CN111630064A - 抗Tau抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了特异性结合Tau的抗体及其使用方法。

Description

抗Tau抗体及其用途
与相关申请的交叉引用
本申请要求2017年10月16日提交的美国申请号62/572,910、2017年10月25日提交的美国申请号62/577,011和2018年7月12日提交的美国申请号62/697,034的利益。每个这些申请整体通过引用并入本文。
序列表
本申请包括作为2018年9月17日生成的名为“104018_001025_SL.txt”的文本文件电子提交的序列表，其大小为916,053字节。所述序列表通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及特异性结合Tau的抗体及其使用方法。
背景技术
人类Tau由位于染色体17q21上的微管相关蛋白Tau基因MAPT编码。成年人类的大脑含有六种主要的Tau亚型，它们通过外显子2(E2)、E3和E10的可选剪接产生。这些亚型的区别在于N-端附近的29个残基的重复区的数量。含有0、1或2个***片段的Tau亚型分别被称为0N、1N和2N。未加工的Tau亚型还含有3个(“3R”)或4个(“4R”)结合微管的重复结构域。这些重复结构域中的第二个由E10编码，并且不包含在3R Tau亚型中(图1)。
尽管Tau通常是高度可溶的，但在病理条件下，它可以聚集成成对螺旋细丝、神经原纤维缠结和其他结构，定义了被称为Tau蛋白病的大范围神经变性疾病。因此，Tau蛋白病是指一类与微管相关蛋白Tau的聚集相关的神经变性疾病，包括阿尔茨海默氏病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)和额颞叶痴呆(FTD)
对Tau介导的神经毒性的潜在机制了解甚少，并且神经元中Tau聚集的触发因素也尚未阐明。因此，尽管正在探索靶向Tau的治疗方法，但对靶向Tau的特异性且有效的治疗剂仍存在需求。
发明内容
本文中提供了特异性结合人类Tau亚型或片段的单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些情况下，所述抗体是鼠类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施方式中，所述抗体同种型是IgG1。在某些实施方式中，所述抗体包含：如SEQ ID NO：196中所阐述的重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，和如SEQ IDNO：411中所阐述的轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)；如SEQ ID NO：268中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：465中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或如SEQ ID NO：402中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQID NO：572中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：包含SEQ ID NO：594的HCDR1、包含SEQ ID NO：596的HCDR2、包含SEQ ID NO：598的HCDR3、包含SEQ ID NO：738的LCDR1、包含SEQ ID NO：740的LCDR2和包含SEQ ID NO：742的LCDR3，正如按照Kabat的方法所定义的；包含SEQ ID NO：864的HCDR1、包含SEQ IDNO：866的HCDR2、包含SEQ ID NO：868的HCDR3、包含SEQ ID NO：1008的LCDR1、包含SEQ IDNO：1010的LCDR2和包含SEQ ID NO：1012的LCDR3，正如由IMGT所定义的；包含SEQ ID NO：642的HCDR1、包含SEQ ID NO：644的HCDR2、包含SEQ ID NO：646的HCDR3、包含SEQ ID NO：774的LCDR1、包含SEQ ID NO：776的LCDR2和包含SEQ ID NO：778的LCDR3，正如按照Kabat的方法所定义的；包含SEQ ID NO：912的HCDR1、包含SEQ ID NO：914的HCDR2、包含SEQ ID NO：916的HCDR3、包含SEQ ID NO：1044的LCDR1、包含SEQ ID NO：1046的LCDR2和包含SEQ IDNO：1048的LCDR3，正如由IMGT所定义的；包含SEQ ID NO：732的HCDR1、包含SEQ ID NO：734的HCDR2、包含SEQ ID NO：736的HCDR3、包含SEQ ID NO：846的LCDR1、包含SEQ ID NO：848的LCDR2和包含SEQ ID NO：850的LCDR3，正如按照Kabat的方法所定义的；或包含SEQ ID NO：1002的HCDR1、包含SEQ ID NO：1004的HCDR2、包含SEQ ID NO：1006的HCDR3、包含SEQ IDNO：1116的LCDR1、包含SEQ ID NO：1118的LCDR2和包含SEQ ID NO：1120的LCDR3，正如由IMGT所定义的。
根据某些情况，上述单克隆抗体或其抗原结合片段包含序列修饰。在某些实施方式中，所述修饰是：按照Kabat的方法所述轻链的第49位不是半胱氨酸，按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基不是半胱氨酸，按照Kabat的方法在所述轻链的第34位处的残基是谷氨酸，按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基不是苯丙氨酸，按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基不是精氨酸，按照Kabat的方法在所述重链的第94位处的残基不是赖氨酸，按照Kabat的方法在所述重链的第71位处的残基不是精氨酸，或其任何组合。在其中按照Kabat的方法在所述轻链的第49位处的残基不是半胱氨酸的某些实施方式中，所述残基是丝氨酸。在其中按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基不是半胱氨酸的某些实施方式中，所述残基是丝氨酸。在其中按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基不是苯丙氨酸的某些实施方式中，所述残基是酪氨酸。在其中按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基不是精氨酸的某些实施方式中，所述残基是亮氨酸。在其中按照Kabat的方法在所述重链的第71位处的残基不是精氨酸的某些实施方式中，所述残基是缬氨酸。
在所述特异性结合人类Tau的单克隆抗体或抗原结合片段的某些实施方式中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO：268的重链可变结构域(HCVD)和包含SEQ ID NO：465的轻链可变结构域(LCVD)；包含SEQ ID NO：268的HCVD和包含SEQ ID NO：581的LCVD；包含SEQ IDNO：384的HCVD和包含SEQ ID NO：545的LCVD；包含SEQ ID NO：393的HCVD和包含SEQ ID NO：545的LCVD；包含SEQ ID NO：402的HCVD和包含SEQ ID NO：545的LCVD；包含SEQ ID NO：384的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD；包含SEQ ID NO：393的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD；或包含SEQ ID NO：402的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD。
在所述特异性结合人类Tau的单克隆抗体或抗原结合片段的某些实施方式中，所述抗体由具有ATCC保藏号PTA-124523或ATCC保藏号PTA-124524的细胞系产生。
在某些实施方式中，本文中提供的抗体或抗原结合片段以通过表面等离子体共振所测量的低于约0.5nM的KD结合单体野生型人类2N4R Tau。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段在包含氨基酸序列HVPG(SEQ ID NO：1133)的表位处结合人类Tau。还提供了双表位的抗体或抗原结合片段，其在重复区2或重复区4内包含氨基酸序列HVPG(SEQ IDNO：1133)的表位处结合人类Tau。在某些情况下，所述抗体或抗原结合片段在包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合人类Tau。还提供了双表位的抗体或抗原结合片段，其在重复区2或重复区4内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处人类Tau。在某些实施方式中，所述单克隆抗体或抗原结合片段在重复区2和/或重复区4内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合人类Tau的结合偏好性比在重复区3内包含氨基酸序列HKPGG(SEQ ID NO：182)的表位处或在重复区1内包含氨基酸序列HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位处的结合高至少约10倍，正如通过肽结合测定法所确定的。在某些情况下，本文中提供的抗体或抗原结合片段不在重复区2内包含氨基酸序列HVSGG(SEQ ID NO：184)的表位处或重复区2内包含氨基酸序列HVLGG(SEQ ID NO：185)的表位处结合Tau。
在某些实施方式中，本文中提供的单克隆抗体或抗原结合片段被标记。
还提供了编码所述单克隆抗体或抗原结合片段中的任一者的核酸分子，包含所述核酸分子的载体，表达所述核酸分子的细胞，和通过在适合于生产的条件下培养这些细胞来生产所述抗Tau抗体或抗原结合片段的方法。所述生产方法还可以包括所述抗体或抗原结合片段的回收。
本文中还提供了药物组合物，其包含所述特异性结合人类Tau的单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一者和可药用载体。
本文中还提供了使用所述特异性结合人类Tau的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法。在某些实施方式中，所述特异性结合人类Tau的抗体或抗原结合片段被用作药物。在某些情况下，所述特异性结合人类Tau的抗体或抗原结合片段被用于治疗Tau蛋白病或制备用于治疗Tau蛋白病的药物。还提供了在对象中治疗Tau蛋白病的方法。在某些实施方式中，所述治疗Tau蛋白病的方法包括在对象中有效治疗所述Tau蛋白病的条件下向所述对象给药所述特异性结合人类Tau的单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一者。在某些情况下，所述Tau蛋白病是阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆或进行性核上性麻痹。所述额颞叶痴呆可以是例如匹克氏病(Pick's Disease)。
还提供了在对象中降低十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)不溶性Tau的水平的方法，所述方法包括向所述对象给药所述特异性结合人类Tau的单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一者。还提供了在对象中抑制Tau聚集的方法，所述方法包括向所述对象给药所述特异性结合人类Tau的单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一者。所述方法可以在体外或体内进行。
附图说明
图1示出了在成年人类大脑中表达的Tau的六种亚型：2N4R(UniProt登记号P10636-8)；1N4R(UniProt登记号P10636-7)；0N4R(UniProt登记号P10636-6)；2N3R(UniProt登记号P10636-5)；1N3R(UniProt登记号P10636-4)；和0N3R(UniProt登记号P10636-2)(Spillantini&Goedert,The Lancet,2013,12(6):609–622)。
图2示出了被选择用于产生本文中描述的抗Tau抗体的蛋白质区域(“肽抗原”)。图2按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO.1137、1138和1138。
图3A和3B示出了鼠类7G6(“ms7G6”)抗Tau抗体的精细表位作图的结果。对于图3A来说，野生型2N4R Tau序列的翻译的重叠肽(分别为SEQ ID NO：1-37)被合成，并与对照HA-标签肽一起印刷在玻璃芯片上。如方法中所述检测ms7G6抗体结合(图内部的信号)和对照肽(图外周的信号)。图3B示出了通过LI-COR OdysseyTM和PepslideTM Analyser软件包定量的作为抗体与肽芯片结合的结果的光斑强度。然后将荧光强度对肽序列作图，以产生表位作图数据。图3B按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 1139-1140和1-37。
图4示出了对应于人类2N4R Tau蛋白的第294至308位氨基酸的肽序列KDNIKHVPGGGSVQI(SEQ ID NO：26)的鼠类7G6抗体表位替换扫描的结果。将所述肽的每个氨基酸位置用每个可能的天然存在的氨基酸代替，印刷在玻璃芯片上，并用ms7G6抗体探测。图4示出了所选肽(分别为SEQ ID NO 38-78)的结果。尽管ms7G6抗体结合允许SEQ ID NO：79的第二个位置(缬氨酸)中的一定变动，但抗体结合完全依赖于SEQ ID NO：79的脯氨酸残基。没有观察到抗体7G6与KDNIKHVSGGGSVQI(SEQ ID NO：59)的结合。后者是在Tau P301S突变蛋白中存在的序列。
图5A和5B分别示出了在存在和不存在ms7G6(“7G6”)抗Tau抗体的情况下野生型和P301S Tau蛋白的肝素诱导的聚集的程度和速率。包含了不能结合Tau的小鼠IgG作为对照抗体。
图6A、6B、6C和6D分别示出了介质对照、人类IgG1k、鼠类7G6抗Tau抗体和人源化7G6-HCzu25-LCzu18抗体在Tau接种和聚集的基于细胞的体外模型中的效果。
图7示出了在临床前Tau接种体内模型中重组人类P301S Tau种子与介质、小鼠IgG对照抗体和鼠类抗Tau抗体1F1、7G6或8E5的预温育的结果。
图8示出了在用重组P301S Tau种子ICV注射的P301S转基因小鼠的海马和皮层中不溶性Tau发生的时间过程。
图9示出了在P301S体内接种模型中ms7G6抗体的外周单次重复给药的效果。ms7G6引起海马和皮层中不溶性Tau水平的降低。
图10示出了在P301S体内接种模型中ms7G6抗体的外周多次重复给药的效果。由抗体7G6引起的不溶性Tau水平的降低是剂量依赖性的。
图11示出了与鼠类抗Tau抗体ms7G6最接近同源的人类种系序列。将ms7G6和同源人类种系序列进行比对。Vh和VK结构域通过IMGT和Kabat编号***进行注释。一致的残基在人类种系序列中被表示为“.”。图11按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 1141-1144、1143、1145、1143、1146-1149、1148、1150和1148。
图12将ms7G6抗体重链和轻链与人源化7G6 Vh1和Vk2变体的序列进行了比较。将鼠类7G6和人源化7G6变体进行比对。Vh和Vk结构域通过IMGT和Kabat编号***进行注释。突变被标出下划线。图12按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 1151-1174。
图13A、13B、13C、13D、13E和13F示出了使用7G6 LCzu1人源化变体(图13A)、7G6LCzu2人源化变体(图13B)、7G6 LCzu3人源化变体(图13C)、7G6 LCzu4人源化变体(图13D)、7G6 LCzu5人源化变体(图13E)和用Ser替换了轻链上的Cys49(根据Kabat)和重链上的Cys57(根据Kabat)的7G6人源化变体(图13F)通过ELISA检测的Tau结合。
图14示出了通过直接ELISA分析的人源化7G6 Vh1/Vk2变体的Tau结合的结果。将样品在用2N4R Tau包被的96孔板中在室温下温育1h。将板洗涤，然后向孔添加HRP偶联的抗小鼠或抗人类抗体。每个孔中HRP活性的量通过QuantaBluTM荧光底物来测量，并通过SpectraMax M5读板器检测相对荧光单位(RFU)。大部分mAb在直接ELISA测定法中显示出很小的Tau结合差异。值得注意的例外是7G6-LCzu9，其即使是在最高浓度下也未表现出结合。此外，7G6-LCzu22显示出降低的结合；VκTyr36与Arg46的组合引起抗原结合位点的破坏。
图15示出了Vh1和Vκ2人源化7G6变体的重链和轻链稳定性的SDS-PAGE分析的结果。将2微克每种mAb与4x NuPAGETM LDS样品缓冲液在不存在还原剂的情况下混合，并载样到MOPS缓冲液中的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上。将凝胶用InstantBlueTM染色并在水中脱色。HC-HC-LC三聚体(HHL)、HC-HC二聚体(HH)和游离LC(L)用箭头指示。标志物的分子量以kDa为单位注明。
图16示出了抗体ms7G6(“7G6”)与人类种系数据库在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/上的BLAST比对。Vh和Vk结构域通过IMGT和Kabat编号***进行注释。图16按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 1175-1178、1177、1179、1180-1183、1182和1184。
图17示出了ms7G6和人源化7G6 Vh3/Vk1变体的比对。Vh和VK结构域通过IMGT和Kabat编号***进行注释。将小鼠和人源化7G6变体进行比对。Vh和VK结构域通过IMGT和Kabat编号***进行注释。突变被标出下划线。图17按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO1185-1207。
图18示出了ms7G6和人源化7G6Vh3/Vκ1变体7G6-HCzu11-LCzu11(“HCzu11-LCzu11”)、7G6-HCzu11-LCzu12(“HCzu11-LCzu12”)、7G6-HCzu12-LCzu11(“HCzu12-LCzu11”)和7G6-HCzu12-LCzu12(“HCzu12-LCzu12”)对Tau的直接结合。将样品在用2N4R野生型重组Tau蛋白包被的96孔板中在室温下温育1h。在洗涤后，向孔添加HRP偶联的抗小鼠或抗人类抗体。每个孔中HRP活性的量通过QuantaBluTM荧光底物来测量，并通过SpectraMaxM5读板器检测RFU。
图19A和19B示出了ms7G6、不结合Tau的IgG1对照Ab mAb2和人源化7G6 Vh3/Vκ1变体对Tau的直接结合。图19A示出了ms7G6、不结合Tau的IgG1对照Ab mAb2和人源化7G6 Vh3/Vκ1变体7G6-HCzu12-LCzu12(“HCzu12-LCzu12”)、7G6-HCzu13-LCzu12(“HCzu13-LCzu12”)、7G6-HCzu14-LCzu12(“HCzu14-LCzu12”)、7G6-HCzu15-LCzu12(“HCzu15-LCzu12”)、7G6-HCzu16-LCzu12(“HCzu16-LCzu12”)、7G6-HCzu17-LCzu12(“HCzu17-LCzu12”)、7G6-HCzu18-LCzu12(“HCzu18-LCzu12”)、7G6-HCzu19-LCzu12(“HCzu19-LCzu12”)和7G6-HCzu20-LCzu12(“HCzu20-LCzu12”)对Tau的直接结合。图19B示出了ms7G6、不结合Tau的IgG1对照Ab mAb2和人源化7G6 Vh3/Vκ1变体7G6-HCzu12-LCzu12(“HCzu12-LCzu12”)、7G6-HCzu12-LCzu13(“HCzu12-LCzu13”)、7G6-HCzu12-LCzu14(“HCzu12-LCzu14”)、7G6-HCzu12-LCzu15(“HCzu12-LCzu15”)、7G6-HCzu12-LCzu16(“HCzu12-LCzu16”)和7G6-HCzu12-LCzu17(“HCzu12-LCzu17”)对Tau的直接结合。将样品在用2N4R野生型重组Tau蛋白包被的96孔板中在室温下温育1小时。在将板洗涤后，向孔添加HRP偶联的抗小鼠或抗人类检测抗体。每个孔中HRP活性的量通过QuantaBluTM荧光底物来测量，并通过SpectraMax M5读板器检测RFU。
图20A、20B和20C示出了抗体7G6的Vh3和Vκ1变体的重链/轻链稳定性的非还原SDS-PAGE分析的结果。图20A示出了Vh3和Vκ1变体7G6-HCzu11-LCzu11(“HCzu11-LCzu11”)、7G6-HCzu11-LCzu12(“HCzu11-LCzu12”)、7G6-HCzu12-LCzu11(“HCzu12-LCzu11”)和7G6-HCzu12-LCzu12(“HCzu12-LCzu12”)的重链/轻链稳定性的SDS-PAGE分析的结果。图20B示出了Vh3和Vκ1变体7G6-HCzu12-LCzu12(“HCzu12-LCzu12”)、7G6-HCzu13-LCzu12(“HCzu13-LCzu12”)、7G6-HCzu14-LCzu12(“HCzu14-LCzu12”)、7G6-HCzu16-LCzu12(“HCzu16-LCzu12”)、7G6-HCzu17-LCzu12(“HCzu17-LCzu12”)和7G6-HCzu18-LCzu12(“HCzu18-LCzu12”)的重链/轻链稳定性的SDS-PAGE分析的结果。图20C示出了Vh3和Vκ1变体7G6-HCzu12-LCzu19(“HCzu12-LCzu19”)、7G6-HCzu12-LCzu13(“HCzu12-LCzu13”)、7G6-HCzu12-LCzu14(“HCzu12-LCzu14”)、7G6-HCzu12-LCzu15(“HCzu12-LCzu15”)、7G6-HCzu12-LCzu16(“HCzu12-LCzu16”)和7G6-HCzu12-LCzu17(“HCzu12-LCzu17”)的重链/轻链稳定性的SDS-PAGE分析的结果。将2微克每种mAb与4x NuPAGETM LDS样品缓冲液在不存在还原剂的情况下混合，并载样到MOPS缓冲液中的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上。将凝胶用InstantBlueTM染色并在水中脱色。HC-LC二聚体(HL)和游离HC用箭头指示。分子量标志物以kDa为单位注明。
图21A和21B示出了用于评估抗体7G6人源化变体7G6-HCzu8-LCzu6(图21A)和7G6-HCzu25-LCzu18(图21B)在溶液中的均质性的SEC-HPLC分析的结果。将5微克mAb 7G6人源化变体进样到带有AdvanceBio SEC 300A 2.7um 4.6x50保护柱和AdvanceBio SEC 300A2.7um 4.6x300mm柱的Agilent 1260Infinity中。样品在0.1M pH 6.5磷酸钠缓冲液中以0.35mL/min的流速进行分析，并分析在280nm处的吸光度。示出了mAb 7G6-HCzu8-LCzu6或7G6-HCzu25-LCzu18的代表性数据。
图22A-L示出了通过差示扫描量热术(DSC)分析的F(ab’)2片段的热熔曲线。图22A-L示出了mAb1(图22A)、mAb2(图22B)、嵌合(“xi”)7G6(“xi7G6”)(图22C)、7G6-HCzu8-LCzu6(图22D)、7G6-HCzu8-LCzu21(图22E)、7G6-HCzu23-LCzu15(图22F)、7G6-HCzu24-LCzu15(图22G)、7G6-HCzu25-LCzu15(图22H)、7G6-HCzu23-LCzu18(图22I)、7G6-HCzu24-LCzu18(图22J)、7G6-HCzu25-LCzu18(图22K)和7G6-HCzu8-LCzu6(图22L)的热熔曲线。将F(ab’)2片段和对照使用100℃/小时的扫描速率进行25-100℃范围内的热分析。嵌合、7G6-HCzu8和7G6-HCzu25 F(ab’)2的曲线类似于不结合Tau的IgG1对照mAb1和mAb2。然而，7G6-HCzu23和7G6-HCzu24含有第二个峰，指示了F(ab’)2片段的不稳定性，可能指示了HC-LC相互作用的解离。7G6-HCzu8-LCzu21、7G6-HCzu25-LCzu15和7G6-HCzu25-LCzu18的过渡中点相近，在77.4至77.6℃的范围内。7G6-HCzu8-LCzu6的中点高出一度，为78.6℃。
图23A和23B示出了免疫反应性T细胞表位分析的结果，提供了人源化抗体7G6重链中推测的热点(图23A中的SEQ ID NO：80-94；图23B中的SEQ ID NO：95-111)。表中的肽被鉴定为与人类种系序列具有5％或更低的同一性。所述肽与可变结构域种系序列的百分比同源性也被考虑在内。与可变区种系序列具有～5％或更低的同源性和/或被预测将结合三种或更多种HLA等位基因的肽被鉴定为较高风险(用灰色突出)。
图24A-24D示出了免疫反应性T细胞表位分析的结果，提供了人源化抗体7G6轻链中推测的热点(图24A中的SEQ ID NO：112-130；图24B中的SEQ ID NO：131-150；图24C中的SEQ ID NO：151-165和图24D中的SEQ ID NO：166-180)。表中的肽被鉴定为与人类种系序列具有5％或更低的同一性。所述肽与可变结构域种系序列的百分比同源性也被考虑在内。与可变区种系序列具有～5％或更低的同源性和/或被预测将结合三种或更多种HLA等位基因的肽被鉴定为较高风险(用灰色突出)。
图25示出了用抗体7G6-HCzu25-LCzu18对AD、PSP和PiD组织样品进行免疫组织化学染色的图像。抗体7G6-HCzu25-LCzu18强烈并特异性识别人类尸检患病大脑中的病理性Tau(在每张图像中用黑色箭头指示)。
图26A和26B分别示出了人源化抗体7G6-HCzu8/LCzu6和7G6-HCzu25/LCzu18的精细表位作图的结果。芯片的荧光图像和得到的强度图显示7G6-HCzu8/LCzu6(图26A)和7G6-HCzu25/LCzu18(图26B)抗体两者都结合到全长Tau蛋白上的两个主要位点。图26A按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 1-37。图26B按照出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 1-37。
图27示出了在存在和不存在抗体7G6-HCzu25-LCzu18的情况下野生型2N4R Tau蛋白的肝素诱导的聚集的程度和速率。将重组野生型2N4R Tau在实施例15中描述的条件下诱导以便聚集。反应不含有抗体(仅仅缓冲液，空心三角形)、含有人类IgG1对照抗体(实心菱形)或抗体7G6-HCzu25-LCzu18(空心圆圈)。在添加肝素后立即(第0天)并且然后在其后第1、2、5和6天测量硫磺素S(ThS)荧光。数据被表示为来自于4个独立实验的平均值±SD。为每个时间点进行统计分析(比较IgG对照和抗体7G6-HCzu25-LCzu18的多重t-检验)(p≤0.01**；p≤0.001***)。图27示出了7G6-HCzu25-LCzu18抗体在体外有效地抑制Tau聚集。对于在37℃温育后第1、2、5和6天来说，当比较IgG对照和7G6-HCzu25-LCzu18抗体时，效果是统计学显著性的。在第0天在添加肝素后刚刚开始反应后，没有观察到显著性。
图28示出了在存在和不存在抗体7G6或抗体7G6-HCzu25-LCzu18的情况下野生型2N4R Tau蛋白的肝素诱导的聚集的程度和速率。将重组野生型2N4R Tau在材料和方法中描述的条件下诱导以便聚集。反应不含有抗体(仅仅缓冲液，空心三角形)、含有人类IgG1对照抗体(实心菱形)、抗体7G6(实心正方形)或抗体7G6-HCzu25-LCzu18(空心圆圈)。在添加肝素后立即(第0天)并且然后在其后第1、2、5和6天测量硫磺素S(ThS)荧光。图28显示，当抗体7G6和抗体7G6-HCzu25-LCzu18两者均按照实施例5中提供的测定条件进行测试时，两种抗体在体外有效地抑制Tau聚集。在7G6与7G6-HCzu25-LCzu18抗体之间观察到同样大小的效果。
图29示出了在K18原纤维的基于细胞的接种测定法中在将样品用7G6-HCzu25-LCzu18抗体免疫耗竭后的归一化ThS阳性率。1.5和15μg/ml的7G6-HCzu25-LCzu18抗体消除了K18原纤维的接种效果(与人类IgG1κ对照相比降低>70％)。
图30A-30D示出了在人类P301S Tau转基因小鼠中抗体7G6对由海马内Tau种子注射诱导的大脑十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau的效果。将Tau种子或无种子(100mmol/L乙酸钠，pH7.0)立体定向地注射到左侧海马中。将7G6或对照IgG以40mg/kg的量每周一次腹膜内给药共3周。对照IgG＝小鼠IgG2b同种型对照抗体，7G6＝抗人类Tau小鼠IgG2b单克隆抗体。数据表示平均值±SEM(对于无种子来说n＝6，对于对照IgG、7G6来说n＝11)。****P<0.0001，*P<0.05，与对照IgG相比(通过单因素ANOVA然后通过Fisher’s LSD检验来分析)。7G6以40mg/kg的量每周一次腹膜内给药共3周，对P301S Tau转基因小鼠中由海马内Tau种子注射诱导的对侧海马中十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau的增加产生显著抑制。
图31A和31B示出了来自于用7G6-HCzu25-LCzu18抗体治疗的食蟹猴的脑脊液中的MTBR-Tau。图31A示出了结合的MTBR-Tau。图31B示出了游离MTBR-Tau。平均值±SEM。雄性食蟹猴N＝3(介质、10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg)。
图32示出了掺有7G6-HCzu25-LCzu18抗体(10、100、500、1000和2000ng/mL)的人类脑脊液中结合的MTBR-Tau。
图33A和33B分别示出了在过表达CD32A的CHO细胞中Tau单体或原纤维摄取的功效。与人类IgG1对照(3μg/mL)相比，7G6-HCzu25-LCzu18抗体(3μg/mL)显著提高Tau单体摄取(图33A)。同样地，与人类IgG1对照(3μg/mL)相比，7G6-HCzu25-LCzu18抗体(0.3和3μg/mL)也显著提高Tau原纤维摄取(图33B)。在两种情况下，FcR抑制剂处理在这种细胞测定***中显著阻断7G6-HCzu25-LCzu18抗体诱导的Tau摄取的效果。
具体实施方式
下面的描述表征了特异性结合到Tau的抗体及其抗原结合片段。还描述了能够编码这些抗体和抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所述抗体和抗原结合片段的细胞以及有关的载体。此外，描述了使用所述抗体和抗原结合片段的方法。例如，所提供的抗体和抗原结合片段可用于在对象中治疗Tau蛋白病。
在整个本说明书和权利要求书中使用了与本发明的各个方面相关的各种不同术语。除非另有指明，否则这些术语将被给予它们在本领域中的通常含义。其他具体定义的术语应该以与本文中提供的定义相一致的方式解释。
当在本说明书和随附的权利要求书中使用时，不带具体数量的指称物包括复数指称物，除非上下文明确叙述不是如此。因此，例如对“细胞”的指称包括两个或更多个细胞的组合等。
术语“约”当在本文中用于指称可测量的值例如量、持续时间等时，意味着涵盖与所述指定的值最多±10％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。除非另有指明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表述成分、性质例如分子量、反应条件等的量的所有数字，在所有情况下应该被理解为被术语“约”修饰。因此，除非指明相反，否则在下面的说明书和随附的权利要求书中陈述的数值参数是近似值，其可以随着本发明试图获得的所需性质而变。至少，并且不试图将等同原则的应用限制于权利要求书的范围，每个数值参数应至少根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。
尽管阐述本发明的广阔范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中阐述的数值被尽可能精确地报道。然而，任何数值都固有地含有由它们的相应测试测量中存在的标准偏差必然引起的某些误差。
“分离的”意味着生物组分(例如核酸、肽或蛋白质)已与所述组分天然存在于其中的生物体的其他生物组分即其他染色体和染色体外DNA和RNA和蛋白质基本上分开，已与它们分开地生产或从它们之中纯化出来。因此，已被“分离的”核酸、肽和蛋白质包括通过标准的纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可以作为组合物的一部分，并且如果这种组合物不是所述核酸、肽或蛋白质的本源环境的一部分的话，仍然可以是分离的。所述术语还包含在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。
“多核苷酸”与“核酸分子”或“核酸”同义，是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA、作为单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链和双链区的混合物的RNA、以及包含可以是单链或更通常是双链或单链与双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子。“多核苷酸”还包含通常被称为寡核苷酸的相对短的核酸链。
“基本上相同”的含义可以随着所述术语使用的上下文而不同。由于在重链和轻链以及编码它们的基因之间可能存在天然序列变异，因此人们预期将会在本文描述的氨基酸序列或编码抗体或抗原结合片段的基因内发现一定水平的变异，其对它们的独特结合性质(例如特异性和亲和性)具有很小或没有影响。这种预期部分是由遗传密码的简并性以及不相当大地改变所编码的蛋白质的性质的保守氨基酸序列变异的进化成功所造成的。因此，在核酸序列的情况下，“基本上相同”意味着两个或更多个序列之间至少65％的同一性。优选地，所述术语是指两个或更多个序列之间至少70％的同一性，更优选地至少75％的同一性，更优选地至少80％的同一性，更优选地至少85％的同一性，更优选地至少90％的同一性，更优选地至少91％的同一性，更优选地至少92％的同一性，更优选地至少93％的同一性，更优选地至少94％的同一性，更优选地至少95％的同一性，更优选地至少96％的同一性，更优选地至少97％的同一性，更优选地至少98％的同一性，更优选地至少99％或更高的同一性。这种同一性可以使用nBLAST算法来确定(Altschul等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-8；Karlin和Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-7)。
