CN111647527B - 一种利用枯草芽孢杆菌改良盐碱土和保肥的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用枯草芽孢杆菌改良盐碱土和保肥的方法，该方法为利用枯草芽孢杆菌的发酵菌液中提取的发酵产物在盐碱土高盐度环境中改良盐碱土的理化性质并显著提高农作物对磷肥的利用效率，首先进行菌种发酵培养及发酵产物提取，然后通过枯草芽孢杆菌的发酵产物对盐碱地理化性质的调节及保肥。本发明方法具有工艺简单、环保无害、效果明显的优点；充分利用微生物改良盐碱土，增加土壤中有效磷的含量，提高农作物对土壤中磷的利用效率。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌改良盐碱土和保肥的方法
技术领域
本发明涉及盐碱土改良领域，尤其涉及一种利用枯草芽孢杆菌改良盐碱土、提高农作物在盐碱地对磷肥利用效率的方法。
背景技术
我国盐渍土的分布范围广、面积大、类型众多，总面积约1亿公顷，盐碱土中的可溶性盐主要包括钠、钾、钙、镁等的硫酸盐、氯化物、碳酸盐和重碳酸盐。由于土壤的盐碱化，使得土壤板结，在土壤中实施肥料的有效性大大地降低，尤其是磷肥。大多数土壤是缺磷土壤，磷素是农作物的必需营养元素，它严重影响农作物的生长质量和产量。磷在自然界中的含量循环是单向模式，其消耗在不断的增大，回收可利用的磷含量很少。另外土壤盐渍化是造成可耕土地退化，粮食作物产量降低、品质下降的最大胁迫。世界耕地的20％和灌溉农业的30％受到高盐胁迫。
土壤盐度显著降低了农作物对营养的吸收，尤其是磷离子的损失，磷离子和钙离子会发生沉淀在盐土中。土壤中有机磷矿化随pH升高而增强，这和土壤有机碳、有机N的矿化不同。对大多数作物来说，磷素最大有效性pH在5.5-7.0，这时的土壤微生物活性也最强。高达90％的开采的磷酸盐矿物用于肥料的生产。石灰性土壤中的磷很难被农作物所利用，出现高产土壤中全磷含量较高而有效磷的含量不足的问题。目前全球磷的施用效率对于提高作物产量不高，我国74％耕地为缺磷土壤，所谓缺磷土壤是指土壤中有效磷含量小于10mg/kg的土壤。
目前国内外采用大面积修复盐碱土壤的技术主要是物理化学修复技术。化学修复剂主要用于苏打土的修复。生物修复包括植物及微生物修复，其中植物除盐机制主要有两种，一种是通过降低pH值。研究发现，微生物是一种更经济、高效的修复方式，具有很大的应用前景。
枯草芽孢杆菌这类微生物可以通过发酵培养产生一系列发酵产物，通过研究微生物发酵产物对盐碱地的改良作用以及在农作物对磷肥的利用效率上的作用，能进一步阐明微生物聚合物在在环境修复以及农业中的利用前景，具有重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的是利用从中国北京北纳生物菌种保存库中购得的一株枯草芽孢杆菌(编号BNCC190341)，利用枯草芽孢杆菌改良盐碱土、提高农作物在盐碱地对磷肥的利用效率的方法。本发明在盐碱土壤环境中可以实现利用菌株的分泌产物降低土壤pH及全盐含量，对土壤中的磷素起到活化作用。对盐碱地区的土壤改良、农作物生长具有重要意义。
本发明采用的技术方案如下：本发明提供一种利用枯草芽孢杆菌改良盐碱土和保肥的方法，该方法具体步骤为：
(1)菌种发酵培养及发酵产物提取
(1.1)先将枯草芽孢杆菌以3％-5％(V/V)的接种量接种至种子培养基，并于30-35℃、120-140r/min摇床培养40-50h得到菌液。种子培养基的配方为：大豆蛋白胨10-20g/L，葡萄糖30-40g/L，谷氨酸钠25-40g/L，NaCl 10-30g/L。
