CN111615404A

CN111615404A - 用于分子的跨膜递送的化合物和方法

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Publication number: CN111615404A
Application number: CN201880087266.0A
Authority: CN
Inventors: 伊兰·齐夫; 哈吉特·格林贝格; 约瑟夫·杜布罗夫斯基
Original assignee: Aposense Ltd
Current assignee: Aposense Ltd
Priority date: 2018-01-01
Filing date: 2018-12-31
Publication date: 2020-09-01
Also published as: CA3087294A1; US20210052736A1; JP2021509406A; EP3735276A1; WO2019130319A1; JP2024026212A; EP3735276A4; AU2018394426A1; IL275773A

Abstract

本发明提供用于跨越生物膜递送药物的新颖的递送***。本发明尤其提供包含所述递送***的新颖的化学缀合物，用于合成所述化合物的方法，以及用于利用所述递送***的方法，以用于在体外、离体和体内将遗传药物递送到组织和细胞中来用于医治各种医学病症。

Description

用于分子的跨膜递送的化合物和方法

技术领域

本发明涉及意欲用于体外和体内生物学目的的用于将分子和大分子跨越生物膜递送到细胞中的化合物和包含递送***、货物化合物和大分子的缀合物以及方法。

背景技术

“寡核苷酸药物”(OD)为包含核苷或核苷酸的序列的大分子药物。OD可有望为许多医学病症带来革命性的医学医治。如本领域已知的，OD为单链或双链的、天然或修饰的RNA或DNA分子或其组合。OD的实例尤其为siRNA(小干扰RNA)，其为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的底物；作为Dicer核酸内切酶底物的siRNA序列(dsiRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)药物，或被设计成用作反义寡核苷酸(ASO)的DNA序列；所有这些都在靶标基因表达的下调中有活性。

由于OD的大而重的带电结构，因此对于能够将OD跨越疏水性磷脂膜递送到细胞中的递送***存在未满足的需求。为了在临床环境中利用OD的目的，OD连接到递送***的缀合物的几个特征可为有利的，如在存在或不存在血浆蛋白的情况下的活性，或者包含对氧化还原敏感的可裂解基团，所述可裂解基团在细胞外区室稳定但是在细胞质中占优势的还原条件下经历有效裂解，从而使得货物药物(如OD)能够对细胞质靶标(如Dicer或RISC)发挥其活性。

发明内容

本发明基于新颖的分子递送***(MDS)，其为具有如式(II)中所阐述的结构的化学部分，并且其在与货物药物如大分子OD缀合从而产生根据式(I)的缀合物时需要将OD跨越磷脂膜递送到细胞中，在所述细胞中发挥其相应的生物活性，例如基因沉默。本发明基于由发明人发现和开发的新颖的化合物，其使得能够克服大的和高电荷大分子药物跨越亲油性细胞膜的巨大递送屏障。本发明提供MDS、包含其的缀合物，用于合成MDS和其缀合物的方法，以及用于利用MDS的方法，以尤其用于在体外、离体和体内将遗传药物递送到组织和细胞中，用于医治各种医学病症。

在本发明的一个实施例中，提供具有如式(I)中所阐述的结构的缀合物：

包括由如式(I)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物，其中：

D为待跨越生物膜递送的选自由以下组成的组的药物(即，货物药物)：小分子药物、肽、蛋白质和OD(即，天然或修饰的单链或双链的DNA或RNA、siRNA、dsiRNA或ASO)；

y、z和w各自为独立地选自由以下组成的组的整数：0、1、2、3或4，其中如果y、z或w中的任一个为0，那么这意味着相应的一个或多个E部分不存在；y、z或w中的至少一个不同于0；

E、E'或E”可相同或不同，各自独立地具有如通式(II)中所阐述的结构：

包括由如式(II)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物，其中：

M₁、M₂、M₃、M₄各自分别选自由以下组成的组：N'、N”、不存在、醚、酰胺、酯、硫醚和硫酯；其中N'和N”各自独立地选自由以下组成的组：-N(CH₃)-、-NH-和-N(X)-；其中X为胺的保护基团；M₁、M₂、M₃、M₄可相同或不同；N'、N”可相同或不同。

L为选自由以下组成的组的连接基：不存在、C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆亚烷基或杂亚烷基；任选地被一个或多个氟原子或一个或多个羟基取代的C₅或C₆芳基或杂芳基；以及其组合；

G₁、G₂、G₃、G₄各自独立地代表氢原子或甲基；G基团可相同或不同；G₁、G₂、G₃或G₄基团中的至少两个为氢原子；

a、b、c、d、e为各自独立地选自由以下组成的组的整数：0、1、2、3、4、5或6，其中0＝不存在；a、b、c、d、e可相同或不同；

g代表选自以下的整数：0、1、2、3、4或5；

W选自由以下组成的组：不存在、羟基、二羟基、酰胺、天然或修饰的核苷的残基、如式(II¹)、(II²)和(II³)中所阐述的结构中的任一个，以及其组合：

其中J选自由以下组成的组：不存在、-CH₂-、仲胺或叔胺和氧；

E、E'或E”可连接到由以下组成的组的任何部分：D；如本文所定义的保护基团(例如，醇的保护基团)；选自由以下组成的组的R或R'基团：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；和固体支撑物。在本发明的上下文中，E、E'或E”部分可经由一个或多个点连接到一个D部分；并且W可同时连接到D和R或R'两者。

在本发明的实施例中的一个中，g为0、1或2的整数。

在一个实施例中，c和d各自独立地代表1、2或3的整数；c和d可相同或不同。

在本发明的一个实施例中，G₁、G₂、G₃、G₄全部为氢原子。

在一个实施例中，L为二氟苄胺。

在另一个实施例中，X为胺的保护基团，TEOC[氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯]或Fmoc。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(V)中所阐述的结构：

包括由如式(V)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'和N”各自独立地具有与式(II)中定义的相同的含义。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VII)中所阐述的结构：

包括由如式(VII)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'和N”各自独立地具有与式(II)中定义的相同的含义。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VIII)中所阐述的结构：

包括由如式(VIII)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与式(II)中相同的含义。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VIII-H)中所阐述的结构：

包括由如式(VIII-H)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在相关的实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VIII-M)中所阐述的结构：

包括由如式(VIII-M)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VIII-F)中所阐述的结构：

包括由如式(VIII-F)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中X为胺的保护基团。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIV)中所阐述的结构：

包括由如式(XIV)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中p和q各自独立地为0、1、2、3、4、5或6的整数；N'具有与式(II)中相同的含义。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIV-H)中所阐述的结构：

包括由如式(XIV-H)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIV-M)中所阐述的结构：

包括由如式(XIV-M)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIV-F)中所阐述的结构：

包括由如式(XIV-F)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物，其中X为胺的保护基团。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中L部分为二氟苄胺；并且因此，E、E'或E”各自具有如式(XV)中所阐述的结构：

包括由如式(XV)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与式(II)中相同的含义。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XV-H)中所阐述的结构：

包括由如式(XV-H)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XV-M)中所阐述的结构：

包括由如式(XV-M)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XV-F)中所阐述的结构：

包括由如式(XV-F)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中X为胺的保护基团。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中L部分为四氟苄胺；并且因此E、E'或E”各自具有如式(XVI)中所阐述的结构：

包括由如式(XVI)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与式(II)中相同的意义。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XVI-H)中所阐述的结构：

包括由如式(XVI-H)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XVI-M)中所阐述的结构：

包括由如式(XVI-M)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XVI-F)中所阐述的结构：

包括由如式(XVI-F)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中X为胺的保护基团。

本发明还提供前体分子，其为具有如式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个中所阐述的结构的连接到醇的保护基团和/或胺的保护基团的本发明的任何一个或多个E、E'或E”部分，其中所述保护基团意欲在分子的化学处理期间，例如在与寡核苷酸链缀合期间被除去。

本发明的一些实施例涉及用于在体外或体内将药物跨越生物膜递送到细胞中的方法。所述方法包含使细胞与如本文所述的缀合物接触。

本发明的另一个实施例涉及用于医治有需要的患者的医学病症的方法；方法包含向患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的缀合物，所述缀合物包括对于医治所述患者的疾病有用的药物D，以及药学上可接受的盐或载体。

还描述以非限制性方式说明本发明的实例，以便展示本发明的实施例可如何在实践中进行。实例描述本发明的多种化合物和缀合物。所有描述的缀合物都根据式(Cn-1)或(Cn-2)，其各自包含具有根据通式(II)的结构的E、E'或E”部分。实例提供多种E、E'或E”部分，它们表示如式(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中所阐述的结构。与对照化合物相比，所有这些缀合物在基因沉默中均表现出生物学性能，其可与上述化合物具有结构相似性，但是它们并不完全符合根据式(II)的结构基序，并且分别不示出期望的生物活性。因此，由根据式(I)和(II)的本发明的缀合物展示的性能曲线表示通用并且独特的结构框架，这使得其相关化合物能够用于将大分子OD跨越磷脂膜递送到细胞中，从而在体外和体内表现出有用的生物活性。

另外，实例描述用于化学合成本发明的E部分、其前体以及将其组装成有用的缀合物的方法。

附图说明

图1A和1B举例说明根据式(III)的本发明的E部分与寡核苷酸链的连接模式，以及E部分的相应的氧化还原介导的裂解。图1A示出RNA链，其中根据式(III)的E部分连接在内部位置处；图1B举例说明在还原条件下，如在细胞质内占优势的那些条件下，根据式(III)的此E部分的二硫化物基团的氧化还原介导的裂解，从而释放RNA药物。

图2A、2B、2C、2D和2E举例说明本发明的缀合物的作用机制(MOA)，其中缀合物根据式[Cn-2-(III)]。RNA双链体为25/27个核苷酸长的Dicer底物，具有连接在每条链的5'-末端处的磷酸酯基团，并且其中位于内部的E部分的W基团根据式(II¹)，其中J为-CH₂-；图2A展示完整的缀合物；图2B展示在细胞质中占优势的还原条件下，E、E'和E”部分的裂解和除去，为每个E、E'或E”部分留下短的残余残端；图2C展示RNA双链体与Dicer核酸内切酶的相互作用，这导致双链断裂，留下21/21RNA双链体，并且除去E”部分的残端，留下连接在过客链的5'-末端和内部位置处的E和E'的两个剩余残端；图2D展示通过解旋酶(即能够分离RNA链的细胞质酶)除去有义(过客)链，同时除去连接到过客链的E和E'部分的剩余残端。因此，释放完整的反义链，以进入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，以便诱导期望的基因沉默[图2E]。

图3A和3B描述本发明式[Cn-1-(IX)](即具有各自根据式(IX)的E和E'部分)的缀合物在鼠模型中在体内静脉内施用时使ApoC3基因的表达沉默时的性能；(图3A).肝脏中的基因沉默；(图3B).肾脏中的基因沉默。实验组为：(i).媒剂：用于注射的含5％的葡萄糖的水；(ii).用于ApoC3的“裸”dsiRNA(在不附接分子纳米马达部分的情况下)；(iii).[Cn-1-(IX)]-Kras dsiRNA缀合物(非相关RNA序列，缀合到Apo-Si分子纳米马达递送***)；(iv).靶标[Cn-1-(IX)]-ApoC3 dsiRNA缀合物。

图4A和4B[Cn-2-(VIII)]，即具有各自根据式(VIII)的E、E'和E”部分在体外使EGFP基因的表达沉默时：(图4A)：培养的Hela细胞；(图4B)：培养的3T3细胞。呈现的为在0-300nM的浓度范围的剂量-响应曲线。

图5描述本发明的两种缀合物：缀合物[Cn-1-(VIII-M)]和缀合物[Cn-2-(VIII-M)]在体外使3T3细胞中的EGFP基因的表达沉默时的生物学性能。观察到明显的剂量/响应，具有高度显著的对数衰减，对两种细胞系用R²≈0.97曲线拟合。对于具有2个E部分的缀合物[Cn-1-(VIII-M)](虚线)，IC₅₀发现为2.2nM，而对于具有3个E部分的缀合物[Cn-2-(VIII-M)](实线)，IC₅₀发现为0.8nM。

具体实施方式

本发明涉及缀合物以及其前体，所述缀合物以及其前体包含连接到新颖的分子递送***(MDS)的大分子药物如OD，所述分子递送***可将货物药物跨越磷脂生物膜递送到细胞中，以发挥生物活性，如使靶标基因的表达沉默。此递送***使得能够跨膜递送大分子药物，如遗传药物，例如siRNA或dsiRNA、反义寡核苷酸(ASO)或治疗性蛋白质。本发明基于由发明人发现和开发的新颖的化合物，其通过将跨越磷脂膜的有效跨膜递送与随后货物OD的基于稳健的还原的释放到细胞质中相组合，在基因沉默中表现出有利的性能，以发挥其生物效应。

y、z和w各自为独立地选自以下的整数：0、1、2、3或4，其中如果y、z或w中的任一个为0，那么这意味着相应的一个或多个E部分不存在；y、z或w中的至少一个不同于0；

g代表选自以下的整数：0、1、2、3、4或5；

W选自由以下组成的组：不存在、羟基、二羟基、酰胺、天然或修饰的核苷的残基，以及如式(II¹)、(II²)和(II³)中所阐述的结构中的任一个，以及其组合：

在本发明的实施例中的一个中，g为0、1或2的整数。

在一个实施例中，L为二氟苄胺。

在另一个实施例中，X为TEOC[氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯]或Fmoc。

因此，在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(III)中所阐述的结构：

包括由如式(III)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与式(II)中定义的相同的含义。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(IV)中所阐述的结构：

包括由如式(IV)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(V)中所阐述的结构：

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VI)中所阐述的结构：

包括由如式(VI)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'和N”各自独立地具有与式(II)中定义的相同的含义。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(IX)中所阐述的结构：

包括由如式(IX)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与式(II)中相同的含义。

在又另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(X)中所阐述的结构：

包括由如式(X)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与式(II)中相同的含义。

在又另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XI)中所阐述的结构：

包括由如式(XI)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与式(II)中相同的含义。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XII)中所阐述的结构：

包括由如式(XII)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中p和q各自独立地代表0、1、2、3、4、5或6的整数，其中0意指不存在；p和q可相同或不同；k和g各自独立地代表0、1、2、3、4、5、6的整数，其中0意指不存在；k和g可相同或不同；Z选自由以下组成的组：不存在、-O-和N”；

其中N'和N”具有与式(II)中相同的含义；

在一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(XII)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIIa)中所阐述的结构：

包括由如式(XIIa)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中q为0或1的整数；并且N'具有与式(II)中相同的含义。