可能发生在蛋白质的氨基酸序列内并且对蛋白质功能没有实质性影响的变异的程度远低于核酸序列的所述变异程度，因为同样的简并性原则不适用于氨基酸序列。因此，在抗体或抗原结合片段的情况下，“基本上相同”意味着所述序列具有“非实质性差异”。非实质性差异是抗体或抗体片段的氨基酸序列中1、2、3、4、5或6个氨基酸的替换。与本文中公开的序列基本上相同的氨基酸序列也是本申请的一部分。在某些实施方式中，所述序列同一性可以是约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。其他实施方式包括这样的Tau特异性抗体或抗原结合片段，即它们具有的构架、支架或其他非结合区与本文描述的抗体和抗原结合片段不具有显著同一性，但并入了提供结合所需的一个或多个CDR或其他序列，所述CDR或其他序列与本文中描述的这类序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
“载体”是复制子例如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以可操作地***另一个核酸区段以便引起所述区段的复制或表达。
术语“表达”和“生产”在本文中同义使用，是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖了基因转录成RNA。这些术语也涵盖了RNA翻译成一种或多种多肽，并且进一步涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。抗体或其抗原结合片段的表达或生产可以在细胞的细胞质内，或在细胞外环境例如细胞培养的生长培养基中。
术语“治疗”是指在损伤、疾病或病症的减弱或改善方面的任何成功或成功的标志，包括任何客观或主观参数例如症状的消除、缓解、减轻，或使病症对患者来说更加可忍受，减缓退化或衰退的速度，使退化的终点较少使人衰竭，改善对象的身体或心理健康，或延长生存期。治疗可以通过客观或主观参数来评估，包括身体检查、神经学检查或精神病学评估的结果。在特定实施方式中，Tau蛋白病的症状是认知缺损。在特定实施方式中，Tau蛋白病的症状是学习和/或记忆缺损。在特定实施方式中，Tau蛋白病的症状是长期记忆丧失。在特定实施方式中，Tau蛋白病的症状是痴呆。在某些实施方式中，Tau蛋白病的症状是混乱、烦躁、攻击性、情绪波动或语言障碍。在某些实施方式中，Tau蛋白病的症状是一种或多种认知功能例如推理、情境判断、记忆能力和/或学习的缺损或丧失。
当在本文中使用时，术语“抗体”在广义上是指并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括鼠类、人类、人类适应性、人源化和嵌合单克隆抗体)和抗体片段。通常，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白质或肽链。完整抗体是异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。通常，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(可变区)(VH)，其后是多个恒定结构域(恒定区)。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。任何脊椎动物物种的抗体轻链都可以根据它们的恒定结构域的氨基酸序列而被指派到两种明显不同的类型之一，即κ和λ。
免疫球蛋白可以根据其重链具有的恒定结构域的类型而被指派到5种主要的类别或同种型，即，根据重链恒定结构域的氨基酸序列而被指派到IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG被进一步细分成同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
免疫球蛋白轻链可变区或重链可变区由被三个“抗原结合位点”中断的“构架”区构成。所述抗原结合位点使用如下的各种不同术语来定义：(i)术语互补决定区(CDR)是基于序列可变性(Wu和Kabat，J.Exp.Med.132:211-250,1970)。通常，抗原结合位点具有6个CDR，3个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且3个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)(Kabat等，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。由Lefranc所提议的“IMGT-CDR”(Lefranc等，Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)是基于来自于免疫球蛋白的V结构域和T-细胞受体的比较。国际ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了这些区域的标准化编号和定义。CDR与IMGT轮廓绘制之间的对应性被描述在Lefranc等，Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003中。
抗原结合片段是可以表现出对特定抗原的结合亲和性的任何蛋白质结构。某些抗原结合片段由完整抗体的保留了母体抗体分子的抗原结合特异性的部分构成。例如，抗原结合片段可以包含已知结合特定抗原的抗体的至少一个可变区(重链或轻链可变区)或一个或多个CDR。适合的抗原结合片段的实例包括但不限于双体抗体和单链分子以及Fab、F(ab’)2、Fc、Fabc和Fv分子、单链(Sc)抗体、单独的抗体轻链、单独的抗体重链、抗体链或CDR和其他蛋白质之间的嵌合融合体、蛋白质支架、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体、由一条重链和一条轻链构成的二聚体等。所有抗体同种型都可用于生产抗原结合片段。另外，抗原结合片段可以包括非抗体蛋白质构架，其可能成功地在一个方向上并入了为给定的感兴趣抗原提供亲和性的多肽区段例如蛋白质支架。抗原结合片段可以被重组生产或通过完整抗体的酶或化学切割来生产。短语“抗体或其抗原结合片段”可用于表示给定的抗原结合片段并入了所述短语中指称的抗体的一个或多个氨基酸区段。
“特异性结合”或“特异地结合”是指抗体或抗原结合片段与一个抗原结合的亲和性高于其他抗原。通常，所述抗体或抗原结合片段以约5x10-8 M或更低、例如约5x10-9 M或更低、约1x10-9 M或更低、约1x10-10 M或更低或约1x10-11 M或更低的平衡解离常数KD结合到所述抗原。
当在抗体或抗体片段的情形中使用时，“双表位的”是指所述抗体或片段特异性结合到同一个靶抗原分子上的两个非交叠表位的能力，尽管所述结合不必是同时的。
术语“对象”是指人类和非人类动物，包括所有脊椎动物例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所描述的方法的许多实施方式中，所述对象是人类。
本文中描述的实施方式不限于特定方法、试剂、化合物、组合物或生物体系，它们当然是可以变化的。
本文中描述了特异性结合Tau、优选为人类Tau的分离的单克隆抗体和抗原结合片段(“抗Tau抗体”)。人类Tau 2N4R(也被称为Tau441)在本文中被阐述为SEQ ID NO：181：MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQTPTEDGSEEPG SETSDAKSTPTAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEGTTAEEAGIGD TPSLEDEAAG HVTQARMVSK SKDGTGSDDKKAKGADGKTK IATPRGAAPP GQKGQANATR IPAKTPPAPK TPPSSGEPPK SGDRSGYSSP GSPGTPGSRSRTPSLPTPPT REPKKVAVVR TPPKSPSSAK SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP GGGKVQIINKKLDLSNVQSK CGSKDNIKHV PGGGSVQIVY KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRVQSKIGSLDNI THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN VSSTGSIDMVDSPQLATLAD EVSASLAKQG L。
人类Tau也指Tau变体，例如天然存在的等位基因变体，包括图1中示出的变体[2N4R(UniProt登记号P10636-8)；1N4R(UniProt登记号P10636-7)；0N4R(UniProt登记号P10636-6)；2N3R(UniProt登记号P10636-5)；1N3R(UniProt登记号P10636-4)；和0N3R(UniProt登记号P10636-2)]或相对于它们含有至少一个氨基酸替换的序列。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段是鼠类IgG或其衍生物。尽管所述抗Tau抗体或抗原结合片段可以是人类、人源化或嵌合的，但本文中示例的抗体或抗原结合片段是鼠类和人源化抗体。
在本文中描述的任何实施方式中，所述特异性结合Tau的抗体优选为IgG1，更优选为人类IgG1。实施例部分中公开的特异性结合Tau的抗体和抗原结合片段源自于小鼠。类似的抗体可以通过重组手段源自于任何物种。例如，所述抗体或抗原结合片段可以是嵌合的大鼠、山羊、马、猪、牛、鸡、兔、骆驼、驴、人等。为了用于向人类给药，非人类来源的抗体或抗原结合片段可以进行遗传或结构改变，以在给药到人类患者后抗原性更低。
在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或抗原结合片段是嵌合的。当在本文中使用时，术语“嵌合的”是指抗体或其抗原结合片段的至少一个可变结构域的至少某些部分源自于非人类哺乳动物、啮齿动物或爬行动物的抗体氨基酸序列，而所述抗体或其抗原结合片段的其余部分源自于人类。例如，嵌合抗体可以包含小鼠抗原结合结构域和人类Fc或其他这样的结构域。嵌合抗体用术语“xi”表示。
在某些实施方式中，所述特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段是人源化抗体或片段。人源化抗体可以是含有源自于非人类免疫球蛋白的极少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或抗体的其他抗原结合子序列)。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自于受体的互补决定区(CDR)的残基被来自于非人类物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和性和能力的CDR的残基代替。通常，所述人源化抗体包含基本上全部的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，并且所有或基本上所有的构架区是人类免疫球蛋白序列的构架区。所述人源化抗体可以包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人类免疫球蛋白的恒定区。人源化抗体重链或轻链在本文中用术语“zu”表示。
本文中描述的抗体或抗原结合片段可以以各种不同的形式出现，但将包括表1中示出的一个或多个抗体可变结构域区段或CDR。
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在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO：196中所阐述的重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，以及如SEQ ID NO：411中所阐述的轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)。在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO：268中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及如SEQ ID NO：465中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO：402中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及如SEQ ID NO：572中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：738基本上相同或一致的轻链CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：740基本上相同或一致的轻链CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：742基本上相同或一致的轻链CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：594基本上相同或一致的重链CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：596基本上相同或一致的重链CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：598基本上相同或一致的重链CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQ ID NO：738基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQ ID NO：740基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQ ID NO：742基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：594基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQ ID NO：596基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQ ID NO：598基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQID NO：738基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQID NO：740基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQID NO：742基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；并且还可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：594基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQ ID NO：596基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQ ID NO：598基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。
在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1008基本上相同或一致的轻链CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1010基本上相同或一致的轻链CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1012基本上相同或一致的轻链CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：864基本上相同或一致的重链CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：866基本上相同或一致的重链CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：868基本上相同或一致的重链CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQ ID NO：1008基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；与SEQ ID NO：1010基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；和与SEQ ID NO：1012基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：864基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；与SEQ ID NO：866基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；和与SEQ ID NO：868基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQ ID NO：1008基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；与SEQ ID NO：1010基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；和与SEQ ID NO：1012基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；并且还可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：864基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；与SEQ ID NO：866基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；和与SEQ ID NO：868基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。
在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：774基本上相同或一致的轻链CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：776基本上相同或一致的轻链CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：778基本上相同或一致的轻链CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：642基本上相同或一致的重链CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：644基本上相同或一致的重链CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：646基本上相同或一致的重链CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQ ID NO：774基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQ ID NO：776基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQ ID NO：778基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：642基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQ ID NO：644基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQ ID NO：646基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQID NO：774基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQID NO：776基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQID NO：778基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的，并且还可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：642基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQ ID NO：644基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQ ID NO：646基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。
在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1044基本上相同或一致的轻链CDR1氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1046基本上相同或一致的轻链CDR2氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1048基本上相同或一致的轻链CDR3氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：912基本上相同或一致的重链CDR1氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：914基本上相同或一致的重链CDR2氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：916基本上相同或一致的重链CDR3氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQ ID NO：1044基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的；与SEQ ID NO：1046基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的；和与SEQ ID NO：1048基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：912基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的；与SEQ ID NO：914基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的；和与SEQ ID NO：916基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQ ID NO：1044基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的；与SEQ ID NO：1046基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的；和与SEQ ID NO：1048基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的；并且还可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：912基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的；与SEQ ID NO：914基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的；和与SEQ ID NO：916基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照IMGT的方法所定义的。
在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：846基本上相同或一致的轻链CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：848基本上相同或一致的轻链CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：850基本上相同或一致的轻链CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：732基本上相同或一致的重链CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：734基本上相同或一致的重链CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：736基本上相同或一致的重链CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQ ID NO：846基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQ ID NO：848基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQ ID NO：850基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：732基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQ ID NO：734基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQ ID NO：736基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQID NO：846基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQID NO：848基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQID NO：850基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；并且还可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：732基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；与SEQ ID NO：734基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的；和与SEQ ID NO：736基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如按照Kabat的方法所定义的。
在某些实施方式中，所述抗Tau抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1116基本上相同或一致的轻链CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1118基本上相同或一致的轻链CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1120基本上相同或一致的轻链CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1002基本上相同或一致的重链CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1004基本上相同或一致的重链CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以包括与SEQ ID NO：1006基本上相同或一致的重链CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQ IDNO：1116基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；与SEQ ID NO：1118基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；和与SEQ ID NO：1120基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：1002基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；与SEQ ID NO：1004基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；和与SEQ ID NO：1006基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。所述抗体或抗原结合片段可以包括具有以下序列的轻链：与SEQ ID NO：1116基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；与SEQ ID NO：1118基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；和与SEQ ID NO：1120基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；并且还可以包括具有以下序列的重链：与SEQ ID NO：1002基本上相同或一致的CDR1氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；与SEQ ID NO：1004基本上相同或一致的CDR2氨基酸序列，正如由IMGT所定义的；和与SEQ ID NO：1006基本上相同或一致的CDR3氨基酸序列，正如由IMGT所定义的。
CDR的抗原结合排布也可以使用抗体样蛋白作为CDR支架进行工程化改造。这些工程化改造的抗原结合蛋白在本公开的范围之内。
在本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段的某些实施方式中，某些残基被改变以改进所述抗体或抗原结合片段的结合和/或折叠特征。例如，在所公开的单克隆抗体和抗原结合片段的某些实施方式中，按照Kabat的方法在所述轻链的第49位处的残基不是半胱氨酸。在所公开的单克隆抗体和抗原结合片段的某些实施方式中，按照Kabat的方法在所述轻链的第49位处的残基是丝氨酸。在本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段的某些实施方式中，按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基不是半胱氨酸。在某些实施方式中，按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基是丝氨酸。在本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段的某些实施方式中，按照Kabat的方法在所述轻链的第34位处的残基是谷氨酸。在本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段的某些实施方式中，按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基不是苯丙氨酸。按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基可以是酪氨酸。在本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段的某些实施方式中，按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基不是精氨酸。按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基可以是亮氨酸。在本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段的某些实施方式中，按照Kabat的方法在所述重链的第94位处的残基不是赖氨酸。在本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段的某些实施方式中，按照Kabat的方法在所述重链的第71位处的残基不是精氨酸。按照Kabat的方法在所述重链的第71位处的残基可以是缬氨酸。
所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：411基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ IDNO：411基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ IDNO：410基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个轻链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：196基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：196基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ ID NO：195基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个重链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO：411基本上相同或一致的氨基酸序列，并且所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO：196基本上相同或一致的氨基酸序列。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：411基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：196基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，提供了包括与SEQ ID NO：410基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：195基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。
所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：465基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ IDNO：465基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ IDNO：464基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个轻链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ ID NO：267基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个重链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO：465基本上相同或一致的氨基酸序列，并且所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的氨基酸序列。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：465基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，提供了包括与SEQ ID NO：464基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：267基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。
