CN111670067B - 用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了用于从不同生物流体中分离细胞外囊泡(EV)的方法,所述基于镍的分离方法(NBI)是快速的、可扩大规模的,并且允许在生理pH纯化尺寸上异质的EV,保持它们在溶液中的完整性和稳定性。
Description
发明领域
本发明涉及从细胞培养基或生物流体中分离细胞外囊泡的领域。
背景
细胞外囊泡(EV)是膜状颗粒,包括外泌体(80nm-200nm)、微囊泡(100 μm-600μm)和凋亡小体(800nm-5000nm)。这种分类主要基于囊泡尺寸,但是已经针对它们的生物起源提出不同的机制。在肿瘤学中,EV具有研究肿瘤微环境的调节和免疫监督以捕获从肿瘤中释放的信息和/或生物标志物的潜力或被用作治疗剂的载体的潜力。
生物学和生物医学研究越来越多地集中于EV在不同生理和病理过程中的作用。因此,到目前为止,已经提出许多用于从生物材料中分离EV 的技术,但是其中许多技术不是非常有效的或不可标准化(Théry C等人, Curr Protoc Cell Biol,2006;Gardiner C等人,Extracell Vesicles 2016)。
迄今为止报告的用于EV分离的技术在很大程度上涉及外泌体纯化,外泌体即具有在50nm和200nm之间的尺寸的较小的EV。广泛引用的技术报告如下:
-差速超速离心(Livshits等人,Sci Rep.2015);
-密度梯度离心(Van Deun等人,J Extracell Vesicles,2014;Iwai等人,JExtracell Vesicles.,2016);
-微滤(Merchant等人,Proteomics Clin Appl.2010;Grant等人,J ImmunolMethods,2011;Hyun-Kyung Woo等人,ACS Nano.2017);
-微流体(Davies等人,Lab Chip,2012;He等人,Lab Chip,2014;Kanwar 等人,LabChip,2014;Liga等人,Lab Chip,2015);
-使用合成肽(Ghosh等人,PLoS One,2014)、肝素(Balaj等人,Sci Rep. 2015)、识别膜的抗体的组合(Pugholm等人,Biomed Res Int.2015;Cao等人,Mol Cell Proteomics,2008)、蛋白(簇分化或抗原或组分)或Tim4蛋白 (Nakai等人,Sci Rep.2016)的免疫沉淀;
-基于聚合物的沉淀/分离或基于溶剂的沉淀/分离(Deregibus等人,Int J MolMed.2016;Taylor等人,Methods Mol Biol.,2011;Gallart-Palau等人,Sci Rep.2015);
-超声(Lee等人,ACS Nano 2015);
-基于柱的商业化***,包括ExoQuickTM(System Bioscience)、总外泌体分离试剂(Thermo Fisher)、miRCURYTM外泌体分离试剂盒(Exiqon)、 exoEasy(Qiagen)、Exo-spinTM(Cell Guidance)、METM试剂盒(NEP)。
由于以下事实:可选择的密度梯度离心和沉淀技术使用了干扰EV收率、组成和完整性的化学剂;免疫亲和捕获导致EV亚群的差异化分离(因此低异质性),并且由于免疫亲和捕获涉及抗体,所以其是昂贵的;排阻层析需要极大体积的生物样品,给出非常低的收率;基于柱和基于离心机的***强烈地损害EV完整性,因此超速离心,作为初级分离方法,现在被认为是最有效且广泛应用的(金标准)程序(Gardiner C等人,J ExtracellVesicles,2016;Al-Nedawi K和Read J Methods Mol Biol.2016)。
然而,即使在超速离心中也存在如下关键问题:它们涉及劳动强度(laboriousness)、待处理的重要样品体积和时间(6-12小时)、所获得的样品的纯度、所使用的仪器、操作者经验、与EV共沉降的高水平的污染物(蛋白聚集体)、由于处理时间导致的生物分子的降解(Lobb等人,J Extracell Vesicles 2015;Gardiner C等人,J ExtracellVesicles,2016)。
在现有技术状态下,已知Ni2+-官能化的固定相(诸如固定金属离子亲和层析(IMAC)、镍螯合物受体珠、Dynabead)被设计成用于纯化或识别具有组氨酸标签的重组蛋白。在这些官能化的固定相中,生产者几乎从未描述过从官能化得到的净正电荷,而是报告了在不同pH的稳定指数(非常多变),净正电荷影响溶液与具有宽范围的尺寸(从几kDa到几百kDa)的蛋白的结合效率。
本发明的目的是提供合适的官能化的固定相,以及使固定相官能化和开发固定相的相关方法,作为用于分离细胞外囊泡(EV)的新工具;所述方法必须比超速离心更快、费力更少且更有效,并且与现有方法相比呈现出另外的优点。
发明概述
本发明提供了固定相,该固定相可以由微米尺寸或纳米尺寸的磁性颗粒或非磁性颗粒组成,所述颗粒用Ni2+阳离子或Al3+阳离子官能化,并且特征在于该固定相具有在30mV和80mV之间的净正电荷,净正电荷与如下文示出的异质EV分离的效率相关。
根据本发明的固定相(例如琼脂糖珠)允许快速且有效地分离以宽范围的分散性为特征、具有在50nm和2000nm之间的尺寸范围的全部EV,因此允许捕获生物流体中的外泌体和微囊泡两者。
在一个方面中,本发明涉及用于制备如上文描述的固定相的方法,所述方法包括将未官能化的固定相悬浮于在生理pH缓冲的盐溶液中,该盐溶液包含最少15mM至最多100mM(基于固定相容量,并且为了获得下文关于异质性EV的分离示出的效率)的Ni2+盐或Al3+盐,并且在任何情况下根据所采用的固定相的容量和所获得的净正电荷而定。
在一个方面中,本发明涉及用于分离由培养基或生物流体中的真核细胞或原核细胞(细菌)分泌的EV的方法,所述方法包括使用如上文描述的用镍离子官能化的固定相。本发明的方法在下文中被称为NBI(基于镍的分离)。
此处呈现的本发明的方法的原理是基于利用与用镍离子官能化的固定相(琼脂糖、硅、磁珠等)结合的EV的电动电位(在下文中被称为ZP),来进行EV的分离和纯化。
最近发表的若干报道示出,在生理溶液PBS中,细胞外囊泡的ZP在-17mV和-35mV之间(Rupert DL等人,Biochim Biophys Acta 2017),这是中等-良好稳定性和良好分散性的指标(Correia等人,Langmuir,2004)。
根据本发明,相对于用于EV纯化的金标准技术(UC),NBI方法的优点是:
-快速:少于60分钟的应用时间;
-简单:几个程序步骤不需要使用特定的仪器;
-适应性:官能化珠的量被调整为适应起始生物材料的体积(从十分之几毫升至几升);
-效率:完整EV的高回收率;
-异质性/分散性:同时沉淀具有有限聚集现象的异质性EV(尺寸范围通常在50nm和800nm之间);
-稳定:通过NBI纯化的多分散EV比通过UC纯化的多分散EV更稳定;
