法
所述提高抗菌肽产量的方法，包括如下步骤：
S1、取鲜萝卜75g，用捣碎器捣碎，然后用纱布过滤，除去杂质，收集滤出液，得萝卜提取液；
S2、向步骤S1所得提取液中加入促进剂0.5g，鼠尾草提取物0.3g，用玻璃棒搅拌均匀，得混合物I；由蔗糖脂肪酸酯、纤维素酶、生物素按重量比1：10：3组成；
S3、向步骤S2所得混合物I中加入体积分数为8％醋酸溶液350mL，于超声波发生仪(功率350W，频率50KHZ)中进行超声处理25min，然后用纱布过滤，收集滤出液，得提取液；
S4、将步骤S3制得的提取液于65℃的条件下水浴加热15min，然后降低至室温25℃，于9000rpm的转速下，离心10min，取上清液，得混合液I；
S5、将步骤S4所得混合液I进行透析36h，浓缩，得反相色谱样品，经反相高效液相色谱进一步分离，即可；
所述的经反相高效液相色谱进一步分离的具体过程为：
(1)将所得反相色谱样品利用反相色谱柱进行反相高效液相色谱分离，所述反相色谱柱为C4硅胶柱；
(2)分离后，用含有含量为0.2％的三氟乙酸的双蒸水和含有2％三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，得洗脱样品；
(3)将步骤(2)所得洗脱样品经减压浓缩，即得；经检测，这种方法最终制得的抗菌肽纯度为96.1％；产量可达2718AU/mL。
实施例2一种提高抗菌肽产量的方法
所述提高抗菌肽产量的方法，包括如下步骤：
S1、取鲜萝卜100g，用捣碎器捣碎，然后用纱布过滤，除去杂质，收集滤出液，得萝卜提取液；
S2、向步骤S1所得提取液中加入促进剂0.8g，鼠尾草提取物0.5g，用玻璃棒搅拌均匀，得混合物I；所述促进剂由蔗糖脂肪酸酯、纤维素酶、生物素按重量比1.5：13：5组成；
S3、向步骤S2所得混合物I中加入体积分数为10％的醋酸溶液450mL，于超声波发生仪中(功率400W，频率50KHZ)进行超声处理30min，然后用纱布过滤，收集滤出液，得提取液；
S4、将步骤S3制得的提取液于75℃的条件下水浴加热25min，然后降低至室温25℃，于9000～10000rpm的转速下，离心15min，取上清液，得混合液I；
S5、将步骤S4所得混合液I进行透析58h，浓缩，得反相色谱样品，经反相高效液相色谱进一步分离，即可；
所述的经反相高效液相色谱进一步分离的具体过程为：
(1)将所得反相色谱样品利用反相色谱柱进行反相高效液相色谱分离，所述反相色谱柱为C4硅胶柱；
(2)分离后，用含有含量为0.3％的三氟乙酸的双蒸水和含有3％三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，得洗脱样品；
(3)将步骤(2)所得洗脱样品经减压浓缩，即得；经检测，这种方法最终制得的抗菌肽纯度为97.8％；产量可达2903AU/mL。
实施例3一种提高抗菌肽产量的方法
所述提高抗菌肽产量的方法，包括如下步骤：
S1、取鲜萝卜85g，用捣碎器捣碎，然后用纱布过滤，除去杂质，收集滤出液，得萝卜提取液；
S2、向步骤S1所得提取液中加入促进剂0.6g，鼠尾草提取物0.4g，用玻璃棒搅拌均匀，得混合物I；所述促进剂由蔗糖脂肪酸酯、纤维素酶、生物素按重量比1.3：12：4组成；
S3、向步骤S2所得混合物I中加入体积分数为9％醋酸溶液400mL，于超声波发生仪中(功率380W，频率60KHZ)进行超声处理28min，然后用纱布过滤，收集滤出液，得提取液；
S4、将步骤S3制得的提取液于70℃的条件下水浴加热20min，然后降低至室温25℃，于9500rpm的转速下离心13，取上清液，得混合液I；
S5、将步骤S4所得混合液I进行透析48h，浓缩，得反相色谱样品，经反相高效液相色谱进一步分离，即可；
所述的经反相高效液相色谱进一步分离的具体过程为：
(1)将所得反相色谱样品利用反相色谱柱进行反相高效液相色谱分离，所述反相色谱柱为C4硅胶柱；
(2)分离后，用含有含量为0.25％的三氟乙酸的双蒸水和含有2.5％三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，得洗脱样品；
(3)将步骤(2)所得洗脱样品经减压浓缩，即得；经检测，这种方法最终制得的抗菌肽纯度为99.4％；产量可达3125AU/mL。
对比例1一种抗菌肽的生产方法
所述抗菌肽的生产方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例1中不包含鼠尾草提取物；经检测，这种方法最终制得的抗菌肽纯度为72.3％；产量仅为1753AU/mL。
对比例2一种抗菌肽的生产方法
所述抗菌肽的生产方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例2中的促进剂由蔗糖脂肪酸酯、纤维素酶、生物素按重量比1：1：1组成。这种方法最终制得的抗菌肽纯度仅为65.1％；产量仅为2015AU/mL。
试验例抗菌肽杀菌试验
1.试验样品：实施例1-3及对比例1-2提供的产生抗菌肽的方法；大肠杆菌ATCC25922；金黄色葡萄球菌CVCC1882；链球菌ATCC55121；