所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：581基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ IDNO：581基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ IDNO：580基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个轻链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ ID NO：267基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个重链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO：581基本上相同或一致的氨基酸序列，并且所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的氨基酸序列。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：581基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，提供了包括与SEQ ID NO：580基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：267基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。
所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ IDNO：545基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ IDNO：544基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个轻链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ ID NO：383基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个重链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列，并且所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的氨基酸序列。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，提供了包括与SEQ ID NO：544基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：383基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。
所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ IDNO：545基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ IDNO：544基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个轻链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ ID NO：392基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个重链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列，并且所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的氨基酸序列。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，提供了包括与SEQ ID NO：544基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：392基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。
所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ IDNO：545基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ IDNO：544基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个轻链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ ID NO：401基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个重链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列，并且所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的氨基酸序列。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，提供了包括与SEQ ID NO：544基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：401基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。
所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ IDNO：572基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ IDNO：571基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个轻链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ ID NO：383基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个重链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列，并且所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的氨基酸序列。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，提供了包括与SEQ ID NO：571基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：383基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。
所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ IDNO：572基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ IDNO：571基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个轻链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ ID NO：392基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个重链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列，并且所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的氨基酸序列。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，提供了包括与SEQ ID NO：571基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：392基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。
所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ IDNO：572基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ IDNO：571基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个轻链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括包含与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，包括与SEQ ID NO：401基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸可以编码这个重链可变结构域氨基酸序列。所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可以包括轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列，并且所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的氨基酸序列。在某些情况下，提供了编码与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，提供了包括与SEQ ID NO：571基本上相同或一致的序列和与SEQ ID NO：401基本上相同或一致的序列的分离的多核苷酸。
在某些实施方式中，所述特异性结合Tau的抗体由2017年10月11日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(10801University Blvd.,Manassas,Virginia 20110-2209)并已被指派登记号PTA-124523或PTA-124524的抗体生产细胞生产。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段对由所述保藏的抗体生产细胞生产的抗体的单体野生型2N4R Tau具有结合亲和性，正如通过表面等离子体共振所测量的。在某些实施方式中，所述公开的抗体或其抗原结合片段包含由所述保藏的抗体生产细胞生产的抗体的轻链和重链CDR。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含由所述保藏的抗体生产细胞生产的抗体的轻链和重链可变区。
本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段包括具有单个或多个氨基酸替换、缺失或添加的保留了所描述的抗体或抗原结合片段的生物学性质(例如结合亲和性或免疫效应物活性)的变体。专业技术人员可以生产具有单个或多个氨基酸替换、缺失或添加的变体。这些变体可以包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸替换的变体，(b)其中一个或多个氨基酸被添加到所述多肽或从所述多肽缺失的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体，和(d)其中所述多肽与另一个肽或多肽例如融合配偶体、蛋白质标签或可以为所述多肽提供有用性质的其他化学组成部分例如抗体的表位、聚组氨酸序列、生物素组成部分等融合的变体。本文中描述的抗体或抗原结合片段可以包括其中在保守或非保守位置处来自于一个物种的氨基酸残基被另一个物种中的相应残基替换的变体。在其他实施方式中，非保守位置处的氨基酸残基被保守或非保守残基替换。用于获得这些变体的技术包括遗传(抑制、缺失、突变等)、化学和酶学技术，对于本领域普通技术人员来说是已知的。
本文中描述的抗体或抗原结合片段对野生型单体2N4R Tau的结合亲和性(以nM为单位)包括通过表面等离子体共振测量的小于约1x10-8 M的解离常数(KD)。在某些实施方式中，本文中描述的抗体或抗原结合片段对野生型单体2N4R Tau的结合亲和性(以nM为单位)包括通过表面等离子体共振测量的小于约0.5nM的解离常数(KD)。在某些实施方式中，本文中描述的抗体或抗原结合片段对野生型单体2N4R Tau的结合亲和性(以nM为单位)包括通过表面等离子体共振测量的小于约0.3nM的解离常数(KD)。在某些实施方式中，本文中描述的抗体或抗原结合片段对野生型单体2N4R Tau的结合亲和性(以nM为单位)包括通过表面等离子体共振测量的小于约0.2nM的解离常数(KD)。在某些实施方式中，本文中描述的抗体或抗原结合片段对野生型单体2N4R Tau的结合亲和性(以nM为单位)包括通过表面等离子体共振测量的小于约0.15nM的解离常数(KD)。在某些实施方式中，本文中描述的抗体或抗原结合片段对野生型单体2N4R Tau的结合亲和性(以nM为单位)包括通过表面等离子体共振测量的小于约0.1nM的解离常数(KD)。
在本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段的任何实施方式中，所述抗体或抗原结合片段可以结合包含HVPG(SEQ ID NO：1133)的表位。在某些实施方式中，本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段是双表位的。在某些情况下，本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段结合Tau内包含HVPG(SEQ ID NO：1133)的一个或多个表位。这个序列在人类2N4R Tau中出现两次。第一个位点在2N4R Tau中第二重复区内的第299-302位残基处，第二个位点在第四重复区内的第362-365位残基处。
在本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段的任何实施方式中，所述抗体或抗原结合片段可以结合包含HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位。在某些实施方式中，本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段是双表位的。在某些情况下，本文中描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段结合Tau内包含HVPGG(SEQ ID NO：79)的一个或多个表位。这个序列在人类2N4R Tau中出现两次。第一个位点在2N4R Tau中第二重复区内的第299-303位残基处，第二个位点在第四重复区内的第362-366位残基处。在某些情况下，所述特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段与Tau中重复区2或重复区4内包含HVPGG(SEQ IDNO：79)的表位结合的肽结合偏好性比与Tau中重复区3内包含HKPGG(SEQ ID NO：182)的表位的结合高至少10倍、优选地至少20倍、更优选地至少30倍，正如通过肽结合测定法(例如实施例3中描述的肽结合测定法)所确定的。在某些情况下，所述特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段与Tau中重复区2或重复区4内包含HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位结合的肽结合偏好性比与Tau中重复区1内包含HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位的结合高至少10倍、优选地至少20倍、更优选地至少30倍，正如通过肽结合测定法(例如实施例3中描述的肽结合测定法)所确定的。在某些情况下，所述特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段与Tau中重复区2或重复区4内包含HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位结合的肽结合偏好性比与Tau中重复区3内包含HKPGG(SEQ ID NO：182)的表位的结合高至少10倍、优选地至少20倍、更优选地至少30倍，并且比与重复区1内包含HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位的结合高至少10倍、优选地至少20倍、更优选地至少30倍，正如通过肽结合测定法(例如实施例3中描述的肽结合测定法)所确定的。在某些情况下，所述特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段不结合天然存在的突变体P301S Tau中重复区2内包含HVSGG(SEQ ID NO：184)的表位，正如通过肽结合测定法(例如实施例4中描述的肽结合测定法)所确定的。在某些情况下，所述特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段不结合天然存在的突变体P301L Tau中重复区2内包含HVLGG(SEQ ID NO：185)的表位，正如通过肽结合测定法(例如实施例4中描述的肽结合测定法)所确定的。氨基酸序列HVSGG(SEQ ID NO：184)存在于P301S体外和体内Tau蛋白病模型的2N4R Tau序列中的第299-303位残基处。氨基酸序列HVLGG(SEQ ID NO：185)存在于P301L体外和体内Tau蛋白病模型的2N4R Tau序列中的第299-303位残基处。相对于重复区3内包含HKPGG(SEQ IDNO：182)或重复区1内包含HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位优选地结合Tau中重复区2或重复区4内包含HVPGG(SEQ ID NO：79)的一个或多个表位并且不结合重复区2内包含HVSGG(SEQID NO：184)或HVLGG(SEQ ID NO：185)的表位的本文中提供的抗体或抗原结合片段，在第362-366位残基处结合2N4R Tau P301S/L。令人吃惊的是，正如在本文中所证实的，所述相对于重复区3内包含HKPGG(SEQ ID NO：182)或重复区1内包含HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位优选地结合Tau中重复区2或重复区4内包含HVPGG(SEQ ID NO：79)的一个或多个表位并且对重复区2内包含HVSGG(SEQ ID NO：184)或HVLGG(SEQ ID NO：185)的表位不表现出结合的抗体或抗原结合片段，在体内减少Tau接种和传播。
在某些实施方式中，提供了标记的抗Tau抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或组成部分(例如荧光、发色、电子致密、化学发光或放射活性标记物)和间接检测(例如通过酶反应或分子相互作用)的标记物和组成部分(例如酶或配体)。示例性的标记物包括但不限于放射性标记物(例如32P、14C、111I、125I、3H、131I)、荧光标记物(例如DyLightTM649)、表位标签、生物素、发色团标记物、ECL标记物或酶。更具体来说，所描述的标记物包括钌、111In-DOTA、111In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、
Figure BDA0002444534010001581
嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料、AlexafluorTM染料等。
还公开了编码特异性结合到Tau的抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：738基本上相同或一致的根据Kabat定义的轻链CDR1序列的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：737。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：740基本上相同或一致的根据Kabat定义的轻链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：739。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：742基本上相同或一致的根据Kabat定义的轻链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：741。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：594基本上相同或一致的根据Kabat定义的重链CDR1的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：593。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQID NO：596基本上相同或一致的根据Kabat定义的重链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：595。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：598基本上相同或一致的根据Kabat定义的重链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：597。所述分离的多核苷酸可以编码具有下述轻链的抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO：738基本上相同或一致的CDR1例如SEQ ID NO：737，与SEQ ID NO：740基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：739，和与SEQ ID NO：742基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：741，正如根据Kabat所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：594基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQ ID NO：593，与SEQ ID NO：596基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：595，和与SEQ ID NO：598基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：597，正如根据Kabat所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：738基本上相同或一致的轻链CDR1例如SEQ ID NO：737，由与SEQ ID NO：740基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ IDNO：739编码的CDR2，和由与SEQ ID NO：742基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ IDNO：741编码的CDR3；以及与SEQ ID NO：594基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQ ID NO：593，与SEQ ID NO：596基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：595，和与SEQ ID NO：598基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：597，正如根据Kabat所定义的。
在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1008基本上相同或一致的根据IMGT定义的轻链CDR1序列的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1007。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1010基本上相同或一致的根据IMGT定义的轻链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1009。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1012基本上相同或一致的根据IMGT定义的轻链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1011。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：864基本上相同或一致的根据IMGT定义的重链CDR1的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：863。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：866基本上相同或一致的根据IMGT定义的重链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：865。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ IDNO：868基本上相同或一致的根据IMGT定义的重链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQID NO：867。所述分离的多核苷酸可以编码具有下述轻链的抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO：1008基本上相同或一致的CDR1例如SEQ ID NO：1007，与SEQ ID NO：1010基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：1009，和与SEQ ID NO：1012基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：1011，正如根据IMGT所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：864基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQID NO：863，与SEQ ID NO：866基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：865，和与SEQ IDNO：868基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：867，正如根据IMGT所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：1008基本上相同或一致的轻链CDR1例如SEQ ID NO：1007，由与SEQ ID NO：1010基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：1009编码的CDR2，和由与SEQ ID NO：1012基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：1011编码的CDR3；以及与SEQ ID NO：864基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQ ID NO：863，与SEQ ID NO：866基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：865，和与SEQ ID NO：868基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：867，正如根据IMGT所定义的。
在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：774基本上相同或一致的根据Kabat定义的轻链CDR1序列的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：773。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：776基本上相同或一致的根据Kabat定义的轻链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：775。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：778基本上相同或一致的根据Kabat定义的轻链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：777。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：642基本上相同或一致的根据Kabat定义的重链CDR1的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：641。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：644基本上相同或一致的根据Kabat定义的重链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：643。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQID NO：646基本上相同或一致的根据Kabat定义的重链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：645。所述分离的多核苷酸可以编码具有下述轻链的抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO：774基本上相同或一致的CDR1例如SEQ ID NO：773，与SEQ ID NO：776基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：775，和与SEQ ID NO：778基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：777，正如根据Kabat所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：642基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQID NO：641，与SEQ ID NO：644基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：643，和与SEQ IDNO：646基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：645，正如根据Kabat所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：774基本上相同或一致的轻链CDR1例如SEQ ID NO：773，由与SEQ ID NO：776基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：775编码的CDR2，和由与SEQ ID NO：778基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：777编码的CDR3；以及与SEQ ID NO：642基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQ ID NO：641，与SEQ ID NO：644基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：643，和与SEQID NO：646基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：645，正如根据Kabat所定义的。
在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1044基本上相同或一致的根据IMGT定义的轻链CDR1序列的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1043。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1046基本上相同或一致的根据IMGT定义的轻链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1045。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1048基本上相同或一致的根据IMGT定义的轻链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1047。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：912基本上相同或一致的根据IMGT定义的重链CDR1的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：911。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：914基本上相同或一致的根据IMGT定义的重链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：913。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ IDNO：916基本上相同或一致的根据IMGT定义的重链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQID NO：915。所述分离的多核苷酸可以编码具有下述轻链的抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO：1044基本上相同或一致的CDR1例如SEQ ID NO：1043，与SEQ ID NO：1046基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：1045，和与SEQ ID NO：1048基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：1047，正如根据IMGT所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：912基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQID NO：911，与SEQ ID NO：914基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：913和与SEQ IDNO：916基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：915，正如根据IMGT所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：1044基本上相同或一致的轻链CDR1例如SEQ ID NO：1043，由与SEQ ID NO：1046基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：1045编码的CDR2，和由与SEQ ID NO：1048基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：1047编码的CDR3，以及与SEQ ID NO：912基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQ ID NO：911，与SEQ ID NO：914基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：913，和与SEQ ID NO：916基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：915，正如根据IMGT所定义的。
