CN111676299A - 一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，包括以下步骤：（1）消毒；取刚产出体外的新鲜受精蛋，使用1%新洁尔灭清洗蛋壳，再用75%酒精擦拭蛋壳表明进行消毒；（2）取样；在超净台中药勺法取出新鲜受精蛋的胚盘，PBS清洗三遍，用移液枪轻轻吹匀，制备成单细胞悬液；（3）单细胞测序仪器进行上机建库；（4）对测序数据进行分析；（5）细胞亚群的鉴定。通过本发明，可以准确的鉴定胚盘中细胞的种类，与传统的测序方式不同，单细胞测序可以检测细胞之间的异质性，在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析，在相关研究中具有极高的准确性和可信度。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，属于生物技术、设计动物组织与细胞工程等领域。
背景技术
BCs（鸡囊胚细胞）作为潜在的胚胎干细胞，在胚胎发育动物模型、家禽种质资源的保存以及家禽转基因技术等方面有广阔的应用前景。并且鸡胚作为经典的胚胎生物学模型，价格低廉且容易获得，因此鸡胚胚盘细胞在动物发育模型（如细胞的起源与分化）上具有广泛的应用前景。Eyal-Giladi等将第一次卵裂到鸡胚原条形成的这段早期发育阶段分为I-XIV期，当鸡蛋刚产出体外时已发育至囊胚期，此时胚盘中有大约50000-60000个细胞，但其中的细胞种类未有详细的研究。随着技术的发展，单细胞测序技术（single cellsequencing）越来越多应用到细胞的分析研究中。单细胞测序技术是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术，它能够弥补传统高通量测序的局限性，揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。这项技术刚好可以解决这个问题。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法。
本发明的目的是这样实现的，一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）消毒；取刚产出体外的新鲜受精蛋，使用1%新洁尔灭清洗蛋壳，再用75%酒精擦拭蛋壳表明进行消毒；
（2）取样；在超净台中药勺法取出新鲜受精蛋的胚盘，PBS清洗三遍，用移液枪轻轻吹匀，制备成单细胞悬液；
（3）单细胞测序仪器进行上机建库；将单细胞悬液加入单细胞测序仪器的上样孔中，开机后单细胞悬液中每个细胞和微粒一起在仪器中会被单个油滴包裹，微粒上面有扩增所需的引物，并且每条引物以及每个油滴都有唯一的标记；随后PCR扩增后进行高通量测序，因此可以单独检测出每个细胞内所有基因的表达量；
（4）对测序数据进行分析；单个细胞的所有mRNA进行高通量测序后，软件分析细胞内所有基因的表达模式，使用seurat软件进行主成分分析降维后，利用非线性降维算法t-sne来调整数据，将多维数据降为二维空间；经过降维处理后，所有数据都映射到二维空间，空间上每个点都代表一个细胞，点之间的距离就是指平面上两个点的直线距离，其代表着细胞之间的相似性，细胞之间越相似，他们的基因的表达模式就越接近，那么平面上显示出来的点之间的距离就越近；因此点之间的距离可以决定是否属于相同的细胞类型，然后用k-means算法来把细胞聚类分群；
（5）细胞亚群的鉴定；亚群分好后，需要借助标记基因来鉴定，通过CellMarker网站来找到人和鼠早期胚胎中不同细胞类型的标记基因，从现有的早期鸡胚中不同细胞中表达的基因作为参考，通过热图展现出亚群中高表达基因的表达情况，与准备好的标记基因进行比对，鉴定出每个亚群的细胞类型。
步骤（2）中，胚盘的分离时，将受精蛋大头朝上拿住，使用镊子将蛋中间部分敲开，小心的掀去上半部分蛋壳，用药勺去除蛋黄周围的蛋清，用消毒后的剪刀沿着胚盘周围一圈剪开，置于装有PBS溶液的培养皿中，轻轻摇晃，当胚盘脱落下来后用吸管轻轻吸取到干净的装有PBS溶液的培养皿中，重复清洗三遍。
