CN111635873A - 一株植物乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一株植物乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种植物乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法和应用，该植物乳杆菌命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BLCC2‑0125，于2020年4月24日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020078。所述植物乳杆菌能够提高机体免疫力，对低致病性禽流感有预防作用，并且能够防治鸡毒支原体病。

Description

一株植物乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫微生态领域，具体涉及一株植物乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乳酸菌广泛存在于自然环境中，是人或动物肠道中必不可少的有益菌群。乳酸菌对于宿主的先天免疫***和维持其机体的免疫稳态有着重要的作用。其主要是通过增强或恢复肠道稳态来发挥作用，有能作为粘膜免疫载体的潜能。乳酸菌对肠道上皮细胞或细胞外基质组分的黏附会对机体产生有益的生物学效应。乳酸菌是通过粘附于肠道粘膜抑制病原菌的入侵和增殖，乳酸菌的表面有很多物质如肽聚糖、胞壁磷壁酸、脂磷壁酸、表层蛋白以及其它细胞壁相关多糖等发挥其生物学效应。乳酸菌也可以向细胞外分泌一些具有免疫调节活性的物质成分，如胞外多糖和其它分泌蛋白。这些成分均参与免疫调节或能够直接引起免疫应答，因此构成了乳酸菌发挥其益生功效的物质基础。
低致病性禽流感是危害养禽业的重要传染病之一。病毒感染后损伤部位主要发生在呼吸道、生殖道、肾脏或者胰腺。通常患病畜禽只会显现轻微症状，甚至根本观察不到任何发病症状，可在一定程度上允许宿主存活，因此没有被足够重视。虽然低致病性禽流感没有引起大量死亡，但是感染后往往造成禽群的免疫力下降，容易造成大肠杆菌等细菌病的继发感染。因此，不能放松对低致病性禽流感的防治。目前对低致病性禽流感的防治尚无切实可行的解决方法，随着流感病毒表面抗原不断变异，病毒的基因可能突变，所以低致病性禽流感的预防及控制十分困难。
鸡毒支原体感染是禽呼吸道病的一种，主要引起慢性呼吸道病、气囊炎和窦炎。鸡毒支原体的感染特征主要在气管粘膜的纤毛上和气囊上定植，而气管纤毛末端和气囊上没有血管，而药物是通过血液运输到达作用部位，再通过扩散作用于鸡毒支原体，因此药物只能减少气管纤毛和气囊上定植的鸡毒支原体数量，而不能完全将其杀灭，因此鸡毒支原体感染一般为一次感染会终生处于持续性感染的带菌状态。当禽群处于应激状态，如寒冷刺激、疫苗免疫时，又会表现出临床症状，造成了养禽业的重大损失，危害性日益突出。
因此研制新型有效产品以防控低致病性禽流感和鸡毒支原体的传播势在必行。但是，发明人发现随着具有免疫活性的益生菌不断深入研究，一些具有益生功能的乳酸菌作用效果和稳定性却不尽如人意。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌，能够提高机体免疫力，对低致病性禽流感有预防作用，并且能够预防鸡毒支原体病，并提供了包含该植物乳杆菌的微生态制剂及其制备方法和应用。本发明的微生态制剂可提高黏膜、体液和细胞免疫，对低致病性禽流感(H9N2)有预防作用，在预防鸡毒支原体病上也具有一定的功效；并且本申请的微生态制剂不仅预防效果好，而且能够大大降低产品的使用频率，降低了使用成本。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BLCC2-0125，于2020年4月24日保存于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：M 2020078。
所述植物乳杆菌BLCC2-0125可在MRS培养基上生长，该菌株具有细胞表面疏水性、较好的细胞粘附性、自凝聚(自聚合)能力(2h自凝聚率接近50％)、高产胞外多糖(发酵培养24小时后，胞外多糖产量可达996.67 mg/L)、耐酸(在pH2.5、pH3.0以及pH6.0时存活率分别达到45％和90％和100％，可在pH大于2.0的环境下存活)、耐胆盐(在禽胆盐0.1％培养4h，存活率为92.1％，禽胆盐浓度为0.3％时仍可存活)、对胰蛋白酶及胃蛋白酶均有较强的耐受性(胰蛋白酶液中处理2h，4h后，存活率分别为92％和76％)、传代稳定性良好(连续传5代、10代、15代、20代培养物形态均为革兰氏染色阳性杆菌，活菌含量不同代次之间相差不大，发酵液pH值均在4.15左右)。
本发明的植物乳杆菌BLCC2-0125具有较好的免疫功能，在免疫抑制 (以环磷酰胺制备免疫抑制模型)实验中，使用了本发明植物乳杆菌的动物相较于空白组、模型组、阳性药左旋咪唑对照组体重在灌胃5天后稳步增长，胸腺指数、脾脏指数相较于模型组均显著增加，脾脏指数与空白组无显著差异；在动物血清细胞因子检测实验中，相较于模型组(以环磷酰胺制备免疫抑制模型)，使用了本发明所述植物乳杆菌的动物血清中的IL-2水平、IFN-γ水平、IgG水平均显著提高，表明口服本发明的植物乳杆菌能够提高免疫抑制动物的血清IL-2、IFN-γ和IgG的水平。
本发明的植物乳杆菌BLCC2-0125具有较好的安全性，在动物经口急性毒理试验中，使用了本发明的植物乳杆菌的动物体重在给药后能够正常增长，表明口服本发明的植物乳杆菌具有安全性。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种菌剂，其包含上述第一方面中所述的植物乳杆菌和/或其发酵物。
所述发酵物通过发酵本发明所述植物乳杆菌BLCC2-0125获得。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种微生态制剂，其原料包含本发明第一方面中所述的植物乳杆菌和/或其发酵物与保护剂，或者其原料由本发明第一方面中所述的植物乳杆菌和/或其发酵物与保护剂组成。