在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：846基本上相同或一致的根据Kabat所定义的轻链CDR1序列的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：845。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：848基本上相同或一致的根据Kabat所定义的轻链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：847。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：850基本上相同或一致的根据Kabat所定义的轻链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：849。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：732基本上相同或一致的根据Kabat所定义的重链CDR1的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：731。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：734基本上相同或一致的根据Kabat所定义的重链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：733。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：736基本上相同或一致的根据Kabat所定义的重链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：735。所述分离的多核苷酸可以编码具有下述轻链的抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO：846基本上相同或一致的CDR1例如SEQ IDNO：845，与SEQ ID NO：848基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：847，和与SEQ ID NO：850基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：849，正如根据Kabat所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：732基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQ ID NO：731，与SEQ ID NO：734基本上相同或一致的CDR2例如SEQ IDNO：733，和与SEQ ID NO：736基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：735，正如根据Kabat所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ IDNO：846基本上相同或一致的轻链CDR1例如SEQ ID NO：845，由与SEQ ID NO：848基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：847编码的CDR2，和由与SEQ ID NO：850基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：849编码的CDR3，以及与SEQ ID NO：732基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQ ID NO：731，与SEQ ID NO：734基本上相同或一致的CDR2例如SEQ IDNO：733，和与SEQ ID NO：736基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：735，正如根据Kabat所定义的。
在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1116基本上相同或一致的根据IMGT定义的轻链CDR1序列的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1115。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1118基本上相同或一致的根据IMGT定义的轻链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1117。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1120基本上相同或一致的根据IMGT定义的轻链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1119。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1002基本上相同或一致的根据IMGT定义的重链CDR1的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1001。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQ ID NO：1004基本上相同或一致的根据IMGT定义的重链CDR2的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1003。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码具有与SEQID NO：1006基本上相同或一致的根据IMGT定义的重链CDR3的抗体或其抗原结合片段，例如SEQ ID NO：1005。所述分离的多核苷酸可以编码具有下述轻链的抗体或其抗原结合片段，所述轻链具有与SEQ ID NO：1116基本上相同或一致的CDR1例如SEQ ID NO：1115，与SEQ IDNO：1118基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：1117，和与SEQ ID NO：1120基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：1119，正如根据IMGT所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：1002基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQ ID NO：1001，与SEQ ID NO：1004基本上相同或一致的CDR2例如SEQ ID NO：1003，和与SEQ ID NO：1006基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：1005，正如根据IMGT所定义的。所述分离的多核苷酸可以编码一种抗体或其抗原结合片段，其具有与SEQ ID NO：1116基本上相同或一致的轻链CDR1例如SEQ ID NO：1115，由与SEQ ID NO：1118基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：1117编码的CDR2，和由与SEQ ID NO：1120基本上相同或一致的核苷酸序列例如SEQ ID NO：1119编码的CDR3，以及与SEQ ID NO：1002基本上相同或一致的重链CDR1例如SEQ ID NO：1001，与SEQ ID NO：1004基本上相同或一致的CDR2例如SEQID NO：1003，和与SEQ ID NO：1006基本上相同或一致的CDR3例如SEQ ID NO：1005，正如根据IMGT所定义的。
本文中描述的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：411基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：410。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：196基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：195。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或抗原结合片段，其具有包括与SEQ ID NO：411基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段，例如SEQ ID NO：410，和包括与SEQ ID NO：196基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段，例如SEQ IDNO：195。本文中提供的能够编码可变结构域区段的分离的多核苷酸可以被包括在相同或不同载体上，以生产抗体或抗原结合片段。
本文中描述的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：465基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：464。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：267。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或抗原结合片段，其具有包括与SEQ ID NO：465基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段，例如SEQ ID NO：464，和包括与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段，例如SEQ IDNO：267。本文中提供的能够编码可变结构域区段的分离的多核苷酸可以被包括在相同或不同载体上，以生产抗体或抗原结合片段。
本文中描述的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：581基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：580。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：267。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或抗原结合片段，其具有包括与SEQ ID NO：581基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段，例如SEQ ID NO：580，和包括与SEQ ID NO：268基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段，例如SEQ IDNO：267。本文中提供的能够编码可变结构域区段的分离的多核苷酸可以被包括在相同或不同载体上，以生产抗体或抗原结合片段。
本文中描述的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：544。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：383。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或抗原结合片段，其具有包括与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段，例如SEQ ID NO：544，和包括与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段，例如SEQ IDNO：383。本文中提供的能够编码可变结构域区段的分离的多核苷酸可以被包括在相同或不同载体上，以生产抗体或抗原结合片段。
本文中描述的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：544。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：392。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或抗原结合片段，其具有包括与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段，例如SEQ ID NO：544，和包括与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段，例如SEQ IDNO：392。本文中提供的能够编码可变结构域区段的分离的多核苷酸可以被包括在相同或不同载体上，以生产抗体或抗原结合片段。
本文中描述的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：544。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：401。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或抗原结合片段，其具有包括与SEQ ID NO：545基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段，例如SEQ ID NO：544，和包括与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段，例如SEQ IDNO：401。本文中提供的能够编码可变结构域区段的分离的多核苷酸可以被包括在相同或不同载体上，以生产抗体或抗原结合片段。
本文中描述的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：571。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：383。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或抗原结合片段，其具有包括与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段，例如SEQ ID NO：571，和包括与SEQ ID NO：384基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段，例如SEQ IDNO：383。本文中提供的能够编码可变结构域区段的分离的多核苷酸可以被包括在相同或不同载体上，以生产抗体或抗原结合片段。
本文中描述的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：571。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：392。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或抗原结合片段，其具有包括与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段，例如SEQ ID NO：571，和包括与SEQ ID NO：393基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段，例如SEQ IDNO：392。本文中提供的能够编码可变结构域区段的分离的多核苷酸可以被包括在相同或不同载体上，以生产抗体或抗原结合片段。
本文中描述的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：571。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码具有包括与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段的抗体或抗原结合片段，例如SEQ ID NO：401。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸可以编码抗体或抗原结合片段，其具有包括与SEQ ID NO：572基本上相同或一致的氨基酸序列的轻链可变结构域区段，例如SEQ ID NO：571，和包括与SEQ ID NO：402基本上相同或一致的氨基酸序列的重链可变结构域区段，例如SEQ IDNO：401。本文中提供的能够编码可变结构域区段的分离的多核苷酸可以被包括在相同或不同载体上，以生产抗体或抗原结合片段。
本文中提供的能够编码可变结构域区段的多核苷酸可以被包括在相同或不同的载体上，以生产抗体或抗原结合片段。编码工程化改造的抗原结合蛋白的多核苷酸也在本公开的范围之内。在某些实施方式中，所描述的多核苷酸(和它们编码的肽)包括前导序列。可以使用本领域中已知的任何前导序列。所述前导序列可以包括但不限于限制性位点或翻译起始位点。
还提供了包含本文中描述的多核苷酸的载体。所述载体可以是表达载体。因此，含有编码感兴趣的多肽的序列的重组表达载体被设想为在本公开的范围之内。所述表达载体可以含有一个或多个另外的序列，例如但不限于调控序列(例如启动子、增强子)、选择标记和多腺苷化信号。用于转化广范的各种不同宿主细胞的载体是公知的，并且包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、杆状病毒、杆粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)以及其他细菌、酵母和病毒载体。
在本说明书的范围之内的重组表达载体包括编码至少一种重组蛋白的合成的、基因组或cDNA来源的核酸片段，其可以被可操作连接到适合的调控元件。这些调控元件可以包括转录启动子、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译的终止的序列。表达载体、特别是哺乳动物表达载体也可以包括一个或多个非转录元件，例如复制原点、连接到待表达的基因的适合的启动子和增强子、其他5'或3'侧翼非转录序列、5'或3'非翻译序列(例如必需的核糖体结合位点)、多腺苷化位点、剪接供体和受***点或转录终止序列。也可以包含提供在宿主中复制的能力的复制原点。
可用于转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列可以由病毒来源提供。示例性载体可以如Okayama和Berg,3Mol.Cell.Biol.280(1983)所述来构建。
在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段编码序列被置于强有力的组成型启动子例如用于下述基因的启动子的控制之下：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，腺苷脱氨酶，丙酮酸激酶，β-肌动蛋白，人类肌球蛋白，人类血红蛋白，人类肌肉肌酸等。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地起作用，并适合与所描述的实施方式一起使用。这些病毒启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，SV40的早期和晚期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，马洛尼白血病病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、Epstein Barr病毒(EBV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和其他反转录病毒的长末端重复序列(LTR)，以及单纯性疱疹病毒的胸苷激酶启动子。在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段编码序列被置于诱导型启动子的控制之下，例如金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、多西环素诱导型启动子、含有一个或多个干扰素刺激的响应元件(ISRE)的启动子例如蛋白激酶R 2',5'-寡聚腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1的启动子等。
本文中描述的载体可以含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。在融合载体中包含IRES序列可能对提高某些蛋白质的表达有益。在某些实施方式中，所述载体***包括一个或多个多腺苷化位点(例如SV40)，其可以在任何上述核酸序列的上游或下游。载体组分可以毗邻连接，或者以为表达基因产物提供最佳间隔的方式排列(即通过在ORF之间引入“间隔物”核苷酸)或以另一种方式放置。调控元件例如IRES基序也可以被安排成为表达提供最佳间隔。
所述载体可以包含本领域中公知的选择标记。选择标记包括正和负选择标记，例如抗生素抗性基因(例如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、青霉素抗性基因)、谷氨酸合酶基因、用于更昔洛韦选择的HSV-TK、HSV-TK衍生物或用于6-甲基嘌呤选择的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等，7Gene Ther.1738-1743(2000))。编码选择标记的核酸序列或克隆位点可以在编码感兴趣的多肽的核酸序列或克隆位点的上游或下游。
本文中描述的载体可用于用编码所描述的抗体或抗原结合片段的基因转化各种不同细胞。例如，所述载体可用于产生抗体或抗原结合片段生产细胞。因此，另一方面描述了用载体转化的宿主细胞，所述载体包含编码特异性结合Tau的抗体或其抗原结合片段例如本文中描述和示例的抗体或抗原结合片段的核酸序列。
用于将外来基因引入到细胞中的大量技术在本领域中是已知的，并且可用于构建重组细胞，用于根据本文中描述和示例的各种不同实施方式执行所描述的方法的目的。所使用的技术应该提供所述异源基因序列向宿主细胞的稳定转移，使得所述异源基因序列可遗传并且可以被细胞后代表达，并使得所述受体细胞必需的发育和生理功能不被破坏。可以使用的技术包括但不限于染色体转移(例如细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移)、物理方法(例如转染、原生质球融合、微注射、电穿孔、脂质体载体)、病毒载体转移(例如重组DNA病毒、重组RNA病毒)等(描述在Cline,29Pharmac.Ther.69-92(1985)中)。磷酸钙沉淀和聚乙二醇(PEG)诱导的细菌原生质体与哺乳动物细胞的融合也可用于转化细胞。
适合用于本文中描述的抗体或抗原结合片段的表达的细胞优选为真核细胞，更优选为植物、啮齿动物或人类来源的细胞，包括但不限于NS0、CHO、CHOK1、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK293细胞、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L cells、C127、3T3、HeLa、NS1和Sp2/0骨髓瘤细胞系等。此外，抗体的表达可以使用杂交瘤细胞来实现。生产杂交瘤的方法在本领域中是已确立的。
用本文中描述的表达载体转化的细胞可以被选择或筛选，以用于本文中描述的抗体或抗原结合片段的重组表达。将重组阳性细胞扩增并筛选表现出所需表型例如高水平表达、提高的生长性能或产生例如由于蛋白质修饰或改变的翻译后修饰而具有所需生化特性的蛋白质的能力的亚克隆。这些表型可能是由给定亚克隆的固有性质或突变造成的。突变可以通过使用化学品、UV波长的光、辐射、病毒、***性诱变剂、DNA错配修复的抑制或这些方法的组合来实现。
在某些实施方式中，提供了表达本文中描述的任何抗Tau抗体的分离的细胞系。在一个实施方式中，所述分离的细胞系是杂交瘤。在一个实施方式中，所述分离的细胞系是产生单克隆抗体7G6的杂交瘤。在一个实施方式中，所述分离的细胞系是产生7G6-HCzu8-LCzu6-HEK的
Figure BDA0002444534010001721
293-F细胞，并且所述细胞系已于2017年10月11日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Va.,USA)，ATCC专利保藏名称为PTA-124523。在一个实施方式中，所述分离的细胞系是产生7G6-HCzu25-LCzu18-HEK的
Figure BDA0002444534010001722
293-F细胞，并且所述细胞系已于2017年10月11日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Va.,USA)，ATCC专利保藏名称为PTA-124524。
本文中提供的表达所提供的抗Tau抗体或抗原结合片段的细胞可用于生产所述抗Tau抗体或抗原结合片段的方法中，所述方法包括将所述细胞在适合于相应抗体或抗原结合片段的表达的条件下培养。在某些实施方式中，从培养基回收所述抗Tau抗体或抗原结合片段。
在某些实施方式中，本文中提供的任何特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段可用于检测生物样品中Tau的存在。当在本文中使用时，术语“检测”涵盖了定量或定性检测。在某些实施方式中，所述生物样品可以源自于细胞或组织，例如脑脊液、脑的细胞或组织(例如皮层或海马)、或血液、组织学制备物等。在某些实施方式中，所述方法包括通过将所述生物样品与下述物质接触来检测样品中的Tau：
(a)抗体ms7G6、抗体7G6-HCzu8-LCzu6、抗体7G6-HCzu8-LCzu21、抗体7G6-HCzu23-LCzu15、抗体7G6-HCzu24-LCzu15、抗体7G6-HCzu25-LCzu15、抗体7G6-HCzu23-LCzu18、抗体7G6-HCzu24-LCzu18、抗体7G6-HCzu25-LCzu18或其抗原结合片段中的任一者；
(b)包含表1中所描述的抗体ms7G6、抗体7G6-HCzu8-LCzu6或抗体7G6-HCzu25-LCzu18的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段；
(c)包含如表1中所描述的抗体ms7G6、抗体7G6-HCzu8/LCzu6、抗体7G6-HCzu8/LCzu21、抗体7G6-HCzu23/LCzu15、抗体7G6-HCzu24/LCzu15、抗体7G6-HCzu25/LCzu15、抗体7G6-HCzu23/LCzu18、抗体7G6-HCzu24/LCzu18或抗体7G6-HCzu25/LCzu18中的任一者的重链可变结构域区段和轻链可变结构域区段的抗体或其抗原结合片段；或
(d)具有由ATCC保藏的登记号为PTA-124523或PTA-124524的细胞系中的任一者生产的抗体的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述方法包括将所述生物样品与本文中所提供的抗Tau抗体在允许所述抗Tau抗体与Tau结合的条件下相接触，并检测所述抗Tau抗体与Tau之间是否形成复合物。在这些方法的某些实施方式中，所述抗Tau抗体被可检测地标记。所述方法可以是体外或体内方法。可以将测试生物样品中在抗Tau抗体与Tau之间形成的复合物与对照生物样品(例如来自于健康对象的生物样品)中形成的复合物进行比较。也可以对测试生物样品中在抗Tau抗体与Tau之间形成的复合物的量进行定量，并与对照生物样品中形成的复合物的量或已知在健康对象中形成的复合物的平均量进行比较。
另一方面，本发明提供了包含本文中所描述的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段中的任一者的药物制剂，其例如用于本文中提供的任何治疗方法。在某些实施方式中，药物制剂包含本文中提供的特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段中的任一者和可药用载体。
本文中所描述的抗Tau抗体或抗原结合片段的药物制剂通过将具有所需纯度水平的这种抗体或抗原结合片段与一种或多种任选的可药用载体、稀释剂和/或赋形剂(《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol,A.主编(1980))混合，以冻干制剂或水性溶液的形式来制备。可药用载体、稀释剂和赋形剂通常在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：无菌水，缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸，抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸，防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、氯化六甲铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)，低分子量(小于约10个残基)多肽，蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸，单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精，螯合剂例如EDTA，糖类例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇，形成盐的平衡离子例如钠，金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)，和/或非离子型表面活性剂例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEXTM,Baxter International,Inc.)。包括rHuPH20在内的某些示例性sHASEGP和使用方法被描述在美国专利号7,871,607和美国公开号2006/0104968中。一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶相组合。
美国专利号6,267,958中描述了示例性的冷冻干燥抗体制剂。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所描述的，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
在药物制剂中作为活性成分的抗Tau抗体或抗原结合片段可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊中，在胶体药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或在粗乳液中。这类技术被公开在《Remington制药学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)第16版，Osol,A.主编(1980)中。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合的实例包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为塑形制品例如膜或微胶囊的形式。
用于体内给药的制剂通常是无菌的。无菌性可以例如通过无菌过滤膜过滤容易地实现。
本文中提供的任何特异性结合Tau的抗体或抗原结合片段(或其制剂)可用于治疗方法中。
一方面，提供了用作药物的抗Tau抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，提供了用于减少不溶性Tau的抗Tau抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，提供了用于抑制Tau聚集的抗Tau抗体或抗原结合片段。另一方面，提供了用于治疗Tau蛋白病的抗Tau抗体或抗原结合片段。可以用所公开的抗Tau抗体或抗原结合片段治疗的示例性的Tau蛋白病包括阿尔茨海默氏病(AD)、进行性核上性麻痹(PSP)和额颞叶痴呆(FTD)。可以治疗的示例性FTD是匹克氏病(PiD)。
在某些实施方式中，提供了用于治疗方法中的抗Tau抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，提供了在减少对象中的不溶性Tau的方法中使用的抗Tau抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，提供了在对象中抑制Tau聚集的方法中使用的抗Tau抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，提供了在治疗患有Tau蛋白病的对象的方法中使用的抗Tau抗体或抗原结合片段。Tau蛋白病的治疗方法包括以有效治疗所述Tau蛋白病的量向所述对象给药所述抗Tau抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，所述Tau蛋白病是上述Tau蛋白病中的任一者。在优选实施方式中，所述对象是哺乳动物，优选为人类。
另一方面，本文还提供了本文中所描述的抗Tau抗体或抗原结合片段在制造或制备药物中的用途。在某些实施方式中，所述药物用于减少不溶性Tau。在某些实施方式中，所述药物用于抑制Tau聚集。在某些实施方式中，所述药物用于治疗Tau蛋白病。在某些实施方式中，所述Tau蛋白病是上述Tau蛋白病中的任一者。
本文中所描述的抗Tau抗体或抗原结合片段可以通过任何适合的方式给药，包括肠胃外、肺内和鼻内，以及如果需要局部治疗的话，病灶内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。给药可以通过任何适合的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，这部分取决于所述给药是简短的还是长期的。本文中设想了各种不同的给药方案，包括但不限于在各个不同的时间点单次或多次给药、快速浓注给药和脉冲式输注。
本文中提供的抗Tau抗体或抗原结合片段以与良好医学实践相一致的方式配制、定量和给药。在这种情况下考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、所述障碍的病因、药剂的递送位点、给药方法、给药日程安排和医学从业人员已知的其他因素。