步骤（2）中，单细胞悬液的制备时，吸取3个上一步清洗好的胚盘到1.5ml的EP管中，用移液枪轻轻吹打10次，目测悬液中没有聚集的块状物，然后用40目细胞过滤筛进行过滤至干净的1.5mlEP管中。
步骤（3）中，还包括单细胞活性检测，吸取20ul制备好的单细胞悬液，加入0.4%的台盼蓝染色10分钟，显微镜下观察并且统计细胞的活性，活细胞概率需大于80%方可上机检测。
步骤（3）中，上机测序中，胚盘的单细胞悬液制备好后，加入到微流体装置的单细胞测序仪器的上样孔中，同时上样的还有一种微粒，每个微粒含有超过10 的8次方个独立的引物，它们共享相同的“PCR处理”和“细胞条形码”，但具有不同的独特分子标识符(UMI)；细胞条码只在相同微粒的所有引物中相同，但与其他珠子上的细胞条码不同，可以追溯细胞的来源；每个引物上不同的UMI允许mRNA转录物进行数字计数并识别PCR重复；一旦单细胞悬液和微粒准备就绪后，微流体装置将单个细胞与微粒一起封装在油滴中进行反应；随后通过添加试剂来破坏液滴以使油-水界面不稳定，并且收集微粒并洗涤；然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，形成称为“附着于微粒的单细胞转录组”的(STAMP)的一组珠子；然后可以通过PCR反应对带有条形码的STAMP进行扩增以进行高通量mRNA测序，以分析任何期望数量的单个细胞。
步骤（4）中，数据分析时，单个细胞的所有mRNA进行高通量测序后，软件分析细胞内所有基因的表达模式，使用seurat软件进行主成分分析降维后，利用非线性降维算法t-sne来调整数据，将多维数据降为二维空间；在二维空间里，细胞之间的基因表达情况越相似，在图中的距离也就越靠近；因此点之间的距离可以决定是否属于相同的细胞类型，然后用k-means算法来把细胞聚类分群。
本发明方法先进科学，通过本发明，提供了一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，旨在鸡胚早期（0日龄，刚产出体外）鉴定胚盘中所有的细胞种类, 为早期家禽的发育过程以及早期细胞的分化提供理论依据并为早期干细胞的进一步应用奠定基础。本方法适用于家禽早期胚盘的细胞种类鉴定，方法新颖科学，结果准确可靠。
本发明的优越性在于：
1、本发明可以准确的鉴定胚盘中细胞的种类，与传统的测序方式不同，单细胞测序可以检测细胞之间的异质性，在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析，在相关研究中具有极高的准确性和可信度。
2、本发明中的鉴定胚盘中细胞的种类方法也可以应用于其他禽类研究中，具有很好的推广应用价值。
附图说明
图1为胚盘的分离过程示意图。
图2为单细胞制备示意图。
图3为单细胞测序仪器检测过程示意图。
图4为数据可视化分析图。
具体实施方式
下面结合附图以及附图说明，对本发明做进一步说明。
一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，包括以下步骤：
（1）本例中采用如皋黄鸡进行胚盘的分离（其他家禽类均可用此方法分离），分离步骤如附图1所示。
（2）消毒：取刚产出体外的新鲜受精蛋，使用1%新洁尔灭清洗蛋壳，再用75%酒精擦拭蛋壳表明进行消毒。
（3）胚盘的分离：将受精蛋大头朝上拿住，使用镊子将蛋中间部分敲开，小心的掀去上半部分蛋壳，用药勺去除蛋黄周围的蛋清，用消毒后的剪刀沿着胚盘周围一圈剪开，置于装有PBS溶液的培养皿中，轻轻摇晃，当胚盘脱落下来后用吸管轻轻吸取到干净的装有PBS溶液的培养皿中，重复清洗三遍。
（4）单细胞悬液的制备：吸取三个上一步清洗好的胚盘到1.5ml的EP管中，用移液枪轻轻吹打10次左右，目测悬液中没有聚集的块状物，然后用40目细胞过滤筛进行过滤至干净的1.5mlEP管中。
（5）单细胞活性检测：吸取20ul制备好的单细胞悬液，加入0.4%的台盼蓝染色10分钟，显微镜下观察并且统计细胞的活性，活细胞概率需大于80%方可上机检测。其结果如附图2所示。
