CN111671978B - 一种基于肋软骨的3d打印生物墨水及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于肋软骨的3D打印生物墨水及其制备方法与应用，属于生物医学材料技术领域。所述3D打印生物墨水包括肋软骨粉末、可光固化水凝胶和苯基‑2,4,6‑三甲基苯甲酰基膦酸锂，采用本发明所述3D打印生物墨水通过逆向工程***和光固化3D打印技术可以成功制备人工耳廓。通过本发明制备的3D打印自体肋软骨耳廓具有高度适配的个性化，制备过程简单快捷，外形精度高，充分利于供体自体材料，极大减少肋软骨取骨量，具有良好的生物相容性和组织重构能力，在小耳畸形重建手术中具有巨大临床应用价值。

Description

一种基于肋软骨的3D打印生物墨水及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及从CT扫描图像数据到耳廓制作的逆向工程方法，尤其涉及自体肋软骨生物墨水的配制方法及其成型制造技术。
技术背景
先天性小耳畸形(Congenital microtia)是一类以重度耳廓发育不全、外耳道闭锁或狭窄、中耳畸形为主要临床特征的先天性疾病。据统计，小耳畸形的发病率在东方人群约为1/3000～1/5000，其临床症状及伴发畸形不仅引起了患儿外形以及听力等器官功能障碍，更是使患儿及其家庭产生了极大的心理负担。先天性小耳畸形通常通过耳廓重建进行治疗，由于外耳呈现复杂的三维立体结构，细微结构较多，使得耳廓再造术成为整形外科中最复杂、难度最大的手术之一。
目前针对小耳畸形的主要手术方法为自体肋软骨雕刻技术。该手术具体流程如下：首先需手术切取患耳一侧7-8肋软骨(对于肋软骨较小者可酌情加取第6肋软骨)；然后医师根据患儿发育正常耳(少部分双侧小耳畸形患儿根据父母正常发育外耳)的耳廓结构进行雕刻；最后再将雕刻完成耳廓植入患儿患侧耳部皮肤下，从而形成新的耳廓结构。
自体肋软骨雕刻手术是目前治疗小耳畸形最重要的手术方式，在国内外各大医院均有开展，但是其仍然存在诸多缺点：①该手术对医师技术要求较高，普通医师需要经过长期和大量的手术操作积累手术经验来提高耳廓雕刻技术；②雕刻外耳耳廓精度有限，与正常耳仍存在较大差距；③肋软骨雕刻手术对肋骨取骨量需求大，1-2个肋软骨通常不够，雕刻手术常会出现供体材料的浪费。
对于小耳畸形耳廓再造手术，除肋软骨雕刻外，还有使用人工材料假体置入的方法。有文献曾报道硅胶、多孔聚乙烯(Medpor)等人工合成生物材料植入重构外耳耳廓的应用，但是因为其生物相容性和较高的外露率等问题，人工合成生物材料的应用受限。
发明内容
本发明的目的是针对现有小耳畸形耳廓再造手术的不足，开发一种使用3D生物打印肋软骨材料制备外耳人工耳廓的技术。其特点是通过制备肋软骨生物墨水，然后使用3D生物打印技术获得具有软骨细胞的外耳人工耳廓结构。肋软骨材料制备生物墨水保证了材料独特的生物活性，3D生物打印能够精准构建患者个性外的外耳耳廓结构，从而满足小耳畸形耳再造手术对于耳廓个性化、结构精细和生物相容性高等多种功能的需求。本发明制备的3D打印自体肋软骨耳廓具有高度适配的个性化，制备过程简单快捷，外形精度高，充分利于供体自体材料，极大减少肋软骨取骨量，具有良好的生物相容性和组织重构能力，在小耳畸形重建手术中具有巨大临床应用价值。
本发明包含以下技术方案：
一种基于肋软骨的3D打印生物墨水，包括肋软骨粉末、可光固化水凝胶和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂。各组分均为生物相容性优异的材料，肋软骨自体材料与耳廓软骨成分相似，理化性质接近，更符合耳廓再造对于材料的需求，且硬相肋软骨粉末的加入提高了耳廓的力学性能。光固化水凝胶具有生物降解性和生物相容性。苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂作为光引发剂，在没有暴露在紫外线光下，具有一定的生物毒性，但经过充分的紫外线暴露下，这种生物光引发剂并不影响细胞活性。