对于疾病的预防或治疗来说，所述抗Tau抗体或抗原结合片段的适合剂量取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和过程、所述抗体或抗原结合片段的给药是用于预防还是治疗目的、以前的治疗、患者的临床史和对所述抗体的响应、和主治医师的判断。所述抗体或抗原结合片段适合于一次性或在一系列治疗中给药到所述患者。取决于所述疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg的抗体或抗原结合片段可以作为用于给药到所述患者的初始候选剂量，不论是例如通过一次或多次分开的给药还是通过连续输注。取决于上面提到的因素，一种典型的每日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于取决于病症在几天或更长时间内的重复给药来说，治疗通常持续直至发生疾病症状的所需抑制。所述抗体或抗原结合片段的一种示例性剂量在约0.05mg/kg至约100mg/kg的范围内。因此，可以向所述患者给药约0.5mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg中的一种或多种剂量(或其任何组合)。这些剂量可以被间歇地例如每周或每三周给药(例如使得所述患者接受约2至约20剂或例如约6剂所述抗体)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一次或多次较低的剂量。然而，其他给药方案也可能是有用的。这种疗法的进展可以通过常规技术和测定法来监测。
本文中还提供了一种制成品，其含有可用于上述障碍的治疗、预防和/或诊断的材料。所述制成品包含容器和在所述容器上或与其相伴的标签或包装说明书。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由各种不同的材料例如玻璃或塑料形成。所述容器装有组合物自身或所述组合物与有效治疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物的组合，并且可以具有无菌接入端口(例如所述容器可以是具有可以用皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。所述组合物中的活性剂是本文中所描述的抗Tau抗体或抗原结合片段。所述标签或包装说明书指示了所述组合物用于治疗选择的病症。可选地或此外，所述制成品还可以包含第二个容器，其包含可药用缓冲液例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户观点来看需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
说明性实施方式
这里提供了所公开的技术的说明性实施方式。这些实施方式仅仅是说明性的，并且不限制本公开及其随附的权利要求书的范围。
实施方式1.一种特异性结合人类Tau的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含：
如SEQ ID NO：196中所阐述的重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，以及如SEQ ID NO：411中所阐述的轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)；
如SEQ ID NO：268中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：465中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
如SEQ ID NO：402中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：572中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
实施方式2.根据实施方式1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中：
所述HCDR1包含SEQ ID NO：594，所述HCDR2包含SEQ ID NO：596，所述HCDR3包含SEQ ID NO：598，所述LCDR1包含SEQ ID NO：738，所述LCDR2包含SEQ ID NO：740，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：742，正如按照Kabat的方法所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：864，所述HCDR2包含SEQ ID NO：866，所述HCDR3包含SEQ ID NO：868，所述LCDR1包含SEQ ID NO：1008，所述LCDR2包含SEQ ID NO：1010，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：1012，正如由IMGT所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：642，所述HCDR2包含SEQ ID NO：644，所述HCDR3包含SEQ ID NO：646，所述LCDR1包含SEQ ID NO：774，所述LCDR2包含SEQ ID NO：776，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：778，正如按照Kabat的方法所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：912，所述HCDR2包含SEQ ID NO：914，所述HCDR3包含SEQ ID NO：916，所述LCDR1包含SEQID NO：1044，所述LCDR2包含SEQ ID NO：1046，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：1048，正如由IMGT所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：732，所述HCDR2包含SEQ ID NO：734，所述HCDR3包含SEQ ID NO：736，所述LCDR1包含SEQ ID NO：846，所述LCDR2包含SEQ ID NO：848，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：850，正如按照Kabat的方法所定义的；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO：1002，所述HCDR2包含SEQ ID NO：1004，所述HCDR3包含SEQ ID NO：1006，所述LCDR1包含SEQ ID NO：1116，所述LCDR2包含SEQ ID NO：1118，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：1120，正如由IMGT所定义的。
实施方式3.根据实施方式1或2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第49位处的残基不是半胱氨酸。
实施方式4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第49位处的残基是丝氨酸。
实施方式5.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基不是半胱氨酸。
实施方式6.根据实施方式5所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基是丝氨酸。
实施方式7.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第34位处的残基是谷氨酸。
实施方式8.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基不是苯丙氨酸。
实施方式9.根据实施方式8所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基是酪氨酸。
实施方式10.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基不是精氨酸。
实施方式11.根据实施方式10所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基是亮氨酸。
实施方式12.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第94位处的残基不是赖氨酸。
实施方式13.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，按照Kabat的方法在所述重链的第71位处的残基不是精氨酸。
实施方式14.根据实施方式13所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法所述重链的第71位是缬氨酸。
实施方式15.根据实施方式1或实施方式2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述抗体包含：
包含SEQ ID NO：268的重链可变结构域(HCVD)和包含SEQ ID NO：465的轻链可变结构域(LCVD)；
包含SEQ ID NO：268的HCVD和包含SEQ ID NO：581的LCVD；
包含SEQ ID NO：384的HCVD和包含SEQ ID NO：545的LCVD；
包含SEQ ID NO：393的HCVD和包含SEQ ID NO：545的LCVD；
包含SEQ ID NO：402的HCVD和包含SEQ ID NO：545的LCVD；
包含SEQ ID NO：384的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD；
包含SEQ ID NO：393的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD；或
包含SEQ ID NO：402的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD。
实施方式16.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体由具有ATCC保藏号PTA-124523的细胞系生产。
实施方式17.根据实施方式1至15中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体由具有ATCC保藏号PTA-124524的细胞系生产。
实施方式18.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是鼠类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
实施方式19.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1。
实施方式20.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体以通过表面等离子体共振所测量的低于约0.5nM的KD结合单体野生型人类2N4RTau。
实施方式21.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在包含氨基酸序列HVPG(SEQ ID NO：1133)的表位处结合到人类Tau。
实施方式22.根据实施方式21所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双表位的，并在重复区2或重复区4内包含氨基酸序列HVPG(SEQ ID NO：1133)的表位处结合到人类Tau。
实施方式23.根据实施方式1至20中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合到人类Tau。
实施方式24.根据实施方式23所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双表位的，并在重复区2或重复区4内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合到人类Tau。
实施方式25.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，
其中所述抗体或抗原结合片段在重复区2内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合人类Tau的结合偏好性比在重复区3内包含氨基酸序列HKPGG(SEQ ID NO：182)的表位处的结合或在重复区1内包含氨基酸序列HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位处的结合高至少约10倍，或者
其中所述抗体或抗原结合片段在重复区4内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合人类Tau的结合偏好性比在重复区3内包含氨基酸序列HKPGG(SEQ ID NO：182)的表位处的结合或在重复区1内包含氨基酸序列HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位处的结合高至少约10倍，
正如通过肽结合测定法所确定的。
实施方式26.根据前述实施方式中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不在重复区2内包含氨基酸序列HVSGG(SEQ ID NO：184)的表位处或重复区2内包含氨基酸序列HVLGG(SEQ ID NO：185)的表位处结合Tau。
实施方式27.一种标记的抗体或抗原结合片段，其包含根据前述实施方式中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
实施方式28.一种核酸分子，其编码根据实施方式1至26中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
实施方式29.一种载体，其包含根据实施方式28所述的核酸分子。
实施方式30.一种细胞，其表达根据实施方式28所述的核酸分子。
实施方式31.一种生产抗Tau抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括将根据实施方式30所述的细胞在适合于生产所述抗体或抗原结合片段的条件下培养。
实施方式32.根据实施方式31所述的方法，其还包括回收所述抗体或抗原结合片段。
实施方式33.一种药物组合物，其包含根据实施方式1至26中任一项所述的抗体或抗原结合片段和可药用载体。
实施方式34.根据实施方式1至26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其用作药物。
实施方式35.根据实施方式1至26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其用于治疗Tau蛋白病。
实施方式36.根据实施方式1至26中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其用于制备治疗Tau蛋白病的药物。
实施方式37.根据实施方式35或36所述的供使用的抗体，其中所述Tau蛋白病是阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆或进行性核上性麻痹。
实施方式38.根据实施方式37所述的供使用的抗体，其中所述额颞叶痴呆是匹克氏病。
实施方式39.一种降低十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau水平的方法，所述方法包括向所述对象给药根据实施方式1至26中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
实施方式40.一种抑制Tau聚集的方法，所述方法包括向所述对象给药根据实施方式1至26中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
实施方式41.根据实施方式39或40所述的方法，其中所述方法在体外或体内进行。
实施方式42.一种在对象中治疗Tau蛋白病的方法，所述方法包括在所述对象中有效治疗所述Tau蛋白病的条件下向所述对象给药根据实施方式1至26中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
实施方式43.根据实施方式42所述的方法，其中所述Tau蛋白病是阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆或进行性核上性麻痹。
实施方式44.根据实施方式43所述的方法，其中所述额颞叶痴呆是匹克氏病。
提供了下面的实施例以补充前述公开内容并提供本文中描述的主题内容的更好的理解。这些实施例不应被认为限制所描述的主题内容。应该理解，本文中描述的实施例和实施方式仅仅是出于说明的目的，并且根据其做出的各种不同的修改或改变对于本领域技术人员来说是显而易见的并且应该被包括在本发明的范围之内，并且可以在不背离本发明的真正范围的情况下做出。
实施例1：单克隆抗体的产生
为了产生识别Tau的微管结合区(MTBR)的抗Tau抗体，合成了肽序列CNIKHVPGGGSVQIVYKPVD(SEQ ID NO：186)(肽抗原)。SEQ ID NO：186的第2-20位残基对应于跨越Tau的第二(即不存在于3R亚型中)与第三重复区之间的接合部的氨基酸序列(图2)。所述序列还包括被称为PHF6的六肽基序(VQIVYK)(SEQ ID NO：187)(von Bergen等，PNAS,2000,97(10):5129-5134)，其是启动Tau的聚集的位点之一。将肽抗原通过在全长Tau-441人类蛋白序列中天然不存在的N-端半胱氨酸残基偶联到钥孔戚血蓝蛋白(KLH)载体蛋白。最终的免疫原通过将所述肽抗原偶联的KLH与弗氏完全佐剂混合(1:2(v/v))来制备。将Tau敲除小鼠(Jackson#007251)用每只小鼠0.08mL的2.5mg/mL免疫原溶液进行免疫接种。在初次注射后大约3周，小鼠接受加强免疫，其中每只小鼠使用0.05mL的与前述相同的蛋白质浓度的不含佐剂的肽抗原偶联的KLH。
在加强免疫后一个月，从小鼠收集抗血清并通过ELISA评估抗体滴度，以测量针对原始免疫接种的Tau肽以及2N4R和1N3R两种重组Tau蛋白的免疫反应性。简单来说，使用150ng偶联到BSA的肽抗原或50ng 2N4R或1N3R重组Tau蛋白(Enzo Life Sciences，目录号分别为BML-SE321和BML-SE323)，在10mM pH 7.0的磷酸盐缓冲液中将96孔板(Costar目录号2797)的每个孔在37℃下包被1小时。将板用在PBS中稀释至终浓度为1％的BSA在室温阻断30分钟。除去阻断溶液，并向所述板添加在相同阻断缓冲液中的各种不同稀释度的抗血清，在室温下1小时。将板用PBS洗涤几次，然后添加HRP标记的抗小鼠IgG抗体，在室温下30分钟。在另外的洗涤步骤后，通过添加3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物来检测抗体结合。使用等体积的2M H2SO4终止所述酶反应，并使用读板器在450nm波长处测定孔的光密度。
在具有高抗体滴度的小鼠已被确定后，从髂骨肌***分离细胞并使用聚乙二醇将它与小鼠骨髓瘤SP2细胞融合，以产生杂交瘤。将融合的细胞接种在96孔板中，并在次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择培养基中培养。首先使用如前一段中详述的标准肽和重组Tau ELISA测定法筛查培养上清液的Tau结合。为了给出相对结合的近似值，然后将在所述肽和重组蛋白2N4R或1N3R中的任一者或两者的ELISA中阳性的培养上清液在竞争性ELISA***中进行评估。如前所述将96孔板用2N4R重组Tau包被，阻断并洗涤。在第一抗体步骤时，将培养上清液1比10稀释，并与不同稀释度的游离抗原(2N4R Tau)在室温温育1小时，然后添加到板。一旦抗体/抗原复合物被添加到板后，所述测定法的剩余部分的流程与标准的ELISA程序一致。单细胞克隆通过连续稀释和显微术确认。得到的最终杂交瘤在无血清培养基中冷冻保存。
从杂交瘤纯化抗体
将杂交瘤生长在含有1％FBS、1ng/mL人类IL-6(R&D Systems)和青霉素/链霉素的杂交瘤-SFM(Life Technologies)培养基中。培养规模放大到100mL，并在细胞达到高密度并约30％存活时收获上清液。抗体使用蛋白G柱来纯化，用pH2.5的甘氨酸/HCl洗脱，并立即中和。然后将纯化的抗体在25mM磷酸钠(pH6.5)和150mM NaCl中透析，分成等分试样并储存在-80℃。
产生了生产识别原始免疫接种肽和全长重组2N4R Tau蛋白的抗体的杂交瘤克隆(表2)。
实施例2：鼠类抗体对大肠杆菌中表达的重组单体Tau蛋白的亲和性
使用BIAcoreTM T100仪器进行了实施例1中产生的抗Tau小鼠单克隆抗体与人类野生型Tau(2N4R)和等效的P301S突变体Tau蛋白的相互作用的动力学分析。将重组人类全长Tau蛋白在大肠杆菌中表达，然后通过CellufineTM磷酸盐亲和层析并随后通过硫酸铵沉淀和反相HPLC色谱进行纯化。
将从杂交瘤纯化的抗体用固定化在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上的蛋白A/G捕获。然后将野生型和P301S Tau蛋白在5种不同浓度下注射到传感器芯片上，并按照制造商的说明书计算亲和性(平衡解离常数，KD)。
结果示出在表2中。
表2. 7种抗Tau小鼠抗体对2N4R野生型和P301S突变体重组Tau蛋白的计算的亲和性。
Figure BDA0002444534010001871
实施例3：ms7G6抗体的精细表位作图
使用肽芯片微阵列对鼠类7G6(“ms7G6”或“7G6”)抗体针对全长野生型2N4R人类Tau蛋白序列(Tau441)的识别序列进行了精细表位作图。
所有程序由PEPperPrint GmbH,Germany进行。将全长2N4R野生型人类Tau序列在C-端处用中性GSGSGSG连接物序列(SEQ ID NO：188)延长，并翻译成交叠的15-mer肽。将得到的含有411种不同肽的肽微阵列一式两份与82个另外的带有HA标签的对照肽(YPYDVPDYAG)(SEQ ID NO：189)的样品点一起印刷在玻璃芯片上。
将ms7G6抗Tau抗体在含有0.05％Tween 20和10％Rockland阻断缓冲液(MB-070)的PBS(pH 7.4)中稀释到1μg/mL的浓度。将所述稀释的抗体在4℃和以140rpm振摇下在芯片上温育16小时。除去第一抗体，并将芯片在PBS(pH 7.4)/0.05％Tween 20中洗涤。除去洗涤缓冲液，然后将在与第一抗体相同的缓冲液中的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体DyLightTM680(1:5000)和抗HA标签抗体DyLightTM 800(1:2000)在室温下在芯片上温育45分钟。除去检测抗体，并将芯片如前所述再次洗涤一次。在LI-COR OdysseyTM成像***上获取荧光图像，并在最后使用PepSlideTM Analyser软件分析微阵列数据。
所述芯片的荧光图像(图3A)和得到的强度图(图3B)显示，ms7G6结合到全长Tau蛋白上的两个主要位点。还已发现，ms7G6在两个位点处结合所需的最小序列是HVPGG(SEQ IDNO：79)，其存在于第299至303(在第二重复区中)和第362至366(在第四重复区中)氨基酸位置处。在另外两个位点处观察到次要结合：第268至272氨基酸位置处的HQPGG(SEQ ID NO：183)和第330至334位处的HKPGG(SEQ ID NO：182)。平均信号强度的计算证实，与HQPGG(SEQID NO：183)(重复区1)或HKPGG(SEQ ID NO：182)(重复区3)序列相比，小鼠7G6抗体结合通常包含在全长4R Tau的第二重复区内的HVPGG(SEQ ID NO：79)位点的偏好性分别为41倍或38倍。同样地，观察到与HQPGG(SEQ ID NO：183)(重复区1)或HKPGG(SEQ ID NO：182)(重复区3)序列相比，结合通常包含在全长4R Tau的第四重复区内的HVPGG(SEQ ID NO：79)位点的偏好性分别为35倍或33倍。
实施例4：7G6表位替换扫描
为了确定被ms7G6抗体识别的表位的氨基酸严格性，进行了天然存在的Tau肽序列1KDNIKHVPGGGSVQI15(SEQ ID NO：26)的替换扫描。所有程序由PEPperPrint GmbH,Germany承担，并且基于所述起始肽中的所有位置与20种天然存在的氨基酸中的每一种的交换。
合成了每种可能的15-mer肽，并一式三份印刷在玻璃芯片上，给出含有900个肽样品点的微阵列。另外的野生型肽以及HA标签对照肽的拷贝也被点样在所述芯片上作为对照。然后将所述肽芯片在与实施例3(ms7G6抗体的精细表位作图)中所述相同的条件下用ms7G6探测，并使用PepSlideTM Analyser软件分析得到的数据(图4示出了使用SEQ ID NO：38至78的结果)。所述替换扫描显示，在1HVPGG5(SEQ ID NO：79)的肽表位内，抗体ms7G6在第二个位置中显示出一定的灵活性，存在许多可能的残基。当第5个氨基酸(甘氨酸)被替换成丙氨酸或丝氨酸时，也存在一定的结合。中间的脯氨酸残基是抗体结合所需要的，并且不可以被任何其他天然存在的氨基酸替换。这个氨基酸可以对应于P301残基(在Tau441的第299至303位氨基酸内，Uniprot登记号P10636-8)，其在许多临床前体外和体内模型中通常被突变成丝氨酸或亮氨酸残基以模拟人类Tau蛋白病。所述替换扫描数据表明，ms7G6抗体优先识别突变体P301S蛋白中第362-366位氨基酸处的氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)结合位点。
实施例5：体外Tau聚集
为了确定ms7G6抗体是否可以在体外功能性抑制Tau聚集，使用重组Tau蛋白进行了聚集测定。
将野生型或P301S突变体Tau蛋白在含有25mM HEPES(pH 7.4)、100mM NaCl和0.5mM TCEP的缓冲液中稀释到60μM的浓度，终体积为20μl。将所述混合物在热循环仪中在98℃加热30分钟，然后允许其冷却至室温。将小鼠IgG2b对照或ms7G6抗体在25mM HEPES(pH7.4)、100mM NaCl和HALT蛋白酶和磷酸化酶抑制剂中稀释到终浓度为8.3μM。将稀释的抗体或缓冲液对照与Tau蛋白混合并在37℃温育30分钟。为了诱导Tau聚集，向每个反应添加肝素至终浓度为12μM并且终体积为100μl。最终的反应条件是在25mM HEPES pH7.4/100mM NaCl缓冲液中12μM Tau、8.3μM抗体、0.1mM TCEP和12μM肝素。将最终的反应混合物在37℃温育至少6天并在整个过程中取样以测量Tau聚集。
在第0、1、2、5和6天通过取出10μL反应混合物并置于384孔黑底板(Greiner)中来测量Tau的聚集。向每个孔添加硫磺素S染料至终浓度为15μM，并将板在室温在暗处温育30分钟。在PherastarTM读板器上，使用分别为485nm和520nm的激发和发射波长来测量荧光。
如图5A和5B中所示，与野生型相比，对P301S Tau蛋白来说肝素诱导的聚集的程度和速率更高。与IgG相比ms7G6抗体在体外实质性减少P301S Tau和野生型Tau两者的聚集，正如通过产生的荧光量较低所指示的。这表明，即使对于P301S蛋白来说，ms7G6仅仅结合到第362-366位残基也能在这些条件下抑制聚集。
实施例6：体外细胞接种模型
为了确定ms7G6或被称为7G6-zuHC25-zuLC18的人源化版本(参见实施例10)是否对细胞有影响，在Tau接种和聚集的体外基于细胞的模型中测试了每种抗体。
如前所述将人类野生型Tau的2N4R亚型在大肠杆菌中表达然后纯化(Soeda等，NatCommun.2015,6:10216)。将重组Tau(40μM)与肝素(240μg/mL)混合，并在含有2mM DTT的100mM pH 7.0乙酸钠中在37℃温育48至96小时。通过超速离心收集聚集的Tau蛋白并重悬浮在100mM pH 7.0乙酸钠或PBS中。然后将所述溶液超声处理以产生重组Tau种子。
使用Lipofectamine LTX(Thermo Fisher Scientific)将Neuro-2a(ATCC)细胞在含有编码0N4R P301S Tau的cDNA表达质粒的悬液中转染，并以每孔1.5x 104个细胞的密度在96孔板中在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中铺板。在添加Tau种子之前将细胞在37℃下放置以附着过夜。平行地，将各种不同浓度的抗Tau抗体与1μg/mL Tau种子混合，并且也在37℃温育过夜。第二天，除去培养基并添加含有抗Tau抗体和种子的混合物的培养基。将板在37℃再次培养过夜。
将细胞用终浓度为4％的聚甲醛固定，并用H-150(Santa Cruz Technology，sc-5587)、硫磺素S(Sigma-Aldrich，T-1892)和DAPI(Wako，340-07971)免疫染色。使用InCellAnalyzer 2200和Toolbox捕获并分析图像。
如图6A、6B、6C和6D中所示，对ms7G6和7G6-HCzu25-LCzu18处理两者做出响应观察到硫磺素S染色(聚集的Tau)的显著降低。这表明在这些测定条件下，两种抗体能够在这种基于细胞的模型中阻断Tau接种效应。
实施例7：通过将重组P301S Tau种子与抗体预温育在Tau蛋白病的临床前体内模型中实现的功效
包括ms7G6在内的三种新抗体在Tau沉积的短期体内模型中的效应，通过将相关抗体与重组P301S Tau种子预温育进行了测试。然后将含有或不含抗体的种子注射到P301S转基因小鼠的脑中。
Tau种子的脑室内(ICV)注射
预先形成的原纤维(PFF)Tau通过将重组2N4R P301S Tau(40μM)与肝素(240μg/mL)混合，然后在含有2mM DTT的100mM pH7.0乙酸钠中在37℃进行48至96小时的温育步骤来产生。通过超速离心收集聚集的Tau，并将其重悬浮在100mM pH7.0乙酸钠中。将得到的原纤维超声处理并用作种子以备注射。将浓度为0.83mg/mL的Tau种子与1mg/mL IgG1或2mg/mL抗Tau抗体在37℃温育1小时。将所述Tau种子/抗体混合物、对照(即单独的Tau)或介质注射到2-3.5月龄的P301S转基因小鼠(MRC Technology,United Kingdom)的脑室内(ICV)区域中。这些小鼠在CBAxC57/bl6背景上在鼠类神经元特异性Thy-1启动子控制下过表达人类0N4R P301S Tau。
以前已报道，这些动物如果不治疗，将在5至6月龄时在脑和脊髓中发生广泛的Tau病理并伴有显著的运动缺陷(Allen等，J Neurosci.2002,22(21):9340-51)。在当前的使用较年幼P301S小鼠的实验中，将动物在ICV注射后2周处死，取出脑并收集感兴趣的组织区域。然后如下所述将组织样品分级成十二烷基肌氨酸钠可溶性和不溶性Tau(Sahara等，JNeurochem.2002Dec；83(6):1498-508)。
从种子注射的P301S小鼠脑提取十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau
将组织在19倍体积(组织重量/体积)的提取缓冲液中匀浆，所述缓冲液含有50mMTris-HCl(pH7.5)(Invitrogen)、5mM EDTA(Nippon Gene)、1mM EGTA(NacalaiTesque)、1％NP-40(Fluka)、0.25％脱氧胆酸钠盐(Sigma Aldrich)、0.1M NaCl、0.5mM PMSF(SigmaAldrich)、1×PhosSTOPTM(Roche,Basel,Schweiz)和1×完全EDTA(-)(Roche)。将匀浆物在4℃下以163,000g离心20分钟，收集得到的上清液并作为Tris缓冲液可溶性级分保留。将沉积物重悬浮在约10倍体积(组织重量/体积)的含有10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5M NaCl、1mMEGTA、10％蔗糖(Wako Pure Chemical)和1％十二烷基肌氨酸钠的缓冲液中，然后进行超声处理。将十二烷基肌氨酸钠处理的样品在37℃温育60分钟，然后在4℃下以163,000g再离心20分钟。收集上清液作为十二烷基肌氨酸钠可溶性级分。最后，向沉积物添加约10倍体积的PBS(Gibco)，然后将其进行超声处理。这形成十二烷基肌氨酸钠不溶性级分。
通过Western印迹检测十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau
将十二烷基肌氨酸钠不溶性级分溶解在NuPAGETMLDS样品缓冲液和NuPAGETM样品还原剂(Invitrogen)中，在70℃加热10分钟，并使用12.5％聚丙烯酰胺凝胶(DRC)分离。将蛋白质转移到0.2μm PVDF膜(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)，并将印迹在含有0.05％Tween(Nacalaitesque)和2.5％脱脂奶(Yukikirushi)的TBS(Takara)中在室温阻断1小时。在阻断后，将印迹在阻断缓冲液中用人类特异性单克隆抗Tau抗体HT7(1:1000或1:2000，ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)在室温下探测1小时。将印迹在TBS-T中洗涤30分钟，然后与HRP偶联的抗小鼠IgG抗体(1:2000，GE healthcare)在室温继续温育1小时。除去第二抗体并将印迹如上所述洗涤。Tau蛋白通过化学发光辣根过氧化物酶(HRP)底物(MerckMillipore)来检测，并使用Fusion FX(Vilber-Lourmat,France)分析仪来定量。为了确定Tau的量，将源自于P301S脊髓的原始十二烷基肌氨酸钠不溶性级分的标准品Tau的连续稀释液载样在每块凝胶上。
如图7中所示，与介质相比，P301S种子与ms7G6的预温育，但不是对照IgG、8E5或1F1，显示出十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau水平的显著降低。这表明在这种范式中，ms7G6与产生的其他抗Tau抗体相比是优越的抗体。
实施例8：体内模型中P301S接种和传播的验证
为了确定在啮齿动物临床前模型中是否可能发生病理性Tau从一个脑区向另一个脑区的任何传播，在P301S转基因小鼠中进行了与实施例7中所述相同的接种实验，但进行了一些修改。在这种情况下，将20μL浓度为0.9mg/mL的重组P301S Tau种子ICV注射到2.5至3月龄小鼠的脑中。在初始的种子注射后2、4、或6周将小鼠处死，取出脑并保留海马和皮层两者。如上所述制备并检测十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau。
如图8中所示，在种子注射后2至4周之间在海马中观察到不溶性Tau水平的急剧升高，但在相同时间点的皮层中仅观察到低水平的不溶性Tau。然而，在种子注射后4至6周之间，与无种子的对照组相比，在皮层中观察到不溶性Tau的更大增加。这显示出在这种模型中，不溶性Tau可以先于皮层在海马中形成，提示了继发性传播事件。
实施例9：在P301S种子注射体内模型中每周一次外周给药7G6的效果
a)实验1
P301S转基因小鼠中P301S Tau种子的注射如实施例8中所述来进行并进行了少量修改。在Tau种子注射前约7至约4小时，小鼠腹膜内接受一剂40mg/kg IgG2b对照抗体(BioXCell)或ms7G6抗体。每种抗体被配制在含有150mM NaCl的25mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中。也包括接受单独的缓冲液的介质治疗对照组。在Tau种子注射到脑中后，小鼠每周一次接受另外的抗体或缓冲液给药为期6周。然后将动物处死，分离脑组织，并如实施例7中所述制备并测量不溶性Tau。
b)实验2
进行实验1(实施例9a)的精确重复。
c)实验3