本发明还提供根据式(I)和式(II)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIII)中所阐述的结构：

包括由如式(XIII)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中a、b、c、d、e各自独立地代表0、1、2或3的整数，其中0意指不存在；a、b、c、d和e可相同或不同；Q选自由以下组成的组：不存在和-O-；N'具有与式(II)中相同的含义。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(I)和式(XIII)的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIIIa)中所阐述的结构：

包括由如式(XIIIa)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中a为1或2的整数；N'具有与式(II)中相同的含义。

包括由如式(XV)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物；其中p和q各自独立地为0、1、2、3、4、5或6的整数；N'具有与式(II)中相同的含义。

在E、E'或E”具有如式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个中所阐述的结构的情况下，它可连接到醇或胺的保护基团，其中醇的保护基团通常为但不限于二甲氧基三苯甲基[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMT)和亚磷酰胺。在寡核苷酸药物(OD)的构建过程期间，这些部分尤其可用于本发明的E、E'或E”部分与寡核苷酸链的缀合过程。

另外，胺的常用保护基团为Fmoc和TEOC[氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯]，其可用于在OD合成期间保护附接到E、E'或E”的各种官能团。在碱性条件下被除去，这类保护基团因此可在OD合成结束时在除去保护基团的步骤期间被有效地除去，从而在最终的OD缀合物上暴露期望的官能团，所述官能团先前已经被一个或多个保护部分掩蔽。

在本发明的上下文中，前体分子为具有如式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个中所阐述的结构的连接到醇和/或胺的保护基团的任何一个或多个E、E'或E”部分，其中所述保护基团意欲要在分子的化学加工期间，例如在缀合到寡核苷酸链期间除去；包括相应的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物、盐的溶剂化物和水合物。

以非限制性方式提供的本发明的前体分子的实例基于式(VIII)的结构，并且具有如下式(VIII-F)-前体中所阐述的结构：

包括由如式(VIII-F)-前体中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

仍然基于式(VIII)的结构的本发明的前体分子的另一个实例为下式(VIII-M)-前体：

包括由结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

本发明的前体分子的另一个实例基于式(XIV)的结构，并且为下式(XIV-F)-前体：

包括由如式(XIV-F)-前体中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

本发明的前体分子的另一个实例仍然基于具有下式(XIV-M)-前体的式(XIV)的结构：

本发明的前体分子的又另一个实例基于具有下式(XV-F)-前体的式(XV)的结构：

包括由如式(XV-F)-前体中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

本发明的前体分子的另一个实例仍然基于具有下式(XV-M)-前体的式(XV)的结构：

本发明的前体分子的另一个实例基于具有下式(XVI-F)-前体的式(XVI)的结构：

包括由如式(XVI-F)-前体中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

本发明的前体分子的另一个实例仍然基于具有下式(XVI-M)-前体的式(XVI)的结构：

根据式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个的一种或多种化合物可用作E、E'或E”部分，用于连接到药物D，从而形成本发明的期望的缀合物，其旨在将D跨膜递送到细胞中的生物学性能。

在本发明的一个实施例中，本发明提供缀合物，其中D为连接到E、E'或E”部分的OD，如siRNA或Dicer底物，所述E、E'或E”部分各自根据式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个，包括相应缀合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。

在D为寡核苷酸药物(OD)的情况下，缀合物尤其可根据以下选项中的任一个：

(i).OD连接到单个E、E'或E”部分。

(ii).OD连接到两个相同或不同的E部分；每个E部分任选地连接在每个寡核苷酸链的一个末端(例如5'-末端)处。

(iii).OD连接到三个相同或不同的E部分；E和E'部分连接在每个寡核苷酸链的末端处(例如，在5'-末端处)，而E”连接在寡核苷酸链内的内部位置处。

(iv).OD连接到几个(n>3)相同或不同的E部分；E部分连接在每个寡核苷酸链的末端处(例如，在5'-末端处)，而其它几个E部分连接在沿寡核苷酸链的几个内部位置处。

在E部分***沿寡核苷酸链的内部位置处的情况下，可根据需要将其定位在任何位置处。在D为OD，为siRNA RNA双链体的情况下，优选在过客链上***内部E部分。在基因沉默中将不干扰构建体活性的沿过客链的潜在有益位置可为位置#12或#14。E部分可替代沿链的核苷酸，或者可为序列的附加物，从而在生成siRNA双链体的退火过程后，在RNA双链体的结构中产生“凸起”。

对于每个缀合物，E、E'或E”也可连接到各自如式(II)中定义的R或R'部分(磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团)。E、E'、E”部分可相同或不同，并且R和R'部分也可相同或不同。

举例来说，本发明的缀合物可具有如下式(Cn-1)、(Cn-2)、(Cn-3)中所阐述的结构，其包含各自具有根据式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个的结构的E、E'或E”部分，而R和R'各自如式(II)中定义：

包括相应缀合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。

在本发明的一个实施例中，本发明提供包含D的缀合物，所述D为如上文所定义的反义寡核苷酸(ASO)，其包含15-25个核苷酸长的单链寡核苷酸。此ASO选自由以下组成的组：天然或修饰的DNA、RNA、锁核酸核苷酸(LNA)，其中核苷酸经由磷酸三酯基团、硫代磷酸酯基团、如本领域已知的其它核酸连接策略或其组合来连接。此缀合物包含与E、E'部分的连接，如式(Cn-3)中所阐述：

其中T和T'各自独立地选自不存在和由以下组成的组：1',2'-二脱氧核糖、核苷酸或其组合；T和T'可相同或不同；并且R和R'部分如式(II)中定义；包括由如式(Cn-3)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在其实施例中的一个中，本发明提供根据式(Cn-1)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(VIII-H)；因此所述缀合物具有如下式[Cn-1-(VIII-H)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-1-(VIII-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-1)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(VIII-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(VIII-M)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-1-(VIII-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-2)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(VIII-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(VIII-H)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-2-(VIII-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在又另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-2)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(VIII-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(VIII-M)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-2-(VIII-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-1)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XV-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(XV-H)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-1-(XV-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-1)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XV-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(XV-M)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-1-(XV-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-2)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XV-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(XV-H)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-2-(XV-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-2)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XV-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(XV-M)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-2-(XIV-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-1)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XVI-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(XVI-H)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-1-(XVI-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-1)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XVI-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(XVI-M)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-1-(XVI-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-2)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XVI-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(XVI-H)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-2-(XVI-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在另一个实施例中，本发明提供根据式(Cn-2)的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XVI-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(XVI-M)]中所阐述的结构：

包括由如式[Cn-2-(XVI-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及盐的溶剂化物和水合物。

在本发明的上下文中，“药物”或“货物药物”(即，部分D)是指旨在由本发明的缀合物跨越磷脂膜递送到细胞中的分子，其中D为小分子药物或大分子，如肽、蛋白质或寡核苷酸药物(OD)。

在本发明的上下文中，术语“药物”或“药剂”涉及化学物质，所述化学物质当施用于患有疾病的患者时能够对患者发挥有益效果。有益效果的范围可从症状的改善到抵消在疾病过程中起作用的试剂或物质(例如，蛋白质)的效果。药物可包含被施用以抑制基因表达的小分子，或者可为大分子，如蛋白质或单链或双链的RNA或DNA。尤其是，药物可包含siRNA、dsiRNA或ASO。在一些实施例中，药物旨在医治退行性病症、癌症、缺血性、传染性、毒性或外伤性损伤、遗传性或获得性代谢疾病或免疫介导的病症。

在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸药物”(在下文中也被指定为“OD”)是指包含核苷或核苷酸的药物。寡核苷酸药物(OD)的实例为单链或双链的、天然或修饰的RNA或DNA。OD可为siRNA(小干扰RNA)、Dicer酶的底物(dsiRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)或被设计成用作反义寡核苷酸(ASO)的DNA序列。OD的核苷酸建构嵌段之间的连接尤其可经由磷酸三酯桥、经由硫代磷酸酯键或经由本领域已知的任何其它方法进行。用作OD的建构嵌段的核苷酸可为天然或修饰的核苷酸，如锁核酸(LNA)。

作为本发明的实施例的更具体的OD为：“siRNA”，其为RNA双链体，其中每条RNA链为19-21个核苷酸长，旨在经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)细胞质蛋白复合物使基因表达沉默；

Dicer的siRNA底物(“dsiRNA”)为RNA双链体，其中每条RNA链为24-30个核苷酸长。在一个实施例中，dsiRNA双链体由组成：一条25个核苷酸的链，同时第二条链由27个核苷酸组成。在另一个实施例中，dsiRNA双链体由组成：一条24个核苷酸的链，同时第二条链由27个核苷酸组成。在又另一个实施例中，dsiRNA双链体包含相等长度的RNA链，每条链由27个核苷酸组成。

“反义寡核苷酸”(ASO)为合成的、单链的、天然或修饰的DNA或RNA寡核苷酸，通常为15至20个核苷酸长。ASO的序列为反义的，即，它与编码寻求抑制其合成的蛋白质的特定mRNA的有义序列互补。ASO与所述互补序列的结合阻断核糖体沿mRNA移动的能力，从而阻止蛋白质的合成，或替代地，加快mRNA的降解速率。

在本发明的上下文中，“核苷”被定义为化学部分，其包含含氮碱基(核碱基)和http://en.wikipedia.org/wiki/Pentose具有五个或六个碳原子的糖(例如，核糖或脱氧核糖)。核碱基选自天然或修饰的嘌呤(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤)和天然或修饰的嘧啶(例如，胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶)。核碱基可通过如本领域已知的各种修饰(例如，甲基化、乙酰化)来修饰。另外，核苷的糖部分也可如本领域已知的被修饰[例如2'-脱氧衍生物、核糖的2'位置处的甲基化、2'-氟原子的配置或2'-O-甲氧基乙基、或具有连接2'氧和4'碳原子的桥，从而生成锁核酸(LNA)]。因此，缀合到本发明的E部分的这类修饰的核苷的用途也在本发明的范围内。在一个实施例中，核苷包含选自天然或修饰的胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的嘧啶衍生物，并且糖部分为核糖或脱氧核糖。

在本发明的上下文中，“核苷酸”为连接到磷酸酯基团的如上文所定义的核苷。核苷酸为寡核苷酸的建构嵌段。

在本发明的上下文中，“前体分子”被定义为具有如式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个中所阐述的结构的附接到如下文定义的醇或胺的保护基团E、E'或E”部分。

在本发明的上下文中，“保护基团”被定义为在合成本发明的缀合物期间意欲被除去或修饰的化学基团。这类除去或修饰可发生在合成的各个阶段；例如但不限于，在E、E'或E”部分附接到D期间，在D为大分子药物如寡核苷酸药物(OD)的情况下。在本发明的优选实施例中，保护基团为如下文定义的醇的保护基团。

在本发明的上下文中，“醇的保护基团”是指附接到羟基以便在某些化学反应期间“掩蔽”羟基并且此后潜在地被除去的如本领域已知的化学基团。这类保护基团的实例为乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基](MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基(三苯基甲基，Tr)、甲硅烷基醚[例如，三甲基甲硅烷基(TMS)醚、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)醚、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)醚和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚]、乙氧基***(EE)、亚磷酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。用于将部分缀合到大分子药物如OD的醇的常用的保护基团为二甲氧基三苯甲基[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMT)和亚磷酰胺。

在本发明的上下文中，术语“胺的保护基团”[根据式(II)的X部分]是指附接到胺基以便在某些化学反应期间“掩蔽”羟基并且此后潜在地被除去的如本领域已知的化学基团。以非限制性方式提供的在本发明的范围内的胺的保护基团的实例为：苄氧羰基(Cbz)基团；对甲氧基苄基羰基(Moz或MeOZ)基团；叔丁氧基羰基(BOC)基团；9-氟基甲氧基羰基(FMOC)基团；苯氧基乙酰基(PAC)基团；4-叔丁基苯氧基乙酰基(t-PAC)基团；乙酰基(Ac)基团；苯甲酰基(Bz)基团、苄基(Bn)基团；氨基甲酸酯基团；对甲氧基苄基(PMB)；3,4-二甲氧基苄基(DMPM)；对甲氧基苯基(PMP)基团；甲苯磺酰(Ts)基团；https://en.wikipedia.org/wiki/2,2,2-Trichloroethoxycarbonyl_chloride氯甲酸三氯乙酯(Troc)基团、氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(TEOC)。

在本发明的上下文中，术语“与固体支撑物的连接点”意指在化学合成期间E、E'或E”部分与固体支撑物的附接点。举例来说，可控孔玻璃(CPG)可用作固体支撑物，用于在本发明的寡核苷酸链的合成期间附接寡核苷酸的3'-末端。

根据本发明的术语“生物膜”是指与生物***相关的任何磷脂膜。这类磷脂膜的实例为细胞的质膜、细胞内膜或与生物屏障如血脑屏障(BBB)、血眼屏障(BOB)或血胎屏障相关联的磷脂膜。

根据本发明的术语“翻转”是指两亲性化合物(即，同时具有疏水性和亲水性元素的分子)将磷脂膜双层的一个小叶形成为另一小叶的移动。

根据本发明的术语“胞吞”是指活细胞吸收结合到其表面的分子的过程；所述过程包含向内折叠质膜，从而将所述分子带入细胞。

本发明的实施例另外涉及根据本发明的缀合物用于医治有需要的受试者中的医学病症的用途，所述缀合物包含治疗上有用的药物，如蛋白质或OD(例如，siRNA、dsiRNA或ASO)。医学病症可为但不限于退行性病症、癌症、血管病症、代谢病症、外伤性、毒性或缺血性损伤、感染(例如，病毒感染或细菌感染)或免疫介导的病症，其中一种或多种特定蛋白质在疾病病因或发病机理中起作用。对于这类医学病症，通过siRNA或反义机制调节编码这些疾病相关蛋白的一个或多个基因的表达，或通过治疗性蛋白(如通过抗体或通过在信号转导中起作用的蛋白质或通过蛋白质替代疗法)调节相应疾病相关蛋白的活性，可在抑制疾病相关过程或医治疾病的根本原因方面具有有益效果。

举例来说，根据本发明的实施例的缀合物可用作反义、siRNA或dsiRNA疗法，其为一种形式的医学医治，其包含施用单链或双链核酸序列(DNA、RNA或其化学类似物)，所述单链或双链核酸序列结合到编码特定蛋白质的DNA序列或结合到将所述DNA序列翻译成蛋白质的信使RNA(mRNA)。此医治可用以抑制疾病相关基因的表达，从而阻止可在疾病的病因或发病机理中起作用的疾病相关蛋白的产生。替代地，本发明的缀合物可包含治疗性蛋白质或蛋白质/核酸复合物，如能够进行基因编辑的Cas9-RNA复合物。

