CN111647586A - 一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法 - Google Patents

一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明中提供了一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，属于分离提取技术领域。包括以下步骤：(1)、制备尿激酶溶液；(2)、制备尿激酶冻干粉；在尿激酶制备过程中使用D6246树脂袋吸附尿液中尿激酶无需对尿液进行其他处理，然后将树脂袋装入层析柱中，洗脱即可得到尿激酶，在实施过程中通过控制洗脱缓冲液为体积比为1：1‑2的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液的混合溶液以及控制上样量与柱体积的比为20‑50：1，能够更好的分离尿激酶，使液体尿激酶的收率可达到75‑88％，冻干后尿激酶的收率可达到70‑80％，纯度可达到25％以上。

Description

一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法
技术领域
本发明属于分离提取技术领域，具体涉及一种使用D6246树脂直接吸附尿液中尿激酶的方法。
背景技术
尿激酶是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人体及哺乳动物的尿液中，血液凝固时人体的正常机能，但是某些病理状态下，在血管内形成血酸，堵塞血液流通时就会造成严重后果，尿激酶是溶血栓药物，但它并不直接用于血块本身，而是首先激活体内的纤溶酶脘，成为有活性的纤溶酶，纤溶酶作用于纤维蛋白酶凝块，使其分解成可溶性多碳。
尿激酶是一种专一性很强的蛋白水解酶，也具有酯酶活力，无抗原性，无毒性和其他副作用，可临床用于肺血栓、冠心病、脑血栓、心肌梗塞、玻璃体浑浊、眼底出血、颅内出血、静脉栓塞以及急(慢)性肾小球肾炎等疾病的治疗，还可以用于治疗纤维蛋白沉着引起的疾病，并可用于作抗癌的辅助药物。
由于尿激酶有着重要的医药价值，所以相继有很多专刊报道了尿激酶粗品的提取方法，因人体尿液中尿激酶含量很低，取尿激酶的主要关键就是如何从大量的尿液中富集尿激酶，从目前公开的文献来看，主要有三类方法：(1)、发泡法：即以高速搅拌使酶液发泡，然后使泡沫液化，加入硫酸铵使尿激酶沉淀；(2)、沉淀剂法：在尿液中加入沉淀剂，使尿激酶沉淀，尿激酶则保留在沉淀中；(3)、吸附剂，此法应用最多，选择适当的吸附剂，有选择的吸附尿激酶。
如中国专利申请201611077802.8中公开了一种提高尿激酶收率的方法。该方法利用尿激酶蛋白质在等电点溶解度最低的特性，通过调节尿液PH值，然后加入甲壳质吸附、过滤、洗脱、离心、沉淀、干燥步骤来实现从尿液中提取尿激酶。但是在吸附过程中尿激酶也会被洗附，因此会造成尿激酶的损失，从而降低尿激酶的产率。
再如，中国专利申请201510549397.1中公开了一种直接在小便池或便斗中用装改性硅胶的滤布袋吸附尿液中的尿蛋白，并将吸附尿蛋白的滤布袋运至加工点进行后续处理的尿蛋白富集方法。该方法利用特定尿蛋白的等电点性质，通过使用包括改性硅胶,大孔树脂，甲壳素，离子树脂等；对尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接有效吸附，避免了尿液的收集步骤。但是最终得到的冻干粉的活性为4.12×105IU，不能满足要求。
由于社会对环境保护越来越重视，尿蛋白的收集越来越困难，因此提高尿液中尿蛋白的提取率应该成为重点关注的问题之一，因此亟需开发一种提高尿激酶收率的方法。
发明内容
为了解决现有技术中面临的问题，本发明旨在提供一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，该方法可以明显提高尿激酶的收率，提高尿激酶的含量。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，包括以下步骤：
(1)、制备尿激酶溶液；
(2)、制备尿激酶冻干粉；
上述步骤(1)的具体步骤为：