2.试验方法：采用牛津杯法。分别用灭菌水稀释上述抗菌肽至0.5mg/mL；用培养基分别培养上述菌种浓度为1.2×106cfu/mL，向每个牛津杯中加入200μL抗菌肽，以灭菌水做阴性对照，4℃静置24h后，转入恒温培养箱，于37℃温度下培养24h，培养后用游标卡尺测定抑菌圈直径，并根据其直径大小判断抑菌活性的强弱。
3.试验结果：具体试验结果见表1。
表1不同试验样品的抑菌圈直径对比
Figure BDA0002526988840000071
由表1可知，与阴性对照组相比，本发明实施例1-3组方法获得的抗菌肽均具有显著的杀菌效果，尤其是实施例3组，对3种细菌的抑制作用均最强，故实施例3组本发明的最佳实施例；而对比例1-2组方法获得的抗菌肽杀菌效果均有一定程度的降低；尤其是对比例2组，抑菌圈直径仅在5mm左右，抑菌性大大降低。
最后应当说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 广州颜如玉生物科技有限公司
<120> 一种提高抗菌肽产量的方法
<130> 2020.5.26
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> PRT
<213> 抗菌肽As-AFP2的氨基酸序列(Amino acid sequence of antibacterialpeptide As-AFP2)
<400> 1
Gln Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn Ala
1 5 10 15
Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser Cys
20 25 30
Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys
35 40 45

Claims (10)

1.一种提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取鲜萝卜75～100g，用捣碎器捣碎，然后用纱布过滤，除去杂质，收集滤出液，得萝卜提取液；
S2、向步骤S1所得提取液中加入促进剂及鼠尾草提取物，用玻璃棒搅拌均匀，得混合物I；
S3、向步骤S2所得混合物I中加入醋酸溶液，于超声波发生仪中进行超声处理25～30min，然后用纱布过滤，收集滤出液，得提取液；
S4、将步骤S3制得的提取液于65～75℃的条件下水浴加热15～25min，然后降低至室温25℃，离心，取上清液，得混合液I；
S5、将步骤S4所得混合液I进行透析、浓缩，得反相色谱样品，经反相高效液相色谱进一步分离，即可。
2.如权利要求1所述提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，步骤S2中的促进剂由蔗糖脂肪酸酯、纤维素酶、生物素按重量比1～1.5：10～13：3～5组成。
3.如权利要求2所述提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，步骤S2中的促进剂由蔗糖脂肪酸酯、纤维素酶、生物素按重量比1.3：12：4组成。
4.如权利要求1所述提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，步骤S2中各成分的加入量为：促进剂0.5～0.8g，鼠尾草提取物0.3～0.5g。
5.如权利要求1所述提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，步骤S3中所述醋酸溶液的体积分数为8～10％，加入量为350～450mL。
6.如权利要求1所述提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，步骤S3中所述超声处理的过程为：调节超声波发生仪的功率为350～400W，频率为50kHZ，进行超声处理。
7.如权利要求1所述提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，步骤S4中所述的离心过程为于9000～10000rpm的转速下，离心10～15min。
8.如权利要求1所述提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，步骤S5中所述的透析时间为36～58h。
9.如权利要求1所述提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，步骤S5中所述的经反相高效液相色谱进一步分离的具体过程为：
(1)将所得反相色谱样品利用反相色谱柱进行反相高效液相色谱分离，所述反相色谱柱为C4硅胶柱；
(2)分离后，用含有三氟乙酸的双蒸水和含有三氟乙酸的乙腈对C4硅胶柱进行洗脱处理，得洗脱样品；
(3)将步骤(2)所得洗脱样品经减压浓缩，即得。
10.如权利要求9所述提高抗菌肽产量的方法，其特征在于，步骤(2)所述含有三氟乙酸的双蒸水中三氟乙酸的含量为0.2～0.3％，所述含有三氟乙酸的乙腈中，三氟乙酸的含量为2～3％，乙腈的含量为97～98％。
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