-无标记物/聚合物:不存在向起始生物样品添加疏水性聚合物或在NBI 的整个程序期间不存在疏水性聚合物;
-生理pH:整个程序用在pH 7.4缓冲的盐溶液进行;
-纯度:NBI允许从富含蛋白的生物流体中选择性地纯化EV;
-组合性(combination):NBI可以与被设计成分离EV并且基于其他物理化学原理的其他***耦合,特别是为了获得来自相同的起始生物样品的具有不同尺寸的EV亚群;
-多功能性:NBI能够适用于暴露于蛋白降解酶或核酸降解酶诸如胰蛋白酶、蛋白酶K、DNA酶、不同的RNA酶的生物样品;在用NBI处理之后用荧光亲脂性探针标记生物样品的可能性;
-对于体内注射/输注用NBI纯化的细胞外囊泡的可耐受性。
在一个方面中,本发明还涉及试剂盒,该试剂盒包括:
包含如上文描述的固定相的容器。
发明详述
根据本发明的固定相优选地用镍官能化。
固定相优选地选自由以下组成的组:磁性的或非磁性的琼脂糖珠或硅珠、海藻酸盐基质、用于固定金属离子亲和层析(IMAC)的聚合物、镍螯合物受体珠、阴离子苯乙烯聚合物(如苯乙烯二乙烯基苯)或碳苯乙烯聚合物 (如石墨烯)。琼脂糖珠是特别优选的。
对于微米尺寸,我们意指从0.5μm至1000μm;对于纳米尺寸,我们意指从1nm至500nm。
本发明的方法在下文中基于具有被镍离子(即带正电荷的,因此允许在生理溶液中与带负电荷的纳米颗粒和微米颗粒结合)官能化的具有已知标称尺寸(优选地25μm-40μm)的琼脂糖珠的实施方案被描述。暴露于一定浓度的所使用的珠的镍离子的量赋予它们电化学性质,产生在30mV和80 mV之间的净正电荷,如果将珠储存在4℃的生理磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中,则至少6个月是稳定的。在PBS中充分洗涤之后,在使用固定相之前,可以将任何防腐剂诸如叠氮化钠或20%乙醇添加到储存溶液。
在生理pH的盐溶液优选地是PBS,但是可以用不干扰二价阳离子例如镍(处于过渡状态或稳定的可检测的形式)且在生理pH 7.4缓冲的任何其他缓冲溶液(Trizma碱、HEPES等)替代。包含Ni2+离子的缓冲盐溶液优选地进一步用0.2μm过滤器灭菌。
根据本发明的琼脂糖珠优选地由未官能化珠在15mM-30mM在pH 7.4的PBS中的镍盐(优选地硫酸镍或氯化镍、氧化镍,或者在用铝、硫酸铝、氯化铝、氧化铝和/或硅酸铝官能化的情况下)溶液中孵育,用0.2μm 过滤器灭菌来制备。
优选地,将珠在镍盐溶液中的混合物在室温(20℃-25℃)且在温和的轨道旋转时被孵育最少1-3分钟。
在孵育之后,珠通过离心从溶液中分离。
去除上清液,并且用优选地灭菌的缓冲盐溶液洗涤珠。优选地,洗涤可以重复2-3次,以通过悬浮、离心和去除上清液来去除痕量镍离子和残余的抗衡离子。
在洗涤之后,优选地将珠悬浮在一定体积、优选地等于珠的体积的在生理pH缓冲的盐溶液中,优选地用0.2μm过滤器灭菌,并且它们(在下文中被称为CBeads)可以储存在4℃。
如果固定相(如能够商购的)用Ni2+阳离子或Al3+阳离子官能化,则在如上文描述的官能化之前,有必要对其进行剥离(strip),所述剥离通过用补充有200mM-300mM NaCl或KCl、100mM-300mM EDTA或EGTA、300 mM-500mM咪唑的水溶液或者包含具有宽pH范围(通常在5和8之间) 的阳离子螯合剂的溶液一次或更多次洗涤,并且用双蒸馏水(18.2MΩcm-1)一次或更多次洗涤进行。
根据本发明的方法涉及使用CBeads,该CBeads可以被逐滴添加到收集在任何尺寸的管中的生物液体的表面,并在室温孵育最少30分钟,所述生物液体优选地通过在2800rcf离心细胞碎片而被澄清。以每ml样品 10μl-30μl的体积比添加CBeads,并且其过量基于在生物流体中发现的颗粒数目凭经验确定。
生物液体可以是:
-包含最多1.5%的胎牛血清(FBS)的细胞培养基,如此被用于NBI程序。如果FBS的百分比更高,则优选用pH 7.4的PBS稀释;
-细菌培养基(LB,或包含蛋白胨、糖类和/或酵母提取物);
-生理缓冲溶液;
-来自人或动物来源的液体活检样品(全血或血清或血浆、尿液、脑脊液、乳汁、唾液、组织渗出物)。即使在这种情况下,也可以用合适体积的 PBS稀释介质的粘度。
在与生物样品孵育之后,CBeads+EV通过倾析来分离。允许以300rcf 的最大速度进行弱离心以使该步骤加速,并且同时在NBI程序期间保持 EV和固定相完整性。
EV与CBeads的脱离通过添加一种溶液(从现在开始定义为洗脱液(Elution))来进行,该洗脱液在使用之前在pH 7.4的PBS中新鲜地制备,通过将包含至少2种不同螯合剂的两种溶液A和B混合获得。
所述溶液A优选地包含在pH 8.0的3mM-6mM EDTA;更优选地溶液A是补充有在pH8.0的3mM-6mM EDTA的PBS。
所述溶液B优选地包含30μM-300μM柠檬酸钠;更优选地溶液B是补充有30μM-300μM柠檬酸钠和50mM-100mM NaCl的PBS。对于溶液 A和溶液B两者,都可以使用的其他螯合剂是咪唑、DTPA、NTA、氨肟 (amidoxime)、可以与Ni2+建立共价结合和/或竞争性结合的被设计用于此目的分子或肽,并且所述分子或肽因此或多或少有效地促进EV从固定相释放的步骤。
一旦溶液A和溶液B已经混合,就添加适量的KH2PO4(当EDTA为 3.2mM,NaCl为60mM且柠檬酸钠为45μM时,添加8μl的KH2PO4)或添加适量的缓冲至生理pH 7.4且同时不干扰镍离子和/或EV的形态-生物化学性质的任何其他盐溶液。
CBeads+EV优选地与至少相同体积的洗脱溶液孵育,所述孵育优选地在20℃-37℃、优选地28℃在轨道旋转时进行最少10-20分钟。
为了从洗脱溶液+EV溶液中分离CBeads,优选的是在倾斜转子中以最小300rcf离心约1分钟。包含完整EV和多分散EV(通常分布在50nm 和2000nm之间)的上清液被转移到优选地低结合样品管中。
上文关于琼脂糖珠的描述经过明显的调整对于根据本发明的任何其他固定相是有效的。
以其所有步骤描述的上述程序能够支持进一步修改或适合包含固定相的仪器耦合装置并且允许简化或程序优化,无论所述固定相根据上文指定的生物化学条件具有何种性质,其处在稳定或流动的条件(柱、基质、过滤器等)下。
上文描述的方法与下游应用相容,所述下游应用诸如从EV提取RNA,基于抗体的EV沉淀和/或分选,通过PCR(聚合酶链式反应)及其技术变化形式扩增EV中包含或吸附的核酸,真核细胞中EV的转染,用核酸工程化EV,开发EV作为核酸、肽或药剂载体。
在一个方面中,本发明涉及试剂盒,该试剂盒包括:
包含如上文描述的固定相的容器
或可选择地,
包含由微米尺寸或纳米尺寸的磁性颗粒和非磁性颗粒组成的未官能化的固定相的容器;以及
包含Ni2+盐或Al3+盐的容器。
优选地,该试剂盒还包括:
包含在生理pH缓冲的盐溶液的容器;
各自包含不同的螯合剂的至少两个容器。
优选地,该试剂盒还包括:
包含pH调节盐溶液的至少一个容器,该pH调节盐溶液将螯合剂的混合物缓冲在生理pH。