a、收集尿液，在5-8℃，pH＝7.0-8.0条件下，静置1-2小时，弃去沉淀，得上清液；
b、将树脂袋放入过滤瓶中，然后将步骤a中得到的上清液装入树脂袋中，过滤，待尿液全部流出后，取出装有滤渣的树脂袋；
c、将步骤b中得到的装有滤渣的树脂袋装入层析柱中，进行洗涤，然后洗脱，得到洗脱液，即为尿激酶溶液。
上述步骤(2)的具体步骤为：
将步骤c中得到的尿激酶溶液放入冻干机中，在-45-50度条件下冷冻2-3小时，然后升温，待样品升温到室温，并保持2-3小时，即可取出得到尿激酶粗品冷冻粉。
上述步骤c中还包括以下步骤：
c1)、装柱：将凝胶介质混匀后，取适量混匀的凝胶填于层析柱，用3-5倍的缓冲溶液洗涤凝胶；
c2)、平衡介质：用5-10倍柱体积的样品缓冲液平衡凝胶柱；
c3)上样：将装有滤渣的树脂袋装入层析柱中；
c4)收集洗脱液，即为尿激酶溶液。
优选地，
上述步骤a)中用3倍体积的缓冲溶液进行洗涤，缓冲溶液为0.3M磷酸缓冲液，pH为3.0。
优选地，
上述步骤c2)中平衡介质步骤中使用的缓冲液为磷酸盐、醋酸盐和柠檬酸盐缓冲溶液中的一种，平衡时流速为90-120cm/h。
再优选地，所述的平衡时流速为100-110cm/h。
优选地，
上述步骤c3)中所述的上样步骤中上样量与柱体积的比为20-50：1，上样流速为60-90cm/h。
再优选地，
上述步骤c3)中所述的上样步骤中上样量与柱体积的比为35：1，上样流速为80cm/h。
优选地，
上述步骤c4)中所述的洗脱的洗脱液为2-3倍体积的含氯化钠的缓冲液；
所述的缓冲液为体积比为1：1-2的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液的混合溶液，缓冲液的pH值为6.0-8.0。
再优选地，
所述的缓冲液为体积比为1：2的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液的混合溶液，缓冲液的pH值为7.0。
所述的氯化钠的浓度为0.1-1mol/L。
进一步优选地，
上述步骤c1)中所述的层析柱为TSK-gei G3000SW凝胶色谱柱，规格为7.5mmI.D.x60cm，10um。
更进一步优选地，
所述的凝胶填料为D6246/Purolite、SP sepharose BB/GE、Capto S/GE和SPSeplife FF/蓝晓中的一种。
再进一步优选地，
所述的树脂袋为D6246树脂袋，D6246树脂的购买厂家为Purolite。
所述的D6246树脂袋的制备方法为：首先在两层无纺布中间夹一层再生纤维素，然后将夹有纤维素的双层无纺布制成袋子，将D6246树脂装入双层透水无纺布制备的袋子中，双层透水无纺布设计是为了确保树脂***漏，填充在两层无纺布中间的再生纤维素是为了有效截留尿液中的颗粒物，防止堵塞树脂；所述的树脂袋的尺寸为10cmX10cmX3cm。
在使用过程中D6246树脂与尿液的体积比为30mL：500-800L。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的吸附尿液中尿激酶的方法无需对尿液进行处理，直接使尿液穿过D6246树脂袋，然后将树脂袋铺平按压紧密装入层析柱中，洗脱即可得到尿激酶，操作简单，并且可以减少尿激酶的损失；
(2)本发明在实施过程中通过洗脱过程中的缓冲液种类以及控制上样量与柱体积的比例，能够使尿激酶更好的分离，从而得到纯度较高的尿激酶，收集得到的尿激酶的纯度为25％以上；
(3)本发明使用树脂袋进行尿激酶的收集提取，可以有效提高尿激酶的含量，液体尿激酶的收率可达到75-88％，冻干后尿激酶的收率可达到70-80％。
附图说明
图1为实施例2中所述的D6246树脂液体尿激酶解脱液图谱；
图2为实施例2中所述的D6246树脂解析液冻干后图谱。
具体实施方式
实施例1一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法
包括以下步骤：
(1)、制备尿激酶溶液；
a、收集尿液，在5℃，pH＝7.0条件下，静置2小时，弃去沉淀，得上清液；
b、将D6246树脂袋放入过滤瓶中，然后将步骤a中得到的上清液装入D6246树脂袋中，过滤，待尿液全部流出后，取出装有滤渣的D6246树脂袋；