在本发明的一些实施方式中，所述的植物乳杆菌和/或其发酵物中植物乳杆菌BLCC2-0125的活菌数不低于1×108CFU/mL，在进一步地实施方式中，所述植物乳杆菌BLCC2-0125的活菌数为1×108CFU/mL～1×1010CFU/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述冻干保护剂可采用本领域常规使用的冻干保护剂，比如脱脂乳、蔗糖、甘油等，所述冻干保护剂的加入量可以为本领域的常规用量，或者所述冻干保护剂的加入量为混合原料重量的 2-90wt％，优选为5-80wt％，尤其为40-60wt％，例如在本发明的一些实施方式中，以质量份计，所述微生态制剂中，冻干保护剂与菌泥(或菌体) 的质量份数分别为120份和100份。
在本发明的实施方式中，所述微生态制剂为口服微生态制剂或气雾微生态制剂。两种制剂优选的剂型均为粉剂，其中口服微生态制剂可与饲料搅拌后使用，或者直接以水服用；气雾微生态制剂配合气雾装置(比如喷雾器)喷施使用。
在本发明的实施方式中，虽然常规的冻干保护剂在冻干过程中可一定程度的保护本发明的菌体，但在本发明的研究过程中发现，当选用特定组成的冻干保护剂时，能够更好的实现本发明的技术效果。比如，在本发明的一些实施方式中，所述保护剂包括或由以下成分组成：脱脂乳、海藻糖、硫酸锰、蔗糖、异Vc钠和葡萄糖；或者，所述保护剂包括或由以下成分组成：脱脂乳、海藻糖、硫酸锰、蔗糖、Vc、甘油和葡萄糖。
在本发明较为优选的实施方式中，所述微生态制剂为口服微生态制剂时，所述保护剂包括或由以下成分组成：脱脂乳、海藻糖、硫酸锰、蔗糖、异Vc钠和葡萄糖。特别地，在这些实施方式中，所述保护剂中各成分的含量为：脱脂乳1-10重量份、海藻糖1-3重量份、硫酸锰0.1-0.5重量份、蔗糖0.1-0.5重量份、异Vc钠0.1-0.5重量份、葡萄糖0-0.5重量份(优选为0.1-0.5 重量份)，所述各成分均匀混合后以无菌水溶解即得；在一种推荐的实施方式中，优选预先把保护剂配方中的成分封口包装后辐射灭菌，再按照一定比例溶解于无菌水(比如溶解于100重量份的无菌水)中，置于干热灭菌过的玻璃瓶中备用。
在本发明较为优选的实施方式中，所述微生态制剂为气雾微生态制剂时，所述保护剂包括或由以下成分组成：脱脂乳、海藻糖、硫酸锰、蔗糖、Vc、甘油和葡萄糖。特别地，在这些实施方式中，所述保护剂中各成分的含量为：脱脂乳5-20重量份、海藻糖10-25重量份、硫酸锰0.1-1重量份、蔗糖0.1-0.5 重量份、Vc 2-4重量份、甘油2-5重量份、葡萄糖0-0.2重量份(优选为0.1-0.2 重量份)，所述各成分均匀混合后以无菌水溶解即得；在一种推荐的实施方式中，优选预先把保护剂配方中的成分封口包装后辐射灭菌，再按照一定比例溶解于无菌水(比如溶解于100重量份的无菌水)中，置于干热灭菌过的玻璃瓶中备用。
在本发明的第四方面，本发明提供了上述第三方面中所述的微生态制剂的制备方法，其包括将上述第一方面中所述的植物乳杆菌和/或其发酵物与保护剂在无菌条件下混合，然后进行真空冷冻干燥。
在本发明的第五方面，本发明提供了上述第一方面所述的植物乳杆菌或者上述第二方面所述的菌剂或者上述第三方面所述的微生态制剂在制备免疫治疗剂制品中的应用。
在本发明的实施方式中，所述免疫治疗剂制品可调节禽类的免疫力，尤其提高禽类的黏膜、体液和/或细胞免疫；所述禽类尤其指鸡。
在本发明所述的实施方式中，所述免疫治疗剂制品为药品、保健品、食品、卫生用品或消毒用品。
在本发明的第六方面，本发明提供了上述第一方面所述的植物乳杆菌或者上述第二方面所述的菌剂或者上述第三方面所述的微生态制剂在制备具有下述(1)至(5)中任一种或多种功能的制品中的应用：
(1)调节禽类盲肠黏膜中sIgA抗体水平的制品；
(2)调节禽类气管中sIgA抗体水平的制品；
(3)调节禽类血清中IgG抗体水平的制品；
(4)调节禽类血清中IFN-γ水平的制品；
(5)调节禽类血清中H9抗体水平的制品；
在本发明的实施方中，所述制品为药品、保健品、食品、卫生用品或消毒用品。所述禽类尤其指鸡。
在本发明的第七方面，本发明提供了上述第一方面所述的植物乳杆菌或者上述第二方面所述的菌剂或者上述第三方面所述的微生态制剂在制备预防低致病性禽流感疾病的制品中的应用；优选地，所述低致病性禽流感为H9N2病毒感染所致的禽流感。
在本发明的实施方中，所述制品为药品、保健品、食品、卫生用品或消毒用品。所述禽类尤其指鸡。
在本发明的第八方面，本发明提供了上述第一方面所述的植物乳杆菌或者上述第二方面所述的菌剂或者上述第三方面所述的微生态制剂在制备防治鸡毒支原体感染的制品中的应用。
在本发明的实施方中，所述制品为药品、保健品、食品、卫生用品或消毒用品。所述禽类尤其指鸡。
相较于现有技术，本发明的有益效果包括：
本发明所述的植物乳杆菌能够提高机体免疫力，对低致病性禽流感有预防作用，并且能够防治鸡毒支原体病。本发明提供了口服和气雾两种包含本发明所述植物乳杆菌的微生态制剂，并分别进行了免疫功能的检测，结果表明均可提高黏膜、体液和细胞免疫；对低致病性禽流感(H9N2) 有预防作用，在预防鸡毒支原体病上也具有一定的功效。
特别需要说明的，本发明的微生态制剂大大减少了使用频率，由于本发明所述植物乳杆菌的粘附性强，效力好，在预防低致病性禽流感(H9N2) 的整个周期只有15、16日龄连续两天使用即可，使用频率低，预防效果显著，大大降低了使用成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1具有免疫活性乳酸菌的初筛
1材料与方法
1.1材料
MRS培养基：按质量百分数计算，葡萄糖2.0％、柠檬酸钠0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、吐温-80 0.1％，pH 6.0。
IEC-6细胞(小肠上皮细胞)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
1.2方法
1.2.1菌悬液的制备
将山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种保藏中心提供的20株乳酸菌分别接种于MRS液体培养基中，37℃培养16-18h后，4℃ 3000rpm离心15min，收集菌体，用PBS溶液悬浮菌体后离心，重复3次。
1.2.2疏水性乳酸菌的筛选
乳酸菌表面疏水性的测定采用微生物黏着碳烃化合物法(BATH)。将洗涤后的菌体重新悬浮于0.1M KNO3溶液中，使菌体悬液的吸光度 (OD＝600nm)达到0.5±0.02(A0)，取菌悬液2mL与200μL二甲苯混匀，室温静置10min，涡旋震荡2min后再静置10min，重新形成为两相体系。小心吸取水相，在600nm下测定吸光度(A1)。
细胞表面疏水性计算公式：
Figure BDA0002523759260000071
1.2.3乳酸菌黏附性筛选