作为可选方式，在上述3D打印生物墨水中，所述光引发苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂剂的浓度为0.20-0.5％(w/v)，这些光引发剂能够在紫外光的激发下充分地与可光固化水凝胶进行交联反应，很少或者几乎没有自由基和光引发剂残留，这样大大减少了光引发剂所引起的细胞毒性。
作为可选方式，在上述3D打印生物墨水中，所述可光固化水凝胶为甲基丙烯酸酐化明胶、甲基丙烯酸酐化透明质酸、甲基丙烯酸酐化丝素蛋白、甲基丙烯酸酐化壳聚糖中的一种或多种。其中，明胶为天然高分子材料胶原的水解产物，具有良好的生物相容和生物降解性，甲基丙烯酸酐化后的明胶具有相同的生物相容性和生物降解性。
作为可选方式，在上述3D打印生物墨水中，所述肋软骨粉末固含量约为30～50％，以利于打印工艺的进行，在保持较高的固含量的情况下，此固含量范围打印效果较好。
作为可选方式，在上述3D打印生物墨水中，所述肋软骨粉末为自体肋软骨粉末。肋软骨取自患者自身，具有良好的生物相容性和极的低排斥性，相比于人工合成生物材料，自体来源(即生物自体材料)材料具有明显优势，其主要表现在：(1)自体材料生物相容性好，人工合成材料置入往往存在有异物排斥、异物致癌等风险，大多无生物活性。自体材料取材自患者自身，具有良好的生物相容性和生物活性。(2)自体材料理化性质更适合组织修复重建。人体组织具有精妙的成分和结构，在漫长的进化过程中，人体为适应生理活动而优化形成了其特定的自体材料，人工合成材料往往难以达到仿生天然自体材料的理化性质和功能。
作为可选方式，在上述3D打印生物墨水中，所述肋软骨粉末粒度＜10～150μm。
作为可选方式，在上述3D打印生物墨水中，所述甲基丙烯酸酐化明胶接枝率约为60％～100％。接枝率较高的水凝胶力学性能较好。
作为可选方式，在上述3D打印生物墨水中，所述甲基丙烯酸酐化明胶水溶液浓度为5-30％(w/v)。5％是水凝胶光固化下限，超过30％含量的水凝胶活性提升不大。
本发明还提供了一种上述3D打印生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用生物粉碎机对肋软骨进行无菌粉碎得到肋软骨粉末并低温无菌保存；
(2)制备可光固化水凝胶；
(3)配制苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂溶液，并与步骤(2)所得的可光固化水凝胶在50℃～60℃下充分混合(这个范围的温度能使两种溶质充分溶解混匀)；
(4)将步骤(1)所得的肋软骨粉末和步骤(3)所得混合溶液通过混合脱泡仪进行充分混合，得到3D打印生物墨水。
作为可选方式，在上述3D打印生物墨水的制备方法中，所述步骤(2)具体为：将明胶或透明质酸或丝素蛋白或壳聚糖在60℃温度下溶碳酸盐碱性缓冲液，然后滴加甲基丙烯酸酐并剧烈搅拌，然后加入磷酸缓冲盐溶液终止反应，将产物离心取上层清液并在去离子水中透析，然后进行冷冻干燥得到多孔海绵状固体即为甲基丙烯酸酐化明胶，然后溶于去离子水中备用。
本发明还提供了一种上述3D打印生物墨水的应用，通过逆向工程***和光固化3D打印技术将其用于制备人工耳廓。
本发明还提供了一种人工耳廓，其特征在于，采用权利要求1所述的3D打印生物墨水通过光固化3D打印而成。尽管目前临床上已有肋软骨雕刻耳廓技术的广泛应用，但3D生物打印技术在个性化重构耳廓的应用上具有巨大优势和潜力，具体体现在以下几方面：(1)精准化定制：3D打印可根据患者或其家人完整的耳廓结构构建畸形耳三维模型并进行打印，精准打造个性化耳廓并用于畸形侧耳再造。(2)精细化结构：3D打印精度高，可以精细地制作外耳耳廓各个部位的精细结构，相比于人工雕刻软骨制作耳廓更加立体和精细。(3)生物3D打印耳廓可直接根据患者耳部三维重建数据进行耳廓制作，降低了医师对该手术的学习曲线，有利于小耳畸形耳廓再造手术的广泛开展。(4)通过添加辅助生物材料配置自体肋软骨打印墨水，进行小耳畸形耳廓重构制造，可以极大节约自体肋软骨的取骨量，避免常规肋软骨雕刻技术中产生雕刻余料，减少取骨量及对肋软骨形状的限制。