c、将步骤b中得到的装有滤渣的D6246树脂袋装入层析柱中，进行洗涤，然后洗脱，得到洗脱液，即为尿激酶溶液。
c1)、装柱：将凝胶介质混匀后，取适量混匀的凝胶填于层析柱，用3倍的pH＝3.0，0.3M的磷酸盐缓冲溶液洗涤凝胶；
c2)、平衡介质：用5倍柱体积的0.3M磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱，平衡时流速为90cm/h；
c3)上样：将装有滤渣的树脂袋铺平按压紧密装入层析柱中，上样量与柱体积的比为20：1，上样流速为60cm/h；
c4)洗脱：使用2倍体积的含0.1mol/L氯化钠的pH值为5.0，体积比为1：1的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，即为尿激酶溶液。
步骤c1)中所述的层析柱为TSK-gei G3000SW凝胶色谱柱，规格为7.5mmI.D.x60cm，10um。
所述的凝胶填料为D6246/Purolite。
(2)、制备尿激酶冻干粉；
将步骤c4中得到的尿激酶溶液放入冻干机中，在-45度条件下冷冻3小时，然后升温，待样品升温到室温，并保持3小时，即可取出得到尿激酶粗品冷冻粉。
实施例2一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法
包括以下步骤：
(1)、制备尿激酶溶液；
a、收集尿液，在8℃，pH＝8.0条件下，静置1小时，弃去沉淀，得上清液；
b、将D6246树脂袋放入过滤瓶中，然后将步骤a中得到的上清液装入D6246树脂袋中，过滤，待尿液全部流出后，取出装有滤渣的D6246树脂袋；
c、将步骤b中得到的装有滤渣的D6246树脂袋装入层析柱中，进行洗涤，然后洗脱，得到洗脱液，即为尿激酶溶液；
c1)、装柱：将凝胶介质混匀后，取适量混匀的凝胶填于层析柱，用5倍的pH＝3.0，0.3M的磷酸盐缓冲溶液洗涤凝胶；
c2)、平衡介质：用10倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱，平衡时流速为120cm/h；
c3)上样：将装有滤渣的树脂袋铺平按压紧密装入层析柱中，上样量与柱体积的比为50：1，上样流速为90cm/h；
c4)洗脱：使用3倍体积的含1mol/L氯化钠的pH值为8.0，体积比为1：2的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，即为尿激酶溶液。
步骤c1)中所述的层析柱为TSK-gei G3000SW凝胶色谱柱，规格为7.5mmI.D.x60cm，10um。
所述的凝胶填料为SP sepharose BB/GE。
(2)、制备尿激酶冻干粉；
将步骤c4中得到的尿激酶溶液放入冻干机中，在-50度条件下冷冻3小时，然后升温，待样品升温到室温，并保持3小时，即可取出得到尿激酶粗品冷冻粉。
实施例3一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法
包括以下步骤：
(1)、制备尿激酶溶液；
a、收集尿液，在6℃，pH＝7.5条件下，静置1.5小时，弃去沉淀，得上清液；
b、将D6246树脂袋放入过滤瓶中，然后将步骤a中得到的上清液装入D6246树脂袋中，过滤，待尿液全部流出后，取出装有滤渣的D6246树脂袋；
c、将步骤b中得到的装有滤渣的D6246树脂袋装入层析柱中，进行洗涤，然后洗脱，得到洗脱液，即为尿激酶溶液；
c1)、装柱：将凝胶介质混匀后，取适量混匀的凝胶填于层析柱，用4倍的pH＝3.0，0.3M的磷酸盐缓冲溶液洗涤凝胶；
c2)、平衡介质：用8倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱，平衡时流速为100cm/h；
c3)上样：将装有滤渣的树脂袋铺平按压紧密装入层析柱中，上样量与柱体积的比为30：1，上样流速为80cm/h；
c4)洗脱：使用2.5倍体积的含0.5mol/L氯化钠的pH值为6.0，体积比为1：1.5的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，即为尿激酶溶液。