（6）上机测序：胚盘的单细胞悬液制备好后，加入到微流体装置的单细胞测序仪器的上样孔中，同时上样的还有一种微粒，每个微粒含有超过10 的8次方个独立的引物，它们共享相同的“PCR处理”和“细胞条形码”，但具有不同的独特分子标识符(UMI)。细胞条码只在相同微粒的所有引物中相同，但与其他珠子上的细胞条码不同，可以追溯细胞的来源。每个引物上不同的UMI允许mRNA转录物进行数字计数并识别PCR重复。一旦单细胞悬液和微粒准备就绪后，微流体装置将单个细胞与微粒一起封装在油滴中进行反应。随后通过添加试剂来破坏液滴以使油 - 水界面不稳定，并且收集微粒并洗涤。然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，形成称为“附着于微粒的单细胞转录组”的(STAMP)的一组珠子。然后可以通过PCR反应对带有条形码的STAMP进行扩增以进行高通量mRNA测序，以分析任何期望数量的单个细胞。该装置如附图3所示。
（7）数据分析：单个细胞的所有mRNA进行高通量测序后，软件分析细胞内所有基因的表达模式，使用seurat软件进行主成分分析降维后，利用非线性降维算法t-sne来调整数据，将多维数据降为二维空间。在二维空间里，细胞之间的基因表达情况越相似，在图中的距离也就越靠近。因此点之间的距离可以决定是否属于相同的细胞类型，然后用k-means算法来把细胞聚类分群。结果如附图4所示。亚群分好后，需要借助标记基因来鉴定，首先可以借助CellMarker网站来找到人和鼠早期胚胎中不同细胞类型的标记基因，还可以查阅文献，从已经报导的早期鸡胚中不同细胞中表达的基因等作为参考。通过热图展现出亚群中高表达基因的表达情况，与准备好的标记基因进行比对，鉴定出每个亚群的细胞类型。
相关器材：新鲜受精蛋、40目细胞过滤筛、培养皿、镊子、剪刀、离心管、培养瓶、台盼蓝、磷酸缓冲液（PBS）、单细胞测序仪器。
Claims (6)
1.一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）消毒；取刚产出体外的新鲜受精蛋，使用1%新洁尔灭清洗蛋壳，再用75%酒精擦拭蛋壳表明进行消毒；
（2）取样；在超净台中药勺法取出新鲜受精蛋的胚盘，PBS清洗三遍，用移液枪轻轻吹匀，制备成单细胞悬液；
（3）单细胞测序仪器进行上机建库；将单细胞悬液加入单细胞测序仪器的上样孔中，开机后单细胞悬液中每个细胞和微粒一起在仪器中会被单个油滴包裹，微粒上面有扩增所需的引物，并且每条引物以及每个油滴都有唯一的标记；随后PCR扩增后进行高通量测序，因此可以单独检测出每个细胞内所有基因的表达量；
（4）对测序数据进行分析；单个细胞的所有mRNA进行高通量测序后，软件分析细胞内所有基因的表达模式，使用seurat软件进行主成分分析降维后，利用非线性降维算法t-sne来调整数据，将多维数据降为二维空间；经过降维处理后，所有数据都映射到二维空间，空间上每个点都代表一个细胞，点之间的距离就是指平面上两个点的直线距离，其代表着细胞之间的相似性，细胞之间越相似，他们的基因的表达模式就越接近，那么平面上显示出来的点之间的距离就越近；因此点之间的距离可以决定是否属于相同的细胞类型，然后用k-means算法来把细胞聚类分群；
（5）细胞亚群的鉴定；亚群分好后，需要借助标记基因来鉴定，通过CellMarker网站来找到人和鼠早期胚胎中不同细胞类型的标记基因，从现有的早期鸡胚中不同细胞中表达的基因作为参考，通过热图展现出亚群中高表达基因的表达情况，与准备好的标记基因进行比对，鉴定出每个亚群的细胞类型。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，其特征是，步骤（2）中，胚盘的分离时，将受精蛋大头朝上拿住，使用镊子将蛋中间部分敲开，小心的掀去上半部分蛋壳，用药勺去除蛋黄周围的蛋清，用消毒后的剪刀沿着胚盘周围一圈剪开，置于装有PBS溶液的培养皿中，轻轻摇晃，当胚盘脱落下来后用吸管轻轻吸取到干净的装有PBS溶液的培养皿中，重复清洗三遍。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，其特征是，步骤（2）中，单细胞悬液的制备时，吸取3个上一步清洗好的胚盘到1.5ml的EP管中，用移液枪轻轻吹打10次，目测悬液中没有聚集的块状物，然后用40目细胞过滤筛进行过滤至干净的1.5mlEP管中。
