CN111647509A - 一种坐滴式细胞球培养芯片及其使用方法 - Google Patents

一种坐滴式细胞球培养芯片及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种坐滴式细胞球培养芯片及其使用方法，坐滴式细胞球培养芯片包括加样腔和微腔阵列，所述微腔阵列设置在所述加样腔底部，且所述加样腔和所述微腔阵列表面设置有超疏水表面，所述微腔阵列设置有若干微腔，所述微腔内设置有至少一个通孔，所述通孔截面小于所述微腔截面。本发明还包括坐滴式细胞球培养芯片的使用方法。本发明利用微腔阵列结合超疏水表面，通过超疏水表面憎水效应、液样表面张力和自身重力协同作用，可以实现细胞悬浮液的自动分配、培养过程的简便快速换液以及培养细胞球的简便、快速回收，有效解决了现有技术中培养基更新困难、透气性差、细胞球均一性差、难以原位观察、成本高和细胞球不易取出等问题。

Description

一种坐滴式细胞球培养芯片及其使用方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种坐滴式细胞球培养芯片及其使用方法。
背景技术
与传统单层细胞培养技术相比，三维细胞培养形成的细胞球可以更好地反应细胞与细胞之间、细胞与外界微环境之间紧密而丰富的三维联系，更好地模拟天然生理环境中细胞固有代谢(如养分、氧气、代谢物等)和增殖梯度，可追踪药物的扩散路径，是细胞研究的理想模型。由于其独特优势，近年来，三维细胞球培养已在细胞生物学和医学研究中获得广泛应用，成为药物筛选、肿瘤治疗机制分析、干细胞分化和再生医学等方面研究不可或缺的有力工具。目前用于制备三维细胞球的方法主要有旋转搅拌式培养、悬滴式培养、基于细胞低粘附表面的微腔式培养、基于声表面波驱动的声聚焦式培养、磁悬浮式培养、凝胶包埋式培养等。但是这些方法都存在各自的局限，比如旋转搅拌式培养方法难以实现细胞球的均一培养，且剪切力易造成细胞损伤，培养过程无法实时观察；悬滴式培养则存在培养液滴易受机械扰动脱落、培养过程中换液困难等问题；低粘附表面微腔式培养则需要繁琐的表面处理操作，且细胞球位于营养液液面以下较深部位，与外界气氛交换困难；声聚焦式和磁悬浮式培养均需特殊辅助装置，导致培养***复杂，实验成本较高；而凝胶包埋式培养则使得细胞培养过程中，细胞周围存在外源基质无法准确反映细胞真实微环境的生理活动，这将导致生理信号的缺失甚至获得错误的研究结果。因此，亟待发展一种操作简便、成本低廉、生物相容性好、稳定性高、一致性好、外源干扰少且便于原位观察的三维细胞球培养新装置和方法，以促进细胞生物学和医学的发展。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种坐滴式细胞球培养芯片及其使用方法，利用微腔阵列结合超疏水表面，通过超疏水表面憎水效应、液样表面张力和自身重力协同作用，可以实现细胞悬浮液的自动分配、培养过程的简便快速换液以及培养细胞球的简便、快速回收，有效解决了现有技术中培养基更新困难、透气性差、细胞球均一性差、难以原位观察、成本高和细胞球不易取出等问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种坐滴式细胞球培养芯片，包括加样腔和微腔阵列，微腔阵列设置在加样腔底部，且加样腔和微腔阵列表面设置有超疏水表面，微腔阵列设置有若干微腔，微腔内设置有至少一个通孔，通孔截面小于微腔截面。
进一步，微腔阵列至少设置有4个微腔。
进一步，微腔腔体为圆柱形，直径大于2mm，且微腔底部为圆弧形。
进一步，坐滴式细胞球培养芯片的基材材质为聚苯乙烯、聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯和环氧树脂中的一种。
进一步，微腔阵列通过数控雕刻或注塑工艺制备得到。
进一步，超疏水表面通过以下方法制备得到：将纳米材料悬浮液喷涂或浸涂在坐滴式细胞球培养芯片的基材上，干燥，得超疏水表面。
进一步，在70℃温度下干燥至少1h。
进一步，纳米材料悬浮液为纳米材料、胶水和分散剂按质量比1～2:1～3:15混合而成的混合液。
