CN111621504A

CN111621504A - 一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS及其应用

Info

Publication number: CN111621504A
Application number: CN202010614115.5A
Authority: CN
Inventors: 程春红; 蔡兆明; 李昌满; 叶春宏; 吴静; 罗圆
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111621504B

Abstract

本发明公开了一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS及其应用，所述BjuIBS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明发现BjuIBS蛋白及其编码基因过表达得到的转基因拟南芥植株，具有耐盐抗ABA性能，本发明为植物基因改造工程提供了一个高效的抗逆基因，为推进茎瘤芥功能基因组学的发展奠定了实验基础，也为在实际生产中培育耐逆稳产茎瘤芥新品种提供理论基础，对我国农业生产具有重要应用价值。

Description

一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别的涉及一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS及其应用。

背景技术

干旱、高盐等非生物逆境是影响植物生长和农作物产量的主要逆境因素，严重影响植物的生长发育，使作物减产，制约经济的可持续发展。所以人们长期以来一直在寻找有效措施来培育能够抵抗非生物胁迫和在各种逆境下生长的农作物。随着分子生物学的发展，利用基因工程改良农作物抗逆基因，培育具有抗逆能力的新品种成为一种可行性方案。

茎瘤芥(Brassicajuncea var. tumida Tsen et Lee)，又称青菜头，是十字花科芸薹属植物，为榨菜的主要原料，是我国重庆、四川、浙江等地区主要的经济作物之一。多年来，茎瘤芥的相关研究主要集中在遗传育种、良种繁育、栽培技术、品质安全等领域，近年才陆续有生物学方面研究的报道。前人研究表明，茎瘤芥对非生物胁迫具有较强的抗性，目前已经从茎瘤芥中获得多个逆境胁迫相关基因。如发明专利CN104328127A公开了茎瘤芥来源的抗逆基因BjEFh1及其植物表达载体及应用，该抗逆基因BjEFh1在提高植物耐逆境特性中的应用，尤其是提高植物在高盐条件的耐受力。发明专利CN103243108A公开了茎瘤芥来源的钙离子结合蛋白及其基因与应用，BjCBP1基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成BjCBP1蛋白，能提高植物耐逆境特性。但目前有效的具有抗逆功能的候选基因比较稀缺并且对于茎瘤芥抗逆基因的研究目前仍存在很大空白。因此在茎瘤芥中筛选具有优良抗逆功能的基因，不仅可以丰富茎瘤芥抗逆基因库，同时也可以为培育优质抗逆品种提供种质资源，具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS，为培育抗逆作物品种的遗传改造提供了一个新的候选基因。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或***得到的具有相同功能的核苷酸序列。

本发明还提供了上述茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或***得到的具有相同功能的氨基酸序列。

本发明还提供了一种含有所述茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS的植物表达载体。

本发明还提供了一种含有所述茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS的宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供了茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS在提高植物抗逆性方面的应用。进一步，所述抗逆性为对高盐或/和脱落酸环境的耐受性。

本发明的另一个目的在于提供一种增加植物抗逆性的方法，所述方法包括向植物细胞中导入所述植物表达载体或所述宿主细胞，使基因BjuIBS过表达。进一步，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。优选的，所述双子叶植物为拟南芥或茎瘤芥等。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明首次克隆了茎瘤芥BjuIBS基因全长序列，获得其编码的蛋白序列，采用生物领域前沿的生物工程技术将茎瘤芥中的抗逆基因BjuIBS以转基因的形式导入到其它植物中，使植物可在盐胁迫（NaCl）和脱落酸（ABA）的条件下仍然具有较高的耐受性。该研究为植物基因改造工程提供了一个高效的抗逆基因，为推进茎瘤芥功能基因组学的发展奠定了实验基础，也为在实际生产中培育耐逆稳产茎瘤芥新品种提供理论基础，对我国农业生产具有重要应用价值。

2、本发明通过实验证明BjuIBS过表达植株对盐和ABA处理表现出抗性，说明基因BjuIBS参与植物的非生物胁迫调控过程。这为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，采用本技术培育优质的抗逆作物品种可在非生物逆境胁迫条件下保持作物产量，具有很大的应用价值。