优选地,该试剂盒还可以包括:
微型离心低结合样品管。
上文描述的试剂盒,其中优选地:
固定相由25μm-40μm琼脂糖珠组成;
镍盐为NiSO4,或铝盐为Al2O3或硅酸铝;
在生理pH缓冲的盐溶液为PBS;
当阳离子是Ni2+时,螯合剂为EDTA,或者当阳离子是Al3+时,螯合剂为镁盐诸如MgCl2或MgSO4;
当阳离子是Ni2+时,其他螯合剂为柠檬酸钠,或者当阳离子是Al3+时,其他螯合剂为钙盐诸如CaCl2或Ca3(PO4)2;
pH调节盐溶液为KH2PO4或K2HPO4。
根据以下实施方案将更好地理解本发明。
附图简述
图1-指示根据本发明的NBI从不同来源的生物材料开始来分离EV的使用者友好的方法和步骤的方案。
图2-流式细胞术分析,其示出通过超速离心或通过NBI分离的颗粒(> 0.5μm)的数目之间的比较。A)FACS Canto(BD)仪器用1μm和10μm直径的聚苯乙烯珠(F13838,LifeTechnologies)校准。B)采用NBI程序使用未官能化珠(阴性对照)捕获的颗粒的数目。C)在超速离心(56.6%)或使用用19 mM硫酸镍官能化的琼脂糖珠的NBI(58.8%)之后获得的>0.5μm颗粒(P2) 的数目。图代表两个独立实验。
图3-A)具有组氨酸标签的蛋白的纯化。在重组蛋白的15%-SDS聚丙烯酰胺凝胶在考马斯染色之后示出:M:预染的蛋白梯(pre-coloured protein ladder);1:T7p07蛋白,105kDa(2μg加载在凝胶上);2:HuR蛋白,36 kDa(300ng加载在凝胶上);3:YTHDF1蛋白,23kDa(2μg加载在凝胶上)。B)在无血清细胞培养基中进行的竞争性测定,该无血清细胞培养基富含500μg/ml大肠杆菌(E.coli)DH5α总蛋白提取物并且具有总共150μg/ml 的A中示出的重组蛋白(T7p07、HuR、YTHDF1)。在SYPRO Ruby染色或使用针对组氨酸标签的抗体的蛋白印迹之后,显现了两块平行的凝胶。 FT(流通级分(flowthrough))是暴露于NBI珠之后的介质,并且这些图使用指定的纳米孔由qNANO(iZON Science)分析产生。1X溶液允许在富含蛋白的***中最大选择性洗脱EV。C)洗脱缓冲液中超过1.5X的增加浓度的螯合剂和盐改变EV完整性。通过qNANO分析获得的图代表两个独立实验,并且数目和尺寸的减少指示损害EV的作用。
图4-A)在用在洗脱缓冲液中的2.5%多聚甲醛固定之后,通过NBI获得的EV的透射电子显微镜(TEM)采集。B)从18*106(NBI1)或9*106(NBI2) 或1%的U87细胞总细胞裂解物(TCL)中回收的EV裂解物的蛋白印迹分析。
图5-通过超速离心(UC)或NBI回收的具有181±23.8nm直径的4.2*109个脂质体的混合物。在用磷脂酰乙醇胺-罗丹明(PE-Rho,5ng/ml)脂质体染色之后,重复相同的实验。
图6-从培养在3ml无血清介质中的U87细胞分离的微囊泡,并且在(t0) 之后或在24天(t24,储存在4℃)之后立即通过UC或NBI进行分析。然后在纯化后多达52天进行重复的gNANO测量,并且使用GraphPad Prism软件v.5计算微囊泡群体相对时间t0的半衰期。
图7-使用无血清介质通过以不同密度接种在6孔板中的U87细胞测试 NBI方法的再现性,如所指示的(NBI 1、NBI 2和NBI 3)。10%超速离心血清条件(dFBS)示出与用NBI1样品获得的结果的显著重叠。图代表3个独立实验,并且总变异系数(CV)为6.1%,证明该方法优异的再现性。
图8-分离的EV作为6孔板(1ml)中细胞密度的函数揭示了培养基中不同的释放动力学。A)在24小时之后通过NBI来纯化EV,并且使细胞暴露于10ng/ml Hoechst33342,该DNA染料指示接种的细胞的数目。图像用“高含量”分析***、Harmony软件v4.1和Operetta仪器(Perkin Elmer)获得。 B)通过NBI来处理A中描述的培养基,并且用qNANO(iZON Science)测量外泌体和微囊泡的数目,在此以Log2指示。标准偏差在此处涉及3个独立实验。
图9-对如所指示的若干个肿瘤细胞系分析通过NBI分离的EV的数目和尺寸。仅SH-SY5Y细胞示出两个EV群体的释放显著减少(**P值=0.006, F=70.13,和***<0.0001,F=30.84,使用ANOVA和Bonferroni后检验)。标准偏差在此处涉及3个独立实验。
图10-还在分离由革兰氏阴性细菌释放的囊泡时证实了NBI多功能性。大肠杆菌DH5α细胞在全LB培养基中生长直至OD600=0.7。细菌通过在 4000rcf离心15min被沉淀,并且将上清液用于NBI处理。使用NP150 纳米孔和NP200纳米孔用qNANO分析颗粒,并且检测到的最大群体示出直径为92±29nm。图代表两个独立实验。
图11-从平均年龄为45岁的47名健康供体获取的血液微粒成分计数 (Bloodcorpuscular element counting)在佛罗伦萨迈耶儿童医院(Meyer Children's Hospitalof Florence)根据制造说明通过Sysmex XE-5000血液分析仪(Sysmex America,Mundelein,IL)进行。
图12-通过NBI从相同的供体血浆和血清中分离的微米颗粒(≥500nm) 的数目之间的比较。持续2分钟采集流式细胞仪事件并示出相同颗粒群体的相对百分比。
图13-A)将NBI应用于0.5ml的血浆,并且TRPS分析检测到所指示的囊泡的数目和尺寸。外泌体的数目与红细胞(RBC)相关,皮尔逊系数= 0.99。B)将在A中进行的相同分析应用于微囊泡计数,并且与血小板(PLT) 的相关性为0.98。
图14-针对已知的血小板或血球(globule)标志物的CD41a生物素化抗体和CD235a生物素化抗体分别被用于探索“EV谱系”。将通过NBI纯化的在溶液中的每个囊泡样品分成两个相等的部分,以分别与抗体或生物素 (阴性对照)孵育。在用链霉亲和素缀合的磁珠沉淀之后,溶液中剩余的囊泡以qNANO被表征。所示出的颗粒的数目被相对阴性对照归一化。*P值 <0.05;**P值<0.01;***P值<0.001。
图15-从来自47个供体的血浆的NBI纯化的囊泡提取的0.1ng-4ng RNA开始合成的20微升中两微升的cDNA。液滴数字PCR(ddPCR)与 EvaGreen化学品和以下引物一起使用:5'-CAACGAATTTGGCTACAGCA (SEQ ID No.1)和5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG(SEQ ID No.2)。在用 QuantaSoft分析软件(BIORAD)分析之后获得GAPDH mRNA的绝对拷贝数。
图16-图17-在图15中报告的GAPDH mRNA的绝对拷贝数与血小板数正相关(r=0.62)。
图18-在NBI方法中使用的缓冲溶液与液滴数字PCR(ddPCR)相容,该液滴数字PCR直接用于从SK-MEL-28黑素瘤细胞纯化的全部EV,以便定量分析包含V600E突变的特异性RNA。