再次进行实验1(实施例9a)的重复，区别在于ms7G6以两种剂量水平20和40mg/kg给药，并且在种子注射后8周而不是如前两个实验中的6周处死动物。
如图9和10中所示，这三个实验证实，在P301S转基因小鼠中使用P301S重组Tau种子的这种种子注射模型中，ms7G6可以引起不溶性Tau水平的降低。在皮层中观察到的降低表明所述抗体可以减缓病理性Tau传播。在实施例4中确定了，ms7G6抗体不能结合到存在于突变蛋白的P301S位点中的HVSGG序列(SEQ ID NO：184)(aa299-303)。合在一起，这意味着在这种体内模型中ms7G6的体内效应由剩余的在第四重复区内的HVPGG(SEQ ID NO：79)表位(aa362-366)处与Tau的结合驱动。
实施例10：抗体人源化
10A.材料和方法
10A.a.计算机建模
使用Discovery Studio 4.5产生ms7G6 Fv区的分子模型。将具有与ms7G6可变重链(VH)和可变κ(VK)结构域最同源的蛋白质序列的前1至3位的晶体结构用作模板，使用“产生同源性模型”功能产生了25个同源性模型。选择具有最低能量分值的模型，并且首先将仅仅氢然后将所有原子进行能量最小化。将在小鼠序列(HCzu1和LCzu1)之间不同的构架残基加亮，并将其中最靠近CDR或在VH/VK界面处的那些残基分别鉴定为可能对维持Tau被CDR结合或抗体稳定性来说重要的残基。将在小鼠序列(HCzu1和LCzu1)之间不同的CDR残基加亮，并鉴定可能对维持Tau被CDR结合来说不重要的残基。
10A.b.基因合成和克隆
10A.b.1.InFusionTM克隆
将人源化重链和轻链可变结构域为在CHO细胞中表达进行密码子优化，并由GeneArt合成。所述可变结构域被合成为具有Kozak翻译起始序列和Ig分泌前导序列，并在5’和3’末端包含与亚克隆载体内的克隆位点同源的15个碱基对。使用InFusionTM HD克隆试剂盒(Clontech)将由GeneArt合成的PCR片段亚克隆到含有人类γ或κ恒定区的表达质粒中。对所有克隆进行测序以确认***片段的存在和保真性。
10A.b.2.QuikChangeTM
使用Stratagene's QuikChangeTM XL，按照制造商的流程制造点突变。对所有克隆进行测序以确认突变的存在。
10A.c.细胞培养
10A.c.1.HEK瞬时mAb生产
对于将要用ExpiFectamineTM(Thermo)转染的每毫升3x106个细胞，将333.3ng HC质粒和333.3ng LC质粒在50μL Opti-MEM(Thermo)中温育5-10min。同样地，将2.67μLExpiFectamineTM在50μL Opti-MEM中温育。向DNA混合物添加ExpiFectamineTM溶液并在室温下温育20-30min。在旋动的同时向细胞添加DNA:ExpiFectamineTM混合物，并在37℃、8％CO2、125rpm振摇下温育。第二天，将每mL细胞5μL增强剂1和50μL增强剂2添加到所述转染，继续温育另外7-10天。在48-72h后，向细胞补料终浓度为10g/L的Yeastolate(BDBiosciences)、5mM戊酸(Sigma-Aldrich)和1:100CD脂质浓缩物(Thermo)。
10A.c.2.CHO瞬时mAb生产
对于将要用ExpiFectamineTM CHO(Thermo)转染的每毫升6x106个细胞，将500ngHC质粒和500ng LC质粒在Opti-PROTM(Thermo)中混合，总体积为40μL。同样地，将3.2μLExpiFectamineTM CHO在36.8μL Opti-PRO中混合。向DNA混合物添加ExpiFectamineTM CHO溶液并在室温下温育1-5min。在旋动的同时向细胞添加DNA:ExpiFectamineTM CHO混合物，并在37℃、8％CO2、125rpm振摇下温育。第二天，将每mL细胞6μL增强剂和160μL补料添加到所述转染，并将细胞转移到32℃、5％CO2下。在第5天，添加每mL细胞另外160μL补料。在第12至14天收获上清液。
10A.d.MAb纯化
10A.d.1.分批纯化
将ProsepTM-vA高容量蛋白A树脂(Millipore)或CaptureSelectTMκSelect LC-κ树脂(Thermo)用DPBS平衡，并取50μL添加到2mL样品。在室温下温育1小时后，将培养基和树脂添加到过滤板，并用1mL DPBS洗涤两次。通过添加400μL pH 2.9的0.1M甘氨酸，然后以15,000x g离心30s，将样品从树脂洗脱。将所述样品用20μL pH 8.0的1M Tris中和。使用0.5mLAmiconTM Ultra 10k截留滤器(Millipore)通过以15,000x g离心5分钟，将样品浓缩到～100μL，并使用0.5mL ZebaTM脱盐柱7K MWCO，按照制造商的流程将缓冲液更换成DPBS。
10A.d.2.柱纯化
使用AKTA Xpress纯化平台(GE Healthcare)来进行纯化。将最多1L调制培养基载样到在pH 7.0的20mM磷酸钠、150mM NaCl中平衡的5mL MabSelectTM SURE柱(GEHealthcare)上。在载样后将柱用平衡缓冲液大量洗涤，直至观察到稳定的基线。使用pH2.9的100mM甘氨酸洗脱结合的材料。将洗脱的材料立即进样到在1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的26/10HiPrep脱盐柱(GE Healthcare)上，并在相同的缓冲液中洗脱。将峰级分合并。所述材料通过BCA测定法(Thermo)分析蛋白质含量，并通过还原和非还原SDS-PAGE分析纯度。
10A.e.2N4R Tau结合ELISA
将黑色Nunc MaxiSorp 96孔板用DPBS中的2μg/mL(除非另有指明)重组野生型2N4R Tau在4℃包被过夜。第二天，将板中液体吸出并用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween-20)洗涤三次。将孔与测定缓冲液(1％w/v BSA[热休克级分，Sigma]，0.05％Tween-20[BioRad]，DPBS)在室温下温育1h。吸出测定缓冲液并将孔如上所述洗涤三次。向每个孔添加DPBS中的各种不同浓度的mAb，在微量滴定板振摇器上振摇的同时在室温下温育1小时。吸出样品并将孔如上所述洗涤三次。将HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(JIRL 115-035-146)、山羊抗人IgG(H+L)抗体(JIRL 109-035-127)或链亲和素-HRP(JIRL 016-030-084)在测定缓冲液中1:5000稀释并添加到孔。在室温下温育并振摇1小时后，吸出样品并将孔如上所述洗涤三次。向每个孔添加QuantaBlu(Thermo)并在室温下温育15min。使用SpectramaxTM M5读板器(Molecular Devices)，使用分别设定在320和460nm处的激发和发射波长测量相对荧光单位(RFU)。
10A.f.表面等离子体共振(SPR)结合分析
10A.f.1.抗人/抗小鼠抗体捕获单体Tau结合测定法
10A.f.1.i.芯片制备
所有实验使用BIAcoreTM T-100仪器(GE Healthcare)来进行。将来自于人类抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)的10μL抗人类IgG抗体(单克隆小鼠抗人类Fc抗体)在200μL最终固定化缓冲液(10mM乙酸钠，pH 5.0)中稀释到25μL/mL。流速被设定到5μL/min，流动路径1。将50μL N-羟基琥珀酰胺(NHS)和50μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)混合并进样420sec，以活化CM5芯片表面。将稀释的抗体进样360秒，然后将1M乙醇胺进样420秒。然后将流动路径切换到流动路径2。制备新的EDC/NHS混合物并对流动池2重复所述程序。通过使用流动路径1、2，用30μL/min 3M MgCl2进行2次30sec进样，对表面进行调制。对于抗小鼠抗体表面来说，将来自于小鼠抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)的10μL抗小鼠IgG抗体(多克隆兔抗小鼠IgG抗体)在324μL最终固定化缓冲液(10mM乙酸钠，pH 5.0)中稀释到30μL/mL。流速被设定到5μL/min，流动路径3。将50μL NHS与50μL EDC混合并进样420sec，以活化芯片表面。将稀释的抗体进样420sec。将1M乙醇胺进样420sec。将流动路径切换到流动路径4。制备新的EDC/NHS混合物并对流动池4重复所述程序。通过使用流动路径3、4，用30μL/min pH 1.7的10mM甘氨酸进行2次30sec进样，对表面进行调制。
最终的固定化水平是：
流动池1–10,000RU(抗人类抗体)
流动池2–10,092RU(抗人类抗体)
流动池3–11,824RU(抗小鼠抗体)
流动池4–11,216RU(抗小鼠抗体)
10A.f.1.ii.结合测定法
用于结合测定法的运行缓冲液是PBS-P+/0.2％BSA。将所有抗体在PBS-P+/0.2％BSA(与用于运行缓冲液相同的制备物)中稀释到1μg/mL，在室温下以14,000g离心5min，并将上清液转移到新的管。将分析物(Tau单体2N4R wt，2.15mg/mL，47μM)在PBS-P+/0.2％BSA中稀释到100nM，在室温下以14,000g离心5min，并将上清液转移到新的管。将100nM溶液在PBS-P+/0.2％BSA中5倍连续稀释。最终浓度为100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM和0nM。将人源化抗体以10μL/min的流速和60sec的接触时间捕获在流动池2上。将鼠类抗体以10μL/min的流速和60sec的接触时间捕获在流动池4上。将Tau蛋白的稀释液以30μL/min的流速和240sec的接触时间进样在所有4个流动池上。解离被跟踪900sec。在每个循环后，通过30sec进样(流动路径1、2)30μL/min 3M MgCl2、30sec进样(流动路径3、4)30μL/min pH1.7的10mM甘氨酸、30sec进样(流动路径1、2)30μL/min 3M MgCl2、然后两次30-sec进样(流动路径3、4)30μL/min pH 1.7的10mM甘氨酸，将表面再生。在运行后，使用BIAEvaluations，使用所有浓度将收集的数据拟合到稳态结合模型。使用1:1Langmuir模型进行动力学数据拟合并排除100nM迹线(100nM迹线的包含导致高得不可接受的X2值)。也使用双态模型分析抗体结合数据的子集。
10A.f.2.抗人类抗体捕获单体Tau结合测定法
10A.f.2.i.芯片制备
使用BIAcoreTM T-100仪器进行芯片制备。使用用于固定化的方法向导进行芯片制备。运行缓冲液是HBS-P+。将来自于人类抗体捕获试剂盒(GE Healthcare)的15μL抗人类IgG抗体(多克隆小鼠抗人类Fc抗体)在300μL最终固定化缓冲液(10mM乙酸钠，pH 5.0)中稀释到25μL/mL。流速被设定到5μL/min。在所有4个流动池上使用360sec的配体接触时间进行固定化。通过使用流动路径1、2、3、4，两次30sec进样30μL/min 3M MgCl2来调制表面。
最终的固定化水平是：
流动池1–7341RU
流动池2–7683RU
流动池3–7530RU
流动池4–6303RU
10A.f.2.ii.结合测定法
使用BIOcoreTM T-100仪器或T-200仪器进行结合实验。用于结合测定法的运行缓冲液是PBS-P+/0.2％BSA。将所有抗体在PBS-P+/0.2％BSA(与用于运行缓冲液相同的制备物)中稀释到2μg/mL，在室温下以14,000g离心5min，并将上清液转移到新的管。将分析物(Tau单体2N4R wt，2.15mg/mL，47μM)在PBS-P+/0.2％BSA中稀释到100nM，在室温下以14,000g离心5min，并将上清液转移到新的管。将100nM溶液在PBS-P+/0.2％BSA中5倍连续稀释。最终浓度为100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM和0nM。将人源化抗体以10μL/min的流速和60sec的接触时间顺序捕获在流动池2、3和4上。将Tau蛋白的稀释液以30μL/min的流速和240sec的接触时间进样到所有4个流动池上。解离被跟踪900sec。在每个循环后，通过在所有4个流动池上连续两次30sec进样30μL/min 3M MgCl2，将表面再生。在运行后，使用1:1Langmuir模型进行动力学数据拟合并排除100nM迹线(100nM迹线的包含导致高得不可接受的X2值)。
10A.f.3.链亲和素捕获单体Tau结合测定法
10A.f.3.i.抗体制备
将400μg的每种抗体稀释到2mg/mL，并使用0.5mL ZebaTM 40kDa MWCO脱盐柱(Thermo)将缓冲液交换成pH 8.3的0.1M碳酸氢钠。在即将使用之前通过溶解在水中至20mM的最终储用浓度而制备的NHS-PEG4-生物素，以5:1的摩尔比(生物素:MAb)添加到抗体并在室温偶联1hr。通过使用0.5mL ZebaTM 40kDa MWCO脱盐柱连续两次将缓冲液交换成1xDPBS，除去过量的生物素。对于BIAcoreTM测定法来说，将抗体在PBS-P+/0.2％BSA(与用于运行缓冲液相同的制备物)中稀释到2μg/mL，在室温下以14,000g离心5min，并将上清液转移到新的管。随后为每种抗体确定进样时间以实现～225RU的捕获水平。
将野生型2N4R Tau蛋白(2.15mg/mL，47μM)在PBS-P+/0.2％BSA中稀释到100nM，在室温下以14,000g离心5min，并将上清液转移到新的管。将20nM溶液在PBS-P+/0.2％BSA中5倍连续稀释。最终浓度为20nM、4nM、0.8nM、0.16nM和0nM。
10A.f.3.ii.结合测定法
使用的生物传感器芯片是来自于生物素CAPtureTM试剂盒(GE Healthcare，目录号28-9202-34)的CAP芯片。所有实验使用T-100仪器来进行。将CAP试剂以2μL/min的流速5min固定化在所有4个流动池(流动路径1、2、3、4)上(最终链亲和素水平为～3500RU)。将生物素化人源化抗体、生物素化嵌合7G6或生物素化鼠类ms7G6以10μL/min的流速和80sec至146sec的接触时间(生物素化嵌合抗体接触时间为240sec)顺序捕获在流动池2、3和4上。将Tau蛋白的稀释液以0nM至20nM的顺序，以30μL/min的流速和180sec的接触时间进样到所有4个流动池上。在最后一次进样(20nM Tau)后，解离被跟踪900sec。在每个循环后，通过在所有4个流动池上一次进样120sec 10μL/min的6M盐酸胍、0.25M NaOH，将表面再生。将样品一式两份进行测定，例外的是鼠类7G6和7G6-zuHC25-zuLC18，它们在两个分开的流动池上一式两份进行分析(每种样品总共4次分析)。在运行后，使用1:1Langmuir模型，使用单循环动力学进行动力学数据拟合。
10A.g.孔径排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)
在装备有AdvanceBioTM SEC 300A,2.7μm,4.6mm ID x 50mm保护柱和AdvanceBioTM SEC 300A,2.7μm,4.6mm ID x 300mm柱(Agilent)的Agilent 1260四元泵HPLC***上进行SEC-HPLC。由0.1M磷酸钠(pH 6.5)构成的流动相以0.35mL/min等度流动。在环境温度下进行分离。在280nm处监测柱洗脱液。每次运行进样50μg样品(10μL 5mg/mL的样品)；每种样品被分析两次。使用Agilent OpenLAB软件进行峰积分。报告保留时间、峰高、峰面积、峰宽和峰对称性。在峰面积的基础上计算聚集体和单体的百分率。
10A.h.差示扫描量热术(DSC)分析
使用VP毛细管差示扫描量热器(VP-CapDSC；MicroCal，VP-CapDSC，s/n 12-07-149，带有Origin-7作图和MicroCal VP-Capillary DSC软件v.2.0)来破译并比较各种不同F(ab’)2片段和对照的高级结构和热稳定性。允许样品适应环境温度30分钟，然后涡旋振荡。将全部样品(0.4–0.5mL)添加到测定板(Microliter Analytical Supply，96孔，500μL，圆孔和圆底，目录号07-2100；Sun Suri板盖，目录号300-005)的适合的孔。向测定板的适合的孔添加0.5mL 20％Contrad溶液和0.5mL水。将密封的板置于10℃下的自动进样器中。
运行使用下述测定法参数来编程并启动：
DSC控制：
起始温度＝25℃
最终温度＝100℃
扫描速率＝100℃/Hr
重新扫描次数＝0
重新扫描冷却速率＝EXP
扫描前恒温＝10分钟
扫描后恒温＝5分钟
循环后恒温＝25℃
过滤时长＝10秒
自动填充池温度＝30℃
反馈模式/增益＝无
唯一扫描
样品参数：
浓度＝mM
文件参数＝自动编号
冲洗站＝选择洗涤2(因此将是洗涤2(1xPBS)，然后是洗涤1(水))
恒温器控制设置点＝25℃
脉冲控制：
脉冲大小＝-3
持续时间＝600
脉冲关闭
Y-轴标度单位＝mCal/分钟
使用Contrad/Contrad在25-70℃、100℃/小时下在线清洁，然后进行两次缓冲液/缓冲液进样。
10B.结果
10B.a.IGHV1/IGKV2人源化
10B.a.1 7G6计算机建模
使用BLAST在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/和http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi检索与小鼠ms7G6 mAb最同源的人类种系可变结构域蛋白质序列。IGHV1-46*03和IGKV2-30*02可变结构域家族是与ms7G6最同源的序列(图11)。将小鼠构架序列用同源性最接近的人类种系序列代替，以产生CDR嫁接的人源化变体。
使用小鼠和CDR嫁接的序列产生可变结构域的计算机模型。将小鼠和人源化模型的理论结构叠加，并分析与CDR紧邻的残基对CDR环的总体结构的潜在结构影响。尽管大多数不同的残基不位于二聚体界面处或远离CDR，但发现有几个残基紧邻CDR(在
Figure BDA0002444534010002041
之内)。
在Vκ结构域中，小鼠Tyr36中的羟基与CDRH3中的Trp100形成潜在的氢键。人类Phe36失去这个氢键，这可能影响CDRH3的结构完整性。人类Arg46比小鼠Leu46体积大得多，并且Arg46可能在空间上妨碍CDR的正确折叠。同样地，在Vh结构域中，第71位紧靠CDR放置。与小鼠Val71相比，人类Arg71可能在空间上阻碍CDR的正确折叠。人类Val78类似地定位，并且体积比小鼠Ala78更大。因此Val78可以但不太可能影响CDR的完整性。
小鼠ms7G6抗体含有两个未配对的半胱氨酸，其由于存在可能对产物聚集、氧化、半胱氨酸化或谷胱甘肽化有贡献的游离巯基，在mAb的开发中可能有问题。一个Cys位于CDRH2中的第57位处，第二个位于FWRL2中的第49位处。
CDRH2的Kabat定义比IMGT定义延长了8个C-端氨基酸。分析了这后8个氨基酸的接近度和对抗原结合的潜在贡献。Asn58在可变结构域顶部的潜在CDR-抗原界面处的潜在抗原结合位点内。在小鼠与人类种系序列之间不同的第60、61、64和65位残基在所述潜在抗原结合位点之外，并且不可能直接接触抗原或为正确CDR折叠提供结构支持。
10B.a.2.人源化Vh1和Vκ2变体和通过ELISA进行的Tau结合分析
使用种系可变结构域Vh1和Vκ2家族产生了一系列人源化突变体，以评估通过计算机建模预测对CDR-抗原相互作用来说重要的位置处的小鼠残基的重要性(图12)。分析了人源化和小鼠7G6在Vh的第60、61、64、65、71和78位处的残基的各种不同组合(7G6-HCzu1-4)以及C57S突变(7G6-HCzu5)。还分析了ms7G6 Vκ中第36、46和49位处的人类和小鼠残基的组合(7G6-LCzu1-5)以及C49S突变(7G6-LCzu6)。将MAb以矩阵格式表达，由此将人源化HC和LC的每种组合共转染，例外的是7G6-HCzu5仅仅与7G6-LCzu2共表达并且7G6-LCzu6仅仅与7G6-HCzu3共表达。
为了测试与Tau的直接结合，将2N4R包被在96孔板上并向孔添加各种不同浓度的人源化mAb。结合到Tau的MAb使用HRP偶联的抗小鼠抗体(小鼠[ms]7G6)或抗人类抗体(剩余的样品)来检测。将样品在用2N4R Tau包被的96孔板中在室温下温育1h。在洗涤后，向孔添加HRP偶联的抗小鼠或抗人类检测抗体。所述抗小鼠抗体被用于检测ms7G6。每个孔中HRP活性的量通过QuantaBlu荧光底物来测量，并且RFU通过SpectraMax M5读板器来检测。
图13A-13F中示出了来自于按照LC变体分组的样品的数据，例外的是半胱氨酸变体，其被分组在最底部的图上。在所有的7G6 HC和LC变体之间，在Tau结合方面存在很小差异(图13A-F；表3)。尽管ms7G6与人源化抗体相比显示出更好的结合，但应该指出这个结果可能是由于小鼠与人类样品之间不同的检测抗体误导的。mAb2对应于不结合Tau的对照IgG抗体。
表3.结合Tau的人源化7G6 Vh1/Vκ2变体的EC50*
Figure BDA0002444534010002051
Figure BDA0002444534010002061
*EC50通过在GraphPad Prism 6.05中拟合非线性回归曲线来确定。
为了降低任何潜在的免疫原性，产生了另一系列的突变体，其具有逐渐增加的人类残基数目(7G6-HCzu6、7G6-HCzu 7和7G6-HCzu 8；图12)。由于Vh Ser57在与Cys57结合方面显示出很小差异，因此大多数突变体含有Ser57。为了进一步证实丝氨酸是第57位处半胱氨酸的可行替换，产生了仅在第57位处不同的两个突变体对(7G6-HCzu7和7G6-HCzu9以及7G6-HCzu8和7G6-HCzu10；图12)。
所有Vκ变体被工程化改造成具有Ser49，例外的是7G6-LCzu10，其被制造是为了确定人类残基Tyr49是否是Cys49的可行替换。除了Ser49之外，7G6-LCzu7类似于7G6-LCzu1和7G6-LCzu3。7G6-LCzu21类似于7G6-LCzu5并且7G6-LCzu22类似于7G6-LCzu4，同样具有Ser49。7G6-LCzu8在第30位处具有缬氨酸，以确定这个位置处的人类残基是否保留Tau结合。第34位被稍微埋藏在结构中，并且它可能对抗原结合没有贡献，因此将在CDRL1末端处的人类残基Asn34工程化改造成7G6-LCzu9。将所有HC变体与7G6-LCzu6共表达，并将所有LC变体与7G6-HCzu5共表达。
Tau结合通过如上所述的直接ELISA来分析。将样品在用野生型2N4R Tau包被的96孔板中在室温下温育1小时。在洗涤步骤后，向孔添加HRP偶联的抗小鼠或抗人类检测抗体。所述抗小鼠抗体被用于检测ms7G6。每个孔中HRP活性的量通过QuantaBlu荧光底物来测量，并且RFU通过SpectraMax M5读板器来检测。在直接ELISA测定法中，大部分mAb在Tau结合方面显示出很小差异(图14；表4)。值得注意的例外是LCzu9，其即使在最高浓度下也不表现出结合。因此，VκGlu34对于抗原结合来说是关键的。此外，LCzu22显示出结合降低；与Arg46组合的VκTyr36导致抗原结合位点的破坏。
表4.结合Tau的人源化7G6 Vh1/Vκ2变体的EC50*
Figure BDA0002444534010002071
Figure BDA0002444534010002081
*EC50通过在GraphPad Prism 6.05中拟合非线性回归曲线来确定。NB(无结合)指示与Tau的结合很少到没有。
通过表面等离子体共振(BIAcoreTM)分析了人源化和小鼠抗体的结合，以确定它们的相对结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡结合常数(KD)。将抗小鼠或抗人类抗体固定化在CM5芯片上，并将样品mAb捕获在芯片上。使2N4R Tau流过芯片并观察结合。使用1:1Langmuir拟合模型确定结合常数ka、kd和KD。源自于杂交瘤的抗体ms7G6或IgG2a或IgG2b重组材料在结合或解离速率方面没有显示出差异(表5)。在7G6 HC变体之中仅存在略微差异，并且半胱氨酸向丝氨酸的突变不影响Tau结合。7G6-LCzu2、LCzu6、LCzu7、LCzu8和LCzu21相似地结合Tau，证实了这些mAb之间不同的氨基酸对结合几乎没有影响。人源化样品与小鼠mAb相比显示出与Tau更好的结合，但这最可能是由于在这种测定法格式中需要使用不同捕获抗体造成的。
表5.小鼠和人源化Vh1/Vκ2的BIAcoreTM分析
Figure BDA0002444534010002082
Figure BDA0002444534010002091
这些数据与来自于ELISA测定法的数据一起证实了需要7G6 VκGlu34，以及7G6 VκTyr36和Arg46的不利组合。LCzu6中的7G6 Vκ残基Tyr36和Leu46与7G6-LCzu7和7G6-LCzu8中的人类Phe36和Arg46残基相比略微有利，但在这些位置处保留人类残基的重要性超过kd的少量降低。7G6-LCzu10中的人类VκTyr57对kd具有显著影响。
10B.a.3.Vh1和Vκ2变体的HC/LC稳定性的SDS-PAGE分析
将2微克每种mAb与4x NuPAGETM LDS样品缓冲液混合，并在MOPS缓冲液中在4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上进行非还原条件下的分离。将凝胶用InstantBlueTM染色并在水中脱色。所有在LC中具有Cys49的mAb(7G6-LCzu2、7G6-LCzu3、7G6-LCzu4和7G6-LCzu5)不稳定，并且在非还原条件下HC-HC-LC三聚体、HC-HC二聚体和游离LC通过SDS-PAGE分离开(图15)。7G6-LCzu2具有较少的较低分子量物质，可能是由于这个Vκ具有两个另外的小鼠残基Tyr36和Leu46，使Vh-Vκ相互作用稳定。7G6-LCzu3、7G6-LCzu4和7G6-LCzu5的这些残基中的一者或两者被改变成人类Phe36和/或Arg46。最不稳定的mAb是具有两个人类残基的LCzu3变体。7G6-LCzu7、7G6-LCzu8、7G6-LCzu9和7G6-LCzu22具有少量游离轻链，表明这些样品中的HC和LC相互作用可能不是最佳的，导致少量抗体不形成HC-LC链间二硫键。与7G6-LCzu3相同，这些LC变体在第36和46位置中的一者或两者处具有人类残基。7G6-LCzu10和7G6-LCzu21在这些位置处也具有人类残基，但是没有看到游离LC，可能是被InstantBlueTM染料不完全染色的结果。
10B.b IGHV3/IGKV1人源化
10B.b.1人源化Vh3和Vκ1变体和通过ELISA进行的Tau结合分析
上面讨论的人源化7G6变体利用在与ms7G6的相似性的基础上选择的人类种系可变结构域家族IGHV1和IGKV2。然而，这些家族在人类群体中代表性不足，从而提高了所述人源化变体在患者中具有免疫原性的机会(Brezinschek HP,Foster SJ,
Figure BDA0002444534010002102
T,Brezinschek RI,Lipsky PE.，在单个幼稚和记忆B细胞中可变重链和可变κ链的配对(Pairing of variable heavy and variableκchains in individual naive and memoryB cells)，J Immunol.1998 May 15；160(10):4762-7；Jayaram N,Bhowmick P,MartinAC.，抗体中的种系Vh/VK配对(Germline Vh/VKpairing inantibodies)，Protein Eng DesSel.2012 Oct；25(10):523-9；Tiller T,Schuster I,Deppe D,Siegers K,Strohner R,Herrmann T,Berenguer M,Poujol D,Stehle J,Stark Y,Heβling M,Daubert D,FeldererK,Kaden S,
Figure BDA0002444534010002101
J,Enzelberger M,Urlinger S.，具有有利的生物物理性质的基于固定Vh/VK构架配对的全合成人类Fab抗体文库(A fully synthetic human Fab antibodylibrary based on fixed Vh/VKframework pairings with favorable biophysicalproperties)，MAbs.2013 May-Jun；5(3):445-70)。因此，将ms7G6 CDR嫁接在更常见的IGHV3和IGKV1家族上(图16)。
针对与CDR紧邻
Figure BDA0002444534010002111
的人类残基，如上分析ms7G6的前述计算机模型。Vh中第49、71、76、78和94位处和Vκ中第2和57位处的人类残基被鉴定为潜在的关键构架残基。产生了Vh和Vκ的两种人源化变体，一种具有全人类构架残基(7G6-HCzu11；7G6-LCzu11)，另一种具有回复突变的潜在关键残基(7G6-HCzu12；7G6-HCzu12)(图17)。将两种HC与两种LC共表达。
如上所述将2N4R Tau包被在96孔板上并向孔添加各种不同浓度的人源化mAb。结合到Tau的MAb使用HRP偶联的抗小鼠抗体(ms7G6)或抗人类抗体(剩余的样品)来检测。所有人源化mAb类似地结合到Tau，但7G6-HCzu12-LCzu12 mAb具有最低的EC50(图18和表6)。与人源化变体相比两种小鼠mAb显示出更好的结合，可能是由于在小鼠和人类样品之间使用不同的检测抗体造成的。这些数据表明至少某些与CDR接近的人类残基负面影响抗原结合。
表6.结合Tau的人源化7G6Vh1/Vκ2变体的EC50
Ab EC50
ms7G6 89.88
7G6-HCzu11-LCzu11 245.9
7G6-HCzu11-LCzu12 284.2
7G6-HCzu12-LCzu11 218.4
7G6-HCzu12-LCzu12 153.4
EC50通过在GraphPad Prism 6.05中拟合非线性回归曲线来确定。
为了降低潜在的免疫原性，产生了具有逐渐增加的人类残基数目的另一系列的突变体。在基于Vh1的变体7G6-HCzu4C中，DRH2的C-端一半中的残基对Tau结合几乎没有影响。因此，在7G6-HCzu13、7G6-HCzu14、7G6-HCzu19和7G6-HCzu20中将这些残基改变成Vh3种系残基(图17)。制造了7G6-HCzu12的变体，使得在计算机ms7G6模型的基础上以对抗原结合来说重要性可能逐渐提高的顺序将小鼠残基用人类残基代替。例如，Ser76的侧链在远离CDR的环上，并且是最不可能影响CDR-抗原相互作用的残基。因此在7G6-HCzu15中它是被第一个改变成人类残基Asn76的残基。接下来被突变的是第49位残基(7G6-HCzu16)，然后是第78位残基(7G6-HCzu17)、第71位残基(7G6-HCzu18)，最后是第94位残基(7G6-HCzu20)。
由于在7G6-LCzu11与7G6-LCzu12之间具有极少差异，因此预期在第2和57位处的人类残基将对抗原结合具有很小影响。因此，将它们每一者一次突变一个。对于第67位来说，分析了酪氨酸和丝氨酸替换。第30位处的缬氨酸被引入到7G6-LCzu16和7G6-LCzu17中。在CDRL1的末端处的人类残基Asn34被工程化改造到7G6-LCzu17中。将所有HC变体与7G6-LCzu12共表达，并将所有LC变体与7G6-HCzu12共表达。
在直接ELISA测定法中大部分mAb在Tau结合方面显示出很少差异(图19和表7)。值得注意的例外是LCzu17，其即使在最高浓度下也不表现出结合。因此，VκGlu34对于抗原结合来说是关键的。
表7.结合Tau的人源化7G6Vh1/Vκ2变体的EC50
Figure BDA0002444534010002121
Figure BDA0002444534010002131
EC50通过在GraphPad Prism 6.05中拟合非线性回归曲线来确定。NB(无结合)指示与Tau的结合很少到没有。
10B.b.2 Vh3和Vκ1变体的Tau亲和性的BIAcoreTM分析
通过BIAcoreTM分析人源化和小鼠抗体的结合以确定它们的相对结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡结合常数(KD)。将抗小鼠或抗人类抗体固定化在CM5芯片上，并将样品mAb捕获在芯片上。将2N4R Tau流过芯片并观察结合。使用1:1Langmuir拟合模型确定结合常数ka、kd和KD。两种基于7G6-HCzu12的mAb具有相近的ka和kd值(表8)。然而，7G6-HCzu11的ka降低，尽管kd不受影响。因此，Vh3构架中的人类残基影响与Tau的结合。与ELISA测定法相同，7G6-LCzu17不结合Tau。7G6-HCzu12、7G6-HCzu13与7G6-HCzu14之间kd的差异表明CDRH2C-端人类残基对抗原结合具有负面影响。对于在所述区域中也具有人类残基的7G6-HCzu19和7G6-HCzu20来说，没有观察到kd的降低；然而，这些mAb具有ka的降低。7G6-HCzu15不很好地结合到芯片，并且来自于这个mAb的数据是有问题的。尽管没有关于单一S76N突变的具体数据可用，但7G6-HCzu16、7G6-HCzu17、7G6-HCzu18的ka和kd值接近于7G6-HCzu12，表明S76N突变应该不影响Tau结合。7G6-HCzu20的ka低于7G6-HCzu19，并且可能是K94R突变的结果。因此，第49、71、76和78位处的人类残基似乎不影响Tau结合。与小鼠mAb相比人源化样品表现出与Tau更好的结合，但这最可能是由于在这种测定法格式中需要使用不同捕获抗体造成的。
表8.小鼠和人源化7G6 Vh3/Vκ1mAb的BIAcoreTM分析
Figure BDA0002444534010002132
Figure BDA0002444534010002141
任何7G6 LC变体的ka或kd值之间存在很小差异，例外的是7G6-LCzu17，其由于Asn34而不结合Tau。因此，人类Ile2对抗原结合没有影响。第57位处的半胱氨酸、丝氨酸和酪氨酸似乎都被耐受。第30位处的缬氨酸对Tau结合没有影响。
10B.b.3 Vh3和Vκ1变体的HC/LC稳定性的SDS-PAGE分析
将2微克每种mAb与4x NuPAGETM LDS样品缓冲液混合，并在MOPS缓冲液中在4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上进行非还原条件下的分离。将凝胶用InstantBlue染色并在水中脱色。更多人类的7G6-HCzu11，特别是当与更少人类的7G6-LCzu12配对时，产生HC-LC二聚体和游离HC(图20A)。此外，7G6-HCzu18和7G6-HCzu19显示出显著的片段(图20B和20C)。这两种抗体彼此的差异在于第71位。因此，人类残基Arg41，尽管不影响Tau结合，但对HC-LC相互作用的去稳定化有贡献。所有LC变体未显示出抗体片段。与上面分析的Vh1-Vκ2mAb相反，Cys49不产生HC-HC-LC三聚体、HC-HC二聚体或游离LC。
10B.c.人源化抗体的筛选
在来自于IGHV1/IGKV2人源化的序列的人类性、BIAcoreTM亲和性数据和SDS-PAGE稳定性数据的基础上，选择7G6-HCzu8作为对Tau具有最高亲和性的最人类序列。7G6-LCzu6和7G6-LCzu21具有可比的在SDS-PAGE中的稳定性和对Tau的亲和性，但是在第36位处相差一个氨基酸。选择这两个轻链与7G6-HCzu8共表达，以确定基于IGHV1/IGKV2的最佳mAb。