进一步，纳米材料为纳米颗粒、纳米纤维或纳米棒，特征尺度为5～500nm；胶水为环氧树脂、有机硅树脂或结构胶；分散剂为四氢呋喃、无水乙醇、异丙醇或甲烷卤代烃。
进一步，纳米材料为二氧化硅纳米颗粒、氧化铝纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒、碳纳米纤维、聚丙烯腈纳米纤维、聚偏氟乙烯纳米纤维、碳纳米管或金属纳米棒。
上述的坐滴式细胞球培养芯片的使用方法，依次包括以下步骤：
(1)将坐滴式细胞球培养芯片洗净、干燥，然后紫外消毒；
(2)将细胞悬浮液加入消毒后的加样腔中，倾斜、转动或抖动芯片，待细胞悬浮液充满微腔阵列，吸出余液；
(3)将完成样品分配的芯片置于37℃、含5％二氧化碳气氛和相对湿度大于90％的环境中培养24～72h，然后在加样腔中加入培养基或待测药物，倾斜或转动芯片，充分扩散后吸出余液，在原培养条件下继续培养；根据细胞球培养需求，该换液过程可重复多次，直至结束，收集细胞球。
进一步，收集细胞球时，翻转芯片将各微腔中含细胞球液滴转移至平板玻璃或培养皿中；或将各微腔中含细胞球液滴直接倾倒至充有培养基的培养皿中；或通过移液器或吸管从单个微腔中吸取已培养的细胞球。
进一步，紫外消毒时，在辐射强度大于70W/cm2的紫外灯下消毒15～60min。
综上所述，本发明具备以下优点：
1、本发明的坐滴式细胞球培养芯片利用微腔阵列结合超疏水表面，通过超疏水表面憎水效应、液样表面张力和自身重力协同作用，可以实现细胞悬浮液的自动分配、培养过程的简便快速换液以及培养细胞球的简便、快速回收，操作简单高效，使用成本低，有效解决了现有技术中培养基更新困难、透气性差、细胞球均一性差、难以原位观察、成本高和细胞球不易取出等问题。
2、芯片具有超疏水表面特征的通孔型微腔阵列芯片，该芯片通过超疏水表面的憎水效应、液体样品的表面张力和流体自身重力的协同作用，可以实现细胞悬浮液在超疏水微腔阵列中的自动分配，使得每个微腔中自动形成一个独立的细胞悬浮液液滴，应用于细胞球的高通量培养。相比于现有的悬滴式细胞球培养装置和基于弧形底面的微腔阵列式细胞球培养芯片，本发明公开的坐滴式培养芯片在培养液滴的长期稳定性、液样分配和营养液更新的简便性、培养气氛的交换速率、原位可观察性等方面体现了更好的优势，为三维细胞的培养以及药物筛选提供了一种高效的平台，在细胞生物学和医学研究方面具有重要的应用价值。
3、本发明可以简便快速地实现细胞悬浮液的分配、培养过程换液、药物加载、培养细胞球回收等操作，且培养液滴抗机械扰动能力强、培养液滴透气性好、无需复杂的外部辅助装置，避免了目前细胞球培养方法操作困难、可控性差、耗材成本高、原位观察困难等难题，有望促进三维细胞培养技术在生物学基础研究和医学研究方面的快速发展和广泛应用。
4、因为有基板的支撑、微腔的限制，培养过程中不会出现因外部扰动导致液滴脱落的现象，具有更好的机械稳定性；由于超疏水微腔设计，无需通过移液器一个一个地分配培养液滴至培养板上，只需一次加载细胞悬液简单地倾斜、旋转芯片即可通过重力作用和表面张力作用实现所有培养液滴的快速分配，大大降低实验人员的劳动强度；悬滴式培养由于液滴稳定性差，培养中往往难以进行换液操作，而本发明则利用超疏水微腔设计，结合坐滴式方案，可以方便、快速地实现换液操作，无需担心换液过程中的液滴脱落问题。
5、由于微腔底部有通孔结构，同时因微腔为超疏水表面，培养液滴与微腔固体表面之间为非完全接触，有大量气体存在，有利于培养过程中位于液滴底部的细胞球与外界的气氛交换，而微孔板式培养的细胞球位于微腔封闭的底部，距离与大气接触的液面具有较大距离，气体交换比较困难，不利于细胞球生长；微孔板式培养往往各细胞球培养微腔之间是由培养液连通的，相互之间有信号分子的扩散、干扰，而本发明因超疏水微腔设计，各培养微腔是独立的，培养过程中无信号分子交换、干扰，每个微腔可以实行独立的药物筛选或刺激因子试验，因而单个芯片即可以实现多重实验，具有更好的灵活性和经济性。