(1.2)再将步骤(1.1)中培养的菌液以3％-5％(V/V)的接种量接入发酵培养基，并于32-38℃、120-140r/min摇床培养40-50h后得到发酵菌液。发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨20-30g/L，葡萄糖30-40g/L，谷氨酸钠30-50g/L，NaCl 15-20g/L，MgSO40.5-1g/L，CaCl20.25-0.5g/L，K2HPO4 2.0-3.0g/L，KH2PO4 4.0-5.0g/L及0.1～0.5g/L生物素。然后采用有机溶剂(乙醇)沉淀法：取发酵菌液用盐酸调节pH为3～4，以12000r/min离心10min，连续离心2次，上清液用体积分数为95％的乙醇于-20℃过夜沉淀，上清液与乙醇体积比为1:2～4，然后于4℃下以12000r/min离心10min去掉上清液，沉淀用去离子水充分溶解，以12000r/min离心去沉淀，上清液用透析袋透析脱盐，直至澄清得到去盐溶液，然后经冷冻干燥后得到发酵产物。
(2)枯草芽孢杆菌的发酵产物对盐碱地理化性质的调节及保肥
在某盐碱荒地盐碱土壤中种植农作物，施加100～150mg/kg磷肥、100～200mg/kg氮肥、10～50mg/kg钾肥，并加入10～250mg/L不同浓度的发酵产物，5～7天添加一次发酵产物溶液，灌水量为20％～30％。收获前最后一周停止浇灌发酵产物溶液，30天后收获。发酵产物可以降低土壤pH及全盐含量，对土壤中的磷素起到活化作用。
进一步地，步骤(1)中，所用到的枯草芽孢杆菌可以在质量分数10‰～30‰的盐度条件下良好生长，可以耐受质量分数10‰～30‰的盐度，菌株发酵培养稳定期的OD660达到2.25。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)所利用的物质为微生物发酵法获取，成本较低、污染较小，且该微生物能耐受10‰～30‰的盐，可以用于高盐碱环境；
(2)微生物合成的有机高分子物质在盐碱土壤中的应用研究比较少，且对肥料的影响作用及影响机理有待于研究，本发明进一步验证微生物在盐碱土壤中对植物生长的影响，并进行了盆栽实验，以说明微生物发酵产物能调节盐碱土的功能以及对磷肥利用的影响；
(3)本发明所用方法环保无害，且成本低，微生物发酵产物可以改良盐碱土且具有保水保肥的功能，在农业生产以及环境修复治理中均有积极意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明提供一种微生物(枯草芽孢杆菌)改良盐碱土并且具有保肥作用的方法。所述方法为提取枯草芽孢杆菌发酵产物，将提取物加入到盐碱土中，采用育苗移栽的方式在该盐碱土中种植农作物，在农作物种植过程中测定改良后的盐碱土的理化性质以及农作物对磷肥的利用效率。
A.所述枯草芽孢杆菌，购买于中国北京北纳生物菌种保存库(编号BNCC190341)。
B.枯草芽孢杆菌的驯化：先将枯草芽孢杆菌以3％-5％的接种量接种至种子培养基并于30-35℃、120-140r/min摇床培养40-50h。种子培养基的配方为：大豆蛋白胨10-20g/L，葡萄糖30-40g/L，谷氨酸钠25-40g/L，NaCl 10-30g/L。
C.枯草芽孢杆菌发酵培养：将种子培养液中的菌株以3％-5％的接种量接种至发酵培养基中于32-38℃、120-140r/min摇床培养40-50h后得到发酵菌液。发酵培养基成分：大豆蛋白胨20-30g/L，葡萄糖30-40g/L，谷氨酸钠30-50g/L，NaCl 15-20g/L，MgSO4 0.5-1g/L，CaCl2 0.25-0.5g/L，K2HPO4 2.0-3.0g/L，KH2PO4 4.0-5.0g/L及0.1～0.5g/L生物素。