将IEC-6细胞复苏后，置于含有DMEM完全培养液的培养瓶中，于37℃ 5％CO2培养箱中孵育，传代5次左右进行黏附试验。将IEC-6细胞浓度调整至2×104cells/mL，接种于6孔培养板中(预先置入无菌盖玻片)，使细胞贴附盖玻片生长，待细胞培养至致密单层后，用PBS缓冲液漂洗2次，然后每孔加入1mL DMEM完全培养液和1mL制备好的菌悬液，摇晃混匀，于 CO2培养箱继续孵育，每株菌重复3孔。培养60min后，取出6孔培养板，用PBS缓冲液洗涤细胞5次(除去未黏附的乳酸菌)，加入无水甲醇固定 20min，革兰染色后，显微镜下随机选取20个视野，计100个细胞上黏附的细菌个数，用平均每个细胞所黏附的细菌个数表示黏附能力。
1.2.4自凝聚能力乳酸菌的筛选
将PBS溶液洗涤菌体两次，重悬于PBS溶液中，使菌体悬液的吸光度 (OD＝600nm)达到0.5±0.02(A0h)。以PBS溶液为空白对照，取4mL调整好菌浓度的菌悬液于试管中，室温静置2h后吸取1mL上层溶液测600nm吸光值(A2h)。
自凝聚能力计算公式：
Figure BDA0002523759260000081
2结果
2.1疏水性乳酸菌的筛选
见表1，20株乳酸菌的表面疏水性差异较大，共有8株乳酸菌表面疏水性超过45％，分别是1、4、9、11、14、15、16、20号菌株，表面疏水性在 30％～45％的乳酸菌共有4株。其中1号乳酸菌的表面疏水性最高，达到62％，其次是16号菌株，达到54％。
表1乳酸菌表面疏水性的测定
Figure BDA0002523759260000082
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
2.2乳酸菌黏附性筛选
不同乳酸菌对IEC-6细胞黏附情况如表2所示。不同乳酸菌对细胞黏附菌数差异较大，黏附数量大于10个的乳酸菌有8个，分别是1、4、9、11、 14、15、16、20号菌株，其中16号乳酸菌的黏附数最高达到18个。
表2乳酸菌对IEC-6细胞的黏附数(n＝3，
Figure BDA0002523759260000083
)
Figure BDA0002523759260000084
Figure BDA0002523759260000091
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
2.3自凝聚能力乳酸菌的筛选
20种乳酸菌的自聚合能力如表3所示。不同菌种之间的聚合能力差别较大，在37％以上的有10株菌，分别是1、4、9、11、12、14、15、16、17、 20号菌株。16号菌的自聚合能力最强，达到48％，其次为1号、9号和15 号菌，为46％，最低的为5号菌株和19号菌株，自凝聚率只有11％。
表3乳酸菌自凝聚能力的测定
Figure BDA0002523759260000092
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
实施例2具有免疫活性乳酸菌的复筛
1材料与方法
1.1材料
MRS培养基：按质量百分数计算，葡萄糖2.0％、柠檬酸钠0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、吐温-80 0.1％，pH 6.0。固体培养基需要加1.5％琼脂粉。
改良的MRS培养基：用蔗糖代替葡萄糖，其他同MRS培养基。
1.2方法
1.2.1产胞外多糖乳酸菌初筛(菌落拉丝法)
将实施例1中初筛的8株乳酸菌(见表4)接种于MRS培养基中进行活化，采取平板划线法将活化好的乳酸菌接种于改良的MRS固体培养基中， 37℃培养24h，观察菌落形态。
1.2.2产胞外多糖乳酸菌复筛(苯酚-浓硫酸法)
将本实施例1.2.1初筛获得的菌株接种于改良的MRS液体培养基中，37℃静置发酵24h。取发酵液，全程在4℃条件下进行，10000rpm，离心15min，取上清液加三氯乙酸至终质量分数4％，反应12h后，10000rpm，离心15min，收集上清液，加入3倍体积95％(体积分数)的乙醇溶液浸提12h，10000rpm 离心15min，收集沉淀，用无水乙醇洗涤后，用去离子水溶解定容，溶液用去离子水透析(8000～14000Da)3d，每8h换一次水，透析结束后减压真空浓缩至原体积即为粗多糖溶液。
2结果
2.1产胞外多糖乳酸菌初筛
筛选结果如表4所示，选取菌落表面黏稠且可拉丝的1号、4号、15号和16号单菌落，保藏于MRS培养基斜面，置于4℃冰箱保存。
表4产胞外多糖乳酸菌初筛结果
Figure BDA0002523759260000101
Figure BDA0002523759260000111
注：“+”：是，“-”：否。
2.2产胞外多糖乳酸菌复筛
复筛结果如表5所示，结果表明，其中1、16号菌株的胞外多糖的产量在700～800mg/L之间，而15号菌株的胞外多糖产量可以达到996.67mg/L。因此选择1、15、16号菌株进行免疫功能检测。
表5产胞外多糖乳酸菌复筛结果
Figure BDA0002523759260000112
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
实施例3乳酸菌免疫功能检测实验
1材料与方法
1.1材料
健康昆明小鼠，购自山东泰邦生物制品有限公司；小鼠白细胞介素2 (IL-2)ELISA检测试剂盒、小鼠γ干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒、小鼠免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒均购自北京方程生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1乳酸菌免疫功能检测试验
选用健康昆明小鼠210只，雌雄各半，体重18-20g，置于安静、温暖、避强光的环境中饲养适应3d后，随机分6组，每组35只，分别为空白组、模型组、阳性对照组、1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组。实验开始前，对除空白组外其余组通过采取连续3d(D-2-D0)腹腔注射80mg/kg的环磷酰胺方法建立免疫低下小鼠模型，免疫抑制作用由小鼠体重来衡量。
免疫抑制后连续灌胃3周，空白组和模型组给予灭菌生理盐水，阳性对照组给予左旋咪唑(浓度为50mg/kg)，按0.1mL/10g/d剂量灌胃，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组均按照108CFU/0.2mL/只/天灌胃，灌胃期间每隔4天称重一次。最后一次灌胃后第2天，分别取空白组和其他组各5只小鼠称体重、采集全血用于免疫指标的检测，称脾脏、胸腺重量，并观察小鼠活动及有无死亡，详细纪录。