附图说明

图1为逆境环境下基因BjIBS的转录水平；A为脱落酸；B为氯化钠。

图2为基因BjIBS在不同组织部位的时空表达。

图3为基因BjIBS的亚细胞定位分析；从左到右依次为荧光下的烟草叶片；荧光和白光条件融合下的烟草叶片；白光下的烟草叶片。

图4为转基因拟南芥中BjIBS基因的定量表达分析图。

图5为转基因拟南芥对抗脱落酸特性的效果图；A为分别在MS培养基和含有0.5 μMABA的MS培养基上，拟南芥野生型Col-0和BjuIBS过表达株系在萌发阶段和转绿阶段的表型分析；B为分别在MS培养基和含有0.5 μM ABA的MS培养基上，拟南芥野生型Col-0和BjuIBS过表达株系在萌发阶段的萌发率分析；C为分别在MS培养基和含有0.5 μM ABA的MS培养基上，拟南芥野生型Col-0和BjuIBS过表达株系在转绿阶段的转绿率分析。

图6为转基因拟南芥对抗氯化钠特性的效果图；A为分别在MS培养基和含有200 mMNaCl的MS培养基上，拟南芥野生型Col-0和BjuIBS过表达株系在萌发阶段和转绿阶段的表型分析；B为分别在MS培养基和含有200 mM NaCl的MS培养基上，拟南芥野生型Col-0和BjuIBS过表达株系在萌发阶段的萌发率分析；C为分别在MS培养基和含有200 mM NaCl的MS培养基上，拟南芥野生型Col-0和BjuIBS过表达株系在转绿阶段的转绿率分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1

为了验证基因BjIBS参与茎瘤芥对逆境胁迫的响应，对萌发后7天的茎瘤芥幼苗分别施加200 mM NaCl和50 μM ABA 的胁迫处理，分别于处理后的0 h、3 h、6 h、12 h和24 h取样，通过荧光定量PCR检测基因BjIBS的转录水平，结果如图1所示。

结果表明，在50 μM ABA和200 mM NaCl 处理下，与0 h相比，随着诱导时间的延长基因BjIBS的转录水平也受到显著诱导，尤其在3 h时诱导表达水平达到最高值，说明基因BjIBS受NaCl和ABA的诱导表达，预示着该基因在茎瘤芥响应逆境胁迫过程中发挥重要功能。

实施例2

为了研究基因BjIBS在不同组织部位的时空表达模式，选取茎瘤芥的根、未膨大茎、膨大瘤茎、叶、花、花序和种荚进行RNA提取，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，检测基因BjIBS的组织表达模式。结果如图2所示。

结果显示BjIBS在茎瘤芥各个组织中均有表达，其中在根中表达量最高，在未膨大茎、叶和种荚中表达也相对较高，在膨大瘤茎中表达量最低。由于根生长发育的可塑性，其在植物响应非生物逆境胁迫过程中具有重要功能，而BjIBS在根部的高表达表明该基因对根的发育或生理功能具有十分重要的作用，也预示着BjIBS在植物响应逆境胁迫过程中发挥功能。

实施例3 GFP融合表达载体构建及亚细胞定位分析

（1）构建pTF101-BjIBS-GFP表达载体

根据pTF101-GFP载体序列和BjIBS基因全长序列（SEQ ID NO .1），设计正向引物（BjIBS-F1）和反向引物（BjIBS-R1）。以茎瘤芥全基因组为模板，进行BjIBS基因片段的PCR扩增。

所述引物序列如下：

BjIBS-F1: 5'-CCCGGGATGAATAATCTGCCAGAGGACTG-3'

BjIBS-R1: 5'-GGATCCTTAGGGCAGTACTGGCCTAATCTC-3'

注：加粗序列为酶切位点。

PCR反应体系：高保真扩增酶KOD FX (KFX-101, TOYOBO) 0.5μL，2xPCR Bufferfor KOD FX (Mg²⁺Plus) 25μL，正向引物(10μM) 1μL，反向引物(10μM) 1μL，模板(茎瘤芥基因组DNA) 2μL，dNTP (2.5mM) 4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，1.5min，30个循环；72℃, 10min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，按照胶回收试剂盒（9672，Takara）步骤回收纯化，即获得目的基因片段。