对最人类、最高亲和性和最稳定的IGHV3和IGKV1变体进行另一轮诱变，以分别除去第57和49位处未配对的半胱氨酸。选择7G6-HCzu17和7G6-HCzu18作为具有最高亲和性的最人类的构架残基。通过将人类残基引入到CDRH2的C-端部分中将7G6-HCzu18超级人源化以产生7G6-HCzu21，但亲和性从未被分析。7G6-HCzu18、7G6-HCzu21和7G6-HCzu17都在第57位处含有半胱氨酸，并在所有三种变体中的第57位处引入丝氨酸，以分别产生7G6-HCzu23、7G6-HCzu24和7G6-HCzu25(图17)。7G6-LCzu14和7G6-LCzu15是具有最高亲和性的最人类的Vκ序列。7G6-LCzu14保留Cys49，并因此被突变以除去未配对的半胱氨酸并被命名为7G6-LCzu18。将每种IGHV3 HC与每种IGKV1 LC配对。
10B.c.1完整质量分析
通过ESI-MS分析每种mAb的质量，以确认理论质量与观察到的质量相匹配。将MAb用IdeS消化以产生F(ab’)2片段，然后用2mM DTT还原并在60℃加热3min。通过ESI-MS分析Fd(Vh-CH1)和LC片段的质量。7G6-HCzu8含有N-端焦谷氨酸，这是N-端谷氨酰胺的典型翻译后修饰。所有观察到的质量在预测质量的3道尔顿之内(表9)。
表9.人源化变体的ESI-MS分析
Figure BDA0002444534010002161
10B.c.2 Tau结合BIAcoreTM测定
通过BIAcoreTM以两种不同格式分析了人源化mAb的Tau结合。第一种格式如上所述进行，即用固定化的物种特异性抗Fc抗体捕获mAb。在表5和8中可看到这种格式的限制，其中由于捕获抗体的不同，亲代小鼠和人源化mAb的亲和性不能被直接比较。在第二种格式中，将生物素化的mAb捕获在链亲和素包被的芯片上。由于捕获方法一致，这后一种格式允许人源化和亲代小鼠抗体之间的Tau结合亲和性的直接比较。
10B.c.2.i Fc特异性捕获
如上所述通过BIAcoreTM分析最终的人源化mAb以确定与Tau结合的ka、kd和KD(表10)。从7G6-HCzu23到7G6-HCzu24存在解离速率(kd)的显著变化，而7G6-HCzu24与7G6-HCzu25相似，后一种情况在总体亲和性KD中也被看到。这证实了在CDRH2中保留小鼠残基的重要性，正如在上文表7中看到的。
表10.结合单体Tau的人源化7G6 mAb的BIAcoreTM分析(抗人类抗体捕获)
Figure BDA0002444534010002171
10B.c.2.ii链亲和素捕获
将生物素化的人源化和小鼠mAb捕获在链亲和素包被的芯片上，并确定与Tau结合的ka、kd和KD(表11)。与7G6-HCzu8-LCzu6相比7G6-HCzu8-LCzu21显示出亲和性的略微下降(<2倍)。同样地，与7G6-HCzu24和7G6-HCzu25 mAb相比7G6-HCzu23变体具有亲和性的～2倍下降，正如在表11中看到的。7G6-HCzu8-LCzu6、7G6-HCzu24-LCzu15、7G6-HCzu24-LCzu18、7G6-HCzu25-LCzu15和7G6-HCzu25-LCzu18的亲和性都相近。总的来说，这些抗体与ms7G6相比显示出亲和性的～1.4倍下降，主要反映在人源化形式的略微更快的解离速率上。
表11.结合单体Tau的人源化7G6 mAb和小鼠7G6的BIAcoreTM分析(链亲和素捕获)
Figure BDA0002444534010002181
10B.c.3通过SEC-HPLC分析均质性和聚集
通过SEC-HPLC分析每种mAb以确定mAb在溶液中的均质性。7G6-HCzu8-LCzu6和7G6-HCzu8-LCzu21 mAb的图形一致，主要峰在14.5min处并具有宽肩，表明超过16分钟的可能的产物非均质性(图21A)。7G6-HCzu23、7G6-HCzu24和7G6-HCzu25 mAb的图形一致，具有14.7min附近的紧密峰(图21B)。
10B.c.4 DSC分析
通过差示扫描量热术(DSC)分析F(ab’)2片段的热熔曲线。嵌合的7G6-HCzu8和7G6-HCzu25 F(ab’)2的曲线与不结合Tau的对照人类IgG1抗体mAb1和mAb2相近。然而，7G6-HCzu23和7G6-HCzu24含有第二个峰，指示了F(ab’)2片段的不稳定性，可能是HC-LC相互作用的解离(图22A-L)。7G6-HCzu8-LCzu21、7G6-HCzu25-LCzu15和7G6-HCzu25-LCzu18的转变中点相近，在77.4至77.6℃的范围内。7G6-HCzu8-LCzu6的中点高1度，为78.6℃(表12)。
表12.人源化7G6 F(ab’)2片段的熔化转变中点
分析1 转变中点-1 转变中点-2
7G6-HCzu8-LCzu6 N/A 78.61
7G6-HCzu23-LCzu15 67.81 73.41
7G6-HCzu24-LCzu15 68.04 73.38
7G6-HCzu25-LCzu15 N/A 77.42
7G6-HCzu23-LCzu18 67.81 73.41
7G6-HCzu24-LCzu18 68.78 73.26
7G6-HCzu25-LCzu18 N/A 77.6
分析2 转变中点-1 转变中点-2
7G6-HCzu8-LCzu6 N/A 78.58
7G6-HCzu8-LCzu21 N/A 77.51
10B.d T细胞表位分析
由Stealth Biologics在计算机上分析了人源化序列的潜在免疫反应性T细胞表位。分析了每个可变区种系家族的两个序列，其各自含有不同量的人类和小鼠残基。mAb1-2a和mAb1-2b代表IGHV1-46a/IGKV2-30a，mAb3-1a和mAb3-1b代表IGHV3-23b/IGKV1-39b。尽管对每个可变结构域仅仅分析了4个序列，但代表了所测试的人源化mAb中存在的所有潜在T细胞表位。与人类种系序列具有高于5％的同一性的肽表位被认为具有较低风险，仅仅结合一个或两个HLA等位基因的肽也是如此。
图23和24概述了mAb中存在的表位的分析。表中的肽被鉴定为与人类种系序列具有5％或更低的同一性。所述肽与可变结构域种系序列的百分比同源性也被考虑在内。与可变区种系序列具有～5％或更低的同源性和/或预测结合三个或更多个HLA等位基因的肽被鉴定为较高风险(用灰色突出)。
7G6-HCzu8和7G6-HCzu25两者在第32位处都含有共同的低风险肽，其与种系序列没有同源性并结合3个等位基因(图23A和23B)。据预测肽2在7G6-HCzu25中是低风险的，但7G6-HCzu8的肽2不是。肽64在两个HC中作为风险存在，预测结合3个等位基因。7G6-HCzu8中的所述肽序列可能存在较低风险，因为它与种系可变结构域具有一定同源性。肽70在7G6-HCzu8但不是7G6-HCzu25中具有轻微风险。
在7G6-LCzu6与7G6-LCzu21之间存在一个差异，其中7G6-LCzu21中的肽38据预测结合1个HLA等位基因但表现出非常低的风险(图24A-24D)。在7G6-LCzu15与7G6-LCzu18之间存在仅仅一个肽2的差异，其在7G6-LCzu15中具有比在7G6-LCzu18中更高的风险，因为与可变结构域种系序列具有很小至没有同源性，将7G6-LCzu6/7G6-LCzu21与7G6-LCzu15/7G6-LCzu18相比，7G6-LCzu6/7G6-LCzu21序列含有9个潜在免疫原性肽，而7G6-LCzu15/7G6-LCzu18含有6个。肽51和52在所有LC之间相同，肽88-94是相同或相近的，例外的是肽90，其存在于7G6-LCzu6/7G6-LCzu21中但不存在于7G6-LCzu15/7G6-LCzu18中。肽2和3在7G6-LCzu6/7G6-LCzu21中比在7G6-LCzu15/7G6-LCzu18中风险更高。
10C.概述
概括来说，将ms7G6在两个不同的人类种系可变结构域家族上进行人源化，具有与ms7G6相似的亲和性。
最接近小鼠序列的人类种系是IGHV1-46和IGKV2-30。尽管几个小鼠构架残基被怀疑是维持抗原结合所需要的，但Tau结合不受人类构架残基影响(7G6-HCzu1/7G6-HCzu8)。此外，Tau结合不受未配对的Cys57向丝氨酸的突变(7G6-HCzu5/7G6-HCzu8)或CDRH2在第60、61、64和65位残基处的超人源化(7G6-HCzu4/7G6-HCzu8)的影响。将VκCDR嫁接在IGKV2上不引起Tau结合的急剧降低，但一个或两个小鼠构架残基的添加使HC-LC相互作用稳定。正如通过SDS-PAGE所分析的，在具有或不具有Tyr36的情况下Leu46提高Vh-Vκ相互作用的稳定性，并且Tyr36-Leu46(7G6-LCzu2/7G6-LCzu6)组合产生与单独的Leu46或Tyr36(分别为7G6-LCzu/7G6-LCzu21和7G6-LCzu4/7G6-LCzu22)相比对Tau具有略微更高亲和性的抗体。尽管在第46位处带有亮氨酸具有轻微的免疫原性风险，但所述风险低。未配对的Cys49可以被丝氨酸替换，但酪氨酸替换导致解离速率的提高。
选择人类种系可变结构域家族IGHV3-23和IGKV1-39用于通过利用更通常表达的IGHV3和IGKV1家族来潜在地降低人源化mAb的免疫原性。将CDR嫁接在IGHV3种系上需要一个或多个小鼠残基。Arg94不可以是人类赖氨酸残基。第60、61、62、63和65位处的小鼠残基是最佳抗原结合所需要的。第71位处的精氨酸不影响抗原结合，但是Vh-Vκ相互作用的稳定性所需要的(7G6-HCzu12、7G6-HCzu13、7G6-HCzu14、7G6-HCzu15、7G6-HCzu16、7G6-HCzu17、7G6-HCzu25)。尽管Val71在与Phe63和Ser65配对时产生潜在免疫原性的肽，但风险低。Tau结合不受未配对的Cys57向丝氨酸的突变的影响(7G6-HCzu23、7G6-HCzu24、7G6-HCzu25)。整个IGKV1构架中的人类残基不影响抗原结合或稳定性(7G6-LCzu18)。
对于所有测试的抗体来说，在pI和热稳定性上几乎没有差异。
实施例11：在人类患病大脑上使用7G6-HCzu25/LCzu18的免疫组织化学
将石蜡包埋的固定的人类脑切片(8μm)通过多次更换二甲苯脱蜡，然后在100％工业用甲醇变性酒精(IMS)中充分洗涤。将切片在过氧化氢(H2O2)和甲醇中(每100mL甲醇2mL过氧化氢)在室温放置10分钟以阻断内源过氧化物酶，然后在流动的自来水下继续洗涤10分钟。然后将每个切片用98％甲酸在室温处理10分钟，然后在流动的自来水中另外洗涤10分钟。然后将切片在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中在压力下煮10分钟，然后再次在流动的自来水中随后是TBS洗涤。在去离子水中漂洗后，小心地取出每个载片并围绕组织边缘干燥。在干燥后，使用蜡笔在切片的周围标记，然后施加蛋白酶K溶液，在室温下10分钟。
在组织切片制备后，使用Klear人类HRP-聚合物DAB检测试剂盒(GBI Labs,Bothwell,WA；目录号D103-18)，按照制造商的说明书用不同浓度的7G6-HCzu25-LCzu18抗体进行染色。如图25中所示，抗体7G6-HCzu25-LCzu18通过免疫组织化学强烈且特异性地识别来自于阿尔茨海默氏病(神经原纤维缠结和神经纤维网线)、PSP(缠结、簇生星形细胞和卷曲小体)和匹克氏病(匹克氏体)的脑中的病理性Tau。在所有测试的组织中，所述抗体也仅仅显示出非常低的背景染色水平。
实施例12：7G6-HCzu25-LCzu18对2N4R野生型Tau的亲和性
12A.材料和方法
12A.c.2.CHO瞬时mAb生产
7G6-HCzu25-LCzu18抗体使用Lonza第7版平台，按照制造商的程序来生产。将编码7G6-HCzu25和7G6-LCzu18的DNA片段克隆到来自于Lonza的编码谷氨酰胺合成酶的表达质粒中。按照Lonza的选择MSX抗性细胞系的流程，将CHO-K1sv细胞用7G6-HCzu25-LCzu18表达质粒电穿孔，然后在96孔板中，在无谷氨酰胺培养基中，在25或50μM MSX存在下每个孔接种2500个细胞。对含有MSX抗性细胞的孔在各种不同的细胞培养体积下进行几轮抗体表达的筛选。选择产生最高7G6-HCzu25-LCzu18抗体滴度的细胞系96E7用于进一步开发，在-80℃下冷冻并储存在液氮的蒸气相中。
将一瓶细胞系96E7融化并在一次性摇瓶中在36.5℃和5％CO2下培养，然后每3-4天在更大尺寸的一次性摇动袋中在36.5℃和5％CO2下进一步扩增。使用200L不锈钢种子生物反应器在36.5℃和受控的pH和溶解氧下进行最后扩增，然后接种1000L不锈钢补料分批生产生物反应器。在补料分批模式和36.5℃以及受控pH和溶解氧下15天后，通过深层过滤收获上清液。
12A.d.MAb纯化
使用AKTAprocess纯化平台(GE Healthcare)来进行纯化。纯化过程由下述步骤构成：蛋白A捕获层析，病毒失活，深层过滤，阴离子交换穿流层析，病毒消减过滤，浓缩和最终的缓冲液交换。
最初的捕获步骤使用Amsphere A3蛋白A树脂(JSR)进行。将14.1L柱用50mM pH7.0的磷酸钠、1M NaCl平衡，然后每个循环每升树脂载样至多45g蛋白质。在载样后，将柱用平衡缓冲液洗涤，然后用25mM pH 7.0的Bis-Tris洗涤，直至UV回到基线。使用100mM pH3.4的甘氨酸将结合的材料从柱上洗脱。使用2M乙酸将洗脱液的pH调整到pH 3.6，用于低pH病毒失活。在最少30分钟的静态保持后，使用2M Tris碱将洗脱液中和至pH 6.8。立即使用Millistak+D0HC和X0HC荚式过滤器(Millipore)进行深层过滤。使用在25mM pH 7.0的Bis-Tris中平衡的6.7L Capto Q(GE Healthcare)阴离子交换柱将滤液进一步处理。将所述柱在非结合状态下每升树脂载样至多150g蛋白质。将穿流产物使用Viresolve Pro病毒消减滤器过滤，然后浓缩至25g/L。将所述材料在缓冲液中进行缓冲液交换。所述纯化程序在两个不同的单克隆抗体生产运行上进行，并被命名为批号17-0190和18-0146。来自于批号17-0190的几个小瓶被命名为17-0190ARS，用作参比标准品。
12A.f.表面等离子体共振(SPR)结合分析
12A.f.2.抗人类抗体捕获单体Tau结合测定法
12A.f.2.i.芯片制备
试剂制备。通过向每个小瓶添加10.0ml Milli-Q水来溶解EDC[1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺]和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)。将小瓶盖紧盖子并涡旋振荡直至固体完全溶解。将EDC、NHS和乙醇胺溶液在7mm塑料小瓶中分别等分成0.5ml等分试样，盖上盖子并在-20℃冷冻储存。将来自于试剂盒的抗人类IgG(Fc)抗体在微量离心管中简短离心以将抗体收集在管底。移取15μL抗人类IgG(Fc)抗体到新的1.5mL微量离心管中，并用285μL固定化缓冲液稀释到300μL。将样品简短涡旋振荡混合，然后分取70μL到4个单独的7mm管中并盖上盖子。将EDC、NHS和乙醇胺的各4个等分试样融化，简短涡旋振荡混合并驱除捕获在管壁上的任何空气泡，置于试剂架2上。
通过在1L Pyrex瓶中将50mL 10X HBS-P+用450mL
Figure BDA0002444534010002241
水稀释到0.5L，来制备0.5L 1x HBS-P+(测定法运行缓冲液)。
用于测定的仪器的准备。将测定法运行缓冲液的1L瓶子附连到
Figure BDA0002444534010002242
T-100上的缓冲液A管线，将空的2L Pyrex瓶附连到
Figure BDA0002444534010002243
T-100废液管线，并将装有新鲜的1L
Figure BDA0002444534010002244
水的1L Pyrex瓶附连到水管线。将新的CM5芯片安装在仪器中。
捕获抗体固定化。在
Figure BDA0002444534010002245
T-100控制软件中，打开新的向导模板并选择“固定化”。将芯片类型设置成“CM5”。将方法设置成“胺”。配体空格填入“抗人类抗体”。接触时间设定到对每个流动池来说360sec，流速设定为5μL/min。在这些步骤完成后，运行测定。
12A.f.2.ii.结合测定法
使用BIAcoreTM T-100仪器或T-200仪器进行结合实验。用于结合测定法的运行缓冲液是HBS-P+/0.2％BSA。将7G6-HCzu25LCzu18样品在测定法运行缓冲液中稀释到100μg/mL，终体积为100μL，然后在微量离心机中在环境温度下以18,000x g离心10min。通过取出40μL上清液并在带标签的5mL管中用测定法运行缓冲液稀释到4.0mL，进行向1μg/mL的稀释。将1μg/mL抗体溶液转移到带标签的1.5mL无盖塑料小瓶中并用3型盖子盖紧。将小瓶简短涡旋振荡以除去附着于管壁或管底的任何空气泡，并放置在样品和试剂架1中。将200μL1μg/mL的稀释的参比标准抗体溶液转移到7mm塑料小瓶，盖上盖子，简短涡旋振荡以驱逐附着的空气泡，并置于样品和试剂架1中(用于芯片调制循环)。将重组人类野生型2N4R Tau蛋白在测定法运行缓冲液中稀释到1μM，终体积为0.5mL(1mg/mL储用液为21.7μM)。将样品在微量离心机中在环境温度下以18,000x g离心10min，并通过取出400μL上清液并在带标签的5mL管中用测定法运行缓冲液稀释到4.0mL，稀释到100nM。通过取出1333μL 100nM溶液并在2667μL测定法运行缓冲液中稀释到4.0mL的终体积，对100nM溶液进行3倍连续稀释(33.3nM)。连续稀释被重复6次，总共8个稀释度(100nM、33.3nM、11.1nM、3.70nM、1.23nM、0.41nM、0.14nM和0.046nM tau)。0nM Tau蛋白溶液通过向带标签的5mL管添加3mL测定法运行缓冲液来制备。将分析物稀释液转移到带标签的4mL塑料小管，并用5型盖子盖紧，简短涡旋振荡以除去附着于管壁或管底的任何空气泡，并放置在样品和试剂架1中。对于芯片调制分析物样品来说，取出5μL 1μM Tau蛋白溶液上清液并在7mm塑料小管中在测定法缓冲液中稀释到500μL，盖上盖子，简短涡旋振荡以驱逐附着的空气泡，并放置在样品和试剂架1中。将人源化抗体以10μL/min的流速和36sec的接触时间顺序捕获在流动池2、3和4上。将Tau蛋白的稀释液以30μL/min的流速和300sec接触时间进样到所有4个流动池上。解离被跟踪1800sec。在每个循环后，通过在所有4个流动池上连续两次以30μL/min进行3M MgCl2的30sec进样，将表面再生。在运行后，使用1:1Langmuir模型进行动力学数据拟合。
12B.结果
使用抗体捕获格式测定法确定重组人类野生型2N4R Tau蛋白对7G6-HCzu25LCzu18抗体的亲和性。在7G6-HCzu25LCzu18抗体捕获后，将人类Tau蛋白进样到配体表面上300sec，然后观察并测量解离1800sec。在每个抗体捕获、Tau蛋白结合和解离循环后，按照制造商的要求使用3M MgCl2将芯片表面再生成抗人类抗体捕获表面。Tau蛋白在100nM至0.046nM的浓度范围内(3倍稀释)进行分析。所述测定以多循环模式进行，以便对每个Tau蛋白进样进行解离。每种配体在所有三个流动池(fc2、fc3和fc4)上一式三份进行分析，以便消除任何流动池特异性影响。
确定了每种配体在每个流动池上的捕获水平(相对于fc1)。这些结果列于表13中：
表13–7G6-HCzu25-LCzu18配体的捕获水平
Figure BDA0002444534010002261
数据以RU为单位表示。值代表所有相关循环的配体捕获水平的平均值。
fc–流动池
捕获的配体平均水平都在158RU与196RU之间。在给定配体内在流动池之间仅观察到轻微差异。
结合数据是双重参比的，意味着参比于没有配体结合的fc1和缓冲液分析物进样(0nM Tau蛋白)两者。将结合数据拟合到1:1Langmuir结合模型。这个模型适合于所述测定法格式，因为抗体的二价性和得到的亲和性效应与抗体捕获格式无关。将每种配体在各个流动池上的亲和性数据平均并确定标准偏差。这些结果列于表14中：
表14–人类Tau结合7G6-HCzu25LCzu18的亲和性常数
Figure BDA0002444534010002271
数据被表示为平均值±标准偏差。平均值来自于每个流动池的动力学数据。
在两个7G6-HCzu25LCzu18药物物质批号与7G6-HCzu25LCzu18参比标准品之间没有观察到结合速率、解离速率或亲和性的显著差异。
实施例13：7G6-HCzu8-LCzu6和7G6-HCzu25-LCzu18的精细表位作图
如实施例3中所述对7G6-HCzu8-LCzu6和7G6-HCzu25-LCzu18抗体进行了精细表位作图。
芯片的荧光图像和得到的强度图显示，7G6-HCzu8-LCzu6(图26A)和7G6-HCzu25/LCzu18(图26B)抗体两者与鼠类7G6抗体(参见图3)相似，都结合到全长Tau蛋白上的两个主要位点。对于某些但不是所有的肽来说，通常对7G6-HCzu25-LCzu18在芯片上观察到更强的荧光强度，产生信号饱和的一些迹象并因此缺少真实的定量。在这个实验中，数据分析软件(PepSlideTM Analyser)将7G6-HCzu8-LCzu6的最小结合序列鉴定为对于2N4R蛋白的第二重复区内的位点(第298至304位)来说KHVPGGG(SEQ ID NO：1135)和对于第四重复区内的位点(第362至366位)来说HVPGG(SEQ ID NO：79)。对于7G6-HCzu25-LCzu18来说，软件鉴定到对于两个结合位点来说最小所需序列为HVPG(SEQ ID NO：1133)。
与鼠类7G6相似，对于7G6-HCzu8-LCzu6和7G6-HCzu25-LCzu18两种抗体来说在两个另外的位点处观察到次要结合：在第268至272氨基酸位置处的HQPGG(SEQ ID NO：183)和在第330至334位处的HKPGG(SEQ ID NO：182)。含有HXPGG序列(SEQ ID NO：1136)的肽的平均信号强度的计算证实，与HQPGG(SEQ ID NO：183)(重复区1)或HKPGG(SEQ ID NO：182)(重复区3)序列相比，7G6-HCzu8-LCzu6人类抗体与通常包含在全长2N4R Tau的第二重复区内的HVPGG位点(SEQ ID NO：79)的结合分别显示出108倍或104倍的偏好性。同样地，观察到与HQPGG(SEQ ID NO：183)(重复区1)或HKPGG(SEQ ID NO：182)(重复区3)序列相比，7G6-HCzu8-LCzu6与通常包含在全长2N4R Tau的第四重复区内的HVPGG(SEQ ID NO：79)位点的结合分别具有99倍或95倍的偏好性。对7G6-HCzu25-LCzu18的一致的数据分析证实了，与HQPGG(SEQ ID NO：183)(重复区1)或HKPGG(SEQ ID NO：182)(重复区3)序列相比，与通常包含在全长4R Tau的第二重复区内的HVPGG(SEQ ID NO：79)位点的结合分别具有65倍或100倍的偏好性。同样地，观察到与HQPGG(SEQ ID NO：183)(重复区1)或HKPGG(SEQ ID NO：182)(重复区3)序列相比，7G6-HCzu25-LCzu18与通常包含在全长4R Tau的第四重复区内的HVPGG(SEQ ID NO：79)位点的结合分别分别具有77倍或119倍的偏好性。
实施例14：7G6-HCzu8-LCzu6和7G6-HCzu25-LCzu18的表位替换扫描
如实施例4中所述对7G6-HCzu8-LCzu6和7G6-HCzu25-LCzu18抗体进行了表位替换扫描。
所述替换扫描显示，在1HVPGG5(SEQ ID NO：79)序列中，7G6-HCzu8-LCzu6和7G6-HCzu25-LCzu18两种抗体的肽结合需要1H、3P和4G残基，并在2V处具有一定的替换耐受性。这些发现与对鼠类7G6抗体观察到的相似(参见实施例4)。在这种情况下在1HVPGG5(SEQ IDNO：79)序列的第二个甘氨酸残基(5G)处也观察到一定的替换耐受性。然而，这个残基仍然能够对7G6-HCzu25-LCzu18和7G6-HCzu8-LCzu6抗体与更长的野生型肽序列的结合发挥相当大的影响。与实施例13一起，这些结果表明HVPGG(SEQ ID NO：79)序列促进7G6、7G6-HCzu25-LCzu18和7G6-HCzu8-LCzu6抗体与2N4R Tau在分别在第二和第四重复区内的第299至303位和第362至366位处的高效结合。
实施例15：使用7G6-HCzu25-LCzu18的体外Tau聚集实验1
为了确定7G6-HCzu25-LCzu18抗体是否能够在体外抑制Tau聚集，在实施例5中描述的使用野生型Tau蛋白的测定法中做出少量修改，对所述抗体进行了测试。唯一的区别是在这种情况下使用的对照IgG是人类IgG1抗体(BioXCell，目录号BE0297)。
在这个测定法中，在几天的时间过程内对7G6-HCzu25-LCzu18抗体进行了测试。图27显示，7G6-HCzu25-LCzu18能够在体外有效抑制Tau聚集。当将IgG对照与7G6-HCzu25-LCzu18相比时，在37℃温育后第1、2、5和6天，效果是统计学显著性的(t-检验)。仅在肝素添加后起始反应后第0天，没有观察到显著性。
实验2
为了证实人源化7G6-HCzu25-LCzu18抗体在体外抑制Tau聚集时与鼠类7G6抗体相当，将两种抗体在相同的体外Tau聚集测定法中进行比较。使用的条件与本实施例的实验1中一致，区别在于使用在实施例5中描述的相同的小鼠IgG2b对照抗体。
当按照实施例5中提供的测定条件测试鼠类抗体7G6和人源化抗体7G6-HCzu25-LCzu18两者时，两种抗体有效地在体外抑制Tau聚集。如图28中所示，在鼠类7G6与7G6-HCzu25-LCzu18抗体之间看到相同的效应大小。
实施例16：在用7G6-HCzu25-LCzu18免疫耗竭后使用K18 Tau原纤维的基于细胞的接种测定法
为了确定来自于细胞培养基的Tau种子的免疫耗竭是否可以进一步阻止细胞内的Tau聚集，使用了与实施例6中所描述的相同的HEK293测定***。然而在这种情况下，使用强效的截短形式的Tau(K18)原纤维作为Tau种子，而不是如以前所描述的全长蛋白。所述K18片段已被深入研究，并且通常被重组表达为全长2N4R Tau蛋白的第244至372位残基。这个片段编码Tau的微管结合区，并且已被报道比全长蛋白更容易聚集(Shammas等，NatureComms.,6,Article number:7025(2015))并具有在基于细胞的测定法中形成强效种子的能力(Kfoury等，2012,J.Biol.Chem.,287:19440-19451)。
材料和方法：
K18原纤维的制备。将重组人类Tau-441(244-372；“K18”)(SignalChem)溶解在超纯水中。通过将终浓度为40μmol/L的K18蛋白、100mmol/L乙酸钠(pH 7)、2mmol/L DTT和240μg/mL肝素混合在一起来产生原纤维。将反应在37℃搅拌3天。在温育后，将所述溶液在室温下以135,000g离心20分钟。舍弃上清液，并将沉积物重悬浮在100mmol/L乙酸钠(pH 7)中。将聚集的蛋白质简短超声处理，然后用D-PBS(-)稀释到50μg/mL的浓度并储存在-80℃下。
免疫耗竭和免疫沉淀的样品的制备。制备的K18原纤维的免疫沉淀使用免疫沉淀
Figure BDA0002444534010002301
蛋白G试剂盒(Thermofisher Scientific，目录号10007D)，按照制造商的说明书来进行。简单来说，每次免疫沉淀使用1.5mg结合到3或0.3μg 7G6-HCzu25-LCzu18抗体的Dynabeads。包含介质(无抗体)或3μg可商购的人类IgG1抗体(Bio-Rad Laboratories,Inc.，目录号HCA192)作为对照。将抗体结合的(或介质处理的)珠子重悬浮在170μL含有0.2％BSA的缓冲液中。然后将K18原纤维溶液融化，在PBS中稀释到10μg/mL，并添加到抗体结合的珠子以给出200μL的终体积(总共含有300ng K18)。这在每个免疫沉淀反应中给出15或1.5μg/mL抗体的终浓度。将珠子与K18原纤维在室温下旋转温育20分钟，并保留未结合的材料作为免疫耗竭(ID)的样品。将抗体结合的材料洗脱在20μL试剂盒中提供的缓冲液中，并且也保留下来以提供免疫沉淀(IP)的样品。
基于细胞的测定法。将聚乙烯亚胺(PEI)溶液在纯水中稀释至终浓度为0.1％，然后用于在37℃下将96孔组织培养板包被至少一夜。然后将板用水洗涤两次，然后在进行测定之前向每个孔添加150μl含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle’培养基(D-MEM)(“DMEM(+FBS，P/S)培养基”)。
在添加Tau种子之前，将常规在37℃和5％CO2下维持在D-MEM(+FBS，P/S)中的Lenti-X 293T(Takar Bio Inc.)细胞在不含抗生素的相同培养基中悬浮转染。对于转染来说，将7μg含有编码突变体P301S 0N4R Tau亚型的cDNA的pcDNA3.1(+)(Invitrogen)哺乳动物表达载体与LTX和PlusTM试剂(Life Technologies，目录号15228-100)按照制造商的推荐混合。将得到的混合物在室温下温育至少25分钟，然后直接添加到密度为1.0×105个细胞/mL的6.0×106个Lenti-X 293T细胞的悬液。从预包被的板除去培养基，并将处理过的细胞悬液以每孔150μL(1.5×104个细胞/孔)分发，并在37℃下和5％CO2气氛中温育19小时。
在冰上融化后，将30μL每种ID样品在420μL
Figure BDA0002444534010002311
I减血清培养基(ThermoFisher Scientific，目录号31985-062)中稀释。对于IP样品来说，也将溶液在冰上融化，并将各2μL在50μL
Figure BDA0002444534010002312
I减血清培养基中稀释。然后添加2.5μL P3000(Thermofisher Scientific，目录号L3000-008)。在分开的管中，将22μL
Figure BDA0002444534010002313
3000(Thermofisher Scientific，目录号L3000-008)在550μL
Figure BDA0002444534010002314
I减血清培养基中稀释。然后将52μL稀释的Lipofectamine 3000溶液添加到每个含有P3000试剂的IP样品。
将铺板的细胞洗涤两次并留在75μL
Figure BDA0002444534010002321
I减血清培养基(ThermoFisherScientific)中。向每个孔添加等体积的如上所述稀释的ID或IP样品，并在37℃下和5％CO2气氛中温育44小时。所述实验进行一式四份。
免疫细胞化学。在温育2天后，将细胞在室温下在4％聚甲醛中固定30分钟。将每个孔用100μL纯化水洗涤3次，然后向每个孔添加70μL通透化/阻断/DAPI染色缓冲液(在含有5％BSA的TBS中稀释的Triton X-100溶液(终浓度：0.2％)和
Figure BDA0002444534010002322
DAPI溶液(终浓度：0.1％；Dojindo))。将板盖上并在室温下避光温育30分钟。在温育后，除去通透化/阻断/DAPI染色缓冲液，向每个孔添加80μL硫磺素S(ThS)染色缓冲液(将硫磺素S溶解在50％乙醇中至终浓度为0.0003％)，并在室温下温育40分钟。然后，将每个孔用50％乙醇洗涤两次，并用250μL纯化水代替。
成像测定法。通过
Figure BDA0002444534010002323
Analyzer 2200(GE Healthcare)获得每个孔的荧光图像(ThS：激发[Ex]/发射[Em]＝475/511nm，DAPI：Ex/Em＝390/435nm)。然后使用InCellDeveloper软件(GE Healthcare)分析每个孔中ThS和DAPI阳性信号的数目。
数据分析。ThS阳性率使用下面的公式来计算：
ThS阳性率＝ThS/DAPI
＝ThS阳性信号的数目/DAPI阳性信号的数目。
然后，使用下述公式计算ID或IP样品的接种效果(软件：TIBCO Spotfire)：
ID样品的接种效果(对照的％)＝T1/C1×100，其中
T1：抗体处理的ID样品中ThS阳性率的平均值，并且
C1：缓冲液处理的ID样品中ThS阳性率的平均值。
IP样品的接种效果(对照的％)＝T2/C2×100，其中
T2：抗体处理的IP样品中ThS阳性率的平均值，并且
C2：7G6-HCzu25-LCzu18抗体(15μg/mL)处理的IP样品中ThS阳性率的平均值。
图29示出了在基于细胞的接种测定法中在ID样品处理后归一化的ThS阳性率。1.5和15μg/ml的7G6-HCzu25-LCzu18抗体消除了K18原纤维的接种效应(与人类IgG1κ对照相比降低>70％)。对于IP样品来说，7G6-HCzu25-LCzu18抗体以浓度依赖性方式高效诱导接种效应(数据未示出)。
实施例17：使用7G6的海马内P301S Tau种子注射模型
材料和方法：
通过将重组人类2N4R P301S Tau(40μmol/L)与肝素(240μg/mL)混合，然后在含有2mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的100mmol/L pH7.0的乙酸钠中进行在37℃下48至96小时的温育步骤，来产生Tau种子。通过超离心收集聚集的Tau并重悬浮在100mmol/L pH7.0的乙酸钠中。将得到的原纤维超声处理并作为种子用于注射。
使用UltraMicroPump III和Micro4控制器(World Precision Instruments)，以0.5μL/min的速率6分钟，将3μL Tau种子(1.5mg/mL)或非种子(100mmol/L乙酸钠，pH7.0)立体定向注射到3至4月龄小鼠/Thy-1hTau.P301S(CBA.C57BL/6)小鼠[以前产生的纯合人类P301S Tau转基因小鼠(C57BL/6)(Allen等，J Neurosci.2002；22:9340–51)]的左侧海马中(A：+2.5，L：2.0，V：1.5)(Franklin和Paxinos，《立体定向坐标中的小鼠脑》(The MouseBrain in Stereotaxic Coordinates)第三版，2007，Elsevier USA)。将小鼠随机分成如表15中所示的组。在已接受种子的组中，将配制缓冲液(25mmol/L磷酸钠，0.15mol/L NaCl，pH6.5)中的抗人类Tau小鼠IgG2b单克隆抗体克隆7G6或小鼠IgG2b同种型对照抗体(克隆MPC11，BioXCell)腹膜内给药以达到40mg/kg的剂量。将相同的配制缓冲液给药到非种子组。在Tau种子注射之前6-16小时和之后1和2周进行给药(总共3次)。在给药前从体重计算给药体积(10mL/kg)。
表15.治疗组
Figure BDA0002444534010002341
“非种子”表示在左侧海马中注射溶液(100mmol/L乙酸钠，pH7.0)，“Tau种子”表示在左侧海马中注射1.5mg/mL Tau种子溶液。对照IgG＝小鼠IgG2b同种型对照抗体，7G6＝抗人类Tau小鼠IgG2b单克隆抗体。
Figure BDA0002444534010002342
将来自于非种子组的另外的5只动物和接受种子的两个治疗组的11只动物的组织，通过向组织直接添加含有十二烷基肌氨酸钠的缓冲液代替RIPA缓冲液进行处理。因此这些另外的动物不被包括在数据分析中。然而，在这些另外的动物中仍观察到不溶性Tau(在用含有十二烷基肌氨酸钠的缓冲液提取两次后)的减少。
将所有小鼠用组合麻醉剂(M/M/B：0.3/4/5；用0.9mg/kg美托咪定、12.0mg/kg咪达***和15mg/kg布托啡诺制备)深度麻醉，并收集血浆和脑脊液(CSF)。然后，在用盐水心内灌注后分开地从两侧(同侧和对侧)解剖皮层和海马。将脑组织立即在液氮中冷冻并储存在-80℃下。
将解剖的脑组织在19倍体积(组织重量/体积)的含有50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)(Invitrogen)、5mmol/L EDTA(Nippon Gene)、1mmol/L EGTA(Nacalai Tesque)、1％NP-40Alternative(EMD Millipore)、0.25％脱氧胆酸钠(Bio world)、0.1mol/L NaCl、0.5mmol/L PMSF(Sigma Aldrich)、1×PhosSTOPTM(Roche)和1×完全EDTA(-)(Roche)的提取缓冲液(“RIPA缓冲液”)中匀浆。将匀浆物在4℃下以163,000g离心20分钟，并在超声处理前将沉积物重悬浮在10倍体积(组织重量/体积)的含有10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、0.5mol/L NaCl、1mmol/L EGTA、10％蔗糖(Wako Pure Chemical)和1％十二烷基肌氨酸钠的缓冲液中。将十二烷基肌氨酸钠处理的样品在37℃温育60分钟，然后在4℃下以163,000g再次离心20分钟。最后，向沉积物添加10倍体积的PBS(Gibco)，随后将其超声处理。这形成十二烷基肌氨酸钠不溶性级分。