图19-A)镍(正)和EV(负)之间的符号相反的电荷之间的初始结合使得 NBI和Alpha技术之间的耦合成为可能,其中镍-受体珠与生物素化抗体和链霉亲和素珠-供体组合使用,以便捕获和检测EV表面上的特异性抗原。 B)识别和定量在人血浆中循环的EV上存在的特异性抗原(CD235a、CD41a、 CD45)的实例。CD146抗原是上皮来源的细胞的标志物,其充当实验的阴性对照。
图20-用于NBI的缓冲溶液还与用于检测处于变性条件的蛋白的常规技术诸如蛋白印迹相容。
实验部分
实施例1-镍离子官能化的珠的制备
用于珠官能化的程序如下进行:
-可商购的NiNTA高效琼脂糖珠(GE Healthcare产品代码71-5027-67 或17-5268-01)作为起始珠;测量净电荷值,并且在22℃-25℃在PBS中产生从3mV至25mV的范围,如使用Malvern Zetasizer仪器检测的。
-对起始珠进行剥离,所述剥离通过用补充有200mM-300mM NaCl 或KCl、100mM-300mM EDTA或EGTA、300mM-500mM咪唑的水溶液或包含具有宽pH范围(通常在5和8之间)的阳离子螯合剂的溶液一次或更多次洗涤,并且用双蒸馏水(18.2MΩcm-1)一次或更多次洗涤进行;
-将先前进行剥离处理的、等分在50ml管中的40mg/ml起始珠(NiNTA 高效琼脂糖珠,GE Healthcare,17-5268-01,已知标称尺寸为34μm)悬浮液重悬于两倍体积(相对于珠体积)的在pH 7.4的PBS中的浓缩的19mM硫酸镍溶液中,用0.2μm注射器式过滤器灭菌。
-将硫酸镍溶液中的珠混合物在室温孵育并伴随持续两分钟的温和的轨道旋转。
-将50ml管在倾斜转子中以200rcf离心1分钟,并且收集在管的底部的珠。
-轻轻吸取上清液并丢弃,并且将三倍体积(相对于珠体积)的、用0.2μm 注射器式过滤器灭菌的pH 7.4的PBS添加到珠。
-如所描述的再次将珠离心,吸取上清液并丢弃。
-将PBS添加到珠和去除PBS的步骤被依次地另外重复两次,以去除残余的痕量硫酸根或镍离子。
-将珠重悬于相同体积(相对于珠体积)的、用0.2μm注射器式过滤器灭菌的pH 7.4的PBS中,并且将这些珠(在下文中被称为CBeads)储存在4℃。
暴露于珠的镍离子的量赋予它们电化学性质,产生在40mV和60mV 之间的净正电荷,在磷酸盐缓冲盐水(PBS)生理溶液中在室温稳定至少六个月。
实施例2-从生物样品分离EV的方法
可将CBeads逐滴添加到收集在任何尺寸的管中的生物液体(细胞碎片通过2800rcf离心澄清)的表面并以20μl/ml的体积比在室温孵育30分钟。
生物流体可以是主要包含1.5%胎牛血清(FBS)(如果FBS百分比较高,则允许用pH7.4的PBS稀释)的细胞培养基;液体活检样品(全血或血清或血浆、尿液、脑脊液、乳汁、唾液)。
从生物样品分离EV如下进行:
-将CBeads与生物样品在具有温和的轨道旋转(300rpm-600rpm)的情况下在室温孵育30分钟,在孵育结束时,将管稳定在竖直位置,以允许 CBeads重力沉降或弱离心(100rcf-400rcf)(7-15分钟)在管的底部处。
-完全吸取上清液并丢弃。
EV纯化,即将EV从珠取出,通过在使用前几分钟在pH 7.4的PBS 中制备的、由包含螯合剂的两种溶液A和B的混合物提供的溶液(从现在开始定义为洗脱液)来促进。
EV-洗脱液A:补充有最终3.2mM EDTA(pH 8.0)的PBS。
EV-洗脱液B:具有60mM NaCl、45μM柠檬酸钠的完全PBS。
一旦EV-洗脱液A缓冲液和EV-洗脱液B缓冲液被混合(获得1X洗脱溶液)后,就将8μl/ml KH2PO4添加到该洗脱溶液,然后立即进行EV洗脱。
洗脱溶液允许溶液中成分之间的离子交换,并且促进EV从琼脂糖珠的快速分离,同时保持EV的完整性、尺寸和形态。
EV纯化如下进行:
-将体积等于CBeads体积的洗脱溶液逐滴且轻轻地添加到CBeads。
-将包含CBeads+洗脱液混合物的管在具有轨道旋转(500rpm)的情况下孵育15分钟,优选地在28℃。
-将管在倾斜转子中以1800rpm离心1分钟。
将包含全部和多分散EV(通常分布在50nm和800nm之间)的上清液转移到低结合管。
实施例3–通过UC或通过NBI分离的颗粒数目(>0.5μm)的比较
应用NBI来分离从U87神经胶质瘤细胞释放的囊泡,并且具有≥0.5μm 直径的颗粒数目(如通过流式细胞术估计的)与使用差速UC获得的颗粒数目相当,不同于未官能化珠捕获少数事件(图2A)。
实施例4–对颗粒群体的分析和洗脱步骤的改进
为了分析颗粒群体并且改进允许溶液中EV富集的洗脱步骤,一起***地使用可调谐电阻脉冲传感(TRPS)与qNANO仪器。
为了评估洗脱的选择性,在富含蛋白的***中进行竞争测试,该富含蛋白的***包括具有6X组氨酸的重组蛋白,6X组氨酸是已知赋予与Ni2+最强相互作用的标签。补充有DH5α大肠杆菌细胞的原始提取物(500μg/ml) 和具有不同纯化蛋白(各自50μg/ml,T7p07,105kDa;HuR,36kDa;YTH, 23kDa,图3A)的U87细胞无血清培养基遵循缓冲液洗脱梯度进行NBI,保持1X洗脱溶液(3.2mM EDTA、45μM柠檬酸钠和60mM NaCl)作为参考。以1.5X洗脱溶液(4.8mM EDTA、90mM NaCl和67.5μM柠檬酸钠) 开始,逐步洗脱到具有最少量的HuR和YTHDF1的富含T7p07的最高分子量(MW)蛋白,如通过SDS-PAGE、Ruby SYPRO染色和使用抗His抗体的蛋白印迹所展示的(图3B)。相比之下,大部分EV用1X洗脱缓冲液洗脱,证明减少量的化学剂足以替代EV/Ni-珠相互作用,而溶液中没有镍污染,该事件需要>100mM EDTA。特别地,EV形态根据不同的洗脱缓冲液而改变,从1.5X溶液开始影响EV的尺寸和分散(图3C)。
透射电子显微镜(TEM)(20500x和87000x放大率,图4A)证实了NBI 样品中的低蛋白水平,并且指示1X溶液保留EV形态和宽分散,示出了 541±120nm的直径以及0.61±0.05的分散性指数,如通过动态光散射评估的(n=3)。将这些数据与对由少量的9*106个U87细胞得到的EV裂解物中膜缔合蛋白或内体蛋白呈阳性的蛋白印迹分析相结合(图4B),证实了NBI在异质性EV回收中的有效性。
实施例5-机械力和盐平衡在NBI程序期间的影响
为了分析机械力和盐平衡在NBI程序期间的影响,以四种不同的平均尺寸(149nm、177nm、196nm、202nm)生产类似于外泌体的脂质体,并且在用NBI处理之前,将其混合物添加在10ml DMEM培养基中(图5)。 NBI和UC两者均允许颗粒的完全回收(98.6%)。相比之下,我们观察到用磷脂酰乙醇胺-罗丹明预染色并超速离心的脂质体(PE-Rho UC)与PE-Rho NBI颗粒相比具有聚结行为(>40nm位移),这可能是由于UC产生了更大的膜损伤或弯曲。这些数据指示,NBI更好地保持EV形态并且可以与具有边缘干扰的磷脂缀合的染色结合使用。