本发明还提供了一种上述人工耳廓的制备方法，包括以下步骤：
1)构建目标耳廓三维数字模型，以STL格式文件导出；
2)将目标耳廓三维数字模型STL格式文件导入进光固化打印机中，使用上述3D打印生物墨水，3D打印成型三维肋软骨人工耳廓。
作为可选方式，在上述人工耳廓的制备方法中，所述步骤2)中，基于光固化的切片厚度设置为50μm，每层曝光时间7-20s，进行层层叠加成型三维肋软骨人工耳廓
作为可选方式，在上述人工耳廓的制备方法中，所述3D打印技术为快速成型技术。进一步的，具体为立体光固化成型(Stereo lithographyAppearance，SLA)、数字光处理(Digital light processing，DLP)等光固化3D打印技术中的一种。
作为可选方式，在上述人工耳廓的制备方法中，所述步骤1)具体为：以小耳畸形患者的头部CT扫描图像数据作为数据源(少部分双侧小耳畸形患儿根据父母正常发育外耳耳廓结构)，结合Mimics软件提取发育正常耳廓并进行三维重建，最后导出发育正常耳廓STL格式文件。
作为可选方式，在上述人工耳廓的制备方法中，所述步骤1)具体为：将人工耳廓受体头部CT扫描获得的数据导入Mimics软件中，新建一个Mask，设置阈值范围为-960～-920，确定软组织范围，并进行3D目标重建，对该Mask进行“Crop Mask”剪裁，得出单独的目标耳廓，最后以STL格式文件导出所需的目标耳廓三维数字模型。
作为可选方式，在上述人工耳廓的制备方法中，通过CT数据重建的发育正常的目标耳廓时整体减少厚度2mm。即在使用Mimics导出STL格式三维数据后，应使用三维软件进行整体耳廓厚度减薄2mm左右，因为临床雕刻耳廓也是需要雕制小一点，加上覆盖在雕刻的耳廓表面的皮瓣的厚度才能达到和健康耳朵差不多大小。
作为可选方式，在上述人工耳廓的制备方法中，具体步骤如下：1)以小耳畸形患者或者其父母正常发育外耳耳廓CT扫描数据作为数据源，经过计算机处理得到健康耳廓STL格式文件；2)取小耳畸形患者肋软骨，并对其进行无菌生物粉碎得到肋软骨粉末；3)将肋软骨粉末与甲基丙烯酸酐化明胶、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂、去离子水按一定比例混合制备光固化生物肋软骨墨水；4)导入健康耳廓STL到光固化3D打印机并使用光固化生物肋软骨墨水打印出耳廓。
作为可选方式，在上述人工耳廓的制备方法中，采用基于逆向工程技术和光固化3D打印技术相结合，制备个性化肋软骨重构人工耳廓，具体步骤如下：
1)将人工耳廓受体头部CT扫描获得的数据导入Mimics软件中，新建一个Mask，设置阈值范围为-960～-920，确定软组织范围，并进行3D目标重建；
2)对1)中的Mask进行“Crop Mask”剪裁出单独的健康耳廓，最后以STL格式文件导出所需数字耳廓三维模型；
3)获取人工耳廓受体一定量的肋软骨，并使用生物粉碎机对肋软骨进行无菌粉碎得到肋软骨粉末并低温无菌保存；
4)将明胶在60℃温度下溶于0.25mol/L碳酸盐碱性缓冲液(0.075mol/L碳酸钠，0.175mol/L碳酸氢钠)，随后滴加一定量的甲基丙烯酸酐并剧烈搅拌，最后加一定量的磷酸缓冲盐溶液终止反应，将产物离心取上层清液并在去离子水中透析，最后进行冷冻干燥得到多孔海绵状固体即为甲基丙烯酸酐化明胶，并以一定的浓度溶于去离子水中；
5)配制一定浓度的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂作为光引发剂，并与步骤4)所得的特定浓度的甲基丙烯酸酐化明胶溶液在60℃下充分混合；
6)将步骤3)所得的肋软骨粉末和步骤5)所得的含有苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂的甲基丙烯酸酐化明胶溶液通过混合脱泡仪进行充分混合；