2结果
2.1小鼠体重分析
在整个试验过程中，对小鼠进行了6次称重。结果如表6所示，在灌胃试验开始前2天(D-2)的初始体重没有明显差异。随后，与空白组相比，其余五组小鼠在注射环磷酰胺后显示体重急剧下降，说明环磷酰胺的注射造成了小鼠免疫抑制。在灌胃治疗期间，与模型组相比，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组的小鼠体重在开始灌胃后第5天均有一定增加，并逐渐稳步增长。
表6小鼠体重随时间的变化
Figure BDA0002523759260000121
注：D-2指灌胃试验开始前两天，D1、D5、D10、D15、D20分别指灌胃第1、5、10、 15、20天。
2.2小鼠免疫器官指数的检测
如表7所示，对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响：与模型组小鼠相比，空白组和1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组的小鼠胸腺指数均显著提高(P<0.05)；相较于模型组，1号菌株组、15号菌株组和阳性对照组小鼠的脾脏指数均显着增加(P<0.05)，另外，15号菌株组和空白组小鼠脾脏指数没有显著差异(P>0.05)。
表7 3种乳酸菌对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响
Figure BDA0002523759260000131
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
2.3小鼠血清细胞因子的检测
将血清在室温下融化后，采用ELISA法检测血清中IL-2和IFN-γ和IgG 水平。结果见表8，由表中数据可知，与模型组相比，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组小鼠血清中的IL-2水平均显著提高(P<0.05)，并且不同乳酸菌(1、15、16)之间均差异显著(P<0.05)，其中15号菌株组IL-2水平最高。分析结果表明乳酸菌具有体内免疫活性，能够提高小鼠血清IL-2 水平。
IFN-γ：由表中数据可以看出，与模型组相比，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组小鼠血清中的IFN-γ水平均显著提高(P<0.05)，其中15号菌株组的IFN-γ水平显著高于1号乳酸菌组。分析结果表明，这3株乳酸菌具有体内免疫活性，能够提高免疫抑制小鼠血清IFN-γ水平。
IgG：IgG是存在于血液、淋巴、腹腔液以及脑脊液中的主要免疫球蛋白，其占血清总免疫球蛋白的75％以上。由表中数据可以看出：与模型组小鼠相比，1号菌株组、15号菌株组、16号菌株组均能够提高免疫抑制小鼠血清中的IgG水平，并且差异显著(P<0.05)。分析结果表明，这3株乳酸菌具有体内免疫活性，能够提高免疫抑制小鼠血清IgG水平，其中15号菌株效果最为明显。
表8 3种乳酸菌对小鼠血清IL-2、IFN-γ、IgG水平的影响
Figure BDA0002523759260000141
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
综上所述，15号菌株的免疫效果最强，因此准备将15号菌株保藏进行后续试验。
实施例4 15号乳酸菌生物学特性检测及其鉴定
1材料与方法
1.1材料
MRS培养基：按质量百分数计算，葡萄糖2.0％、柠檬酸钠0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、吐温-80 0.1％，pH 6.0。固体培养基需要加1.5％琼脂粉。
健康成年SPF级KM小鼠，购自山东泰邦生物制品有限公司。
1.2方法
1.2.1耐酸性试验
15号乳酸菌培养15h，按1％(V/V)的接种量分别接种于pH 2.0、2.5、3.0的MRS培养基中，以PH 6.0的MRS培养基为对照，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。37℃培养4h，取样进行菌落计数，计算乳酸菌的存活率。
存活率(％)＝(待测PH的菌液活菌数/初始菌液活菌数)×100
1.2.2耐胆盐实验
15号乳酸菌培养16h，按1％(V/V)的接种量分别接种于禽胆盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％的MRS培养基中，以不加禽胆盐的MRS培养基为对照，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却备用。将菌株以2％(v/v)的接种量接种到上述处理后的培养基中，37℃培养4h，取样进行菌落计数，进行存活率测定。
存活率(％)＝(待测禽胆盐浓度菌液活菌数/初始菌液活菌数)×100
1.2.3消化酶耐受性试验
将15号乳酸菌在MRS固体平板上37℃过夜培养，菌液离心，取菌泥，用等量的生理盐水复溶，稀释10倍备用；取1mL菌悬液与9mL胃蛋白酶液混合，37℃静置培养4h，于0h、2h、4h分别计数。
将1mL菌悬液与9mL胰蛋白酶液混合，37℃静置培养4h，于0h、4h 分别计数。
1.2.4动物经口急性毒理试验
选用18～22g的健康成年SPF级KM小鼠20只，雌雄各半，分为两组，对照组和试验组。按照20.0mL/kg体重的比例进行灌胃，试验组灌胃15号乳酸菌菌液，活菌数为1×1010CFU/mL，空腹灌胃一次，对照组空腹灌胃无菌生理盐水。灌胃后立即观察其活动表现、体重以及身体状况变化，观察期为7天。
1.2.5传代稳定性测定
将15号乳酸菌在MRS琼脂平板上37℃培养48小时后，挑取单菌落于 MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱培养16小时作为第1代菌液，以1％ (v/v)比例接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱培养16小时作为第2代菌液，如此连续接种传至第20代。对5代、10代、15代、20代细菌培养物进行菌液计数并测定其pH值，记录结果。
1.2.6菌种鉴定