用SmaI和BamHI双酶切处理pTF101-GFP表达载体。酶切体系为：pTF101-GFPvector 5μL；SmaI 0.5μL；BamHI 0.5μL；Buffer 10xK 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pTF101-GFP载体片段。

利用T4 DNA Ligase（FL101，Trans）构建pTF101-BjIBS-GFP表达载体。

连接反应体系为：

Purifed PCR fragment (回收的BjIBS目的片段) 50ng；Linearized vector(pTF101-GFP载体) 100ng；5x T4 DNA Ligase Buffer 2μL；T4 DNA Ligase 0.5μL；无菌ddH2O补足至10μL。25℃反应30min。按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有壮观霉素抗性（75 mg/L）的筛选培养板上，通过阳性克隆测序，获得正确的含BjIBS基因片段的重组表达载体pTF101-BjIBS-GFP。重组表达载体中报告基因GFP与目的基因BjIBS的5’端融合后，位于组成型启动子P35S下游，形成融合表达；BjIBS的3’端组装有NOS终止子，可以有效终止融合基因的转录。报告基因GFP经过蓝光激发，无需辅助因子和底物就能发出绿色荧光，作为报告基因可以检测目的基因表达情况。

（2）BjIBS的亚细胞定位分析

通过常规冻融法将构建的重组表达载体pTF101-BjIBS-GFP转入农杆菌菌株GV3101中，通过PCR筛选阳性克隆。以含有pTF101-GFP质粒的农杆菌菌株为阳性对照，按照霍琳等（农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化, 分子植物育种, 2016 , 14(1):80-85）方法制备农杆菌注射缓冲液。选择光照培养箱中正常生长具有8-10片叶子完全展开的烟草进行注射，用去除针头的注射器将注射缓冲液缓慢推入叶片背面。然后，把转化后的植株重新放回培养箱中，培养36h-48h后进行观察。

用剪刀小心剪下转化后的烟草叶片放在载玻片上，加1滴蒸馏水，制成装片；然后放在荧光显微镜上，在激发光波长488-507nm的蓝光下，进行荧光观察。结果如图3所示，结果表明，在植物细胞的细胞质和细胞核内均能清晰的检测到BjIBS-GFP融合蛋白，说明BjIBS在植物的细胞质和细胞核内发挥生物学功能。

实施例3 BjIBS过表达拟南芥的遗传转化

拟南芥的遗传转化

拟南芥的遗传转化采用浸花法（Zhang X., et al., Nat Protoc. 2006, 1:641-646）。将携带pTF101-BjIBS-GFP载体的农杆菌导入哥伦比亚Col型拟南芥。用除草剂（Basta）筛选具抗性的拟南芥再生幼苗，通过常规PCR方法扩增BjIBS目标基因。

PCR扩增引物为：

BjIBS-F: 5'-ATGAATAATCTGCCAGAGGACTG-3'

BjIBS-R: 5'-TTAGGGCAGTACTGGCCTAATCTC-3'

PCR检测结果显示，在野生型植株（WT）中检测不到BjIBS基因的存在，只有在转基因株系 (7-8，8-1，12-22以及13-11)中扩增出明显的条带，表明上述4个阳性株系中，重组表达框已导入拟南芥基因组。

进一步，采用Trizol试剂（Invitrogen™），按说明书步骤提取野生型和转基因阳性拟南芥叶片总RNA，利用DNase I（Invitrogen™）去除残余DNA，采用cDNA反转录试剂（6210A，Takara）并按照说明书步骤合成第一链cDNA。以拟南芥Actin基因（AT3G53750）为内参，通过半定量RT-PCR方法分析转基因阳性株系与野生型中BjIBS基因的表达水平。

检测Actin基因引物为：

Actin-qF: 5'- GTCTGGATTGGAGGATCCAT -3'

Actin-qR:5'- CCGGTGAACAATCGACGGGC -3'

检测BjIBS基因引物为：

BjIBS-qF：5'-CTTCTTCTCCCTCGTCCATAAC-3'

BjIBS-qR：5'-CTAGCAGCCATCATGTAGCA-3'