D.发酵产物对盐碱地理化性质的调节及保肥作用：将作物种植到装满盐碱土的花盆中，施加100～150mg/kg磷肥、100～200mg/kg氮肥、10～50mg/kg钾肥，5～7天添加一次发酵产物(10-250mg/L)溶液，灌水量为20％～30％。期间施加一次营养液，营养液的成分为尿素5-10g，磷酸二氢钾3-5g，硫酸钙1-5g，硫酸镁0.5-1g，硫酸锌0.001-0.01g，硫酸铁0.003-0.005g，硫酸铜0.001-0.01g，硫酸锰0.003-0.005g，硼酸粉0.002-0.01g，溶解后加水至10L。30天左右收获，收获前最后一周停止浇灌发酵产物溶液。采样测定分析，结果表明：枯草芽孢杆菌发酵产生的物质可以降低土壤pH及全盐含量，对土壤中的磷素起到活化作用，从而对盐碱地区的土壤改良、农作物生长具有重要意义。
实施例1
(1)菌种来源与驯化培养：所选取的菌种为枯草芽孢杆菌，购买于中国北京北纳生物菌种保存库，保存编号为BNCC190341。为了提高枯草芽孢杆菌的发酵能力，首先将枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中驯化培养，以3％的接种量接种至种子培养基并于30℃、120r/min摇床培养40h。种子培养基的配方为：大豆蛋白胨10g/L，葡萄糖30g/L，谷氨酸钠25g/L，NaCl 10g/L；
(2)枯草芽孢杆菌发酵培养：将种子培养液中的菌株以3％的接种量接种至发酵培养基中于32℃、120r/min摇床培养40h后得到发酵菌液。发酵培养基成分为：大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖30g/L，谷氨酸钠30g/L，NaCl 15g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.25g/L，K2HPO42.0g/L，KH2PO4 4.0g/L及0.1g/L生物素。
(3)枯草芽孢杆菌发酵产物的提取：菌株产物的提取采用有机溶剂沉淀法。取发酵液用盐酸调节pH为3，以12000r/min离心10min，连续离心2次，上清液用2倍体积的95％乙醇于-20℃过夜沉淀，于4℃以12000r/min离心10min去掉上清液，沉淀用去离子水充分溶解，以12000r/min离心去沉淀，上清液用透析袋透析脱盐，去盐溶液经冷冻干燥后得到纯的产物。
(4)发酵产物对盐碱地理化性质的调节及保肥作用：将作物甜菜的种子首先种进育苗小盆中，后进行苗移植，移栽(带土)至装满盐碱土的花盆中。施加100mg/kg磷肥、100mg/kg氮肥、10mg/kg钾肥，每5天添加一次发酵产物10mg/L溶液，灌水量为20％。期间施加一次营养液，营养液的成分为尿素5g，磷酸二氢钾3g，硫酸钙1g，硫酸镁0.5g，硫酸锌0.001g，硫酸铁0.003g，硫酸铜0.001g，硫酸锰0.003g，硼酸粉0.002g，溶解后加水至10L。30天左右收获，收获前最后一周停止浇灌。育苗移植后起按第7，14，27，34天，取土壤样品和植物样品。
对甜菜的影响：添加10mg/L发酵产物的相比空白组，在第7天时光合速率能提高38％，到第14天时，比空白组提高19％，第27天和第34天效果不明显。相比空白组，最后植物的株高提高了18％，鲜重提高了86％，干重提高6％。施用10mg/L发酵产物的相对于空白对照组，甜菜中的全磷平均提高了17.9％。对土壤理化性质的影响：添加发酵产物10mg/L相比空白组，pH降低0.5％，EC降低18％，全盐含量降低14％，对土壤中全磷影响不显著，有效磷含量提高了94％。
实施例2