实施例6–采用NBI分离的EV相对于UC的稳定性增加
由于生物材料经受了不同的储存条件,我们分析了在通过NBI或UC 纯化之后储存在4℃的微囊泡的转化(turnover)(图6)。在分离后24天(t24) 的UC样品中,最初分析的600nm群体被~300nm群体替代。令人惊讶地,在NBI样品中,使用相同的纳米孔仍然可检测到86%的原始EV群体(图6,中心图),并且***性微囊泡分析示出相比于来自UC的EV的7.35天,来自NBI的EV的半衰期>50天(图6,右侧)。总之,NBI保留了原始的EV 形态及其分散,导致在溶液中更好的稳定性。
实施例7–NBI方法在细胞***中的稳健性
为了评估NBI在细胞***中的稳健性,独立于以不同密度一式三份接种在6孔板上的U87细胞的培养基来纯化EV(图7)。回收的颗粒与接种的细胞的数目成比例,其中外泌体(197±26nm)和微囊泡(595±37nm)两者的总体变异系数(CV)为6.14%(对于NBI 1、NBI 2和NBI 3,n=9);我们没有观察到来自无血清培养基(NBI1)和无囊泡的超速离心(dFBS)血清的EV 之间的统计学显著的差异(P=0.459)。有趣的是,适用于小体积的快速NBI 程序允许使用较少的细胞诸如103个细胞/cm2来跟随囊泡释放(图8)。我们观察到外泌体作为细胞密度的函数的线性释放,而对于微囊泡是具有不同动力学的连贯性释放(coherentrelease),可能与不同的生物起源机制、稳定性和/或与颗粒尺寸相关的细胞介导的转换有关。
然后比较了用NBI方法从MCF-7、PC3、MDA-MB-231和SH-SY5Y 肿瘤细胞系分离的EV。在所有情况下,观察到对应尺寸的囊泡的等效分布,产生两个囊泡群体的较弱释放的SH-SY5Y细胞除外(图9)。在纯化革兰氏阴性细菌(DH5α大肠杆菌细胞)产生的囊泡时也证明了NBI的总体多功能性(general versatility),检测到92±29nm直径的群体(图10)。
实施例8–NBI对于液体活检的表现
由于EV从许多类型的血细胞中释放并且可以作为生物标志物被研究,因此评估了NBI对于来自具有已知微粒成分计数的健康供体的液体活检的表现(图11)。与血清相比,观察到血浆中的EV富集(图12),并且对47名具有45±10岁平均年龄的受试者***地进行了针对血浆(0.5ml)的NBI。如图13A中示出的,回收具有249.5±36.71nm平均尺寸的30.56±25.78*109个外泌体/ml和具有564.4±57.3nm平均尺寸的5.49±3.09*108个微囊泡 /ml,导致约55:1的外泌体/微囊泡比率。回收的外泌体的数目与红细胞计数(RBC)(皮尔逊r:0.998,P值<0.0001)、血小板(PLT,皮尔逊r:0.958) 和白细胞(WBC,皮尔逊r:0.970)相关,而皮尔逊r随着嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞的亚种的%分别下降至0.74或0.72。另一方面(图13B),微囊泡的数目与PLT(皮尔逊r:0.989,P值<0.0001)、RBC(皮尔逊r:0.976) 和WBC(皮尔逊r:0.912)的数目更好地相关,并且已经示出与嗜酸性粒细胞(皮尔逊r:0.58)或嗜碱性粒细胞(皮尔逊r:0.35)的百分比的一致性低。
使用红细胞CD235a标志物或血小板CD41a标志物对纯化的囊泡的免疫耗竭减少了溶液中外泌体或微囊泡的存在(图14),指示出估计EV在人血浆中的生理丰度的可能性。重要的是,对特异性膜蛋白的阳性可以被用于基于原始细胞类型来对不同的“EV系”排序。
最后,从47个供体EV中提取并且转化为cDNA的RNA被用于计算用于液滴数字PCR测定的GAPDH mRNA/~3*109个EV的绝对数目(图15 和图16)。mRNA拷贝数与PLT数目相关(皮尔逊r:0.623),这可能表明大量的GAPDH mRNA被包含在由PLT产生的微囊泡中(图17),浆细胞已经被认为是GAPDH的主要生产者。还用液滴数字PCR、使用EvaGreen化学品(BIO-RAD)进行了对EV包含的/EV缔合的RNA的分析,而没有预先提取核酸,而是使用直接封装在油反应液滴中的NBI纯化的EV(图18),这表明NBI方法与用于核酸的高灵敏度分析的技术所利用的下游化学反应相容。
此处呈现的NBI方法还与用于可能存在于EV表面上的抗原(蛋白)的超灵敏检测的其他技术相容。根据净正电荷(金属诸如镍或铝)和净负电荷 (诸如EV)之间的相互作用的原理,使用镍螯合的受体珠和由供体珠识别的生物素化抗体的NBI可以与AlphaScreen(Perkin Elmer)技术结合(图19A)。因此,使用图19B中示出的抗体可以直接检测到在人血浆中循环的EV,这代表NBI与Alpha技术联合的直接应用。
NBI方法允许通过蛋白印迹技术进一步验证EV缔合蛋白的存在,使用识别EV中普遍表达的蛋白的抗体的蛋白印迹的实验结果在图20中示出。
总之,NBI是用于细胞外囊泡分离的下一代手段。
材料和方法
细胞培养
U87-MG人神经胶质瘤细胞(HTB-14TM)、SH-SY5Y二成神经细胞瘤(dineuroblastoma)细胞系(CRL-2266TM)和PC-3***腺癌细胞系(CRL-1435TM)从ATCC库(美国典型培养物保藏中心)获得。而乳腺腺癌MCF7细胞系(ICLC;HTL95021)和MDA-MB-231细胞系(ICLC;HTL99004)由IRCCS Azienda OspedalieraUniversitaria San Martino- IST Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro的生物库提供。这些细胞贴壁(adherent)生长,并且除了保持在RPMI 1640培养基中培养的PC-3细胞之外,所有其他系在DMEM培养基中生长,两种培养基均添加有10%FBS (v/v)、100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA),并且在具有5%CO2的情况下在37℃孵育。为了获得含有细胞外囊泡的培养基,最初在全培养基中培养细胞,直到达到75%汇合(通常在48小时内);随后,在用PBS轻轻洗涤两次之后,将细胞在无FBS的培养基中孵育24小时。根据待进行的实验,将细胞铺在不同形式的板和烧瓶中,但是将密度保持恒定在3.2±0.2*104/cm2,除非在图例中另有描述。
在开始NBI程序之前,将收集的培养基在2800rcf离心10分钟,并且轻轻转移到新管中。对于图7中描述的实验,dFBS条件指的是NBI在含有100,000rcf超速离心的FBS的培养基上进行,所述FBS被添加至10%的浓度。然后将该培养基用PBS 1:10稀释以降低溶液粘度。