本发明的实施例还提供药物组合物，其包含本文所述的缀合物和一种或多种药学上可接受的载体或一种或多种盐。根据一些实施例，本发明的缀合物和药物组合物可在体外(例如，在细胞培养中)、离体或体内、在活体受试者中使用，包括在临床环境中使用。

本发明的其它实施例包括本发明的缀合物或包含本发明的缀合物的药物组合物，用于医治有需要的患者中的医学病症。本发明的另外实施例包括本发明的缀合物在制备用于医治有需要的患者中的医学病症的药物组合物中的用途。在一些实施例中，医学病症为癌症、代谢疾病、传染性疾病、退行性疾病、血管疾病、创伤或免疫介导的疾病。所述药物组合物可包含如本领域已知的药学上可接受的成分，包括所述成分以使所述组合物在如缓慢释放、延长停留时间、分散性或安全性的方面具有有益的特性。

与缺少本发明的E、E'或E”部分的相同治疗剂的递送的功效相比，根据本发明的实施例的缀合物在通过细胞膜或通过额外的生物屏障如血脑屏障(BBB)改进siRNA、dsiRNA、ASO或治疗性蛋白质如抗体的递送的功效方面可为有利的。因此，除了功效例如安全性或药代动力学之外，本发明的缀合物可在一个或多个方面改进大分子药物的性能。本发明的缀合物可经由本领域已知的任何施用模式来施用，尤其是包括口服、静脉内、肌内、皮下、气管内、支气管内、腹膜内或鞘内施用。

本发明的缀合物，其中D为OD，可根据以下方法以非限制性方式合成：首先，基于基因在疾病病因或发病机理中的作用来选择待沉默的基因。然后，基于如本领域已知的生物信息学方法，设计并且确定待并入缀合物中的核苷酸序列[对于RISC底物通常为19-21个碱基对的双链siRNA；或对于Dicer底物(dsiRNA)为24-29个碱基对的双链RNA]。合成在寡核苷酸的3'至5'方向上进行。使用以下被保护的建构嵌段应用固相合成：如被保护的2'-脱氧核苷(dA、dC、dG和dT)、核糖核苷(A、C、G和U)或化学修饰的核苷，例如[锁核酸(LNA)或桥接核酸(BNA)]。建构嵌段以核苷前体的形式提供，其中5'-和3'-羟基分别被DMT和亚磷酰胺保护。在核苷酸在合成期间以根据期望的核苷酸序列确定的顺序偶联到生长的寡核苷酸链的反应期间，这些基团被依次除去。

为了合成本发明的缀合物的目的，E基团以前体分子的形式提供，所述前体分子各自为如上所述的连接到一个或多个保护基团的本发明的E、E'或E”部分。虽然保护基团可为本领域已知的羟基的任何保护基团，但是亚磷酰胺和DMT[二甲氧基三苯甲基双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基]通常在寡核苷酸合成中使用。本发明的缀合物的主要优点为，它们提供如上文针对缀合物(Cn-1)和(Cn-2)所解释的将E、E'或E”部分连接到寡核苷酸链的5'-末端、连接到寡核苷酸链的3'-末端或也连接在沿寡核苷酸链的一个或多个内部位置处的选项。因此，本发明的E部分可整合在与任何固有的天然寡核苷酸建构嵌段类似的寡核苷酸链内。核苷酸之间的连接可经由标准的磷酸三酯键，或通过合成的硫代磷酸酯键，其可提供优点，如在血液中的稳定性或有利地结合到血液蛋白，或者经由如本领域已知的任何其它核苷酸连接策略。在链的组装完成后，产物从固体支撑物中释放到溶液中，脱保护并且收集。期望的缀合物然后通过高效液相色谱(HPLC)分离，以便获得高纯度的本发明的期望的缀合物。在siRNA或dsiRNA的情况下，互补的RNA链中的每一条被单独地合成，并且然后如本领域已知的对两条链进行退火，以产生期望的双链siRNA或dsiRNA，然后使所述双链siRNA或dsiRNA经历纯化和等分。

在本发明的一个实施例中，本发明提供用于跨越磷脂生物膜递送药物的方法，所述磷脂生物膜选自由以下组成的组：细胞膜和生物屏障，其中所述生物屏障选自血脑屏障、血眼屏障或血胎屏障；方法包含使细胞或相应的生物屏障与本发明的缀合物接触。

在本发明的一个实施例中，本发明提供用于将药物递送到生物细胞中的方法，其中所述细胞在培养物中，或在活体动物中或在人类受试者中；方法包含使细胞与缀合物或与包含本发明的缀合物的药物组合物接触。在体内施用的情况下，与细胞的接触可通过本领域已知的药物施用的任何途径如口服、静脉内、皮下、或通过肌内施用来实现。

在本发明的一个实施例中，本发明提供本发明的缀合物，或包括根据式(I)的缀合物的药物组合物，其中E、E'或E”中的每一个独立地具有如式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个中所阐述的结构。本发明还包含用于在体外或体内特异性抑制基因表达的方法。在本发明的一个实施例中，方法可包括利用根据式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)、(Cn-1)、(Cn-2)、(Cn-3)中的任一个的缀合物或包括所述缀合物的药物组合物，其中D为被设计成使特定基因的表达沉默的siRNA、dsiRNA或ASO。在一些实施例中，基因编码在疾病的病因或发病机理中具有作用的致病蛋白质。在一些实施例中，D为治疗性蛋白质。

在本发明的又另一个实施例中，本发明以非限制性方式提供用于在生物膜内诱导胞吞和/或翻转的方法；所述方法包含使生物膜与本发明的缀合物或包括所述缀合物的药物组合物接触，其中所述缀合物包含OD和一个或多个各自具有如式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个中所阐述的结构的E、E'或E”部分，从而在生物膜上实现所述缀合物的胞吞和/或翻转。

在非限制性假设中，所述胞吞或翻转的诱导的基础涉及本发明的缀合物的结构。在OD为连接到E部分的siRNA或dsiRNA的情况下，缀合物接近膜的外部小叶，其圆柱形RNA双链体平行于膜表面，并且其E部分朝向膜芯、垂直于膜表面取向。因此，此取向将RNA双链体锚定在膜的外部小叶上。由此产生的高度带负电荷的RNA被迫接近外膜小叶，导致能量上不利的局部应变、外磷脂小叶的表面积扩大、磷脂头部基团周围的水合壳受到干扰和膜的局部弯曲。然后这种弯曲能量的松弛可通过胞吞和/或翻转发生。两个过程均支持本发明的缀合物跨膜递送到细胞(包括其大分子货物药物)中的引发和/或传播。因此，用于在磷脂膜中诱导胞吞或翻转的方法在本发明的范围内；所述方法包含使膜与本发明的缀合物接触。

根据本发明的实施例的缀合物可用于医治医学病症。本发明的实施例包括用于医学医治的方法，所述方法包含向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含根据式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)、(Cn-1)、(Cn-2)、(CN-3)中的任一个的缀合物，其中D为对于医治相应医学病症有用的药物。

在一个实施例中，方法用于用siRNA、dsiRNA或ASO作为治疗剂的遗传医学医治。所述方法包含向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含根据式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)、(Cn-1)、(Cn-2)、(CN-3)中的任一个的本发明的缀合物，其中D为可用于抑制基因表达或阻断在特定患者的疾病的病因或发病机理中起作用的相应蛋白质的活性的siRNA、dsiRNA、mRNA、miRNA、ASO或治疗性蛋白质。

所述医治可涉及将药物递送到体外培养的细胞中、离体培养的细胞中(即，从活组织中取出的细胞，以在治疗操作后任选地返回给患者)，或递送到活体动物或人类受试者体内的细胞中。在一些实施例中，细胞为赘生性细胞。在一些实施例中，赘生性细胞为肿瘤细胞。在一些实施例中，赘生性细胞为转移灶内的细胞。细胞可为真核细胞、被致癌剂转染的真核细胞、人类细胞、细胞系、为癌前细胞的细胞或其任何组合。

在本发明的又另一个实施例中，D为作为替代疗法施用的蛋白质，即，以替代突变的、具有功能障碍的蛋白质，从而解决生理需要。在另一个实施例中，D为在基因调节中具有作用的蛋白质，尤其包括在DNA或RNA编辑(对特定基因的序列进行添加、破坏或改变)中具有作用的蛋白质。在一个实施例中，所述蛋白质可为成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)相关蛋白质的成员。特别地，所述蛋白质可为Cas9蛋白(CRISPR相关蛋白9)、RNA引导的DNA核酸酶，或其类似物，其潜在地负载有其引导寡核苷酸序列。

在实施例中的一个中，本发明描述用于遗传医治医学病症的方法，其中所述方法包含向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含根据式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)、(Cn-1)、(Cn-2)、(Cn-3)中的任一个的缀合物，其中D为与适当的引导寡核苷酸一起施用的CRISPR蛋白，如Cas9，由此实现将负载有相应引导寡核苷酸的蛋白质递送到细胞中，其中CRISPR蛋白可发挥其基因组编辑活性。在此上下文中，引导寡核苷酸为这样的RNA或DNA的序列，其将Cas9蛋白引导到基因组DNA上的特定基因座(位置)，以便在所述位点诱导双链DNA裂解，从而使得能够修复基因组中的局部缺陷。在Cas9的情况下，引导寡核苷酸为RNA的短区段，其序列与靶标DNA基因座的序列互补。

因此，根据本发明的实施例的缀合物和相应的药物组合物以及相应的方法可尤其有益于医治尤其选自以下的医学病症：癌症、毒性损伤、代谢疾病、缺血性疾病、传染性疾病、血管病症、蛋白质贮积疾病、创伤、免疫介导的疾病、退行性疾病、遗传性或获得性医学病症。

因此，在本发明的一个实施例中，本发明提供用于医治医学病症的方法，所述方法包含向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含根据任何式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)、(Cn-1)、(Cn-2)、(Cn-3)中的任一个的缀合物，其中D为对于医治此医学病症有用的药物。

根据一些实施例，医学病症为癌症。如本文所用，术语“癌症”是指表现出致癌细胞的典型特征的特征的细胞的存在，所述致癌细胞的典型特征如不受控制的增殖、特定功能的丧失、永生、显著的转移潜能、抗凋亡活性的显著增加、快速生长和增殖速率、或已知与癌症相关联的某些特征形态和细胞标志物。通常，癌细胞呈肿瘤的形式，局部地存在于动物中，或者作为独立的细胞(例如白血病细胞)在血流中循环。

在神经病症领域中，根据本发明的实施例的缀合物尤其在医治神经退行性病症，如阿尔茨海默氏病、运动神经元病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、多发性硬化和克雅氏病方面可为有用的。

在传染性病症领域中，根据本发明的实施例的缀合物尤其对于递送抗生素以对抗细菌、真菌或其它寄生物感染；或对于递送抗病毒剂以对抗病毒感染可为有用的。因此，本发明的缀合物的D可具有抗感染特性，由此对于医治传染性疾病，如细菌感染或病毒感染可为有用的。本发明的缀合物对于其可有用的病毒感染的实例为但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)；嗜肝病毒如丙型肝炎病毒(HCV)或乙型肝炎病毒(HBV)；通过正黏病毒科如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒引起的感染，或通过副流感病毒引起的感染。因此，本发明的一个实施例为连接到抗病毒药物或抗细菌药物的一个或多个E、E'或E”部分的缀合物。这类药物尤其可为OD，所述序列旨在与感染剂的遗传物质相互作用，由此干扰在所述病原体的复制、代谢、感染或存活中具有作用的遗传过程。这类遗传序列可为被特别设计成使感染剂(例如，病毒)的一个或多个基因的表达沉默的siRNA或dsiRNA。

本发明的缀合物在对抗感染中的效用可为在以下应用的至少一种中的效用：将治疗上有用的试剂跨越生物膜递送到宿主(例如，人类患者)的细胞中；或跨越生物膜递送到病原体(例如，细菌或病毒)的细胞中。

在代谢病症领域中，根据本发明的实施例的缀合物尤其对于递送遗传医治可为有用的，所述遗传医治旨在下调负责所述代谢病症的一个或多个基因的表达，或对于施用蛋白质，以替代在疾病病因或发病机理中具有作用的缺陷的突变蛋白质可为有用的。

在其它实施例中，本发明涉及潜在利用本发明的化合物来增强将化合物跨越磷脂膜递送到植物细胞中，由此潜在地有益于在农业中利用。取决于附接的化合物和期望的适应症，这类递送可在农业中具有多种有用的应用。举例来说，在植物中的这类递送可帮助尤其是通过改进植物的遗传或通过根除多种病原体：昆虫、细菌或真菌来改善作物质量和数量。

实例

以下实例以非限制性方式说明本发明，以便展示本发明的实施例可如何在实践中进行。实例描述本发明的多种化合物和缀合物。所有描述的缀合物都根据式(Cn-1)或(Cn-2)，其中各自包含具有根据通式(II)的结构的E、E'或E”部分。实例提供多种E、E'或E”部分，它们选自如式(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)或(XIV-M)中所阐述的结构。这些缀合物在基因沉默中表现出生物活性。此性能支持这样的概念：包含式(I)和(II)的缀合物呈现通用和统一的结构基序，这使得能够将大分子OD跨越磷脂膜有用地递送到细胞中，从而具有有用的生物学性能(在这种情况下，基因沉默)。另外，实例描述用于化学合成本发明的E部分、其前体以及将其组装成有用的缀合物的方法。

实例1：用于合成根据本发明的实施例的缀合物的通用方法，其中D部分为寡核苷酸：

首先，基于基因在疾病病因或发病机理中的作用来选择待沉默的基因。然后，基于本领域已知的生物信息学方法，设计并且确定待并入缀合物中的核苷酸序列[对于RISC底物通常为19-21个碱基对的双链siRNA，或对于Dicer底物(dsiRNA)为24-29个碱基对的双链RNA]。

合成在寡核苷酸的3'至5'方向上进行。使用源自以下的被保护的建构嵌段应用固相合成：被保护的2'-脱氧核苷(dA、dC、dG和dT)、核糖核苷(A、C、G和U)或化学修饰的核苷，例如[锁核酸(LNA)或桥接核酸(BNA)]。建构嵌段以核苷前体的形式提供，其中5'-和3'-羟基分别被DMT和亚磷酰胺保护。在核苷酸以如根据期望的核苷酸序列确定的顺序偶联到生长的寡核苷酸链的反应期间，这些基团被依次除去。