15号乳酸菌接种于MRS培养基中培养20h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物： R5'-ggttaccttgttacgactt-3'(SEQID NO.2)，F5'-agagttgatcctggctcag-3'(SEQ ID NO.3)，PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min， 72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。
2结果
2.1 15号乳酸菌耐酸性检测
由表9可以看出，15号乳酸菌在pH 2.5和pH 3.0时存活率达到45％和 90％，说明该菌株具有较强的耐酸性。
表9 15号乳酸菌耐酸性检测
Figure BDA0002523759260000161
2.2 15号乳酸菌耐胆盐检测
由表10可以看出，15号乳酸菌在禽胆盐0.1％培养4h，存活率为92.1％，随着禽胆盐浓度的升高，存活率明显下降，在胆盐浓度0.3％时，存活率为 4.1％，由此可以看出15号乳酸菌具有较强的禽胆盐耐受能力。
表10 15号乳酸菌耐胆盐检测
Figure BDA0002523759260000162
2.3消化酶耐受性试验结果
由表11可知，胃蛋白酶液中处理2h、4h后，15号乳酸菌存活率分别为84％和46％。胰蛋白酶液中处理2h、4h后，15号乳酸菌存活率分别为92％和76％，由此可知15号乳酸菌对胰蛋白酶及胃蛋白酶均有较强的耐受性。
表11 15号乳酸菌消化酶耐受性试验结果
Figure BDA0002523759260000171
2.4 15号乳酸菌的安全性试验
由表12知，使用菌液对小鼠灌胃后，小鼠体重在给药前后正常增长，此外，小鼠食欲正常，饮水正常，毛色光洁不潮湿，精神方面无异常，综上说明，在试验浓度范围内，15号乳酸菌对小鼠是安全的。
表12 15号乳酸菌灌胃后小鼠体重变化
Figure BDA0002523759260000172
Figure BDA0002523759260000181
2.5 15号乳酸菌的传代稳定性测定
由表13可知，15号乳酸菌连续传5代、10代、15代、20代培养物形态均为革兰氏染色阳性杆菌，活菌含量不同代次之间相差不大，发酵液pH 值均在4.15左右，说明15号乳酸菌菌株传代稳定性良好。
表13 15号乳酸菌的传代稳定性测定结果
Figure BDA0002523759260000182
2.6菌种鉴定
15号乳酸菌在固体MRS培养基上的菌落形态呈白色圆形，中央凸起，菌落表面细密而光滑。测序结果与数据库进行比对分析，所分离菌株的16S rDNA与植物乳杆菌JY53具有很高的同源性(100％)，因此被确认为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(LactobacillusPlantarum)BLCC2-0125，于2020 年4月24日保存于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO: M 2020078。
16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)如下：
CGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAA ACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC ACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGC TTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGT GTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTC CTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTG GCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATC TCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCC CGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGG TAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGT GCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCC CAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACC CTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTA ATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCA GACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACC GCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTT TCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAA AAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTG CCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTC TGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCT TTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCG TTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCT CCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCT CTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATC TAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCT TTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTG TTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTC ACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTTGCATTATA
实施例5微生态制剂的制备
1口服微生态制剂的制备
1.1菌体制备
将上述筛选出的植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BLCC2-0125菌株接种至MRS液体培养基，30℃静置培养20h，镜检无杂菌后按5％接种量接至MRS液体培养基，30℃静置培养20h，220rpm扩大培养。离心收集菌体，加入一定体积无菌水，调菌浓度至不低于1×108CFU/mL。
1.2保护剂制备
配方为脱脂乳3.4g、海藻糖1.8g、硫酸锰0.25g、蔗糖0.2g、异Vc钠 0.1g、葡萄糖0.1g。预先把该配方中的试剂用透明包装袋封口包装辐射灭菌备用，将其溶解于100mL无菌水中，置于干热灭菌过的玻璃瓶中备用。
1.3真空冷冻干燥
菌泥和保护剂，无菌条件下混合，冻干保护剂与菌泥的质量份数分别为120份和100份。将盛有菌液的玻璃瓶放入预冷真空冷冻干燥机，-20℃预冻2h后，开启真空泵，干燥24h，即得该微生态制剂，其中植物乳杆菌 (Lactobacillus Plantarum)BLCC2-0125的活菌数不低于1.00×1010CFU/g。
2气雾微生态制剂的制备
2.1菌体制备
将筛选出的植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BLCC2-0125菌株接种至MRS液体培养基，30℃静置培养20h，镜检无杂菌后按5％接种量接至 MRS液体培养基，30℃静置培养20h，220rpm扩大培养。离心收集菌体，加入一定体积无菌水，调菌浓度至不低于1×108CFU/mL。
2.2保护剂制备
配方为脱脂乳15g、海藻糖10g、硫酸锰0.8g、蔗糖0.2g、Vc 2g、甘油 2g、葡萄糖均为0.1g。预先把该配方中的试剂用透明包装袋封口包装辐射灭菌备用。将其溶解于100mL无菌水中，置于干热灭菌过的玻璃瓶中备用。
4.2.3真空冷冻干燥
菌泥和保护剂，无菌条件下混合，冻干保护剂与菌泥的质量份数分别为120份和100份。将盛有菌液的玻璃瓶放入预冷真空冷冻干燥机，-20℃预冻2h后，开启真空泵，干燥24h，即得该微生态制剂，其中植物乳杆菌 (Lactobacillus Plantarum)BLCC2-0125的活菌数不低于1.00×1010CFU/g。
实施例6微生态制剂免疫效果研究
1材料与方法
1.1材料
口服微生态制剂(植物乳杆菌BLCC2-0125含量≥1.00×1010CFU/g)、气雾微生态制剂(植物乳杆菌BLCC2-0125含量≥1.00×1010CFU/g)，H9N2亚型禽流感病毒，鸡分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA试剂盒、鸡免疫球蛋白G(IgG)ELISA检测试剂盒、鸡IFN-γELISA检测试剂盒(购自北京方程生物科技有限公司)，喷雾器(购自山东聚诚五里雾环境科技有限公司)。
AA肉鸡210只(购自鼎固山农业)，随机平均分为7组，分别为(1) 空白组；(2)攻毒对照组；(3)口服保护剂组；(4)气雾保护剂组；(5)疫苗组；(6)口服组；(7)气雾组。
1.2方法
1.2.1免疫方案
空白组、攻毒对照组：不做任何处理；
疫苗组：8日龄开始进行新支120点眼(1.5羽份)、新支流三联皮下注射0.3mL/只；15日龄进行法氏囊饮水(2羽份)、22日龄ND四系饮水(2 羽份)、29日龄法氏囊饮水(2羽份)；
口服组：15、16日龄连续两天产品(本发明实施例5制备的口服微生态制剂)饮水，使用无菌水将口服微生态制剂稀释到1.00×108CFU/mL，按照 5mL/只的量，2h内集中饮完；
气雾组：15、16日龄连续两天产品(本发明实施例5制备的气雾微生态制剂)喷雾，使用无菌水将气雾微生态制剂稀释到1.00×108CFU/mL，剂量为口服组用量的两倍进行喷雾，即10mL/只。
口服保护剂组：15、16日龄连续两天口服保护剂；其成分与本发明实施例5制备的口服微生态制剂产品的差异在于未添加菌泥；使用口服保护剂时，饮水量与饮水方式与口服组相同。
气雾保护剂组：15、16日龄连续两天喷雾，用量为口服保护剂组用量的 2倍；其成分与本发明实施例5制备的气雾微生态制剂产品的差异在于未添加菌泥；使用气雾保护剂时，用水量与用水方式与口服组相同。
1.2.2免疫方法
各组按免疫方案实施；
口服组、口服保护剂组直接加入饮水中使用；
气雾组将使用50-150微米的喷头，在约4m2的密闭空间内完成，提前喷雾50mL无菌水增加空气湿度，然后将稀释后的产品在肉鸡上方约50cm 处进行喷洒，4h后将鸡笼移出。
气雾保护剂组实施方式同气雾组。
1.2.3攻H9N2亚型禽流感病毒
病毒繁殖后ELD50＝10-8.15/0.2mL，除空白组外，对23日龄肉鸡进行攻毒，翅静脉注射病毒原液0.8mL。
1.2.4样品采集
分别在7日龄、19日龄、30日龄、42日龄每组随机选择5只翅静脉采血，并且每组随机选择3只安乐死，取其气管和肠道保存待检。
攻毒7天后各组随机选择10只，分别取泄殖腔棉拭子。
1.2.5样品检测
将采集的血清采用ELISA试剂盒检测IgG抗体、IFN-γ含量，血凝抑制试验检测血清中H9抗体含量；将不同日龄不同分组得到的气管及肠道黏液采用ELISA试剂盒检测sIgA抗体含量。
将采集的泄殖腔棉拭子采用血凝试验检测***病毒的效价。
2结果
2.1盲肠黏膜中sIgA消长规律
见表14，口服组盲肠黏膜中sIgA抗体始终保持最高水平，其次为气雾组。19日龄、30日龄口服组、气雾组显著高于空白组、攻毒对照组、口服保护剂组和气雾保护剂组，而在42日龄的样品结果显示口服组、气雾组显著高于其余5组(p＜0.05)。
表14不同日龄肉鸡盲肠黏膜中sIgA抗体水平的测定结果(ng/mL)
Figure BDA0002523759260000221
Figure BDA0002523759260000231
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
2.2气管黏膜中sIgA消长规律
见表15，口服组气管黏膜中sIgA抗体始终保持最高水平、其次为气雾组。19日龄口服组显著高于其余组(p＜0.05)。而气雾组与疫苗组没有表现出显著性差异(p＞0.05)。