对于图9中的细胞密度实验,将U-87-MG、MDA-MB-231、SH-SY5Y、 MCF7和PC-3细胞系一式三份铺在具有以下细胞数目的6孔板中:3.4x105; 1.7x105;8.5x104;4.2x104;2.1x104和1.0x104。在全培养基中孵育48小时之后,将细胞用PBS洗涤两次,并且在无FBS的介质中孵育24小时,然后继续NBI方案。在这种情况下,在取得含有EV的培养基之后,将粘附的细胞用4%多聚甲醛固定,Hoechst 33342标记并且用PBS洗涤,之后通过定量成像***Operetta(Perkin Elmer)采集图像。以10X放大率采集图像,并且通过Harmony软件来分析每孔50个视野。然后使用qNano(IZON Science)采用可调谐电阻脉冲传感分析EV。
通过差速超速离心分离EV
在T150烧瓶(CLS430823-50EA)中培养的U87-MG细胞产生的EV根据Di(Vizio等人,Am J Pathol,2012,15:1573-84)中描述的方案(具有较小修改)通过差速超速离心来分离。简言之,在无FBS培养基中孵育24小时之后,将上清液收集在falcon管中并且在4℃以2,800rcf离心以去除细胞碎片。然后将上清液转移到超速离心管(Polyallomer Quick-Seal离心管25×89 mm,Beckman Coulter)中,并且在具有SW 32Ti转子的Optima XE-90(Beckman Coulter)仪器中在4℃以10000rcf离心30分钟。此步骤允许优先沉淀微囊泡,所述微囊泡被轻轻地重悬于已过滤的PBS中。然后,根据 Thèry C.等人(Curr Protoc CellBiol.2006,第3章:第3.22单元)中描述的方案,将收集的上清液通过0.22μm一次性过滤器(Sarstedt,Numbrecht, Germany)过滤以去除微囊泡污染物或聚集体,并且在4℃以100,000rcf离心70min以优先地沉淀外泌体。将沉淀物重悬于已过滤的PBS中。将从差速超速离心获得的EV合并,并且在TRPS分析之前,储存在-80℃或保持在4℃。
NBI试剂(优选使用):
用0.2μm一次性过滤器膜过滤的PBS(ThermoFisher,10010023)(在整个NBI方案中使用)
NiSO4[0.1M](Sigma,656895)
NaCl[5M](Sigma,450006)
柠檬酸钠[0.2M](Sigma,C8532)
EDTA[0.5]M(ThermoFisher,UltraPure pH 8.0,15575020)
KH2PO4[1M](Sigma,P9791)
剥离缓冲液:PBS+0.5M NaCl、50mM EDTA pH 8.0
EV-洗脱液A:用具有终浓度为3.2mM EDTA(pH 8.0)的PBS至一定体积
EV-洗脱液B:用具有60mM NaCl、45μM柠檬酸钠的PBS至一定体积。
在混合EV-洗脱缓冲液A和EV-洗脱缓冲液B(1X洗脱溶液)之后,在进行EV洗脱之前,将8μl/ml KH2PO4添加到1X溶液。
微囊泡的流式细胞术分析
将来自差速超速离心或来自NBI的囊泡在0.22μm过滤的PBS中稀释。背景信号基于过滤的PBS的采集值来设置,并且校正光散射阈值以允许具有每秒≤5个事件的事件采集速率。
光散射检测以对数标度设置,分配给前向散射和侧向散射的电压分别为300V和310V,并且两个信号的阈值都被设置在200。采集在低流速进行,并且将样品小心地稀释以避免群集效应(swarm effect)和事件同时发生 (coincidence)。标准的1μm和10μm聚苯乙烯珠(Invitrogen)被用于设置针对微囊泡的门限(gate)。在可能的情况下,对于每个样品的分析计数10,000 个事件,基于时间采集,记录至少1分钟的采集。样品采集用FACS Canto流式细胞仪(BD Biosciences)进行,并且数据使用BD Diva(BD Biosciences) 软件来分析。
TRPS(可调谐电阻脉冲传感)
EV尺寸和浓度通过TRPS使用qNano(IZON Science)工具来表征。除非对于6孔板实验(图9、图3C和图8)或其中颗粒速率低于100个颗粒/min 的样品的情况,其中分析至少2分钟的记录,否则对于每个样品计数平均 500个颗粒。NP200纳米孔(A40948,A43545,A43667,A43667)、NP400 (A43592,A44117,A44116)、NP800(A40542,A36164,A40548,A44118)和N1000(A40572)的使用具有I 45.5mm和I 47mm之间的伸展度(stretch)。将电压设置在0.12V-0.68V之间,以保持在95nA-130nA范围内的稳定的电流强度,低于7pA-12pA的背景噪声和线性颗粒计数率。分别具有114 nm、210nm、500nm、710nm和940nm平均直径的校准颗粒CPC100B(批次ID:B8748N)、CPC200B(批次ID:B6481M)、CPC500E(批次ID:659543B)、CPC800E(批次ID:634561B)和CPC1000F(批次ID:669582B)通过iZON Science购买。所有与qNANO分析相关的数据被记录并通过Izon Control Suite v.3软件来分析。
透射电子显微镜术(TEM)
囊泡使用透射电子显微镜(TEM)来可视化。简言之,将固定在具有2.5%甲醛的洗脱缓冲液中的每个EV样品的5μl等分试样置于涂覆有薄碳膜的 300平方目铜和镍的网格上。然后将网格用pH 4.5的1%乙酸双氧铀缓冲液阴性标记,并且使用配备有OlympusMorada相机的100kV TEM FEI Tecnai G2 Spirit显微镜来观察(使用的放大率:20500x和87000x)。
随后使用抗CD63抗体(Abcam,ab193349)、抗Flotillin-1(BD Biosciences,610821)和抗Alix(Cell Signaling Technology,#2171)进行蛋白印迹分析。
竞争性测定
EV洗脱步骤通过竞争性测定来测试,其中将来自DH5α大肠杆菌的 30μg/ml蛋白提取物和用组氨酸加标签的、纯化的15μg/ml重组蛋白(T7 RNA聚合酶,110kDa;HuR,36kDa;YTH,23kDa)添加到含有从U87-MG 细胞得到的EV的10ml介质中。简言之,将DH5α细胞保持培养在LB培养基中,直到达到0.5的OD600,并且通过在6000rcf离心5min来收集。将沉淀物重悬于3mL DMEM培养基+1μg/ml溶菌酶中,并且在4℃在恒温浴中进行7个循环(40超声振幅,7秒开启,10秒关闭)的声处理。裂解物通过在13,000rcf离心20min来澄清,并且然后在添加到含有EV的培养基之前用0.2μm一次性过滤器膜过滤。用组氨酸T7 RNA聚合酶加标签的重组蛋白由S.Mansy博士的实验室(CIBIO,University of Trento)友情提供;重组蛋白HuR(D'Agostino等人,PLoS One,2013年8月12日,8(8): e72426)和YTH(Xu等人,J BiolChem.2015年10月9日,290:24902-13)如参考文献中描述的产生和纯化。