为了合成本发明的缀合物的目的，E基团以前体分子的形式提供，所述前体分子各自为如上所述的连接到保护基团的本发明的E、E'或E”部分。虽然保护基团可为本领域已知的羟基的任何保护基团，但是亚磷酰胺和DMT[二甲氧基三苯甲基双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基]通常在寡核苷酸合成中使用。本发明的缀合物的主要优点为，它们提供如针对缀合物(Cn-1)和(Cn-2)所解释的将E、E'或E”部分连接到寡核苷酸链的5'-末端、连接到寡核苷酸链的3'-末端或也连接在沿寡核苷酸链的内部位置处的选项。因此，本发明的E部分可整合在与任何固有的天然寡核苷酸建构嵌段类似的寡核苷酸链内。核苷酸之间的连接可经由标准的磷酸三酯键，或通过合成的硫代磷酸酯键，其可提供优点，如在血液中的稳定性或结合到血液蛋白，或者经由本领域已知的任何其它核苷酸连接方法。在链的组装完成后，产物从固体支撑物中释放到溶液中，脱保护并且收集。期望的缀合物然后通过高效液相色谱(HPLC)分离，以获得高纯度的本发明的期望的缀合物。在siRNA或dsiRNA的情况下，每条互补的RNA链被单独地合成，并且然后在如本领域已知的标准条件下对两条链进行退火，产生期望的双链siRNA或dsiRNA，然后使所述双链siRNA或dsiRNA经历纯化和等分。

实例2：用于化学合成包含本发明的E、E'或E”部分的前体分子的方法：

实例2A：关键中间体酚1的合成：

将***用过量的氢化钠处理，接着添加烯丙基溴，这导致朝向化合物3的完全转化。随后用1.5当量的9-BBN的硼氢化仅产生末端羟基基团，而用BH₃的硼氢化选择性低得多，并且提供加合物的混合物。将醇5置于Mitsunobu反应条件，以使其与全氟化叔丁醇偶联，以得到化合物6。化合物8的苄基的氢解得到酚1。总之，酚1由***经由5个合成步骤以45％的总产率制备：

2bA1.(8R,9S,13S,14S,17S)-3-苄氧基-17-羟基***-1,3,5(10)-三烯(2)：

(8R,9S,13S,14S,17S)-3-苄氧基-17-羟基***-1,3,5(10)-三烯(2)的合成在上文第2aA1节中公开。

2bA2.(8R,9S,13S,14S,17S)-17-烯丙氧基-3-苄氧基***-1,3,5(10)-三烯 (3)：

(8R,9S,13S,14S,17S)-17-烯丙氧基-3-苄氧基***-1,3,5(10)-三烯(3)的合成在上文第2aA2节中公开。

2bA3.(8R,9S,13S,14S,17S)-3-苄氧基-17-(3-羟基丙氧基)***-1,3,5(10)- 三烯(7)：

在0℃下将9-硼双环[3.3.1]壬烷(800mL，于THF中的0.5M溶液，稳定化的，400mmol)逐滴添加到粗烯烃3(101.2g，251mmol)于THF(1L)中的溶液中，并且在完全添加后，将混合物在室温下搅拌过夜。将溶液冷却至0℃，并且同时缓慢逐滴添加30％NaOH水溶液(150mL，1.3mol)和35％NaOH水溶液(120mL，1.3mol)，并且将所得非均相混合物在室温下剧烈搅拌大约1小时。然后将反应混合物在EtOAc(2L)和盐水(500mL)之间分配。将有机相用额外的500mL盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且在真空中浓缩。以类似方式重复此程序，并且将两部分组合。通过快速色谱法(硅胶，梯度为25％至35％的EtOAc/庚烷)的浓缩物的另外纯化以61％的产率得到呈白色固体状的醇5(130g，310mmol)(3步)。

2bA4.(8R,9S,13S,14S,17S)-3-苄氧基-17-[3-(全氟叔丁氧基)丙氧基]***- 1,3,5(10)-三烯(8)：

在氮气氛围下将偶氮二羧酸二异丙酯(80mL，407mmol)逐滴添加到含醇7(130g，301mmol)、三苯基膦(162g，618mmol)、全氟叔丁醇(70mL，497mmol)的干燥THF(2L)的搅拌的混合物。将混合物在室温下搅拌大约18小时。将反应混合物部分浓缩，并且添加庚烷(1L)。在完全除去THF后，沉淀开始。使用过滤除去固体，并且将滤液浓缩。添加乙腈(1.5L)，并且将混合物搅拌30分钟，同时沉淀开始。将固体经由过滤收集并且在真空中干燥。以81％的产率分离呈白色固体状的化合物8(160g，251mmol)。

2bA5.(8R,9S,13S,14S,17S)-3-羟基-17-[3-(全氟叔丁氧基)丙氧基]***-1, 3,5(10)-三烯(酚1)

用含苄基醚8(160g，251mmol)的EtOAc(1L)装载Parr容器，向其中添加10％钯/碳(4g)。将混合物在室温下在氢气压力(5巴)下搅拌。用¹H NMR监测反应。在大约72小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤(用EtOAc冲洗)，并且用新鲜的10％钯/炭(4g)一起重新置于氢气氛围(5巴)。在大约16小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤(用EtOAc冲洗)并且浓缩，以便以91％的产率得到呈灰色固体状的酚1(125g，228mmol)。

实例2b：关键建构嵌段K-93-A-1的合成：

合成根据以下合成流程进行：

实例2c：式(III)-前体的合成：

虽然中间体K-93-A-1如上所述合成，但是中间体K-103-5的合成根据以下合成流程进行：

实例2d：式(IV)-前体的合成：

式(IV)-前体的合成通过将K-103A-2(其为酚1的衍生物)与关键建构嵌段K-93-A-1缀合来进行。合成根据以下合成流程进行：

实例2e：用于合成式(V)-前体的方法：

硫代乙酸酯11的合成：

合成通过用1,3-丙二醇保护酮来开始以提供高纯度的化合物2。缩醛的LiAlH₄和AlCl₃开环得到化合物3和***的比率为大约85:15的混合物，后者反应性较低并且将在下一步中除去。

用溴乙酸甲酯将酚烷基化并且获得化合物4。使用Mitsunobu条件引入全氟叔丁醇部分(化合物5)。用甲胺处理化合物5以提供酰胺6。使用BH₃.DMS还原酰胺以提供胺7。将胺用溴化物8烷基化以提供酯9。用LiAlH₄将酯还原成对应的醇(10)。最后，使用Mitsunobu条件引入硫代乙酸酯，以提供期望的建构嵌段11。

胺7的烷基化似乎没有预期的简单。在室温下没有实现转化，并且碱(如Et₃N或K₂CO₃)的存在似乎为必需的。但是，所得产率通常在40％的范围内。随后用LiAlH₄将酯还原成醇10，得到良好的转化率并且易于后处理。通常通过添加20％的KOH水溶液(每摩尔160mL)来破坏氧化铝盐，将其简单过滤后得到含期望的物质的THF。醇转化成硫代乙酸酯经由Mitsunobu条件来实现。必须注意的是，对于添加顺序，硫代乙酸应作为最后一种组分添加。在后处理和仔细纯化后，可获得硫酯11。

硫代甲苯磺酸酯18的合成：

在先前化合物的合成期间，观察到硫代甲苯磺酸酯建构嵌段中胺的存在为产率非常低的原因。因此，需要Boc保护的硫代甲苯磺酸酯18。在二硫化物形成后，将除去Boc-基团，并且然后将胺烷基化。氨基丙醇用Boc基团保护，随后被LiAlH₄还原成对应的甲胺13。然后用新的Boc基团保护现在的仲胺以提供化合物14。使醇与重氮乙酸乙酯反应以引入醚官能团(15)。使用LiAlH₄将酯还原以提供醇16。用NBS溴化提供溴化物17。用硫代甲苯磺酸钾取代溴化物得到期望的硫代甲苯磺酸酯建构嵌段18。

碘化物22的合成：

丙二酸二乙酯用4-溴丁酸甲酯烷基化以提供三酯19。通过用LiAlH₄处理来同时还原所有三个酯以提供三醇20。通过与二甲氧基丙烷反应来配置丙酮化物保护基团并且得到醇21。将醇转化成碘化物以提供期望的建构嵌段22。

式(V)-前体的合成的整合：

在硫代乙酸酯11和硫代甲苯磺酸酯18之间的二硫化物形成以良好的产率提供二硫化物23。用TFA除去Boc基团的处理提供胺24。将胺用碘化物22烷基化，以40％的产率得到25。通过用酸处理除去丙酮化物以提供二醇26。配置DMT基团以得到化合物27。最终亚磷酰胺的形成提供式(V)-前体。

实验部分：

硫代乙酸酯11的合成：

(8R,9S,13S,14S)-13-甲基-6,7,8,9,11,12,13,14,15,16-十氢螺[环戊[a]菲-17,2'-[1,3]二噁烷]-3-醇(2)

向雌酮(252克，0.93mol)于甲苯(1.5L)中的悬浮液中添加三甲氧基甲烷(297g，350mL，2.80mol)、丙-1,3-二醇(213g，250mL，2.80mol)和pTsOH(2g，10mmol)。温热至60°0C并且搅拌16小时。添加三乙胺(6mL)和水(600mL)，并且再继续搅拌1小时。分离各相，并且将有机层用水(3×400ml)和盐水洗涤。经Na₂SO₄干燥并且部分浓缩至大约1L。倒入庚烷(4L)中并且过滤其白色固体。用庚烷洗涤，在真空中干燥。以88.5％的产率分离呈白色固体状的化合物2(271克，825mmol)

(8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-羟基丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-醇(3)

在0℃下向(13S)-13-甲基-6,7,8,9,11,12,13,14,15,16-十氢螺[环戊[a]菲-17,2'-[1,3]二噁烷]-3-醇(2，60.7g，185mmol)于THF中的溶液中小心地添加氢化铝锂(8.42g，222mmol)，接着分批添加氯化铝(98.6g，739mmol)(非常放热！)。在0℃下搅拌15in，然后温热至50℃。在50℃下搅拌2小时(由于在旋转蒸发仪上堵塞)，然后冷却至0℃，并且开始用NH₄Cl(水溶液)(500mL)逐滴淬灭。在室温下搅拌1小时。分离各相，并且将有机层用盐水洗涤，浓缩。获得被***(大约15％)污染的白色固体(65克)

2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-羟基丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙酸甲酯(4)

将粗物质3(89.4克)溶解在丙酮(1.25L)和MeOH(0.2L)中，并且用碳酸钾(60克，435mmol)和溴乙酸甲酯(50mL，435mmol)处理。将悬浮液温热至60℃，并且继续搅拌16小时。基于TLC，所有酚醛部分均已烷基化。将混合物冷却至室温并且过滤。将滤液浓缩并且使用快速色谱法(洗脱剂为20％至30％的EtOAc/庚烷，除去所有杂质，100％EtOAc，以获得期望的物质)另外纯化。

以65％的产率分离呈黄色油状的化合物4(56.7克，140.3mmol)。

2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙酸甲酯(5)

向化合物4(56.7克，140.3mmol)于THF(1L)中的溶液中添加三苯基膦(55.4克，211mmol)、九氟叔丁醇(30mL)和偶氮二羧酸二叔丁酯(38.5克，167mmol)。当TLC示出完全转化时，将混合物搅拌30分钟。添加庚烷(500mL)，并且将混合物部分浓缩至约500mL。添加更多的庚烷(1L)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。形成并且滤出沉淀物，将滤液浓缩，得到呈黄色浆液的化合物5，尽管其被痕量的DBAD和三苯基膦污染。

2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-N-甲基乙酰胺(6)

用MeOH(250mL)稀释化合物5的粗浆液，并且添加40％的甲胺水溶液(350mL)。当TLC示出完全转化时，将白色沉淀物搅拌1小时。添加水(1L)，并且滤出固体。将残余物用水洗涤，并且溶于二氯甲烷(1L)中。将有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用大约7cm的二氧化硅进行另外纯化，并且用15％的EtOAc/庚烷进行初步洗脱。当从柱中除去所有杂质时，将化合物6用100％的EtOAc洗脱。以94％的产率分离呈白色固体状的化合物6(82.0克，132mmol)，尽管仍然存在痕量的三苯基膦氧化物。

2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-N-甲基乙-1-胺(7)。

在65℃下向化合物6(56.0克，90.5mmol)于THF(500mL)中的溶液中逐滴添加BH₃.DMS(56mL，590mmol)。回流再继续5小时，然后将混合物冷却至室温。将混合物小心地溶解在MeOH(300mL)中，并且添加含4M二噁烷的HCl(50mL)。将溶液回流30分钟，然后冷却至室温并且浓缩。将混合物溶解在MeOH(300mL)中，并且回流30分钟。在冷却和浓缩后，将浆液溶于CH₂Cl₂(1L)中，并且用饱和碳酸氢钠水溶液(2次)洗涤。有机层经Na₂SO₄干燥并且浓缩。以91％的产率分离呈缓慢固化的透明油状的化合物7(50.0克，82.6mmol)。带有痕量三苯基膦氧化物的杂质分布类似于化合物6。

2-(3-溴丙氧基)乙酸乙酯(8)

在0℃下向2-重氮乙酸乙酯(100g，0.74mol)和3-溴丙-1-醇(0.10kg，74mL，0.74mol)于DCM(100mL)中的溶液中添加BF₃.OEt₂(1.1g，0.94mL，7.4mmol)添加。将反应在0℃下搅拌15分钟，并且在室温下搅拌3小时，直到没有观察到更多的气体产生。将混合物用DCM(500mL)稀释，并且将混合物用H₂O(500mL)和盐水(500mL)洗涤，并且经Na₂SO₄干燥。将溶剂在真空中除去，得到呈透明黄色油状的2-(3-溴丙氧基)乙酸乙酯(8，180g，0.80mol，110％)。

2-(3-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)丙氧基)乙酸乙酯(9)

将2-(3-溴丙氧基)乙酸乙酯(11g，50mmol)化合物7(25g，41mmol)、碳酸钾(11g，83mmol)和碘化钾(0.69g，4.1mmol)于乙腈(300mL)中的悬浮液温热至70C持续16小时。将混合物冷却至室温，用EtOAc(100mL)稀释，过滤并且浓缩。使用快速色谱法(梯度为20％至30％的丙酮+1％的Et₃N/庚烷)另外纯化以39％得到呈缓慢固化的透明油状的化合物8(12.0g，16mmol)。

2-(3-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)(甲基)氨基)丙氧基)乙-1-醇(10)