6、芯片在使用时，首先通过紫外辐射对坐滴式细胞球培养芯片进行灭菌处理；然后将一定量细胞悬浮液加入灭菌处理后的芯片加样腔中，由于芯片加样腔表面的超疏水特性，加入的细胞悬浮液可以在加样腔中自由滚动，适当倾斜、转动或轻微抖动芯片，使液样经过所有微腔，并在重力作用下填充到微腔中，同时，利用液样表面张力和其自身重力的协同作用使得微腔中的填充液样部分与液样主体分开，从而在每个微腔中形成独立的细胞悬浮液液滴；之后移除加样腔中多余的细胞悬浮液，并将完成液样分配的芯片置于高湿度和设定的恒温环境下进行细胞球培养；培养过程中，定期进行培养基更换，换液操作方式类似于加样过程，即先在加样腔中加入一定量培养基，适当倾斜、转动芯片，使液样经过所有微腔，利用分子扩散作用，实现各细胞培养液滴与新鲜培养基营养成分和代谢物分子的交换，然后移除加样腔中完成扩散交换的液样；待微腔中细胞球培养至预期大小后，最后进行细胞球的收集。该方法简单易操作，能够简便快速的进行换液，细胞球收集方便，便于坐滴式细胞球培养芯片的推广使用。
附图说明
图1为坐滴式细胞球培养芯片结构示意图；
图2为数控雕刻技术制备坐滴式细胞球培养芯片的流程示意图；
图3为坐滴式细胞球培养芯片的加样流程示意图；
图4为坐滴式细胞球培养芯片的换液和药物加载流程示意图；
图5为坐滴式细胞球培养芯片中细胞球原位染色、观测流程示意图；
图6为坐滴式细胞球培养芯片细胞球回收流程示意图；
图7为基于本发明坐滴式细胞球培养芯片培养、收集的人高转移性肝癌细胞细胞球显微照片。
具体实施方式
实施例1坐滴式细胞球培养芯片及制备
一种坐滴式细胞球培养芯片，包括加样腔和微腔阵列，微腔阵列设置在加样腔底部，且加样腔和微腔阵列表面设置有超疏水表面，微腔阵列设置有若干微腔，微腔内设置有至少一个通孔，通孔截面小于微腔截面。微腔阵列至少设置有4个微腔；微腔腔体为圆柱形，直径大于2mm，且微腔底部为圆弧形。
坐滴式细胞球培养芯片的制备可以采用数控雕刻方法制作(如图2所示)，具体步骤如下：
(1)利用AutoCAD软件绘制待制作微腔阵列图形，然后将该设计图形导入到数控软件中，生成数控代码，并设置合适的刀具转速和进给速度；
(2)选择一块约6mm厚的PMMA板作为板材，将其固定于数控雕刻机加工平台上，选择直径为2～8mm的球头铣刀，再将水槽加适量的水，以保证板材完全浸没，启动数控雕刻程序进行微腔阵列主体结构加工；
(3)完成微腔阵列主体结构后，更换刀具为0.5～1.5mm钻头，在每个微腔底部中心制作通孔结构；
(4)将完成结构制作的板材置于激光雕刻机下进行切割，移除微腔阵列结构周围多余板材；另取一块6mm厚的PMMA板，切割一个矩形边框结构，边框***大小、形状与微腔阵列板相同，其内框大小稍大于微腔阵列区域；
(5)将切割的边框与微腔阵列板微腔结构面对准，利用有机玻璃胶将两者粘合，使得边框在微腔阵列板上形成加样腔，得芯片基片；
(6)将纳米二氧化硅颗粒、结构胶和氯仿按质量比1:2:15混合，混合均匀后，将混合液加入喷笔加液腔中，开启气泵，将混合液均匀地喷在芯片表面；
(7)将喷涂后的芯片置于70℃烘箱干燥至少1h，得坐滴式细胞球培养芯片。
实施例2坐滴式细胞球培养芯片的加样
坐滴式细胞球培养芯片可以通过以下方法应用于细胞球高通量培养(如图3所示)：
(1)将所得坐滴式细胞球培养芯片清洗、干燥，并置于紫外灯下消毒40min；
(2)将MHCC97-H(人高转移性肝癌细胞)细胞悬浮液加入芯片加样腔中，适当倾斜、转动或轻微抖动芯片，使细胞悬浮液进入微腔阵列的每个微腔中，并形成独立的液滴；
(3)待所有微腔均填充细胞悬浮液后，吸出芯片加样腔中多余的细胞悬浮液，完成芯片加样、分配；
(4)将完成加样后的芯片，至于培养皿中，并加入保湿棉球，然后，放入37℃二氧化碳培养箱中，进行细胞球的培养。
实施例3坐滴式细胞球培养芯片的换液和药物加载
细胞球培养过程中，往往需要通过换液清除细胞在生长过程中产生的代谢废物，同时补充新鲜的培养基，维持细胞的能够正常生长，或者需要在培养液中加入药物，研究药物对细胞球生长的影响，以实现药物筛选。
坐滴式细胞球培养芯片可以通过以下方法实现换液和药物加载操作(如图4所示)：将培养一定时间后的待换液芯片从培养皿中取出，将新鲜培养基或者溶有药物分子的新鲜培养基加入到芯片加样腔中，使新鲜培养基或者溶有药物分子的新鲜培养基覆盖每个微腔，静置10～20min，使微腔中液滴与加载培养基之间发生充分的分子扩散交换，然后吸出加样腔中完成扩散交换的培养基，再将芯片置于原培养环境下继续培养。