表15不同日龄肉鸡气管中sIgA抗体水平的测定结果(ng/mL)
Figure BDA0002523759260000232
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
2.3血清中IgG抗体消长规律
见表16，气雾组血清中IgG始终保持最高水平，其次为口服组。气雾组、口服组在30日龄和42日龄均显著高于其余组(p＜0.05)。
表16不同日龄肉鸡血清中IgG抗体水平的测定结果(μg/mL)
Figure BDA0002523759260000233
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
2.4血清中IFN-γ消长规律
见表17，气雾组血清中IFN-γ始终保持最高水平，其次为口服组。气雾组在30日龄和42日龄显著高于其余组(p＜0.05)。口服组只在42日龄显著高于空白组、攻毒对照组、口服保护剂组和气雾保护剂组(p＜0.05)，而与疫苗组没有显著性差异。
表17不同日龄肉鸡血清中IFN-γ水平的测定结果(pg/mL)
Figure BDA0002523759260000241
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
2.5血清中H9抗体消长规律
见表18，口服组和气雾组血清中H9抗体始终保持较高水平。虽然随着母源抗体消失，H9抗体水平逐渐降低，但口服组和气雾组延缓了抗体下降的趋势。
表18不同日龄肉鸡血清中H9抗体水平的测定结果
Figure BDA0002523759260000242
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
2.6血凝试验
见表19，口服组在泄殖腔分泌物抗原效价上要显著低于攻毒对照组，说明口服组可有效降低机体的病毒含量。
表19攻毒后各组泄殖腔分泌物H9N2抗原效价
Figure BDA0002523759260000252
注：表格中肩标字母代表显著性差异分析(p＜0.05)。
实施例7攻毒保护率的测定
1实验方法
本发明实施例6中23日龄攻毒的肉鸡，在攻毒7d后每组随机选择8 只对其进行安乐死，剖检取气管，刮取气管黏膜进行病毒RNA的提取，以 cDNA为模板，使用禽流感通用引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，各组分别计算感染率、保护率。
2结果
见表20，使用本发明实施例5制备的微生态制剂后各组的感染率均有不同程度的降低，其中气雾组效果最好，口服组次之。
表20攻毒后各组感染率及保护率
Figure BDA0002523759260000253
实施例8预防鸡毒支原体发病率的研究
1材料与方法
1.1材料
本发明实施例5制备的口服微生态制剂(植物乳杆菌含量≥1.00×1010CFU/g)、鸡毒支原体菌株(从泰安市宁阳县某鸡厂病鸡的气囊中分离所得)。
1日龄SPF鸡购自济南塞斯家禽科技有限公司。
1.2方法
1.2.1免疫方案
1日龄SPF鸡80只，分为正常对照组(20只)、口服保护剂组(20只)、口服微生态制剂组(20只)、攻毒对照组(20只)。
正常对照组、攻毒对照组：不做任何处理；
口服微生态制剂组：15日龄口服产品(本发明实施例5制备的口服微生态制剂)饮水，使用无菌水将口服微生态制剂稀释到1.00×108CFU/mL，按照5mL/只的量，2h内集中饮完；
口服保护剂组：15日龄口服保护剂，其成分与本发明实施例5制备的口服微生态制剂产品的差异在于未添加菌泥；使用时口服保护剂时，饮水量与饮水方式与口服微生态制剂组相同。
1.2.2攻毒方案
15日龄SPF鸡口服微生态制剂组口服产品后7天(22日龄)，除正常对照组外其余三组均进行气管攻毒，菌液浊度为1×109ccu/mL，0.5mL/只，同时，创造应激条件诱导发病，如降低温度、增加湿度、断料2d、卫生条件及通风条件差。正常对照组用生理盐水代替鸡毒支原体菌液，攻毒后每天观察并记录SPF鸡的临床症状，观察期7天。
1.2.3检测指标
攻毒后每日记录SPF鸡的死亡数，通过剖检后确定为鸡毒支原体致死的判定为死亡数。
死亡率(％)＝试验组鸡只死亡数/该试验组的鸡只总数×100
试验结束每组随机剖检10只，气囊损伤。对气囊损伤程度进行分级评分，并评价气囊损伤率，参照H.WYoder评分标准，将气囊病理损伤分为5 级；
0级：气囊正常，薄而透明，记0分；
1级：气囊仅有稍增厚的灰色区或黄色渗出斑点，记2分；
2级：部分气囊易见到灰至黄色渗出,有时出现泡沫，气囊增厚，记4分；
3级：大部分气囊增厚,布满大量黄白色干酪物，记6分；
4级：几乎整个气囊布满黄白色干酪样渗出物，气囊严重增厚，记8分；
平均气囊病理损伤度(计分)＝所有鸡气囊损伤度总和/被检鸡数
根据气囊损伤计分结果计算气囊损伤减少百分率：
气囊损伤减少率(％)＝(感染对照组每只鸡气囊损伤平均分－试验组每只鸡气囊损伤平均分)/感染对照组每只鸡气囊损伤平均分
2结果
2.1本发明的口服微生态制剂对鸡毒支原体病死亡率的影响
见表21，与攻毒对照组相比，口服微生态制剂组能显著降低SPF鸡死亡率，死亡率仅为5％。
表21口服微生态制剂对鸡毒支原体病死亡率的影响
Figure BDA0002523759260000271
2.2口服微生态制剂对鸡毒支原体病气囊损伤率的影响
由表22可以看出，使用口服微生态制剂后，气囊病理损伤度较攻毒对照组都有所下降。
表22口服微生态制剂对鸡毒支原体病气囊损伤率的影响
Figure BDA0002523759260000272
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司
<120> 一株植物乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法和应用
<130> 202020775
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1439
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum) BLCC2-0125
<400> 1
cggctggttc ctaaaaggtt accccaccga ctttgggtgt tacaaactct catggtgtga 60
cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact 120