在0℃下向化合物9(12g，16mmol)于THF(200mL)中的溶液中添加氢化铝锂(0.91g，24mmol)。将反应混合物温热至室温，并且搅拌1小时30分钟。TLC给出完全消耗。将反应混合物用20％的KOH(160mL/mol，V＝4.2mL)淬灭，搅拌1小时，过滤并且在真空中浓缩。分离呈透明的化合物10(10.2克，14.4mmol)

硫乙酸S-(2-(3-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基(甲基)氨基)丙氧基)乙基)酯(11)

向化合物10(20.2g，28.5mmol)于THF中的溶液中添加三苯基膦(9.73g，37.1mmol)和DIAD(6.93g，6.66mL，34.3mmol)，然后在5分钟后添加硫代乙酸(3.26g，3.07mL，42.8mmol)。继续搅拌3小时，添加庚烷(20mL)并且浓缩。

使用快速色谱法纯化(10％的丙酮+1％的Et₃N/庚烷)。以71％的产率分离呈透明粘性油状的化合物11(15.4g，20.1mmol)。

硫代甲苯磺酸酯18的合成：

(3-羟丙基)氨基甲酸叔丁酯(12)

向3-氨基丙-1-醇(28.5g，379mmol)和三乙胺(38.4g，53mL，379mmol)于DCM(500mL)中的溶液中缓慢添加二碳酸二叔丁酯(91.1g，417mmol)并且将所得混合物在室温下搅拌2小时。将混合物用咪唑(勺)淬灭并且搅拌5分钟。将混合物用1M HCl(300mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的化合物12(55g，0.31mol，83％)。

3-(甲基氨基)丙-1-醇(13)

在0℃下向氢化铝锂(26g，0.67mol)于THF(500mL)中的冰冷悬浮液中逐滴添加(3-羟丙基)氨基甲酸乙基叔丁酯(12，88g，0.34mol)于THF(250mL)中的溶液。在完全添加后，将混合物在室温下搅拌30分钟，并且在70℃下搅拌16小时。将混合物冷却至室温，并且然后通过在0℃下逐滴添加KOH(20％，107mL)来淬灭。将所得混合物在室温下搅拌2小时。将混合物经硅藻土过滤，并且将滤液经Na₂SO₄干燥并且浓缩。NMR示出仍有一些Boc完整。将物质溶解在THF(500mL)中，并且添加LiAlH₄(13g，0.34 1当量)。将混合物在80℃下搅拌16小时。将混合物冷却至室温。在0℃下通过缓慢添加KOH(20％，54mL)来淬灭反应，并且将所得混合物在室温下搅拌2小时。将混合物经硅藻土过滤，并且将滤液经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的Boc-甲基氨基丙醇(22.6g，170mmol，50％)。

(3-羟丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(14)

向3-(甲基氨基)丙-1-醇(13，22.6g，254mmol)和三乙胺(25.7g，35mL，254mmol)于DCM(500mL)中的溶液中分批添加二碳酸二叔丁酯(55.3g，254mmol)。将所得混合物在室温下搅拌1小时，直到没有观察到更多的气体产生。将混合物用1M HCl洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的Boc保护的胺14(43g，230mmol，90％)。

2-(3-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙氧基)乙酸乙酯(15)

向醇14(36g，0.19mol)于DCM(500mL)中的溶液中添加2-重氮乙酸乙酯(25g，23mL，0.19mol)和三氟化硼醚化物(2.7g，2.4mL，19mmol)并且将所得混合物搅拌16小时。将混合物用水和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用柱色谱法(20％的EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到呈透明油状的酯15(11g，40mmol，21％)。

(3-(2-羟基乙氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(16)

在0℃下向氢化铝锂(2.7g，71mmol)于THF中的冰冷悬浮液中逐滴添加酯15(13g，47mmol)于THF(50mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌1小时。通过在0℃下逐滴添加KOH(20％，11mL)来淬灭反应。将所得混合物在室温下搅拌30分钟。将混合物经硅藻土过滤，经Na₂SO干燥并且浓缩，得到呈透明油状的醇16(8.5g，36mmol，77％)。

(3-(2-溴乙氧基)丙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(17)

向醇16(8.5g，36mmol)于DCM(300mL)中的溶液中添加三苯基膦(13g，51mmol)和NBS(7.8g，44mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌16小时。将混合物用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且过滤。添加庚烷，并且通过蒸发除去DCM。滤出形成的固体，并且将滤液浓缩。使用柱色谱法(20％的EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到呈透明油状的叔丁基溴17(7.6g，26mmol，70％)。

S-(2-(3-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)丙氧基)乙基)4-甲基苯硫代磺酸酯(18)

在50℃下将溴化物17(7.6g，26mmol)和4-甲基苯硫代磺酸钾(8.7g，38mmol)于DMF(200mL)中的溶液搅拌16小时。将混合物冷却至室温，并且用水(1L)稀释。将混合物用EtOAc/庚烷(3×200mL 1:1)提取，并且将组合的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。通过柱色谱法(20％的EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到呈透明油状的硫代甲苯磺酸酯18(9.1g，23mmol)88％)。

碘化物22的合成：

1,1-二乙基4-甲基丁烷-1,1,4-三羧酸酯(19)

向氢化钠(10g，0.26mol)于DMF(500mL)中的冰冷悬浮液中缓慢添加丙二酸二乙酯(42g，40mL，0.26mol)，并且将反应混合物在室温下搅拌1小时，直到混合物澄清。在0℃下添加4-溴丁酸甲酯(47g，0.26mol)，并且将所得混合物在室温下搅拌18小时。将混合物部分浓缩并且将残余物用1N HCl(300mL)和水(1.3L)淬灭。将混合物用Hept/EtOAc(1/1；2×250mL)提取。将组合的有机层用盐水(500mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并且浓缩。通过柱色谱法(20％的EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到呈透明油状的三酯19(63g，0.24mmol，92％)。

2-(羟基甲基)己-1,6-二醇(20)

在0℃下向氢化铝锂(25g，0.66mol)于THF(500mL)中的冰冷悬浮液中缓慢添加三酯19(63g，0.24mol)于THF(100mL)中的溶液，并且将所得混合物在室温下搅拌16小时。通过在0℃下缓慢添加KOH(20％水溶液，106mL)来淬灭反应。将所得混合物在室温下搅拌1小时。将混合物经硅藻土过滤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明黄色油状的三醇20(16g，0.11mmol，45％)。

4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)丁-1-醇(21)

向三醇20(16g，0.11mol)于THF(200mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸(5.1g，27mmol)和2,2-二甲氧基丙烷(34g，40mL，0.32mol)，并且将所得混合物在室温下搅拌1小时。浓缩混合物，并且将残余物溶解在DCM(200mL)中。将混合物用NaHCO₃(饱和水溶液，200mL)和盐水(200mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩成呈棕色油状的丙酮化物21(9.0g，48mmol，44％)。

5-(4-碘丁基)-2,2-二甲基-1,3-二噁烷(22)

向醇21(3.7g，20mmol)、三苯基膦(6.2g，24mmol)和咪唑(1.6g，24mmol)于DCM(250mL)中的溶液中添加碘(5.5g，22mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌1小时。将混合物用硫代硫酸钠(饱和水溶液，2×100mL)和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用柱色谱法(15％的EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到呈透明黄色油状的碘化物22(3.7g，12mmol，63％)。

式(V)-前体的合成：

(1-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-3-甲基-7,14-二氧杂-10,11-二硫杂-3-氮杂十七烷-17-基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(23)

向硫代甲苯磺酸酯18(3.4g，8.5mmol)和硫代乙酸酯11(5.0g，6.5mmol)于DCM(200mL)和MeOH(20mL)中的溶液中添加甲醇钠(1.1g，3.6mL，20mmol)于MeOH(5.4M)中的溶液，并且将所得混合物在室温下搅拌1小时。将混合物用200mL DCM稀释，用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。通过柱色谱法(10％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃)纯化粗物质，得到呈透明油状的二硫化物23(6.5g，6.7mmol，定量)。

N-(2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)-N-甲基-3-(2-((2-(3-(甲基氨基)丙氧基)乙基)二硫烷基)乙氧基)丙-1-胺(24)

向叔丁基二硫化物23(6.5g，6.7mmol)于DCM(200mL)中的溶液中添加TFA(15g，10mL，0.13mol)，并且将所得混合物在室温下搅拌1小时。添加额外的TFA(5mL)并且搅拌30分钟。浓缩混合物，并且将残余物溶解在DCM(250mL)中。将混合物用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈浅黄色透明油状的胺24(5.3g，6.1mmol，91％)。

4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)-N-(1-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-3-甲基-7,14-二氧杂-10,11-二硫杂-3-氮杂十七烷-17-基)-N-甲基丁-1-胺(25)

向胺24(5.3g，6.1mmol)于乙腈(200mL)中的溶液中添加碳酸钾(0.84g，6.1mmol)和碘化物22(1.8g，6.1mmol)，并且将所得混合物在50℃下搅拌16小时。浓缩混合物，并且将残余物溶解在DCM(300mL)中。将混合物用NaHCO₃(半饱和水溶液，250mL)和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用柱色谱法(25％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃)纯化粗物质，得到呈透明油状的丙酮化物25(2.5g，39％)。

2-(1-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-3,18-二甲基-7,14-二氧杂-10,11-二硫杂-3,18-二氮杂二十二烷-22-基)丙-1,3-二醇(26)

向丙酮化物25于MeOH(100mL)中的溶液中添加对甲苯磺酸(1.1g，6.0mmol)，并且将混合物在室温下搅拌1小时。浓缩混合物，并且将残余物溶解在DCM(200mL)中。将混合物用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的二醇26(2.1g，2.1mmol，87％)。

23-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-1-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-3,18-二甲基-7,14-二氧杂-10,11-二硫杂-3,18-二氮杂二十四烷-24-醇(27)

向的二醇26(2.1g，2.1mmol)于DCM(200mL)的溶液中添加三乙胺(0.42g，0.58mL，4.2mmol)、DMAP(26mg，0.21mmol)和4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(0.71g，2.1mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌16小时。将混合物用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用柱色谱法(25-40％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃，用NEt₃预处理的二氧化硅)纯化粗物质，得到呈淡黄色油状的DMT保护的化合物27(2.3g，1.8mmol，84％)。

23-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-1-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-3,18-二甲基-7,14-二氧杂-10,11-二硫杂-3,18-二氮杂二十四烷-24-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(Apo-Si-K-105-B)

向化合物27(2.3g，1.8mmol)于DCM(100mL)中的溶液中添加3-((双(二异丙基氨基)膦酰基)氧基)丙腈(0.69g，0.72mL，2.3mmol)和NMM和TFA(4.6mL，0.5M NMM和0.25MTFA，1.3当量NMM)于DCM中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌3小时。将混合物用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用柱色谱法(30％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃，用庚烷/NEt₃预处理至失活的二氧化硅)纯化粗物质，得到呈透明油状的式(V)-前体(2.2g，83％)。

实例2f：用于合成式(VII)-前体的方法：

式(VII)-前体的合成根据以下合成流程进行。合成侧重于三个主要建构嵌段：

建构嵌段K-105-6：

建构嵌段K-109B-1：

建构嵌段K-53-2：

：

然后将所有建构嵌段整合到最终化合物式(VII)-前体中：

实例2g：用于合成式(VIII-F)-前体的方法：

从雌酮开始，可采用已知的化学反应来制备甲酯5(已知的中间体)。然后可通过与氨基丙醇的反应来引入氮。这可以直接像先前对甲胺所做的那样。否则，可将甲酯水解，并且可使用标准肽偶联方案引入氮。然后可将酰胺还原以得到期望的仲胺K-93-F-2。促进硫代乙酸酯官能团的引入的Boc-基团和Mitsunobu的随后引入将提供期望的建构嵌段K-93-F-4。

将片段整合到最终的式(VIII-F)-前体中：

式(VIII-F)-前体的组装开始于在建构嵌段K-93-F-4和硫代甲苯磺酸酯6之间的二硫化物形成。然后，通过用酸处理同时除去丙酮化物部分和Boc-基团。然后，游离的仲胺用Fmoc基团保护。随后的DMT附接和亚磷酰胺的形成提供式(VIII-F)-前体(流程16)。

实例2h：用于合成式(XIIa)-前体的方法：

在以下流程中描述的合成。合成汇聚二硫化物部分的两侧，其中左侧部分被官能化为硫代乙酸酯，而含类固醇的右侧部分被官能化为硫代甲苯磺酸酯。这些被合并并且需要微小的修饰以提供最终的化合物。

硫代甲苯磺酸酯8的合成：

合成通过用1,3-丙二醇保护酮来开始以提供高纯度的化合物2。缩醛的LiAlH₄和AlCl₃开环得到化合物3和***的比率为大约85:15的混合物，后者反应性较低并且将在下一步中除去。用溴乙酸甲酯将酚烷基化以提供甲酯4。然后使用Mitsunobu条件引入全氟丁醇部分并且提供化合物5。通过氢化铝锂将甲酯还原，并且将形成的醇6溴化以提供溴化物7。用硫代甲苯磺酸钾处理得到期望的建构嵌段硫代甲苯磺酸酯8。

硫代乙酸酯16的合成：

建构嵌段16的合成从4-氨基丁-1-醇开始。胺用Boc基团保护。随后将醇转化成对应的溴化物(10)，然后可将其烷基化到丙二酸二乙酯上以提供双酯11。当在室温下用LiAlH₄处理化合物11时，酯被还原，但Boc基团未被触及。随后通过在催化量的酸的存在下用二甲氧基丙烷处理来保护二醇12，以提供丙酮化物13。在高温下用LiAlH₄处理将Boc部分还原成期望的甲胺(14)。最后，用醛15还原胺化提供硫代乙酸酯16。醛15易于通过一步反应(即硫代乙酸在丙烯醛上的迈克尔加成)获得。

式(XIIa)-前体的整合：

在硫代甲苯磺酸酯8和硫代乙酸酯16之间的二硫化物形成在已知的反应条件下进行，其中乙酸酯被NaOMe原位除去，并且所得硫醇攻击硫代甲苯磺酸酯。丙酮化物的除去和DMT-Cl的随后附接提供18。最终亚磷酰胺的形成得到式(XIIa)-前体。