7)将健康耳廓STL格式文件导入进光固化打印机中，使用步骤6)所得的肋软骨生物墨水，3D打印成型三维自体肋软骨耳廓。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
(1)个性化定制与患者发育正常耳镜像的耳廓。本发明使用3D打印技术可根据患者或其家人正常的耳廓结构，镜像构建畸形耳修复体三维模型，并进行3D精确打印制造耳廓，个性化定制耳廓体用于畸形侧耳再造。
(2)精细打印重构耳廓的各级结构及形状。本发明采用逆向工程和3D打印技术相结合，逆向工程实现耳廓精确建模，3D打印实现高精度制造成型，可以精细打印重构制作外耳耳廓各个部位的精细结构及形状，相比于人工雕刻软骨制作耳廓更加立体和精细。
(3)自体材料重构耳廓具有良好的生物相容性和生物活性。本发明所采用的原材料为患者肋软骨和甲基丙烯酸酐化明胶，植入体生物相容性和生物活性好，肋软骨生物材料与耳廓软骨成分接近，理化性质类似，有利于重构耳廓的结构和生理功能。
(4)通过添加辅助生物材料配置自体肋软骨打印墨水，进行小耳畸形耳廓重构制造，可以极大节约自体肋软骨的取骨量，避免常规肋软骨雕刻技术中产生雕刻余料，减少取骨量及对肋软骨形状的限制。
(5)生物3D打印耳廓可直接根据患者耳部三维重建数据进行耳廓制作，降低了医师对该手术的学习曲线和手术时间，有利于小耳畸形耳廓再造手术的广泛开展。
附图说明：
图1为本发明所述光固化3D打印自体肋软骨重构小耳畸形耳廓制备流程图。
具体实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)肋软骨生物粉碎。
取患者第7、8肋软骨(必要时可取部分第6肋软骨)，在无菌环境下使用生物粉碎机将肋软骨粉碎，粉碎粒径以超微粉碎，成品粒度大小约为：10～30μm。
(2)配置含有光引发剂的自体肋软骨生物墨水
将20g明胶在60℃溶解于150mL的碱性缓冲盐溶液(0.075mol/L碳酸钠，0.175mol/L碳酸氢钠)中，然后将2mL甲基丙烯酸酐缓慢滴加至明胶溶液中，并在50℃下剧烈搅拌3h。反应结束后加入200mL去离子水终止反应并进行离心去上层清夜，随后将粗产物在40℃的超纯水中透析3天(透析袋截留量为12～14KDa)。随后将透析产物冷冻干燥3天得到白色多孔海绵状固体，即为甲基丙烯酸酐化明胶。取50mL磷酸缓冲盐溶液，在避光的条件下加入0.5g苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂光引发剂，并在60℃震荡充分混合，此时光引发剂浓度为0.05％(w/v)。随后取7.5g甲基丙烯酸酐化明胶加入到50mL光引发剂溶液中并在60℃下震荡充分溶解，此时甲基丙烯酸酐化明胶浓度为15％(w/v)。最后将取15g肋软骨粉末加入到含有光引发剂的甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，并通过混合脱泡仪以进行混合得到肋软骨生物墨水。
(3)逆向工程技术重建小耳畸形耳廓
将患者健康耳廓进行CT扫描，获得的数据导入Mimics软件中，新建一个Mask，设置阈值范围为-960～-920，确定软骨组织结构轮廓，在Mask进行“Crop Mask”剪裁出单独的健康耳廓，最后以STL格式文件导出所需三维数字耳廓模型，本发明所述基于逆向工程技术重建的小耳畸形耳廓，在使用Mimics建立STL格式三维数据，进一步使用三维软件进行整体耳廓厚度减薄2mm，预留耳廓表面皮瓣的厚度，以达到和健康耳朵差外形尺寸相当。最后该STL模型为重建小耳畸形耳廓。
(4)3D打印成型自体肋软骨耳廓
将步骤(3)STL.格式文件导入进光固化打印机中，使用步骤(2)所得的自体肋软骨生物墨水，3D打印成型自体肋软骨耳廓，基于光固化的切片厚度设置为50μm，每层曝光时间7s，进行层层叠加成型三维自体肋软骨耳廓。