agcgattccg acttcatgta ggcgagttgc agcctacaat ccgaactgag aatggcttta 180
agagattagc ttactctcgc gagttcgcaa ctcgttgtac catccattgt agcacgtgtg 240
tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300
accggcagtc tcaccagagt gcccaactta atgctggcaa ctgataataa gggttgcgct 360
cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420
tatccatgtc cccgaaggga acgtctaatc tcttagattt gcatagtatg tcaagacctg 480
gtaaggttct tcgcgtagct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 540
gtcaattcct ttgagtttca gccttgcggc cgtactcccc aggcggaatg cttaatgcgt 600
tagctgcagc actgaagggc ggaaaccctc caacacttag cattcatcgt ttacggtatg 660
gactaccagg gtatctaatc ctgtttgcta cccatacttt cgagcctcag cgtcagttac 720
agaccagaca gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat atctacgcat ttcaccgcta 780
cacatggagt tccactgtcc tcttctgcac tcaagtttcc cagtttccga tgcacttctt 840
cggttgagcc gaaggctttc acatcagact taaaaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc 900
aataaatccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960
cgtggctttc tggttaaata ccgtcaatac ctgaacagtt actctcagat atgttcttct 1020
ttaacaacag agttttacga gccgaaaccc ttcttcactc acgcggcgtt gctccatcag 1080
actttcgtcc attgtggaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc 1140
tcagtcccaa tgtggccgat taccctctca ggtcggctac gtatcattgc catggtgagc 1200
cgttacccca ccatctagct aatacgccgc gggaccatcc aaaagtgata gccgaagcca 1260
tctttcaaac tcggaccatg cggtccaagt tgttatgcgg tattagcatc tgtttccagg 1320
tgttatcccc cgcttctggg caggtttccc acgtgttact caccagttcg ccactcactc 1380
aaatgtaaat catgatgcaa gcaccaatca ataccagagt tcgttcgact tgcattata 1439
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<400> 3
agagttgatc ctggctcag 19

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BLCC2-0125，于2020年4月24日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020078。
2.一种菌剂，其包含权利要求1所述的植物乳杆菌和/或其发酵物。
3.一种微生态制剂，其原料包含权利要求1所述的植物乳杆菌和/或其发酵物与保护剂，或者其原料由权利要求1所述的植物乳杆菌和/或其发酵物与保护剂组成。
4.根据权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂为口服微生态制剂或气雾微生态制剂。
5.权利要求3或4所述的微生态制剂的制备方法，其包括将权利要求1所述的植物乳杆菌和/或其发酵物与保护剂在无菌条件下混合，然后进行真空冷冻干燥。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌或者权利要求2所述的菌剂或者权利要求3或4所述的微生态制剂在制备免疫治疗剂制品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫治疗剂制品可调节禽类的免疫力，尤其提高禽类的黏膜、体液和/或细胞免疫；
优选地，所述制品为药品、保健品、食品、卫生用品或消毒用品。
8.权利要求1所述的植物乳杆菌或者权利要求2所述的菌剂或者权利要求3或4所述的微生态制剂在制备具有下述一种或多种功能的制品中的应用：
(1)调节禽类盲肠黏膜中sIgA抗体水平的制品；
(2)调节禽类气管中sIgA抗体水平的制品；
(3)调节禽类血清中IgG抗体水平的制品；
(4)调节禽类血清中IFN-γ水平的制品；
(5)调节禽类血清中H9抗体水平的制品；
优选地，所述制品为药品、保健品、食品、卫生用品或消毒用品。
9.权利要求1所述的植物乳杆菌或者权利要求2所述的菌剂或者权利要求3或4所述的微生态制剂在制备预防低致病性禽流感疾病的制品中的应用；
优选地，所述低致病性禽流感为H9N2病毒感染所致的禽流感；
优选地，所述制品为药品、保健品、食品、卫生用品或消毒用品。
10.权利要求1所述的植物乳杆菌或者权利要求2所述的菌剂或者权利要求3或4所述的微生态制剂在制备防治鸡毒支原体感染的制品中的应用；
优选地，所述制品为药品、保健品、食品、卫生用品或消毒用品。
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Pledgor: SHANDONG BOLY-LELY BIOENGINEERING Co.,Ltd.

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