实验部分：

硫代甲苯磺酸酯8的合成：

向雌酮(252克，0.93mol)于甲苯(1.5L)中的悬浮液中添加三甲氧基甲烷(297g，350mL，2.80mol)、丙-1,3-二醇(213g，250mL，2.80mol)和pTsOH(2g，10mmol)。温热至60℃并且搅拌16小时。添加三乙胺(6mL)和水(600mL)，并且再继续搅拌1小时。分离各相，并且将有机层用水(3×400mL)和盐水洗涤。经Na₂SO₄干燥并且部分浓缩至大约1L。倒入庚烷(4L)中并且滤出白色固体。用庚烷洗涤，在真空中干燥。以88.5％的产率分离呈白色固体状的化合物2(271克，825mmol)。

在0℃下向(13S)-13-甲基-6,7,8,9,11,12,13,14,15,16-十氢螺[环戊[a]菲-17,2'-[1,3]二噁烷]-3-醇(2，60.7g，185mmol)于THF中的溶液中小心地添加氢化铝锂(8.42g，222mmol)，接着分批添加氯化铝(98.6g，739mmol)(非常放热！)。在0℃下搅拌15分钟，然后温热至50℃。在50℃下搅拌2小时(由于在旋转蒸发仪上堵塞)，然后冷却至0℃，并且开始用NH₄Cl(水溶液)(500mL)逐滴淬灭。在室温下搅拌1小时。分离各相，并且将有机层用盐水洗涤，浓缩。获得被***(大约15％)污染的白色固体(65克)。

将粗物质3(89.4克)溶解在丙酮(1.25L)和MeOH(0.2L)中，并且用碳酸钾(60克，435mmol)和溴乙酸甲酯(50mL，435mmol)处理。将悬浮液温热至60℃，并且继续搅拌16小时。基于TLC，所有酚醛部分均已烷基化。将混合物冷却至室温并且过滤。将滤液浓缩并且使用快速色谱法(洗脱剂为20％至30％的EtOAc/庚烷，除去所有杂质，100％EtOAc，以获得期望的物质)另外纯化。以65％的产率分离呈黄色油状的化合物4(56.7克，140.3mmol)。

向化合物4(56.7克，140.3mmol)于THF(1L)中的溶液中添加三苯基膦(55.4克，211mmol)、九氟叔丁醇(30mL)和偶氮二羧酸二叔丁酯(38.5克，167mmol)。当TLC示出完全转化时，将混合物搅拌30分钟。添加庚烷(500mL)，并且将混合物部分浓缩至约500mL。添加更多的庚烷(1L)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。滤出沉淀物，并且将滤液浓缩，得到呈黄色浆液的化合物5。

2-(((13S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙-1-醇(6)

向氢化铝锂(2.0g，53mmol)于THF(300mL)中的冰冷悬浮液中缓慢添加甲酯5(17g，27mmol)于THF(100mL)中的溶液，并且将所得混合物在室温下搅拌2小时。在0℃下缓慢添加KOH(8.5mL，20％水溶液，160mL/mol LiAlH₄)，并且将所得混合物在室温下搅拌30分钟。将混合物经硅藻土过滤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈缓慢结晶的透明油状的醇6(15g，94％)。

(13S,17S)-3-(2-溴乙氧基)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲(7)

向化合物6(15g，25mmol)于DCM(300mL)中的溶液中添加三苯基膦(9.8g，38mmol)和NBS(5.3g，30mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌16小时。将混合物用NaHCO₃洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。向深绿色残余物中添加庚烷(500mL)，并且将所得混合物搅拌30分钟。通过过滤除去固体，并且将滤液浓缩。将混合物溶于庚烷(250mL)中并且搅拌1小时。过滤混合物并且将滤液浓缩，得到呈透明浅黄色油状的溴化物7(15.4g，94.1％)。为了除去残余PPh₃，将物质溶解在Et₂O(300mL)中，并且用KMnO₄水溶液、水和盐水洗涤。有机层经Na₂SO₄干燥并且浓缩。然后通过柱色谱法(5％的EtOAc/庚烷)除去P(O)Ph₃，得到呈透明油状的产物。

S-(2-(((13S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)4-甲基苯硫代磺酸酯(8)

向溴化物7(2.9g，4.4mmol)于DMF(150mL)中的溶液中添加4-甲基苯硫代磺酸钾(2.0g，8.8mmol)，并且将所得混合物在50℃下搅拌16小时并且在室温下搅拌128小时。添加水(500mL)并且将混合物用EtOAc/庚烷(1/1，2×250mL)提取。将组合的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到硫代甲苯磺酸酯8(2.2g，65％)。

硫代乙酸酯14的合成：

(4-羟基丁基)氨基甲酸叔丁酯(9)

向4-氨基丁-1-醇(25g，0.28mol)于DCM(50mL)中的溶液中缓慢添加二碳酸二叔丁酯(61g，0.28mol)于DCM(150mL)中的溶液。将所得混合物搅拌90分钟，之后不再观察到气体产生。将混合物用DCM(200mL)稀释，用1M HCl(400mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的(4-羟基丁基)氨基甲酸叔丁酯(43g，230mmol，82％)。

(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(10)

将(4-羟基丁基)氨基甲酸叔丁酯(7，43g，230mmol)溶解在DCM(500mL)和三苯基膦(90g，340mmol)中并且缓慢添加NBS(45g，250mmol)，同时通过水冷却。将所得混合物在室温下搅拌90分钟。NMR示出完全转化。将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(饱和，300mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩至体积的三分之一。添加庚烷(500mL)，并且在真空中除去剩余DCM。添加额外的庚烷(200mL)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物过滤并且浓缩，得到呈黄色油状的粗制的(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(10，75g，74％)。NMR示出43％的PPh₃和57％的正确产物。

2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)丙二酸二乙酯(11)

向氢化钠(6.8g，0.17mol)于DMF(500mL)中的冰冷悬浮液中缓慢添加丙二酸二乙酯(27g，26mL，0.17mol)，并且将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物再次在0℃下冷却，并且添加(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(10，75g，0.17mol)。使反应混合物达到室温并且搅拌18小时。将反应混合物用1N HCl(300mL)和水(1.3L)淬灭。将混合物用Hept/EtOAc(1/1)(2×250mL)提取。将组合的有机层用盐水(500mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并且浓缩。通过柱色谱法(20％的EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到呈透明油状的化合物11(48g，85％)。NMR示出仍然存在一点丙二酸二乙酯。物质原样用于还原。

(6-羟基-5-(羟基甲基)己基)氨基甲酸叔丁酯(12)

向LiAlH₄(25g，0.66mol)于THF(750mL)中的冰***液中逐滴添加含2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)丙二酸二乙酯(11，48g，0.14mol)的THF(100mL)。将反应混合物在0℃下搅拌2.5小时。通过在0℃下缓慢添加20％的KOH(106mL)来淬灭反应。将所得混合物在室温下搅拌1小时，此后使其经硅藻土过滤。将滤液经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的(6-羟基-5-(羟基甲基)己基)氨基甲酸叔丁酯(12，22.3g，62％)。

(4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(13)

向(6-羟基-5-(羟基甲基)己基)氨基甲酸叔丁酯(12，22.3g，90.2mmol)于THF(300mL)中的溶液中添加2,2-二甲氧基丙烷(28.2g，34mL，270mmol)和4-甲基苯磺酸水合物(3.43g，18.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，之后NMR示出完全转化。将混合物用EtOAc(300mL)稀释，并且用碳酸氢钠饱和溶液(300mL)洗涤。用EtOAc再次提取水层。组合的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并且浓缩，得到呈透明油状的(4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(13，21.6g，83.4％)。

4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)-N-甲基丁-1-胺(14)

向LiAlH₄(4.28g，113mmol)于THF(300mL)中的悬浮液中缓慢添加(4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(13，21.6g，75.2mmol)于THF(100mL)中的溶液。将所得混合物在70℃下回流16小时。将混合物冷却至0℃，之后通过缓慢添加KOH(20％水溶液，18mL)来淬灭反应。将所得混合物在室温下搅拌1小时。将混合物经硅藻土过滤，并且将滤液经Na₂SO₄干燥，然后将其在真空中浓缩，得到呈淡黄色澄清油状的化合物14(13g，86％)。

硫乙酸S-(3-氧代丙基)酯(15)

向丙烯醛(15g，18mL，0.27mol)于DCM(200mL)中的溶液中添加三乙胺(6.8g，9.3mL，67mmol)并且缓慢添加硫代乙酸(20g，19mL，0.27mol)。将所得混合物在室温下搅拌18小时。浓缩混合物，并且通过柱色谱法(15％的EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到呈深黄色/橙色油状的硫乙酸S-(3-氧代丙基)酯(15，26.3g，74％)。

硫乙酸S-(3-((4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)丁基)(甲基)氨基)丙基)酯(16)

向的4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)-N-甲基丁-1-胺(14，9.2g，46mmol)于1,2-二氯乙烷(400mL)和乙酸(11g，10mL，0.18mol)的溶液中添加硫乙酸S-(3-氧代丙基)酯(15 7.2g，55mmol)并且将所得混合物搅拌5分钟。然后，添加三乙酰氧基硼氢化钠(39g，180mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌90分钟。添加饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)以淬灭反应，并且将混合物搅拌15分钟。将混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(300mL)稀释，并且分离各相。水相用二氯甲烷提取，并且将组合的有机相用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用柱色谱法(40-50％的EtOAc/庚烷+1％的NEt₃)纯化粗物质，得到呈橙色油状的硫乙酸S-(3-((4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)丁基)(甲基)氨基)丙基)酯(16，11.5g，79％)。

式(XIIa)-前体的合成：

4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)-N-(3-((2-(((13S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)二硫烷基)丙基)-N-甲基丁-1-胺(17)

向硫代甲苯磺酸酯8(3.3g，4.3mmol)和硫代乙酸酯16(2.3g，7.4mmol)于DCM(200mL)和MeOH(20mL)中的溶液中添加含甲醇钠(0.47g，1.6mL，8.7mmol)的MeOH。将所得混合物搅拌2小时。NMR示出硫代甲苯磺酸酯被完全消耗。将混合物用DCM(200mL)稀释，用NaHCO₃洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。通过柱色谱法(10％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃)纯化粗物质，得到呈透明油状的二硫化物17(0.85g，22％)。

2-(4-((3-((2-(((13S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)二硫烷基)丙基)(甲基)氨基)丁基)丙-1,3-二醇

向丙酮化物17(2.1g，2.3mmol)于MeOH(100mL)中的溶液中添加甲基苯磺酸(530mg，2.8mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌1小时，此后TLC示出完全转化。在真空中除去挥发物。将粗物质溶解在DCM(100mL)中，用NaHCO₃洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈白色固体状的产物(1.7g，2.0mmol，87％)。

2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-6-((3-((2-(((13S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)二硫烷基)丙基)(甲基)氨基)己-1-醇(18)

向二醇(1.7g，2.0mmol)、三乙胺(0.25g，0.34mL，2.4mmol)和DMAP(25mg，0.20mmol)于DCM(100mL)中的溶液中添加4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(0.68g，2.0mmol)，并且将所得黄色混合物在室温下搅拌16小时。将混合物用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。通过柱色谱法(25％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃)纯化粗物质，得到呈透明油状的产物18(1.3g，1.1mmol，56％)。

2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-6-((3-((2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)乙基)二硫烷基)丙基)(甲基)氨基)己基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(Apo-Si-K-113)

向化合物18(1.3g，1.1mmol)于DCM(100mL)中的溶液中添加N-甲基吗啉(0.15g，3.0mL，1.5mmol)和TFA(84mg，3.0mL，0.74mmol)于DCM(0.5M NMM，0.25M TFA)中的溶液。然后，添加3-((双(二异丙基氨基)膦酰基)氧基)丙腈(0.45g，0.47mL，1.5mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌2小时，并且通过TLC监测反应。在完全转化后，将混合物用NaHCO₃洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用柱色谱法(15％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃)纯化粗物质，得到呈透明油状的Apo-Si-K-113(1.5g，1.1mmol，98％)。

实例2i：用于合成式(XIIb)-前体的方法：

式(XIIb)-前体的合成根据以下合成流程进行：

实例2j：用于合成式(XIIIa)-前体的方法：

式(XIIIa)-前体的合成根据以下合成流程进行：

实例2k：用于合成式(XIIIb)-前体的方法：

式(XIIIb)-前体的关键特征为二硫化物和类固醇部分之间的醚基。在二硫化物的另一侧，存在另一种醚以及叔胺。

硫代甲苯磺酸酯10的合成：

合成通过用1,3-丙二醇保护酮来开始以提供高纯度的化合物2。缩醛的LiAlH₄和AlCl₃开环得到化合物3和***的比率为大约85:15的混合物，后者反应性较低并且将在下一步中除去。烯丙基溴被用作反应性亲电试剂。在苯酚上的选择性烷基化允许随后使用Mitsunobu条件将全氟化叔丁醇附接在脂族醇上，以提供化合物5。通过9-BBN处理另外官能化烯丙基，并且随后还原以提供醇6。此醇可用重氮乙酸乙酯加长以提供化合物7。还原为醇，转化成对应的碘化物，并且随后的硫代甲苯磺酰化提供化合物10。

硫代乙酸酯18的合成：

合成建构嵌段18的第一步为保护氨基丁醇的胺以提供醇11。随后通过用NBS和PPh₃处理将醇转化成溴化物12。然后将溴化物烷基化到丙二酸二乙酯上以提供二酯13。在室温下用LiAlH₄处理还原酯，但没有还原Boc-基团，由此得到二醇14。然后将二醇保护为丙酮化物(15)。通过在高温下用LiAlH₄处理还原Boc-基团以提供胺16。胺用适当的氯化物烷基化提供化合物17。使用Mitsunobu条件将羟基部分转化成硫代乙酸酯，以提供建构嵌段18。

式(XIIIb)-前体的合成：

硫代甲苯磺酸酯10和硫代乙酸酯18的混合物用NaOMe处理，以提供二硫化物19。通过用酸处理除去丙酮化物基团以提供二醇20。将DMT基团附接到醇中的一个上，以得到化合物21。最后，亚磷酰胺的形成提供式(XIIIb)-前体。

实验部分：

硫代甲苯磺酸酯10的合成：

向雌酮(252克，0.93mol)于甲苯(1.5L)中的悬浮液中添加三甲氧基甲烷(297g，350mL，2.80mol)、丙-1,3-二醇(213g，250mL，2.80mol)和pTsOH(2g，10mmol)。将混合物温热至60℃并且搅拌16小时。添加三乙胺(6mL)和水(600mL)并且再继续搅拌1小时。分离各相，并且将有机层用水(3×400mL)和盐水洗涤。将混合物经Na₂SO₄干燥并且部分浓缩至大约1L。将混合物倒入庚烷(4L)中并且滤出白色固体，用庚烷洗涤并且在真空中干燥。以88.5％的产率分离呈白色固体状的化合物2(271克，825mmol)。