实施例2
本实施例中，研究不同自体肋软骨生物墨水配方对耳廓成型精度和软骨重构能力的影响。首先将肋软骨生物粉碎，取患者第7、8肋软骨在无菌环境下使用生物粉碎机将肋软骨粉碎，粉碎粒径以超微粉碎，成品粒度大小约为：30～80μm。本例中的步骤及工艺参数与实施例(1)相同，不同之处在于步骤(1)中的自体肋骨生物粉碎后的粒度更大，成品粒度大小约为：30～80μm。其实施的效果在于经步骤(4)3D打印成型自体肋软骨耳廓精度分辨率比实施例1差，其成型精度排序为：实施例1＞实施例2，这是因为打印墨水的生物粉碎肋骨原料更为粗糙，但本例耳廓具有更好的软骨重构能力。
实施例3
本实施例中，研究不同自体肋软骨生物墨水配方对耳廓成型精度和软骨重构能力的影响。首先将肋软骨生物粉碎，取患者第7、8肋软骨，在无菌环境下使用生物粉碎机将肋软骨粉碎，粉碎粒径以超微粉碎，成品粒度大小约为：80～130μm。本例中的步骤及工艺参数与实施例(1)相同，不同之处在于步骤(1)中的自体肋骨生物粉碎后的粒度更大，成品粒度大小约为：80～130μm。其实施的效果在于经步骤(4)3D打印成型自体肋软骨耳廓精度分辨率比实施例2差，其成型精度排序为：实施例1＞实施例2＞实施例3，这是因为打印墨水的生物粉碎肋骨原料更为粗糙，但本例耳廓具有更好的软骨重构能力，其软骨重构耳廓能力排序为：实施例3＞实施例2＞实施例1。
实施例4
本实施例中，研究不同3D打印工艺对耳廓成型精度的影响。首先将肋软骨生物粉碎，按照实施例1的步骤配置生物墨水，本例中的其他步骤及工艺参数与实施例1相同，不同之处在于步骤(4)中的3D打印成型自体肋软骨耳廓工艺参数，基于光固化的切片厚度设置为50μm，每层曝光时间延长至10s，进行层层叠加成型三维自体肋软骨耳廓，其实施的效果在于经3D打印成型自体肋软骨耳廓精度分辨率比实施例1高，耳廓力学强度更好，这是因为延长的曝光时间提高了墨水的固化程度。
实施例5
本实施例中，研究不同3D打印工艺对耳廓成型精度的影响。首先将肋软骨生物粉碎，按照实施例1的步骤配置生物墨水，本例中的其他步骤及工艺参数与实施例4相同，不同之处在于步骤(4)中的3D打印成型自体肋软骨耳廓工艺参数，基于光固化的切片厚度设置为50μm，每层曝光时间延长至15s，进行层层叠加成型三维自体肋软骨耳廓，其实施的效果在于经3D打印成型自体肋软骨耳廓精度分辨率比实施例4高，耳廓力学强度更好，其耳廓力学强度排序为：实施例5＞实施例4＞实施例1，这是因为延长的曝光时间提高了墨水的固化程度。
实施例6
本实施例中，研究不同3D打印工艺对耳廓成型精度的影响。首先将肋软骨生物粉碎，按照实施例1的步骤配置生物墨水，本例中的其他步骤及工艺参数与实施例4相同，不同之处在于步骤(4)中的3D打印成型自体肋软骨耳廓工艺参数，基于光固化的切片厚度设置为50μm，每层曝光时间延长至20s，进行层层叠加成型三维自体肋软骨耳廓，其实施的效果在于经3D打印成型自体肋软骨耳廓精度分辨率比实施例5高，耳廓力学强度更好，其耳廓力学强度排序为：施例6＞实施例5＞实施例4＞实施例1，这是因为延长的曝光时间提高了墨水的固化程度。
以下通过实施例7-9，列举了不同3D打印工艺对耳廓软骨重构能力的影响。
实施例7
首先按照实施例1的步骤配置生物墨水，本例中的其他步骤及工艺参数与实施例4相同，不同之处在于步骤(4)中的3D打印成型自体肋软骨耳廓工艺参数，基于光固化的切片厚度设置为50μm，每层曝光时间为10s，进行层层叠加成型三维自体肋软骨耳廓，其实施的效果在于经3D打印成型自体肋软骨耳廓软骨重构能力比实施例1差，这是因为延长的曝光时间提高了成型耳廓的固化程度，降低了其软骨再生重构能力。
实施例8
首先按照实施例1的步骤配置生物墨水，本例中的其他步骤及工艺参数与实施例7相同，不同之处在于步骤(4)中的3D打印成型自体肋软骨耳廓工艺参数，基于光固化的切片厚度设置为50μm，每层曝光时间为15s，进行层层叠加成型三维自体肋软骨耳廓，其实施的效果在于经3D打印成型自体肋软骨耳廓软骨重构能力比实施例7差，这是因为延长的曝光时间提高了成型耳廓的固化程度，降低了其软骨再生重构能力。