(1)菌种来源与驯化培养：所选取的菌种为枯草芽孢杆菌，购买于中国北京北纳生物菌种保存库，保存编号为BNCC190341。首先将枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中驯化培养，以5％的接种量接种至种子培养基并于35℃、140r/min摇床培养50h。种子培养基的配方为：大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，谷氨酸钠40g/L，NaCl 30g/L；
(2)枯草芽孢杆菌发酵培养：将种子培养液中的菌株以5％的接种量接种至发酵培养基中于38℃、140r/min摇床培养50h后得到发酵菌液。发酵培养基成分为：大豆蛋白胨30g/L，葡萄糖40g/L，谷氨酸钠50g/L，NaCl 20g/L，MgSO4 1g/L，CaCl2 0.5g/L，K2HPO43.0g/L，KH2PO4 5.0g/L及1.0g/L生物素。
(3)枯草芽孢杆菌发酵产物的提取：菌株产物的提取采用有机溶剂沉淀法。取发酵液用盐酸调节pH为4，以12000r/min离心10min，连续离心2次，上清液用4倍体积的95％乙醇于-20℃过夜沉淀，于4℃以12000r/min离心10min去掉上清液，沉淀用去离子水充分溶解，以12000r/min离心去沉淀，上清液用透析袋透析脱盐，去盐溶液经冷冻干燥后得到纯的物质。
(4)发酵产物对盐碱地理化性质的调节及保肥作用：将作物甜菜的种子首先种进育苗小盆中，后进行苗移植，移栽(带土)至装满盐碱土的花盆中。施加150mg/kg磷肥、200mg/kg氮肥、50mg/kg钾肥，每6天添加一次250mg/L的发酵产物溶液，灌水量为30％。期间施加一次营养液，营养液的成分为尿素7g，磷酸二氢钾5g，硫酸钙5g，硫酸镁1g，硫酸锌0.005g，硫酸铁0.005g，硫酸铜0.005g，硫酸锰0.005g，硼酸粉0.001g，溶解后加水至10L。30天左右收获，收获前最后一周停止浇灌。育苗移植后起按第7，14，27，34天，取土壤样品和植物样品。
对甜菜的影响：添加250mg/L发酵产物的相比空白组，在第7天时光合速率能提高26％，到第14天时，比空白组提高19％，第34天比空白组提高了64％。相比空白组，最后植物的株高提高了14％，鲜重提高了36％，干重提高7％。施用250mg/L发酵产物的相对于空白对照组，甜菜全磷平均提高了61.2％。对土壤理化性质的影响：添加250mg/L发酵产物的相比空白组，pH降低0.3％，EC降低20％，全盐含量降低20％，土壤中全磷提高5％。
实施例3
(1)菌种来源与驯化培养：所选取的菌种为枯草芽孢杆菌，购买于中国北京北纳生物菌种保存库，保存编号为BNCC190341。首先将枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中驯化培养，以4.5％的接种量接种至种子培养基并于32℃、130r/min摇床培养45h。种子培养基的配方为：大豆蛋白胨15g/L，葡萄糖35g/L，谷氨酸钠35g/L，NaCl 20g/L；
(2)枯草芽孢杆菌发酵培养：将种子培养液中的菌株以4.5％的接种量接种至发酵培养基中于35℃、130r/min摇床培养45h后得到发酵菌液。发酵培养基成为：大豆蛋白胨25g/L，葡萄糖35g/L，谷氨酸钠40g/L，NaCl 18g/L，MgSO4 0.7g/L，CaCl2 0.35g/L，K2HPO42.5g/L，KH2PO4 4.5g/L及0.3g/L生物素。
(3)枯草芽孢杆菌发酵产物的提取：菌株产物的提取采用有机溶剂沉淀法。取发酵液用盐酸调节pH为3.5，以12000r/min离心10min，连续离心2次，上清液用3倍体积的95％乙醇于-20℃过夜沉淀，于4℃以12000r/min离心10min去掉上清液，沉淀用去离子水充分溶解，以12000r/min离心去沉淀，上清液用透析袋透析脱盐，去盐溶液经冷冻干燥后得到纯的物质。