步骤c1)中所述的层析柱为TSK-gei G3000SW凝胶色谱柱，规格为7.5mmI.D.x60cm，10um。
所述的凝胶填料为Capto S/GE。
(2)、制备尿激酶冻干粉；
将步骤c4中得到的尿激酶溶液放入冻干机中，在-50度条件下冷冻3小时，然后升温，待样品升温到室温，并保持3小时，即可取出得到尿激酶粗品冷冻粉。
实施例4一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法
包括以下步骤：
(1)、制备尿激酶溶液；
a、收集尿液，在6℃，pH＝7.5条件下，静置1.5小时，弃去沉淀，得上清液；
b、将D6246树脂袋放入过滤瓶中，然后将步骤a中得到的上清液装入D6246树脂袋中，过滤，待尿液全部流出后，取出装有滤渣的D6246树脂袋；
c、将步骤b中得到的装有滤渣的D6246树脂袋装入层析柱中，进行洗涤，然后洗脱，得到洗脱液，即为尿激酶溶液；
c1)、装柱：将凝胶介质混匀后，取适量混匀的凝胶填于层析柱，用4倍的pH＝3.0，0.3M的磷酸盐缓冲溶液洗涤凝胶；
c2)、平衡介质：用6倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱，平衡时流速为80cm/h；
c3)上样：将装有滤渣的树脂袋铺平按压紧密装入层析柱中，上样量与柱体积的比为40：1，上样流速为75cm/h；
c4)洗脱：使用2.5倍体积的含0.5mol/L氯化钠的pH值为6.0，体积比为1：2的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，即为尿激酶溶液。
步骤c1)中所述的层析柱为TSK-gei G3000SW凝胶色谱柱，规格为7.5mmI.D.x60cm，10um。
所述的凝胶填料为D6246/Purolite。
(2)、制备尿激酶冻干粉；
将步骤c4中得到的尿激酶溶液放入冻干机中，在-50度条件下冷冻3小时，然后升温，待样品升温到室温，并保持3小时，即可取出得到尿激酶粗品冷冻粉。
对比例1
与实施例4的区别在于：上述步骤c3)中所述的上样量与柱体积的比为10：1，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例2
与实施例4的区别在于：上述步骤c3)中所述的上样量与柱体积的比为60：1，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例3
与实施例4的区别在于：上述步骤c4)中所述的洗脱缓冲液为体积比为1：0.5的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例4
与实施例4的区别在于：上述步骤c4)中所述的洗脱缓冲液为体积比为1：4的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例5
与实施例4的区别在于：上述步骤c4)中所述的洗脱缓冲液为磷酸缓冲液，其他操作与步骤与实施例4相同。
对比例6
与实施例4的区别在于：使用国产海浪60-100目的硅胶进行吸附，得到尿激酶溶液，并进行冷冻制成尿激酶粗品冷冻粉。
试验例1、实施例1-4以及对比例1-6得到的液体尿激酶的收率和纯度检测，具体数据见下表1。
表1
Figure BDA0002575650350000081
根据上表1的检测数据可知，本发明实施例1-4通过直接使尿液穿过D6246树脂袋，然后将树脂袋装入层析柱中，洗脱即可得到尿激酶，操作简单，并且可以减少尿激酶的损失，可以明显提高尿液中尿激酶的含量；在洗脱过程中的缓冲液种类以及控制上样量与柱体积的比例，能够使尿激酶更好的分离，从而得到纯度较高的尿激酶，收集得到的尿激酶的纯度为25％以上，最终得到的液体尿激酶的收率最高可达到87.1％，对比例1-2改变上样量与柱体积的比例不再本发明保护范围内时，得到的液体尿激酶的含量和纯度明显降低，对比例3-5改变洗脱液的种类及含量比，不再本发明保护范围内，也会对液体尿激酶的含量和纯度产生影响；对比例6使用国产海浪60-100目的硅胶对尿液进行吸附，得到的液体尿激酶的含量仅为49.4，纯度仅为10.5％。
试验例2、实施例1-4以及对比例1-6得到的尿激酶冷冻粉的收率和纯度检测，具体数据见下表2。
表2