相对表达水平采用2^−ΔΔCt方法（Livak KJ, Schmittgen TD, 2001. Analysis ofrelative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods 25, 402–408）分析计算。结果如图4所示，与野生型植株（WT）相比，在4个代表转基因株系(7-8，8-1，12-22以及13-11)中目的基因BjIBS均显著上调表达，而在野生型植株（WT）中检测不到BjIBS的表达，表明BjIBS已经导入拟南芥基因组并成功转录表达。

实施例4 转基因拟南芥的表型观察与分析

分别对野生型拟南芥植株和转基因拟南芥植株(7-8，8-1，12-22以及13-11)在含有ABA和NaCl的MS固体培养基上的表型进行分析，结果如图5和图6所示。

从图中可以看出，在没有ABA和NaCl处理下，BjIBS过表达转基因植株的种子萌发和子叶转绿基本正常，和野生型没有显著差异。与之形成显著差异的是，在0.5 μM ABA和200 mM NaCl处理的条件下，无论在萌发还是转绿期，BjIBS过表达转基因植株7-8，8-1，12- 22以及13-11表现出对ABA和NaCl更高的耐受性。结果说明，拟南芥中异源过表达BjIBS后调控植物对于逆境胁迫的响应。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 771

<212> DNA

<213> 茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）

<400> 1

atgaataatc tgccagagga ctgcatcgct aagatccttt ccttgacttc gcctcgagac 60

gtttgccgat catcggctgt ctccaggtgc ttcagatccg ccgcagactc cgaccatgtc 120

tggaaccact tcttaccttc cgagttcccc gaggacttta gggcacctga gggtcttccc 180

accaagaaac acctcttctt ctccctcgtc cataaccctc tccttctcca cggctcccaa 240

ctgagctttt cgctggagag aagtactggt aacaagtgct acatgatggc tgctagggcc 300

ttgaatatta cttggggaca tgatcaaaga tactggcagt ggatctctct tcctgatgcc 360

aggttcaaag aagtggctgc gcttaaaatg gtatggtggc ttgacatcac tggaaaaatc 420

aacatatccc ttctctctga caacaccctc tacgccgctt accttgtctt taggtggaac 480

cttgatccct acggttttcg ccagcccgta gaggcatccc ttgttttggc tggcaccgag 540

catgatgatg tccagccttc catggtcagt ctcatgcaga atccggggag cgaacaaggt 600

cagcgcgctg agctgagaag cgacgactgg tacgaggtgc agttgggaca cttcttcaaa 660

aggagaggag atatgggtga aatagagatg agcctcaagg agacaaagag gccttttgag 720

aagaaaggtc ttatcgtcca tggaattgag attaggccag tactgcccta a 771

<210> 2

<211> 256

<212> PRT

<213> 茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）

<400> 2

MNNLPEDCIA KILSLTSPRD VCRSSAVSRC FRSAADSDHV WNHFLPSEFP EDFRAPEGLP 60

TKKHLFFSLV HNPLLLHGSQ LSFSLERSTG NKCYMMAARA LNITWGHDQR YWQWISLPDA 120

RFKEVAALKM VWWLDITGKI NISLLSDNTL YAAYLVFRWN LDPYGFRQPV EASLVLAGTE 180

HDDVQPSMVS LMQNPGSEQG QRAELRSDDW YEVQLGHFFK RRGDMGEIEM SLKETKRPFE 240

KKGLIVHGIE IRPVLP 256

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccgggatga ataatctgcc agaggactg 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggatccttag ggcagtactg gcctaatctc 30

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaataatc tgccagagga ctg 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttagggcagt actggcctaa tctc 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtctggattg gaggatccat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccggtgaaca atcgacgggc 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cttcttctcc ctcgtccata ac 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctagcagcca tcatgtagca 20

Claims

1. 一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或***得到的具有相同功能的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示或具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或***得到的具有相同功能的氨基酸序列。

3.一种含有如权利要求1所述茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS的植物表达载体。

4.一种含有权利要求1所述茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS的宿主细胞。

5.如权利要求1所述茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS在提高植物抗逆性方面的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述抗逆性为对高盐或/和脱落酸环境的耐受性。

7.一种增加植物抗逆性的方法，其特征在于，所述方法包括向植物细胞中导入权利要求3所述植物表达载体或权利要求4所述宿主细胞，使基因BjuIBS过表达。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述双子叶植物为拟南芥或茎瘤芥。