(4)发酵产物对盐碱地理化性质的调节及保肥作用：将作物甜菜的种子首先种进育苗小盆中，后进行苗移植，移栽(带土)至装满盐碱土的花盆中。施加120mg/kg磷肥、150mg/kg氮肥、30mg/kg钾肥，每7天添加一次100mg/L的发酵产物溶液，灌水量为30％。期间施加一次营养液，营养液的成分为尿素7g，磷酸二氢钾5g，硫酸钙5g，硫酸镁1g，硫酸锌0.005g，硫酸铁0.005g，硫酸铜0.005g，硫酸锰0.005g，硼酸粉0.001g，溶解后加水至10L。30天左右收获，收获前最后一周停止浇灌。育苗移植后起按第7，14，27，34天，取土壤样品和植物样品。
对甜菜的影响：添加100mg/L发酵产物的相比空白组，在第7天时光合速率能提高34％，到第14天时，比空白组提高20％。相比空白组，最后植物的株高提高了25％，鲜重提高了175％，干重提高12％。施用100mg/L发酵产物的相对于空白对照组，甜菜全磷平均提高了24％。对土壤理化性质的影响：添加100mg/L发酵产物的相比空白组，pH降低0.7％，EC降低19％，全盐含量降低23％。
综上所述，本发明主要是利用一种枯草芽孢杆菌改良盐碱土、提高农作物在盐碱地对磷肥利用效率，该技术通过利用微生物发酵培养后的发酵产物在盐碱土这种高盐度环境中改良盐碱土的理化性质，提高农作物对盐碱土壤中磷的吸收从而促进农作物的生长的效果，在土壤治理改良以及农业方面均有重要作用。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种利用枯草芽孢杆菌改良盐碱土和保肥的方法，其特征在于，该方法具体步骤为：
(1)菌种发酵培养及发酵产物提取
(1.1)先将枯草芽孢杆菌以3％-5％(V/V)的接种量接种至种子培养基，并于30-35℃、120-140r/min摇床培养40-50h得到菌液，所述枯草芽孢杆菌购买于中国北京北纳生物菌种保存库，保存编号为BNCC190341；种子培养基的配方为：大豆蛋白胨10-20g/L，葡萄糖30-40g/L，谷氨酸钠25-40g/L，NaCl 10-30g/L；
(1.2)再将步骤(1.1)中培养的菌液以3％-5％(V/V)的接种量接入发酵培养基，并于32-38℃、120-140r/min摇床培养40-50h后得到发酵菌液；发酵培养基的配方为：大豆蛋白胨20-30g/L，葡萄糖30-40g/L，谷氨酸钠30-50g/L，NaCl 15-20g/L，MgSO40.5-1g/L，CaCl20.25-0.5g/L，K2HPO4 2.0-3.0g/L，KH2PO4 4.0-5.0g/L及0.1～0.5g/L生物素；然后采用有机溶剂沉淀法：取发酵菌液用盐酸调节pH为3～4，以12000r/min离心10min，连续离心2次，上清液用体积分数为95％的乙醇于-20℃过夜沉淀，上清液与乙醇体积比为1:2～4，然后于4℃下以12000r/min离心10min去掉上清液，沉淀用去离子水充分溶解，以12000r/min离心去沉淀，上清液用透析袋透析脱盐，直至澄清得到去盐溶液，然后经冷冻干燥后得到发酵产物；
(2)枯草芽孢杆菌的发酵产物对盐碱地理化性质的调节及保肥
在某盐碱荒地盐碱土壤中种植农作物，施加100～150mg/kg磷肥、100～200mg/kg氮肥、10～50mg/kg钾肥，并加入10～250mg/L不同浓度的发酵产物，5～7天添加一次发酵产物溶液，灌水量为20％～30％；收获前最后一周停止浇灌发酵产物溶液，30天后收获；发酵产物可以降低土壤pH及全盐含量，对土壤中的磷素起到活化作用。
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