Figure BDA0002575650350000091
根据上表1的检测数据可知，本发明实施例1-4通过直接使尿液穿过D6246树脂袋，然后将树脂袋装入层析柱中，洗脱即可得到尿激酶，操作简单，并且可以减少尿激酶的损失，可以明显提高尿液中尿激酶的含量，冻干后尿激酶的含量和纯度均未发生巨大变化，得到的尿激酶冻干粉的纯度依然为25％以上，得到的尿激酶冻干粉的收率最高可达到80.0％，对比例1-6改变上样量与柱体积的比例或缓冲液的种类均会对尿激酶冻干粉的收率和纯度产生影响，其变化趋势与液体尿激酶相同。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、制备尿激酶溶液；
(2)、制备尿激酶冻干粉；
上述步骤(1)的具体步骤为：
a、收集尿液，在5-8℃，pH＝7-8条件下，静置1-2小时，弃去沉淀，得上清液；
b、将树脂袋放入过滤瓶中，然后将步骤a中得到的上清液装入树脂袋中，过滤，待尿液全部流出后，取出装有滤渣的树脂袋；
c、将步骤b中得到的装有滤渣的树脂袋装入层析柱中，进行洗涤，然后洗脱，得到洗脱液，即为尿激酶溶液；
上述步骤(2)的具体步骤为：
将步骤c中得到的尿激酶溶液放入冻干机中，在-45-50度条件下冷冻2-3小时，然后升温，待样品升温到室温，并保持2-3小时，即可取出得到尿激酶粗品冷冻粉；
所述的树脂袋为D6246树脂袋。
2.根据权利要求1所述的使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：步骤c中还包括以下步骤：
c1)、装柱：将凝胶介质混匀后，取适量混匀的凝胶填于层析柱，用3-5倍的缓冲溶液洗涤凝胶；
c2)、平衡介质：用5-10倍柱体积的样品缓冲液平衡凝胶柱；
c3)上样：将装有滤渣的树脂袋装入层析柱中；
c4)收集洗脱液，即为尿激酶溶液；
所述的层析柱为TSK-gei G3000SW凝胶色谱柱，规格为7.5mmI.D.x60cm，10um。
3.根据权利要求2所述的使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：步骤a)中用3倍体积的缓冲溶液进行洗涤，缓冲溶液为0.3M磷酸缓冲液，pH为3.0。
4.根据权利要求2所述的使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：步骤c2)中平衡介质步骤中使用磷酸盐、醋酸盐和柠檬酸盐缓冲溶液中的一种，平衡时流速为90-120cm/h。
5.根据权利要求2所述的使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：步骤c3)中所述的上样步骤中上样量与柱体积的比为20-50：1，上样流速为60-90cm/h。
6.根据权利要求5所述的使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：步骤c3)中所述的上样步骤中上样量与柱体积的比为35：1，上样流速为80cm/h。
7.根据权利要求2所述的使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：步骤c4)中所述的洗脱的洗脱液为2-3倍体积的含氯化钠的缓冲液。
8.根据权利要求7所述的使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：所述的缓冲液为体积比为1：1-2的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液的混合溶液，缓冲液的pH值为6.0-8.0。
9.根据权利要求8所述的使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：所述的缓冲液为体积比为1：2的醋酸缓冲液和磷酸缓冲液的混合溶液，缓冲液的pH值为7.0。
10.根据权利要求2所述的使用树脂吸附尿液中尿激酶的方法，其特征在于：所述的凝胶填料为D6246、SP sepharose BB、Capto S和SP Seplife FF中的一种。
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