遵循已经描述的孵育时间和试剂进行NBI,图3B中指示的洗脱梯度溶液除外。遵循对应的方案说明,使用Bicinchoninic Acid测定(BCA)和 Bradford测定来对蛋白样品定量。将等体积的洗脱物加载到12% SDS-PAGE上,并且进行Sypro Ruby染色或使用1:1000稀释的抗组氨酸一级抗体(ab1187)进行蛋白印迹。
鉴于样品的异质性,使用NP800、NP400和NP200纳米孔,通过TRPS 分析回收的颗粒的数目和尺寸。
从革兰氏阴性细菌分离EV
将DH5α大肠杆菌细胞培养在全LB培养基中,直到OD600达到0.7。将细胞在4,000rcf沉淀15min,并且收集上清液以根据NBI方案进行处理。通过qNANO仪器使用NP150纳米孔和NP200纳米孔来对颗粒计数。
脂质体制备
脂质体脂质组成是:20%磷脂酰胆碱摩尔数、10%磷脂酰乙醇胺摩尔数、15%油酰基磷脂酰丝氨酸(oleophosphatidylserine)摩尔数、15%鞘磷脂摩尔数、40%胆固醇(Llorente等人Biochim,Biophys,Acta 2013,1831: 1302-9;Haraszti等人,J.Extracell,Vesicles 2016,5:32570)摩尔数,该脂质体脂质组成具有与真核生物囊泡的脂质组成相似的脂质组成。通过旋转蒸发仪仪器去除脂质溶液中的有机溶剂(例如氯仿)并且真空干燥至少1小时来创建脂质膜。将1mg/mL最终浓度的脂质重悬于DPBS中,并且用涡旋器剧烈搅拌以形成多层脂质体,该多层脂质体被进一步暴露于6次冻融循环。最终的脂质体形态通过使用双注射器挤出机(LiposoFast Basic Unit, Avestin Inc.)挤出多层脂质体的悬浮液来获得。31个步骤通过具有不同尺寸的孔的2个叠层(stacked)聚碳酸酯过滤器(Millipore)进行,以获得不同尺寸的囊泡(MacDonald等人Biochim Biophys,Acta 1991,1061:297-303),随后用Zeta Sizer仪器(Nano-ZS,Malvern Instruments)通过光子相关光谱来验证。
血液样品
在迈耶儿童大学医院(Meyer Children's University Hospital)收集来自健康供体的全血样品。将血浆样品收集在可商购的经EDTA处理的管中,并且然后按照冷链从医院生物库运输到研究实验室。在样品分析之前获得供体的知情同意。
血浆通过在使用冷冻离心机(4℃)(Eppendorf 5702R,Milan,Italy)在 2,000rcf离心10分钟之后去除细胞来获得。血清样品通过允许血液凝固、使其不受干扰地在室温下持续30分钟来获得。凝固物通过使用冷冻离心机(4℃)(Eppendorf 5702R,Milan,Italy)在2000rcf离心来去除。用Sysmex XE-5000流式细胞仪(Sysmex America,Mundelein,IL)分析全血计数。分析程序根据方案说明书进行。
通过NBI纯化的囊泡的免疫耗竭分别使用生物素化抗CD235a抗体 (MiltenylBiotec,130-100-271)和生物素化抗CD41a抗体(Miltenyl Biotec, 130-105-608)以及链霉亲和素珠(ThermoFisher,11205D)进行。在珠的沉淀之后用qNano分析囊泡,并且将其相对于具有定量等同的生物素(Sigma, B4501)的相应的对照样品中的颗粒数目归一化。
RNA提取
遵循附有一些修改的说明书,使用QIAzol试剂(QIAGEN)提取总RNA。简言之,在EV洗脱步骤之前,将100μl QIAzol直接添加到珠,随后用涡旋器搅拌并且在室温孵育5分钟。然后添加20μl氯仿。在剧烈混合15秒之后,将样品在室温孵育3分钟。通过在4℃以12,000rcf离心15分钟来使相分离,并且排出水相。在添加1μl糖原(20mg/ml)和100μl异丙醇之后,使RNA在-80℃过夜沉淀。在以12,000rcf离心10min之后,将RNA 沉淀物用75%乙醇洗涤,如上文描述的进行离心,并且重悬于10μl无RNA 酶的水中。遵循方案说明书,使用Bioanalyzer RNA 6000 Pico试剂盒 (Agilent Technologies)来定量RNA。
逆转录反应和液滴数字PCR
逆转录反应使用miRCURY LNA通用RT微RNA PCR试剂盒、通用 cDNA合成试剂盒II(Exiqon),遵循具有以下反应组成的方案说明书来进行: 2.3μl 5X反应缓冲液、1.15μl酶混合物、0.5μl合成RNA掺入物(spike-in) 和7.5μl模板总RNA。使用EvaGreen化学品和以下引物使用QX200TM Droplet DigitalTM PCR***(BioRad)来定量GAPDH mRNA: 5'-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3'(SEQ ID No.1)和 5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3'(SEQ IDNo.2)。
AlphaScreen测定
反应在20μl最终体积的384-Optiplate(Perkin Elmer)中进行。使用15 μg/ml镍螯合物受体珠和10μg/ml链霉亲和素-供体珠在PBS中优化测定,抗体被系列稀释以鉴定附着点。在用先前通过TRPS表征的EV系列稀释液的剂量-响应谱中分析表面标志物的存在。通过NBI从健康供体血浆或无血清肿瘤细胞样品中纯化EV。在室温在黑暗中孵育90分钟之后,最终能够通过Enspire仪器(Perkin Elmer)检测到荧光信号。
统计分析
独立实验的数据和数目在图的相关插图说明中指出。Anova、t-检验和皮尔逊r系数通过使用GraphPad Prism v5.1软件来计算,并且当P值<0.05 (*)、<0.01(**)、<0.001(***)时,结果被认为是统计学上显著的。
序列表
<110> 特伦托大学
<120> 用于从生物材料中分离细胞外囊泡的方法和固定相
<130> P019950WO
<150> IT102017000146281
<151> 2017-12-19
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
caacgaattt ggctacagca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
aggggtctac atggcaactg 20
Claims (42)