在0℃下向(13S)-13-甲基-6,7,8,9,11,12,13,14,15,16-十氢螺[环戊[a]菲-17,2'-[1,3]二噁烷]-3-醇(2，60.7g，185mmol)于THF中的溶液中小心地添加氢化铝锂(8.42g，222mmol)，接着分批添加氯化铝(98.6g，739mmol)(非常放热！)。在0℃下搅拌15分钟，然后温热至50℃。在50℃下搅拌2小时(由于在旋转蒸发仪上堵塞)，然后冷却至0℃，并且开始用NH₄Cl(水溶液)(500mL)逐滴淬灭。在室温下搅拌1小时。分离各相，并且将有机层用盐水洗涤，浓缩。获得白色固体(65克)，其被***(大约15％)污染。

3-(((8R,9S,13S,14S,17S)-3-(烯丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-17-基)氧基)丙-1-醇(4)

用烯丙基溴(7.39g，5.28mL，61.1mmol)处理化合物3(10.1g，30.6mmol)和碳酸钾(8.45g，61.1mmol)于MeOH/丙酮中的悬浮液。加热至回流4小时，然后观察到完全转化。冷却至室温，过滤并且浓缩。添加二氯甲烷(250mL)并且用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。

粗物质(12.8克，34.5mmol)原样用于后续化学反应中：

(8R,9S,13S,14S,17S)-3-(烯丙氧基)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲(5)

向化合物4(12.78g，34.49mmol)和三苯基膦(13.57g，51.74mmol)于THF(300mL)中的溶液中添加1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-醇(12.21g，7.23mL，51.74mmol)和(E)-二氮烯-1,2-二羧酸二叔丁酯(10.32g，44.84mmol)。将混合物在室温下搅拌16小时，并且然后浓缩。

在使用快速色谱法(梯度为5％至10％的EtOAc/庚烷)纯化后，以82％的产率分离呈淡黄色油状的化合物5(16.7g，28.4mmol)。

3-(((8R,9S,13S,14S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)丙-1-醇(6)

在0℃下将9-BBN(5.54g，90mL，45.4mmol)逐滴添加到粗化合物5(16.7g，28.4mmol)于THF(250mL)中的溶液中，并且在完全添加后，将混合物在室温下搅拌过夜。将溶液冷却至0℃，并且同时缓慢逐滴添加氢氧化钠(20g，16mL，148mmol)和过氧化氢(14g，13mL，148mmol)，并且将所得非均相混合物在室温下剧烈搅拌大约1小时。将反应混合物倾析并且在EtOAc(700mL)和盐水(100mL)之间分配。将有机相用额外量的盐水(100mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并且在真空中浓缩。通过快速色谱法(硅胶，梯度为25％至35％的EtOAc/庚烷)的浓缩物的另外纯化以79.0％的产率得到化合物6(13.6g，22.4mmol)。

2-(3-(((8R,9S,13S,14S,17S)17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)丙氧基)乙酸乙酯(7)

将化合物6(13.6g，22.4mmol)和2-重氮乙酸乙酯(3.0g，2.8mL，22.4mmol)溶解在DCM(250mL)中，并且在0℃下添加BF₃.OEt₂(31.8mg，28.4μL，224μmol)。将反应在0℃下搅拌15分钟，并且在室温下搅拌3小时，直到没有观察到更多的气体产生。基于TLC，没有观察到完全转化。添加更多的2-重氮乙酸乙酯(5mL)和BF₃.OEt₂并且继续搅拌2小时。将混合物用DCM(200mL)稀释，添加三乙胺(1mL)并且将混合物用水(100mL)和盐水(50mL)洗涤，并且经Na₂SO₄干燥。在真空中除去溶剂并且使用快速色谱法(梯度为5％至10％的EtOAc/庚烷)另外纯化，以35％的产率得到呈透明的淡黄色油状的化合物7(5.5g，7.9mmol)。

2-(3-(((8R,9S,13S,14S,17S))-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)丙氧基)乙-1-醇(8)在0℃下向LiAlH₄(0.36g，9.5mmol)于THF(100mL)中的悬浮液中逐滴添加化合物7(5.5g，7.9mmol)的溶液。将混合物在室温下搅拌2小时，然后通过添加含20％的KOH的水(1.7mL)来淬灭。将悬浮液再搅拌1小时，然后经短路径的硅藻土过滤。浓缩。化合物8(4.81g，7.4mmol)以93％的产率分离并且原样用于后续化学反应中。

(8R,9S,13S,14S,17S)-3-(3-(2-溴乙氧基)丙氧基)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲(9)

在0℃下向化合物8(4.81g，7.39mmol)、咪唑(604mg，8.87mmol)和三苯基膦(2.33g，8.87mmol)于二氯甲烷(250mL)中的溶液中添加碘(2.06g，8.13mmol)。将混合物搅拌16小时，然后添加饱和硫代硫酸钠水溶液，并且分离各相。将有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。将残余物溶解在庚烷中，静置沉淀，并且滤出固体。浓缩。

使用快速色谱法(5％的EtOAc/庚烷)另外纯化以69％的产率得到呈透明油状的化合物9(3.90g，5.13mmol)。

S-(2-(3-(((8R,9S,13S,14S,17S)17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)丙氧基)乙基)4-甲基苯硫代磺酸酯(10)

将化合物9(3.90g，5.13mmol)溶解在DMF中，并且添加4-甲基苯硫代磺酸钾(1.72g，7.6mmol)。将悬浮液在室温下搅拌16小时。TLC仅示出部分转化。将混合物温热至50℃持续4小时，并且然后冷却至室温。添加EtOAc(50mL)，接着添加庚烷(100mL)，并且用水洗涤3次，然后用盐水洗涤一次，经硫酸钠干燥并且浓缩。使用快速色谱法(5％至15％的EtOAc/庚烷)另外纯化。以83％的产率分离呈透明油状的化合物10(3.45g，4.2mmol)。

硫代乙酸酯18的合成：

(4-羟基丁基)氨基甲酸叔丁酯(11)

向4-氨基丁-1-醇(25g，0.28mol)于DCM(50mL)中的溶液中缓慢添加二碳酸二叔丁酯(61g，0.28mol)于DCM(150mL)中的溶液。将所得混合物搅拌90分钟此后不再观察到气体产生。将混合物用DCM(200mL)稀释，用1M HCl(400mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的(4-羟基丁基)氨基甲酸叔丁酯(11，43g，82％)。

(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(12)

向(4-羟基丁基)氨基甲酸叔丁酯(11，23g，120mmol)于DCM(500mL)中的溶液中添加三苯基膦(44g，170mmol)并且缓慢添加NBS(25g，143mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2小时。将混合物用NaHCO₃洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。添加庚烷(500mL)，并且将混合物在室温下搅拌1小时。将形成的固体通过过滤除去并且将滤液浓缩，得到呈透明油状的(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(12，32.8g，130mmol，定量)。

2-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)丙二酸二乙酯(13)

向氢化钠(6.8g，0.17mol)于DMF(500mL)中的冰冷悬浮液中缓慢添加丙二酸二乙酯(27g，26mL，0.17mol)，并且将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物再次冷却至0℃，并且添加(4-溴丁基)氨基甲酸叔丁酯(12，75g，0.17mol)。使反应混合物达到室温，并且搅拌18小时。将反应混合物用1N HCl(300mL)和水(1.3L)淬灭。将混合物用庚烷/EtOAc(1/1，2×250mL)提取。将组合的有机层用盐水(500mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并且浓缩。通过柱色谱法(20％的EtOAc/庚烷)纯化粗物质，得到呈透明油状的二酯13(48g，0.14mmol，85％)。

(6-羟基-5-(羟基甲基)己基)氨基甲酸叔丁酯(14)

向LiAlH₄(8.7g，0.23mol)的于THF(750mL)中冰***液中逐滴添加含二酯13(19g，57mmol)的THF(100mL)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过在0℃下缓慢添加20％的KOH(水溶液，37mL)来淬灭反应。将所得混合物在室温下搅拌1小时，此后使其经硅藻土过滤。滤液经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的二醇14(12g，50mmol，86％)。

(4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(15)

向二醇14(22g，90mmol)于THF(300mL)中的溶液中添加2,2-二甲氧基丙烷(28g，34mL，270mmol)和4-甲基苯磺酸水合物(3.4g，18mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。将混合物用EtOAc(300mL)稀释，并且用碳酸氢钠饱和溶液(300mL)洗涤。将水层用EtOAc再次提取。组合的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并且浓缩，得到呈透明油状的丙酮化物15(21.6g，83.4％)。

4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)-N-甲基丁-1-胺(16)

向LiAlH₄(2.2g，58mmol)于THF(300mL)中的悬浮液中添加丙酮化物15(11g，39mmol)，并且将所得混合物在70℃下搅拌16小时。使混合物冷却至室温。然后，将混合物冷却至0℃，并且通过在0℃下缓慢添加KOH(20％，9.3mL)来淬灭反应。将所得混合物在室温下搅拌1小时。将混合物经硅藻土过滤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的甲胺16(7.8g，39mmol，定量)。

2-(2-((4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)丁基)(甲基)氨基)乙氧基)乙-1-醇(17)

向胺16(4.1g，20mmol)于MeCN(150mL)中的溶液中添加2-(2-氯乙氧基)乙-1-醇(2.5g，2.1mL，20mmol)、碘化钾(0.34g，2.0mmol)和碳酸钾(5.6g，41mmol)并且将所得混合物在80℃搅拌40小时。将混合物用水(100mL)和NaHCO₃(100mL)稀释，并且用DCM(2×200mL)提取。将组合的有机层用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用柱色谱法(3％的7M NH3/MeOH:97％的DCM)纯化粗物质，得到呈浅黄色油状的醇17(2.9g，10mmol，49％)。

硫乙酸S-(2-(2-((4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)丁基)(甲基)氨基)乙氧基)乙基)酯(18)

向醇17(2.9g，10mmol)于THF(100mL)中的溶液中添加三苯基膦(4.2g，16mmol)和(E)-二氮烯-1,2-二羧酸二叔丁酯(3.0g，13mmol)，并且将所得混合物搅拌5分钟。然后，添加硫代乙酸(0.99g，0.94mL，13mmol)，并且将混合物大部分脱色。将所得混合物在室温下搅拌16小时。浓缩反应混合物，并且通过柱色谱法(20％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃)纯化粗物质，得到呈黄色油状的硫代乙酸酯18(3.5g，10mmol，定量)。

式(XIIIb)-前体的整合：

4-(2,2-二甲基-1,3-二噁烷-5-基)-N-(2-(2-((2-(3-(((13S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)丙氧基)乙基)二硫烷基)乙氧基)乙基)-N-甲基丁-1-胺(19)

向硫代甲苯磺酸酯10(1.1g，1.3mmol)和硫代乙酸酯18(0.70g，2.0mmol)于DCM(100mL)和MeOH(10mL)中的溶液中添加甲醇钠(5.4M，0.50mL，2.7mmol)的溶液。将所得混合物搅拌1小时。将混合物用DCM(100mL)稀释，用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。通过柱色谱法(10-20％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃)纯化粗物质，得到呈透明油状的二硫化物19(0.58g，0.6mmol，45％)。

2-(1-(((13S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-14-甲基-4,11-二氧杂-7,8-二硫杂-14-氮杂十八烷-18-基)丙-1,3-二醇(20)

向二硫化物20(0.58g，0.60mmol)于MeOH(50mL)中的溶液(添加额外的DCM以溶解)中添加对甲苯磺酸(0.14g，0.72mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌1小时。浓缩混合物，并且将残余物溶解在DCM(100mL)中。将混合物用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈透明油状的二醇20(0.53g，0.57mmol，95％)。

19-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-1-(((13S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-14-甲基-4,11-二氧杂-7,8-二硫杂-14-氮杂二十烷-20-醇(21)

向二醇20(1.0g，1.1mmol)于DCM(50mL)中的溶液中添加三乙胺(0.22g，0.30mL，2.2mmol)、DMAP(13mg，0.11mmol)，并且最后添加4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(0.36g，1.1mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌16小时。将混合物用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。通过柱色谱法(20-25％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃，使用用NEt₃预处理的二氧化硅)纯化粗物质，得到呈透明的淡黄色油状的化合物21(0.96g，0.78mmol，72％)。

19-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-1-(((13S,17S)-17-(3-((1,1,1,3,3,3-六氟-2-(三氟甲基)丙-2-基)氧基)丙氧基)-13-甲基-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-十氢-6H-环戊[a]菲-3-基)氧基)-14-甲基-4,11-二氧杂-7,8-二硫杂-14-氮杂二十烷-20-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺[式(XIIIb)-前体].