实施例9
首先按照实施例1的步骤配置生物墨水，本例中的其他步骤及工艺参数与实施例8相同，不同之处在于步骤(4)中的3D打印成型自体肋软骨耳廓工艺参数，基于光固化的切片厚度设置为50μm，每层曝光时间为20s，进行层层叠加成型三维自体肋软骨耳廓，其实施的效果在于经3D打印成型自体肋软骨耳廓软骨重构能力比实施例8差，其耳廓力软骨再生重构能力排序为：实施例9＜实施例8＜实施例7＜实施例1，这是因为延长的曝光时间提高了成型耳廓的固化程度，降低了其软骨再生重构能力。
实施例10
参照实施例1所述方法，其不同之处在于将其中的明胶分别替换为透明质酸、丝素蛋白、壳聚糖、明胶与透明质酸的混合物。获得的三维肋软骨人工耳廓与实施例1所得产品在软骨再生重构能力、成型精度、力学性能等方面特性基本一致。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于肋软骨的3D打印生物墨水，其特征在于，包括含有软骨细胞的肋软骨粉末、可光固化水凝胶和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，所述肋软骨粉末为自体肋软骨粉末，采用所述基于肋软骨的3D打印生物墨水能够重构耳廓的结构和生理功能。
2.根据权利要求1所述的3D打印生物墨水，其特征在于，所述可光固化水凝胶为甲基丙烯酸酐化明胶、甲基丙烯酸酐化透明质酸、甲基丙烯酸酐化丝素蛋白、甲基丙烯酸酐化壳聚糖中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的3D打印生物墨水，其特征在于，所述肋软骨粉末粒度为10~150μm。
4.一种如权利要求1所述的3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）使用生物粉碎机对肋软骨进行无菌粉碎得到肋软骨粉末并低温无菌保存；
（2）制备可光固化水凝胶；
（3）配制苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂溶液，并与步骤（2）所得的可光固化水凝胶在50℃~60℃下充分混合；
（4）将步骤（1）所得的肋软骨粉末和步骤（3）所得混合溶液通过混合脱泡仪进行充分混合，得到3D打印生物墨水。
5.根据权利要求4所述的3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：将明胶或透明质酸或丝素蛋白或壳聚糖在60℃温度下溶碳酸盐碱性缓冲液，然后滴加甲基丙烯酸酐并剧烈搅拌，然后加入磷酸缓冲盐溶液终止反应，将产物离心取上层清液并在去离子水中透析，然后进行冷冻干燥得到多孔海绵状固体，然后溶于去离子水中备用。
6.一种如权利要求1所述的3D打印生物墨水的应用，其特征在于，通过逆向工程***和光固化3D打印技术将其用于制备人工耳廓。
7.一种人工耳廓，其特征在于，采用权利要求1所述的3D打印生物墨水通过光固化3D打印而成。
8.一种如权利要求7所述的人工耳廓的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建目标耳廓三维数字模型，以STL格式文件导出；
2）将目标耳廓三维数字模型STL格式文件导入进光固化打印机中，使用权利要求1所述3D打印生物墨水，3D打印成型三维肋软骨人工耳廓。
9.根据权利要求8所述的人工耳廓的制备方法，其特征在于，所述步骤1）具体为：将人工耳廓受体头部CT扫描获得的数据导入Mimics 软件中，新建一个Mask，设置阈值范围为-960~-920，确定软组织范围，并进行3D目标重建，对该Mask进行“Crop Mask”剪裁，得出单独的目标耳廓，最后以STL格式文件导出所需的目标耳廓三维数字模型。
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