实施例4坐滴式细胞球培养芯片中细胞球的原位染色、观测
坐滴式细胞球培养芯片可以实现培养细胞球的原位染色、观测，具体操作如下(如图5所示)：
将培养一定时间后的芯片从培养环境中取出，通过移液器将选定的拟染色细胞球所在微腔中液滴的上清液移除部分，再将配制好的细胞染色溶液加入该微腔中，并将芯片置于原培养环境下温育30min；完成染色温育后，取出芯片，再通过移液器移除染色微腔中液滴的部分上清液，并加入PBS缓冲液，该PBS缓冲液换液过程重复两次，最后将芯片放置于荧光显微镜下进行观测。
实施例5坐滴式细胞球培养芯片中培养细胞球的收集
坐滴式细胞球培养芯片可以通过以下方法收集芯片中培养的细胞球，以实现后续分析和应用(如图6所示)：
方法一：取经消毒处理的一平板玻璃或培养皿，将拟接受细胞球一面覆盖于芯片上，然后将组合体倒置，芯片各微腔中液滴及其包含的培养细胞球在重力作用下，转移至平板玻璃或培养皿上，移除芯片即完成细胞球收集。
方法二：将拟实现培养细胞球收集的芯片移至一含培养基的培养皿上方，倾斜芯片，使得芯片各微腔中液滴及其包含的培养细胞球在重力作用下，流入培养皿中，完成细胞球收集。图7为基于本方法收集的细胞球显微照片。所收集的细胞球可应用于后续药物筛选等研究。
方法三：利用移液器或吸管，从选定的微腔中单独吸取其中培养的细胞球，实现细胞球的选择性收集。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (10)

1.一种坐滴式细胞球培养芯片，其特征在于，包括加样腔和微腔阵列，所述微腔阵列设置在所述加样腔底部，且所述加样腔和所述微腔阵列表面设置有超疏水表面，所述微腔阵列设置有若干微腔，所述微腔内设置有至少一个通孔，所述通孔截面小于所述微腔截面。
2.如权利要求1所述的坐滴式细胞球培养芯片，其特征在于，所述微腔阵列至少设置有4个微腔。
3.如权利要求1所述的坐滴式细胞球培养芯片，其特征在于，所述微腔腔体为圆柱形，直径大于2mm，且所述微腔底部为圆弧形。
4.如权利要求1所述的坐滴式细胞球培养芯片，其特征在于，所述坐滴式细胞球培养芯片的基材材质为聚苯乙烯、聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯和环氧树脂中的一种。
5.如权利要求1所述的坐滴式细胞球培养芯片，其特征在于，所述微腔阵列通过数控雕刻或注塑工艺制备得到。
6.如权利要求1所述的坐滴式细胞球培养芯片，其特征在于，所述超疏水表面通过以下方法制备得到：将纳米材料悬浮液喷涂或浸涂在坐滴式细胞球培养芯片的基材上，干燥，得超疏水表面。
7.如权利要求6所述的坐滴式细胞球培养芯片，其特征在于，所述纳米材料悬浮液为纳米材料、胶水和分散剂按质量比1～2:1～3:15混合而成的混合液。
8.如权利要求7所述的坐滴式细胞球培养芯片，其特征在于，所述纳米材料为纳米颗粒、纳米纤维或纳米棒；所述胶水为环氧树脂、有机硅树脂或结构胶；所述分散剂为四氢呋喃、无水乙醇、异丙醇或甲烷卤代烃。
9.权利要求1～8任一项所述的坐滴式细胞球培养芯片的使用方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(1)将坐滴式细胞球培养芯片洗净、干燥，然后紫外消毒；
(2)将细胞悬浮液加入消毒后的加样腔中，倾斜、转动或抖动芯片，待细胞悬浮液充满微腔阵列，吸出余液；
(3)将完成样品分配的芯片置于37℃、含5％二氧化碳气氛和相对湿度大于90％的环境中培养24～72h，然后在加样腔中加入培养基或待测药物，倾斜或转动芯片，充分扩散后吸出余液，在原培养条件下继续培养；根据细胞球培养需求，该换液过程可重复多次，直至结束，收集细胞球。
10.如权利要求9所述的坐滴式细胞球培养芯片的使用方法，其特征在于，收集细胞球时，翻转芯片将各微腔中含细胞球液滴转移至平板玻璃或培养皿中；或将各微腔中含细胞球液滴直接倾倒至充有培养基的培养皿中；或通过移液器或吸管从单个微腔中吸取已培养的细胞球。
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