4.根据权利要求1所述的一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，其特征是，步骤（3）中，还包括单细胞活性检测，吸取20ul制备好的单细胞悬液，加入0.4%的台盼蓝染色10分钟，显微镜下观察并且统计细胞的活性，活细胞概率需大于80%方可上机检测。
5. 根据权利要求1所述的一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，其特征是，步骤（3）中，上机测序中，胚盘的单细胞悬液制备好后，加入到微流体装置的单细胞测序仪器的上样孔中，同时上样的还有一种微粒，每个微粒含有超过10 的8次方个独立的引物，它们共享相同的“PCR处理”和“细胞条形码”，但具有不同的独特分子标识符(UMI)；细胞条码只在相同微粒的所有引物中相同，但与其他珠子上的细胞条码不同，可以追溯细胞的来源；每个引物上不同的UMI允许mRNA转录物进行数字计数并识别PCR重复；一旦单细胞悬液和微粒准备就绪后，微流体装置将单个细胞与微粒一起封装在油滴中进行反应；随后通过添加试剂来破坏液滴以使油-水界面不稳定，并且收集微粒并洗涤；然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，形成称为“附着于微粒的单细胞转录组”的(STAMP)的一组珠子；然后可以通过PCR反应对带有条形码的STAMP进行扩增以进行高通量mRNA测序，以分析任何期望数量的单个细胞。
6.根据权利要求1所述的一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，其特征是，步骤（4）中，数据分析时，单个细胞的所有mRNA进行高通量测序后，软件分析细胞内所有基因的表达模式，使用seurat软件进行主成分分析降维后，利用非线性降维算法t-sne来调整数据，将多维数据降为二维空间；在二维空间里，细胞之间的基因表达情况越相似，在图中的距离也就越靠近；因此点之间的距离可以决定是否属于相同的细胞类型，然后用k-means算法来把细胞聚类分群。
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|---|---|---|---|---|
| CN113151424A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-07-23 | 青岛大学附属医院 | 一种鉴定软骨组织中细胞种类的方法 |
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| CN110060729A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-07-26 | 广州序科码生物技术有限责任公司 | 一种基于单细胞转录组聚类结果注释细胞身份的方法 |
| CN110910950A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-03-24 | 广州竞远生物科技有限公司 | 一种联合分析单细胞scRNA-seq和scATAC-seq的流程方法 |
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2020
- 2020-07-30 CN CN202010749121.1A patent/CN111676299A/zh active Pending
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