1.一种用于分离由生物液体中的真核细胞或原核细胞分泌的细胞外囊泡(EV)的方法,所述方法包括使用固定相,所述固定相用选自由镍和铝组成的组的阳离子官能化,并且特征在于所述固定相具有在30mV和80mV之间的净正电荷;所述固定相由微米尺寸或纳米尺寸的磁性颗粒或非磁性颗粒组成。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述固定相选自由以下组成的组:磁性或非磁性的琼脂糖珠或硅珠、海藻酸盐基质、用于固定金属离子亲和层析(IMAC)的聚合物、镍螯合物受体珠、阴离子苯乙烯聚合物或碳苯乙烯聚合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法,如果以微米尺寸计,则颗粒具有25μm-40μm的平均尺寸。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述固定相被逐滴添加到生物液体的表面。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述固定相被逐滴添加到生物液体的表面。
6.根据权利要求1-2和5中任一项所述的方法,其中将珠在生物液体中孵育之后,通过温和的离心和倾析来分离所述珠。
7.根据权利要求3所述的方法,其中将珠在生物液体中孵育之后,通过温和的离心和倾析来分离所述珠。
8.根据权利要求4所述的方法,其中将珠在生物液体中孵育之后,通过温和的离心和倾析来分离所述珠。
9.根据权利要求1-2、5和7-8中任一项所述的方法,其中通过在至少等体积的洗脱溶液中孵育来从所述固定相中取出EV,所述洗脱溶液在使用前几分钟通过将在生理pH的、包含至少两种不同的螯合剂的两种盐溶液混合来制备。
10.根据权利要求3所述的方法,其中通过在至少等体积的洗脱溶液中孵育来从所述固定相中取出EV,所述洗脱溶液在使用前几分钟通过将在生理pH的、包含至少两种不同的螯合剂的两种盐溶液混合来制备。
11.根据权利要求4所述的方法,其中通过在至少等体积的洗脱溶液中孵育来从所述固定相中取出EV,所述洗脱溶液在使用前几分钟通过将在生理pH的、包含至少两种不同的螯合剂的两种盐溶液混合来制备。
12.根据权利要求6所述的方法,其中通过在至少等体积的洗脱溶液中孵育来从所述固定相中取出EV,所述洗脱溶液在使用前几分钟通过将在生理pH的、包含至少两种不同的螯合剂的两种盐溶液混合来制备。
13.根据权利要求9所述的方法,其中所述螯合剂选自由EDTA和柠檬酸钠组成的组。
14.根据权利要求10-12中任一项所述的方法,其中所述螯合剂选自由EDTA和柠檬酸钠组成的组。
15.根据权利要求9所述的方法,其中在最终的洗脱溶液中,EDTA具有3mM-6mM的浓度,并且柠檬酸钠具有1μM-300μM的浓度。
16.根据权利要求10-12中任一项所述的方法,其中在最终的洗脱溶液中,EDTA具有3mM-6mM的浓度,并且柠檬酸钠具有1μM-300μM的浓度。
17.根据权利要求7-8和10-13中任一项所述的方法,其中与洗脱溶液孵育在轨道旋转下在20℃-37℃被保持。
18.根据权利要求6所述的方法,其中与洗脱溶液孵育在轨道旋转下在20℃-37℃被保持。
19.根据权利要求9所述的方法,其中与洗脱溶液孵育在轨道旋转下在20℃-37℃被保持。
20.根据权利要求14所述的方法,其中与洗脱溶液孵育在轨道旋转下在20℃-37℃被保持。
21.根据权利要求1-2、5、7-8、10-13、15和18-20中任一项所述的方法,其中所述生物液体选自由以下组成的组:细胞培养基、生理缓冲溶液、细菌培养基、人-动物血液、人-动物组织渗出物。
22.根据权利要求3所述的方法,其中所述生物液体选自由以下组成的组:细胞培养基、生理缓冲溶液、细菌培养基、人-动物血液、人-动物组织渗出物。
23.根据权利要求4所述的方法,其中所述生物液体选自由以下组成的组:细胞培养基、生理缓冲溶液、细菌培养基、人-动物血液、人-动物组织渗出物。
24.根据权利要求6所述的方法,其中所述生物液体选自由以下组成的组:细胞培养基、生理缓冲溶液、细菌培养基、人-动物血液、人-动物组织渗出物。
25.根据权利要求9所述的方法,其中所述生物液体选自由以下组成的组:细胞培养基、生理缓冲溶液、细菌培养基、人-动物血液、人-动物组织渗出物。
26.根据权利要求14所述的方法,其中所述生物液体选自由以下组成的组:细胞培养基、生理缓冲溶液、细菌培养基、人-动物血液、人-动物组织渗出物。
27.根据权利要求16所述的方法,其中所述生物液体选自由以下组成的组:细胞培养基、生理缓冲溶液、细菌培养基、人-动物血液、人-动物组织渗出物。
28.根据权利要求17所述的方法,其中所述生物液体选自由以下组成的组:细胞培养基、生理缓冲溶液、细菌培养基、人-动物血液、人-动物组织渗出物。
29.根据权利要求1-2、5、7-8、10-13、15、18-20和22-28中任一项所述的方法,其中然后对所分离的EV进行用于从EV中提取蛋白和核酸的方案、联合特异性抗体的抗原检测技术、通过聚合酶链式反应(PCR)对囊泡缔合的和/或囊泡包含的核酸的检测和定量。
30.根据权利要求3所述的方法,其中然后对所分离的EV进行用于从EV中提取蛋白和核酸的方案、联合特异性抗体的抗原检测技术、通过聚合酶链式反应(PCR)对囊泡缔合的和/或囊泡包含的核酸的检测和定量。
31.根据权利要求4所述的方法,其中然后对所分离的EV进行用于从EV中提取蛋白和核酸的方案、联合特异性抗体的抗原检测技术、通过聚合酶链式反应(PCR)对囊泡缔合的和/或囊泡包含的核酸的检测和定量。
32.根据权利要求6所述的方法,其中然后对所分离的EV进行用于从EV中提取蛋白和核酸的方案、联合特异性抗体的抗原检测技术、通过聚合酶链式反应(PCR)对囊泡缔合的和/或囊泡包含的核酸的检测和定量。
33.根据权利要求9所述的方法,其中然后对所分离的EV进行用于从EV中提取蛋白和核酸的方案、联合特异性抗体的抗原检测技术、通过聚合酶链式反应(PCR)对囊泡缔合的和/或囊泡包含的核酸的检测和定量。
34.根据权利要求14所述的方法,其中然后对所分离的EV进行用于从EV中提取蛋白和核酸的方案、联合特异性抗体的抗原检测技术、通过聚合酶链式反应(PCR)对囊泡缔合的和/或囊泡包含的核酸的检测和定量。
35.根据权利要求16所述的方法,其中然后对所分离的EV进行用于从EV中提取蛋白和核酸的方案、联合特异性抗体的抗原检测技术、通过聚合酶链式反应(PCR)对囊泡缔合的和/或囊泡包含的核酸的检测和定量。
36.根据权利要求17所述的方法,其中然后对所分离的EV进行用于从EV中提取蛋白和核酸的方案、联合特异性抗体的抗原检测技术、通过聚合酶链式反应(PCR)对囊泡缔合的和/或囊泡包含的核酸的检测和定量。
37.根据权利要求21所述的方法,其中然后对所分离的EV进行用于从EV中提取蛋白和核酸的方案、联合特异性抗体的抗原检测技术、通过聚合酶链式反应(PCR)对囊泡缔合的和/或囊泡包含的核酸的检测和定量。
38.根据权利要求29所述的方法,其中所述核酸是DNA或RNA。
39.根据权利要求30-37中任一项所述的方法,其中所述核酸是DNA或RNA。
40.根据权利要求29所述的方法,其中所述聚合酶链式反应(PCR)是液滴数字PCR。
41.根据权利要求39所述的方法,其中所述聚合酶链式反应(PCR)是液滴数字PCR。
42.根据权利要求30-38中任一项所述的方法,其中所述聚合酶链式反应(PCR)是液滴数字PCR。
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