所述十二烷基肌氨酸钠不溶性级分中Tau蛋白的量通过Western印迹分析来定量。将十二烷基肌氨酸钠不溶性级分溶解在NuPAGETM LDS样品缓冲液(Novex)和NuPAGETM样品还原剂(Invitrogen)中，在80℃加热10分钟，并使用12.5％聚丙烯酰胺凝胶(DRC)分离。将蛋白质转移到0.2μm PVDF膜(Bio-Rad)，并将印迹在含有0.05％Tween(Nacalaitesque)和2.5％脱脂奶(Yukijirushi)的TBS(Takara)中，在室温下阻断1小时。在阻断后，将印迹用阻断缓冲液中的人类特异性单克隆抗Tau抗体HT7(1:1000，Thermo Fisher Scientific)在室温下探测1小时。将所述印迹在TBS-T中洗涤30分钟，然后与HRP偶联的抗小鼠IgG抗体(1:2000，GE healthcare)在室温下继续温育1小时。除去第二抗体，并将印迹如上所述进行洗涤。Tau蛋白通过化学发光辣根过氧化物酶(HRP)底物(Merck Millipore)来检测，并使用Fusion FX和FusionCapt 16.15版(Vilber-Lourmat,France)来定量。为了确定Tau的量，将源自于P301S脊髓的原始十二烷基肌氨酸钠不溶性级分的Tau标准品的连续稀释液(1、2、5、10、20任意单位[AU]，1AU等同于在来自于7μg脊髓的十二烷基肌氨酸钠不溶性级分中通过HT7抗体检测到的人类Tau蛋白的带密度)载样到每块凝胶上。被计算为小于1AU(检测限)的数据被表示为0.5AU。
数据被表示成平均值±SEM。非种子、对照IgG治疗和7G6治疗组之间十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau的差异通过单因素方差分析(ANOVA)然后通过Fisher’s LSD检验进行分析。P<0.05的值(双侧)被认为是统计学显著性的。使用GraphPad Prism 7.02版(GraphPadSoftware)进行统计分析。
结果
在同侧(注射侧)和对侧皮层和海马两者中分开地检查了7G6对由海马内Tau种子注射诱导的十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau的影响。正如在图30A-30D中所示，与对照IgG相比，7G6在对侧海马中显著抑制十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau的增加(图30A)，但在其他区域中没有显示出显著影响(图30B、30C和30D)。这表明7G6能够在这种体内模型中阻止Tau传播。
实施例18：7G6-HCzu25-LCzu18翻译生物标志物数据
雄性食蟹猴通过每周一次间歇式静脉内给药共4周，用介质或7G6-HCzu25-LCzu18抗体(10、30和100mg/kg：3只动物/剂量)治疗。将从每只猴收集的脑脊液(“CSF”)中结合到7G6-HCzu25-LCzu18抗体的MTBR-Tau(含有MTBR的全长或截短的Tau的任何亚型)(“结合的MTBR-Tau”)和未结合形式(“游离MTBR-Tau”)通过蛋白A柱进行分离，并通过与质谱偶联的液相色谱(LC/MS)进行分析。使用偶联到Orbitrap FusionTM LumosTM TribridTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)的UltiMateTM 3000 Nano LC***，使用针状柱(3μm C18粒子，150mm长，100μm内径)来进行LC/MS分析。通过金属三通接头施加2000V的喷雾电压。流速为500nL/min。流动相由(A)4％乙腈中的0.5％乙酸和(B)80％乙腈中的0.5％乙酸构成，并使用多步线性梯度(1％至1％B 5min，1％至37％B 15min，37％至68％B 5min，68％至99％B 1min和99％至99％B 4min)来洗脱分析物，然后用初始条件1％B平衡。通过LC/MS测量含有7G6-HCzu25-LCzu18抗体表位的特定肽作为MTBR-Tau的代用品。MTBR-Tau的量被表示为所述特定肽(轻)和它的内标(重)同位素标记的肽的色谱峰面积比。
正如图31A中所示，CSF中结合的MTBR-Tau的量以剂量依赖性方式随着7G6-HCzu25-LCzu18抗体的治疗而增加，然而猴CSF中游离MTBR-Tau的量也剂量依赖性降低(图31B)。这表明7G6-HCzu25-LCzu18抗体在猴CSF中的体内靶向啮合。
也将7G6-HCzu25-LCzu18抗体以10、100、500、1000或2000ng/mL掺入到人类CSF中。然后，以与上述相同的方式通过与质谱偶联的液相色谱(LC/MS)测定被7G6-HCzu25-LCzu18结合的MTBR-Tau。如图32中所示，人类CSF中结合的MTBR-Tau的量被7G6-HCzu25-LCzu18抗体治疗剂量依赖性提高。该数据也表明7G6-HCzu25-LCzu18抗体对人类CSF中的MTBR-Tau的靶向啮合。
实施例19：过表达CD32A的CHO细胞中Tau摄入的测量
标记的Tau单体和原纤维的制备。野生型重组全长人类2N4R Tau聚集体如实施例17中为P301S蛋白所述从单体制备。在标记之前，将聚集体超声处理以产生在测定法中使用的原纤维。Tau原纤维和单体两者都使用DyLightTM 488 NHS酯试剂盒(ThermoFisherScientific，目录号46403)，按照制造商的说明书进行荧光标记，并且在两种形式的蛋白之间存在少量差异：将150μL Tau单体(100μM)与100μL DyLight NHS酯溶液混合，而将300μL Tau-441原纤维(587μg/mL)与66μL DyLight NHS酯溶液混合。标记在室温下进行1小时。使用PierceTM染料移除柱(ThermoFisherScientific，目录号22858，批号SL260099)，按照制造商的流程移除过量的未偶联的染料，使用了125μL标记的Tau单体或122μL标记的原纤维。标记的Tau单体和原纤维的终浓度通过二喹啉甲酸测定法(BCA)来测量，并储存在-80℃。
基于细胞的测定法。将稳定表达CD32a(FcγRIIA)的冷冻CHO细胞在37℃水浴中快速融化，并置于CHO培养基(含有10％胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠和青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基)中。将细胞以1×104个细胞/孔(100μL/孔)接种在96孔测定板(Costar，目录号3603)中，并在37℃下和5％CO2气氛中温育24小时。将标记的Tau单体和原纤维在冰上融化，并在测定缓冲液(RPMI 1640培养基)(GIBCO，目录号21875-034)中分别稀释到1.5μg/mL或0.5μg/mL的浓度。然后，在60μL的总体积中，将7G6-HCzu25-LCzu18抗体(终浓度：0.3或3μg/mL)、人类IgG1同种型对照(BioXcell，目录号BE0297)(终浓度：3μg/mL)或介质(25mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，含有150mM NaCl)添加到任一形式的蛋白质，并在室温下避光温育1小时。从板中除去CHO培养基并将细胞用90μl测定缓冲液或也在测定缓冲液中稀释到100μg/mL的多克隆抗体Fc受体结合抑制剂(ThermoFisher Scientific，目录号16-9161-71)预处理。然后将细胞在37℃和5％CO2气氛中温育30min。接下来，相关的孔接受10μL含有或不含抗体的标记的Tau单体或Tau原纤维混合物，并将板再次在37℃和5％CO2气氛中继续温育60分钟。每种处理在4个平行孔中进行。对于Tau单体摄入测定进行了6个独立实验，并完成了5个独立实验以测量Tau原纤维摄入。
细胞固定和染色。在最后的温育期后后，将细胞在室温下在4％聚甲醛中固定30min。然后将每个孔用100μL水洗涤，并用70μL Hoechst染色缓冲液(Triton X-100溶液(终浓度：0.2％)和Hoechst溶液(终浓度：0.02％))代替。将板盖上并在室温下避光温育30分钟。然后除去染色缓冲液，并将每个孔再用100μL水洗涤两次。
细胞成像。使用Cellomics高内涵成像***(Thermo Fisher Scientific)获得每个孔的荧光图像。使用Thermo Scientific HCS Studio(Thermo Fisher Scientific)软件记录并分析每个孔中标记的Tau的总强度和Hoechst阳性细胞的数目。
数据分析。测量每个孔的Tau信号的总强度的平均值并在TIBCO spotfire软件程序中使用下述公式计算Tau摄入效果：
Tau摄入效果(对照的％)＝T1/C1×100，其中
T1：在抗体处理的样品中每个细胞的DyLight 488NHS偶联的Tau信号的总强度，并且
C1：在7G6-HCzu25-LCzu18(30μg/mL)处理的样品中每个细胞的DyLight 488NHS偶联的Tau信号的总强度。
统计分析。数据被表示成平均值±SEM。使用GraphPad Prism 7.02版(GraphPadSoftware)中的单因素ANOVA检验来进行统计分析。****p<0.0001，**p<0.01，*p<0.05。
图33A和33B分别示出了在过表达CD32A的CHO细胞中Tau单体或原纤维摄入的功效。与人类IgG1对照(3μg/mL)相比，7G6-HCzu25-LCzu18抗体(3μg/mL)显著增加Tau单体摄入(图33A)。同样地，与人类IgG1对照(3μg/mL)相比，7G6-HCzu25-LCzu18抗体(0.3和3μg/mL)也显著增加Tau原纤维摄入(图33B)。在两种情况下，FcR抑制剂处理在这种细胞测定法***中显著阻断7G6-HCzu25-LCzu18抗体诱导的Tau摄入的效果。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种特异性结合人类Tau的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含：
如SEQ ID NO：196中所阐述的重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，以及如SEQ ID NO：411中所阐述的轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)；
如SEQ ID NO：268中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：465中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
如SEQ ID NO：402中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：572中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中：
所述HCDR1包含SEQ ID NO：594，所述HCDR2包含SEQ ID NO：596，所述HCDR3包含SEQ IDNO：598，所述LCDR1包含SEQ ID NO：738，所述LCDR2包含SEQ ID NO：740，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：742，正如按照Kabat的方法所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：864，所述HCDR2包含SEQ ID NO：866，所述HCDR3包含SEQ IDNO：868，所述LCDR1包含SEQ ID NO：1008，所述LCDR2包含SEQ ID NO：1010，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：1012，正如由IMGT所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：642，所述HCDR2包含SEQ ID NO：644，所述HCDR3包含SEQ IDNO：646，所述LCDR1包含SEQ ID NO：774，所述LCDR2包含SEQ ID NO：776，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：778，正如按照Kabat的方法所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：912，所述HCDR2包含SEQ ID NO：914，所述HCDR3包含SEQ IDNO：916，所述LCDR1包含SEQ ID NO：1044，所述LCDR2包含SEQ ID NO：1046，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：1048，正如由IMGT所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：732，所述HCDR2包含SEQ ID NO：734，所述HCDR3包含SEQ IDNO：736，所述LCDR1包含SEQ ID NO：846，所述LCDR2包含SEQ ID NO：848，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：850，正如按照Kabat的方法所定义的；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO：1002，所述HCDR2包含SEQ ID NO：1004，所述HCDR3包含SEQID NO：1006，所述LCDR1包含SEQ ID NO：1116，所述LCDR2包含SEQ ID NO：1118，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：1120，正如由IMGT所定义的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第49位处的残基不是半胱氨酸。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第49位处的残基是丝氨酸。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基不是半胱氨酸。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基是丝氨酸。
7.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第34位处的残基是谷氨酸。
8.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基不是苯丙氨酸。
9.根据权利要求8所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基是酪氨酸。
10.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基不是精氨酸。
11.根据权利要求10所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基是亮氨酸。
12.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第94位处的残基不是赖氨酸。
13.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第71位处的残基不是精氨酸。
14.根据权利要求13所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法所述重链的第71位是缬氨酸。
15.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述抗体包含：
包含SEQ ID NO：268的重链可变结构域(HCVD)和包含SEQ ID NO：465的轻链可变结构域(LCVD)；或
包含SEQ ID NO：402的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD。
16.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体由具有ATCC保藏号PTA-124523的细胞系生产。
17.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体由具有ATCC保藏号PTA-124524的细胞系生产。
18.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是鼠类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
19.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1。
20.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体以通过表面等离子体共振所测量的低于约0.5nM的KD结合单体野生型人类2N4R Tau。
21.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在包含氨基酸序列HVPG(SEQ ID NO：1133)的表位处结合到人类Tau。
22.根据权利要求21所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双表位的，并在重复区2或重复区4内包含氨基酸序列HVPG(SEQ ID NO：1133)的表位处结合到人类Tau。
23.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合到人类Tau。
24.根据权利要求23所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双表位的，并在重复区2或重复区4内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合到人类Tau。
25.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，
其中所述抗体或抗原结合片段在重复区2内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合人类Tau的结合偏好性比在重复区3内包含氨基酸序列HKPGG(SEQ ID NO：182)的表位处的结合或在重复区1内包含氨基酸序列HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位处的结合高至少约10倍，或者
其中所述抗体或抗原结合片段在重复区4内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合人类Tau的结合偏好性比在重复区3内包含氨基酸序列HKPGG(SEQ ID NO：182)的表位处的结合或在重复区1内包含氨基酸序列HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位处的结合高至少约10倍，
正如通过肽结合测定法所确定的。
26.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不在重复区2内包含氨基酸序列HVSGG(SEQ ID NO：184)的表位处或重复区2内包含氨基酸序列HVLGG(SEQ ID NO：185)的表位处结合Tau。
27.一种标记的抗体或抗原结合片段，其包含根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段。
28.一种核酸分子，其编码根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
29.一种载体，其包含根据权利要求28所述的核酸分子。
30.一种细胞，其表达根据权利要求28所述的核酸分子。
31.一种生产抗Tau抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括将根据权利要求30所述的细胞在适合于生产所述抗体或抗原结合片段的条件下培养。
32.根据权利要求31所述的方法，其还包括回收所述抗体或抗原结合片段。
33.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段和可药用载体。
34.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其用作药物。
35.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其用于治疗Tau蛋白病。
36.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其用于制备治疗Tau蛋白病的药物。
37.根据权利要求35或36所述的供使用的抗体，其中所述Tau蛋白病是阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆或进行性核上性麻痹。
38.根据权利要求37所述的供使用的抗体，其中所述额颞叶痴呆是匹克氏病。
39.一种降低十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau水平的方法，所述方法包括向所述对象给药根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法在体外或体内进行。
41.一种抑制Tau聚集的方法，所述方法包括向所述对象给药根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法在体外或体内进行。
43.一种在对象中治疗Tau蛋白病的方法，所述方法包括在所述对象中有效治疗所述Tau蛋白病的条件下向所述对象给药根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述Tau蛋白病是阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆或进行性核上性麻痹。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述额颞叶痴呆是匹克氏病。

Claims (45)

1.一种特异性结合人类Tau的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含：
如SEQ ID NO：196中所阐述的重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，以及如SEQ ID NO：411中所阐述的轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)；
如SEQ ID NO：268中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：465中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
如SEQ ID NO：402中所阐述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：572中所阐述的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中：
所述HCDR1包含SEQ ID NO：594，所述HCDR2包含SEQ ID NO：596，所述HCDR3包含SEQ IDNO：598，所述LCDR1包含SEQ ID NO：738，所述LCDR2包含SEQ ID NO：740，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：742，正如按照Kabat的方法所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：864，所述HCDR2包含SEQ ID NO：866，所述HCDR3包含SEQ IDNO：868，所述LCDR1包含SEQ ID NO：1008，所述LCDR2包含SEQ ID NO：1010，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：1012，正如由IMGT所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：642，所述HCDR2包含SEQ ID NO：644，所述HCDR3包含SEQ IDNO：646，所述LCDR1包含SEQ ID NO：774，所述LCDR2包含SEQ ID NO：776，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：778，正如按照Kabat的方法所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：912，所述HCDR2包含SEQ ID NO：914，所述HCDR3包含SEQ IDNO：916，所述LCDR1包含SEQ ID NO：1044，所述LCDR2包含SEQ ID NO：1046，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：1048，正如由IMGT所定义的；
所述HCDR1包含SEQ ID NO：732，所述HCDR2包含SEQ ID NO：734，所述HCDR3包含SEQ IDNO：736，所述LCDR1包含SEQ ID NO：846，所述LCDR2包含SEQ ID NO：848，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：850，正如按照Kabat的方法所定义的；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO：1002，所述HCDR2包含SEQ ID NO：1004，所述HCDR3包含SEQID NO：1006，所述LCDR1包含SEQ ID NO：1116，所述LCDR2包含SEQ ID NO：1118，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：1120，正如由IMGT所定义的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第49位处的残基不是半胱氨酸。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第49位处的残基是丝氨酸。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基不是半胱氨酸。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第57位处的残基是丝氨酸。
7.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第34位处的残基是谷氨酸。
8.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基不是苯丙氨酸。
9.根据权利要求8所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第36位处的残基是酪氨酸。
10.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基不是精氨酸。
11.根据权利要求10所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述轻链的第46位处的残基是亮氨酸。
12.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第94位处的残基不是赖氨酸。
13.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法在所述重链的第71位处的残基不是精氨酸。
14.根据权利要求13所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中按照Kabat的方法所述重链的第71位是缬氨酸。
15.根据权利要求1或权利要求2所述的单克隆抗体或抗原结合片段，所述抗体包含：
包含SEQ ID NO：268的重链可变结构域(HCVD)和包含SEQ ID NO：465的轻链可变结构域(LCVD)；
包含SEQ ID NO：268的HCVD和包含SEQ ID NO：581的LCVD；
包含SEQ ID NO：384的HCVD和包含SEQ ID NO：545的LCVD；
包含SEQ ID NO：393的HCVD和包含SEQ ID NO：545的LCVD；
包含SEQ ID NO：402的HCVD和包含SEQ ID NO：545的LCVD；
包含SEQ ID NO：384的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD；
包含SEQ ID NO：393的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD；或
包含SEQ ID NO：402的HCVD和包含SEQ ID NO：572的LCVD。
16.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体由具有ATCC保藏号PTA-124523的细胞系生产。
17.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体由具有ATCC保藏号PTA-124524的细胞系生产。
18.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是鼠类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
19.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1。
20.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体以通过表面等离子体共振所测量的低于约0.5nM的KD结合单体野生型人类2N4R Tau。
21.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在包含氨基酸序列HVPG(SEQ ID NO：1133)的表位处结合到人类Tau。
22.根据权利要求21所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双表位的，并在重复区2或重复区4内包含氨基酸序列HVPG(SEQ ID NO：1133)的表位处结合到人类Tau。
23.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合到人类Tau。
24.根据权利要求23所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双表位的，并在重复区2或重复区4内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合到人类Tau。
25.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，
其中所述抗体或抗原结合片段在重复区2内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合人类Tau的结合偏好性比在重复区3内包含氨基酸序列HKPGG(SEQ ID NO：182)的表位处的结合或在重复区1内包含氨基酸序列HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位处的结合高至少约10倍，或者
其中所述抗体或抗原结合片段在重复区4内包含氨基酸序列HVPGG(SEQ ID NO：79)的表位处结合人类Tau的结合偏好性比在重复区3内包含氨基酸序列HKPGG(SEQ ID NO：182)的表位处的结合或在重复区1内包含氨基酸序列HQPGG(SEQ ID NO：183)的表位处的结合高至少约10倍，
正如通过肽结合测定法所确定的。
26.根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不在重复区2内包含氨基酸序列HVSGG(SEQ ID NO：184)的表位处或重复区2内包含氨基酸序列HVLGG(SEQ ID NO：185)的表位处结合Tau。
27.一种标记的抗体或抗原结合片段，其包含根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段。
28.一种核酸分子，其编码根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
29.一种载体，其包含根据权利要求28所述的核酸分子。
30.一种细胞，其表达根据权利要求28所述的核酸分子。
31.一种生产抗Tau抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括将根据权利要求30所述的细胞在适合于生产所述抗体或抗原结合片段的条件下培养。
32.根据权利要求31所述的方法，其还包括回收所述抗体或抗原结合片段。
33.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段和可药用载体。
34.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其用作药物。
35.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其用于治疗Tau蛋白病。
36.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其用于制备治疗Tau蛋白病的药物。
37.根据权利要求35或36所述的供使用的抗体，其中所述Tau蛋白病是阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆或进行性核上性麻痹。
38.根据权利要求37所述的供使用的抗体，其中所述额颞叶痴呆是匹克氏病。
39.一种降低十二烷基肌氨酸钠不溶性Tau水平的方法，所述方法包括向所述对象给药根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法在体外或体内进行。
41.一种抑制Tau聚集的方法，所述方法包括向所述对象给药根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法在体外或体内进行。
43.一种在对象中治疗Tau蛋白病的方法，所述方法包括在所述对象中有效治疗所述Tau蛋白病的条件下向所述对象给药根据权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合片段。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述Tau蛋白病是阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆或进行性核上性麻痹。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述额颞叶痴呆是匹克氏病。
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