向醇21(0.96g，0.78mmol)于DCM(50mL)中的溶液中添加3-((双(二异丙基氨基)膦酰基)氧基)丙腈(0.31g，0.32mL，1.0mmol)和NMM和TFA(2.0mL，0.5M NMM和0.25M TFA，1.3当量NMM)于DCM中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌2小时，此后TLC示出部分转化。添加额外的膦酰基(0.5当量)和NMM/TFA溶液(0.5当量NMM)并且将混合物搅拌1小时。TLC示出完全转化。将混合物用NaHCO₃和盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩。使用柱色谱法(20％的丙酮/庚烷+1％的NEt₃，使用用NEt₃预处理的二氧化硅)纯化粗物质，得到呈透明油状的式(XIIIb)-前体(0.96g，0.67mmol，86％)。

实例2L：式(XIV-F)前体的合成：

从化合物3开始酚可使用溴化物K-105-F-1进行烷基化(参见下文)。全氟部分然后可使用Mitsunobu条件引入(K-150-F-3)。酰胺和酯将同时被还原，并且然后可用Boc-基团保护形成的仲胺。使用Mitsunobu条件的硫代乙酸酯基团的最终引入将提供建构嵌段K-150-F-6。

朝向期望的建构嵌段K-150-F的最快途径为将1,5-二氧杂环庚烷-2-酮用β-丙氨酸开环。用β-丙氨酸开环提供酰胺K-150-F-7。用EtOH酯化保护羧酸。随后将醇转化成溴化物m以提供建构嵌段K-105-F-1，然后将其烷基化到酚上。

式(XIV-F)前体的整合

组装开始于在建构嵌段K-150-F-6和硫代甲苯磺酸酯6之间的二硫化物形成。然后，将通过用酸处理同时除去丙酮化物部分和Boc-基团。然后，游离的仲胺可用Fmoc基团保护。随后的DMT附接和亚磷酰胺的形成将提供式(XIV-F)前体。

实例2m：式(XV-F)前体的合成：

式(XV-F)前体将由硫代甲苯磺酸酯13(流程22)和建构嵌段7(流程23)制备：

第二建构嵌段化合物7将如流程23所示合成：

式(XV-F)-前体的合成的整合和完成：

实例2n：用于合成式(VIII-F)前体的方法：

合成开始于关键建构嵌段硫代甲苯磺酸酯16的合成，其根据以下流程25进行：

然后，合成继续根据以下合成流程26进行的硫代乙酸酯K-93-F-4的合成：

化合物F-2被Teoc保护，以95％的产率得到化合物F-3。硫代乙酸酯F-4的合成以大约60％的产率进行。分离1.76克。具有硫代甲苯磺酸酯16和硫代乙酸酯K-93-F-4的关键片段，然后根据以下流程27进行合成：

首先，硫代甲苯磺酸酯16和硫代乙酸酯K-93-F-4的片段与二硫键的生成结合，以提供中间体K-95-F-5。用含pTsOH的MeOH处理F-5以释放二醇，从而生成F-6(93％的产率；1.3克)。然后将F-6用DMT-Cl单保护以提供化合物F-8。然后附接亚磷酰胺，根据式(VIII-F)-前体(Teoc)的化合物以1.004克分离并且存储在小瓶中用于运输。值得注意的是，作为保护基团的Teoc对酸、碱以及还原剂和氧化剂相对稳定，但是可通过添加氟化物易于除去，由此使其在寡核苷酸的合成期间可用作胺的保护基团。因此，在本发明的E部分的合成中，此保护基团可在仲胺的生成中起作用，如根据式(VIII-H)、(XIV-H)和(XV-H)的化合物中所配置的。

实例2p：用于合成式(XVI-F)前体的方法：

合成与式(XV-F)前体的合成相同，如实例2m中所述；除了两个例外：(i).用于L部分的起始物质为五氟苯甲酸酯(A)，而不是二氟苯甲酸酯(B)。(ii)，胺的保护基团为TEOC，其如实例2n所述配置；

实例3：本发明的缀合物的潜在作用机制(MOA)为跨膜递送中的Dicer底物：

本文以非限制性方式描述包含OD的本发明的缀合物的潜在作用机制。所述MOA包含四个步骤：

1.缀合物与外膜小叶的相互作用：

当本发明的缀合物为连接到2-3个E部分的siRNA或dsiRNA时，缀合物在一定位置接近膜的外部小叶，在所述位置中圆柱形RNA双链体平行于膜表面，并且E、E'或E”部分朝向膜芯、垂直于膜表面取向。此方法用以将OD锚定到膜表面。由此产生的高度带负电荷的RNA被迫接近外膜小叶，导致能量上不利的局部膜应变、外磷脂小叶的表面积扩大和磷脂头部基团的水合壳受到干扰，所有这些导致膜的局部弯曲。

2.弯曲能量的松弛：

不利的膜弯曲的松弛可通过胞吞、翻转或两者发生。这两个过程都支持直接或通过内体区室将包含大分子药物的本发明的缀合物跨膜递送到细胞质中的引发和/或传播。

3.在细胞质内的E、E'或E”部分在氧化还原介导的过程中的脱离，同时释放货物药物。

尽管siRNA或dsiRNA缀合物的跨膜通过需要如上所述的一个或多个E、E'或E”部分，但一旦缀合物到达细胞质，就期望除去这些递送部分，并且将它们从身体内排出，从而释放货物药物以接近其细胞质作用位点。在货物药物为siRNA或dsiRNA的情况下，此裂解使得能够避免siRNA或dsiRNA与基因沉默蛋白复合物(Dicer和RISC)的相互作用中的空间位阻。另外，货物药物与E部分的这类脱离将使缀合物在细胞磷脂膜上的负担降到最低，这从安全性角度来看将为有利的措施。为此目的，本发明的E部分包含二硫化物部分。在氧化条件下，如在细胞外环境中占优势的那些条件下，二硫化物表现出高稳定性，并且因此使得本发明的缀合物在其体内全身施用后能够广泛分布在身体内并且接触巨大的细胞膜池。

相比之下，细胞质主要由于其高浓度的还原型谷胱甘肽(GSH)而为高度还原性环境，所述还原型谷胱甘肽在任何活细胞的细胞质内连续生成，细胞质中的所述还原型谷胱甘肽比细胞外空间高约三至四个数量级：1-5mM对3-5μM。

由于细胞质内这些显著的还原条件，E部分的二硫化物基团在细胞质环境中经历稳健的还原。因此，存在货物药物(例如，dsiRNA)的释放，以在细胞质中的其靶标位点处(例如，在用于基因沉默的Dicer和/或RISC蛋白复合物处)发挥其药理作用。在二硫键裂解后，本发明的E部分经由胆汁和/或尿直接地或在代谢(例如，肝脏中的细胞色素-P-450介导的羟基化或葡糖苷酸化)后从身体中排出，类似于其它基于固醇的分子(例如，***)。

4.释放的OD与细胞质位点相互作用以进行基因沉默，

在图2A、2B、2C、2D和2E中非限制性地举例说明本发明的缀合物的上述MOA。举例说明的为根据[Cn-1-(III)]的缀合物，其中E和E'各自具有根据式(III)的结构。W根据式(II¹)。举例说明的RNA双链体为25/27个核苷酸长的Dicer底物，具有连接到每条链的5'-末端的磷酸酯基团。在跨膜递送后，在到达细胞质后，由于明显的还原性环境条件，发生E、E'和E”部分的裂解和除去，每个E部分留下短的残端，仍然连接到RNA双链体，包含连接到短的烃链的硫醇基团(图2B)。然后，RNA双链体与Dicer核酸内切酶相互作用。这种相互作用通过以下来引发：具有2个核苷酸突出端的引导(反义)链双链体的3'-末端与Dicer蛋白的疏水性口袋的结合；以及过客(有义)链的磷酸酯基团与蛋白质表面上相应的带正电荷的口袋的相互作用。这种锚定将RNA双链体定位在蛋白质表面上，并且使得酶能够进行RNA双链体的精确的双链断裂，留下21/21个核苷酸的双螺旋，在过客(有义)链上留下两个E残端(图2C)。图2D展示随后通过解旋酶(能够分离RNA链的细胞质酶)除去有义链。此作用除去E部分的残余残端，由此释放完整的反义链，以进入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，以便诱导期望的基因沉默(图2E)。

实例4：在静脉内施用后，在鼠模型中，在体内，本发明的缀合物在诱导基因沉默中的生物学性能：

目的：

展示包含连接到本发明的两个E部分的dsiRNA的本发明的缀合物在静脉内施用时诱导基因沉默的能力。

方法：

1).缀合到本发明的E部分的dsi-RNA双链体：

利用25/27个核苷酸长的dsiRNA双链体，其被设计成使APOC3基因沉默。此RNA双链体在每条链的5'-末端处连接到具有如下所述的结构的根据式(IX)的本发明的E部分。APOC3基因编码APOC3蛋白，即由肝脏合成的蛋白，并且其在三酸甘油酯的分布和代谢中具有关键作用。APOC3的表达主要限于肝脏和肾脏。

用于实验的E部分根据式(IX)。E部分由Syncom BV(荷兰(Netherlands))作为前体分子合成，其具有DMT和亚磷酰胺作为保护基团。Apo-Si-APOC3-dsiRNA缀合物由集成DNA技术(Integrated DNA Technologies)(IDT，比利时鲁汶(Leuven,Belgium))合成，如上面实例1中所述。其为[Cn-1-(IX)]-APOC3-dsiRNA缀合物，即其包含两个E部分，每个E部分具有如式(IX)中所阐述的结构，缀合到dsiRNA，用于使APOC3基因沉默。因此，缀合物具有以下结构：

在本研究中使用的遗传序列为：

靶标ApoC3-dsiRNA-缀合物：

有义链的序列：

/5'-(IX)/mGmGrAmUrGmGrArCrArArUmCrAmCrUmUrCmArGrArUrCrCCT；

反义链的序列：

/5'(IX)/rArGmGrGrArUrCrUmGrAmArGmUrGrArUrUrGrUrCrCrAmUrCmCmAmG；

其中m意指甲基化，并且r意指核糖核苷酸。

对照#1：裸ApoC3-dsiRNA缀合物(RNA双链体，具有对使ApoC3基因沉默具有特异性的序列，但缺少Apo-Si分子纳米马达递送***)。

有义链的序列：

mGmGrAmUrGmGrArCrA rArUmCrAmCrUmUrCmA rGrArU rCrCCT；

反义链的序列：

rArGmG rGrArU rCrUmG rAmArG mUrGrA rUrUrG rUrCrCrAmUrCmCmAmG。

对照#2：[Cn-1-(IX)]-KRAS-dsiRNA缀合物；(非相关RNA序列，缀合到Apo-Si分子纳米马达递送***)。

有义链的序列：

/5'-(IX)/mAmArGmGrUmGrUrArCrArGmUrUmArUmGrUmGrArArUrArCTT；

反义链的序列：

/5'-(IX)/rArAmGrUrArUrUrCmArCmArUmArArCrUrGrUrArCrArCmCrUmUmGmU。

对照#3：媒剂；用于注射的含5％的葡萄糖的水溶液。

2).配方：

将所有一种或多种测试和对照制品溶解在用于注射的无菌水中，不含RNase，含有5％的葡萄糖。在施用前新鲜制备5mg/ml的储备溶液。

3).动物护理和居所：

BALB/c小鼠(雄性，22-29克)获自Envigo(以色列有限公司(Israel Ltd.))。在进行实验之前，将小鼠保持在12小时的日/夜循环条件下，随意喂养，并且使其适应至少3天。每个实验组包含7只动物。

4).研究设计：

研究包括如下4个处理组：(i).媒剂：用于注射的含5％的葡萄糖的水；(ii).用于ApoC3的“裸”dsiRNA(在不附接分子纳米马达部分的情况下)；(iii).[Cn-1-(IX)]-KRASdsiRNA缀合物(非相关RNA序列，缀合到Apo-Si分子纳米马达递送***)；(iv).靶标[Cn-1-(IX)]-ApoC3 dsiRNA缀合物。

每个研究组包含5-7只小鼠。小鼠静脉内(i.v.)注射3次连续日剂量，每次剂量为50mg/Kg，通过尾部静脉注射，剂量体积为10ml/Kg。方案未经修改地由Wolfram,C等人(《自然生物技术(Nat Biotechnol)》.25:1149-57,2007)采用。在第4天，在最后一次给药后24小时，称重小鼠，使用CO₂麻醉处死，收获肝脏并且立即进行RNA提取。

5).RNA提取和qRT-PCR：

提取10-100mg的肝脏样品，并且将其浸泡在TRIzol试剂中。然后在不锈钢珠(0.9-2.0mm)的存在下，通过子弹混合器均质器(Next Advance)将组织均质化。将混合物短暂离心以除去碎片和子弹。根据制造商的说明，使用PureLink RNA迷你试剂盒(英杰公司(Invitrogen))提取总RNA。使用infinite M200-Pro Multimode Reader(帝肯(Tecan))定量RNA。RNA用高容量cDNA逆转录试剂盒(美国应用生物***公司(ABI))逆转录，并且ApoC3mRNA表达用Taqman qRT-PCR程序测量，将其标准化为β-肌动蛋白(Step-one-Plus，美国应用生物***公司)。

6).数据分析

使用Microsoft Excel软件进行数据分析。组间的统计学显著性使用不成对的Student t测试(双尾)评估，显著性确定为p<0.05。数据呈现为平均值±SD。

结果：

如图3A所示，[Cn-1-(IX)]-ApoC3 dsiRNA缀合物诱导ApoC3基因表达的显著敲低(40％)。与所有其它实验组相比，基因表达的这种减少在统计学上为高度显著的。

如图3B所示，在肾脏中也观察到ApoC3基因表达的在统计学上显著的敲低(21％)。重要的是，在肾脏中，与所有三个对照组相比，此差异在统计学上也为显著的。

结论：

包含两个E部分的本发明的缀合物连接到被设计成使ApoC3基因的表达沉默的dsiRNA，在体内全身静脉内施用时，在肝脏和肾脏两者中诱导靶标基因表达的选择性敲低中表现出显著活性。这些结果支持这样的概念：Apo-si药物递送***具有全身性的活动模式：在静脉内施用时，缀合到dsiRNA的Apo-Si***使得能够全身性分布遗传药物，以及相应的多器官和特异性基因沉默。

实例5：本发明的缀合物在体外基因沉默中的生物学性能，其中E和E'各自根据式 (IV)：

研究目的：

评价本发明的缀合物[Cn-1-(IV)]-EGFP-dsiRNA在体外使EGFP基因的表达沉默时的性能，所述缀合物包含各自具有如式(IV)中所阐述的结构并且连接到EGFP特异性dsiRNA的E和E'部分。

方法：

dsiRNA双链体：

siRNA双链体为Dicer底物，其被设计成使EGFP基因沉默。如式(IV)中所阐述的结构的E部分在每条RNA链的5'-末端处与其附接。因此，本研究中使用的缀合物为具有以下结构的[Cn-1-(IV)]-EGFP-dsiRNA：

核苷酸序列如下：

有义：5'-phos/iApo-Si-K103A/mAmCrCmCrUmGrArArGrUrUmCrAmUrCmUrGmCrArCrCrArCmCGrUrCrA

反义：5'-phos/iApo-Si-K103A/rCrGmGrUrGrGrUrGmCrAmGrAmUrGrArArCrUrGmGrGmUmCmA

体外研究：Hela-GFP细胞系获自细胞生物实验室(Cell Biolabs)。使细胞在补充有10％的FBS(吉毕科公司(Gibco))、100U/ml的青霉素100mg/ml的链霉素(以色列的生物工业公司(Biological Industries,Israel))和10μg/ml的杀稻瘟素的杜氏改良伊格尔培养基(吉毕科公司)中生长。将细胞维持在具有5％的CO2加湿空气的37℃的孵育箱中。在转染前一天，将细胞接种(40,000个细胞/孔)在24孔黑色玻璃底板上。第二天，在10％血清存在下，将细胞暴露于缀合物[Cn-1-(IV)]-EGFP-dsiRNA。对于无血清转染，吸出培养基，将细胞用汉克平衡盐溶液(HBSS)洗涤，并且然后将培养基用无血清的Opti-MEM(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))替代持续24小时，接着添加血清再孵育48小时。转染后72小时测量蛋白表达的下调。为此目的，吸出培养基，并且将细胞用HBSS洗涤。EGFP荧光强度通过Infinite M200-Pro Multimode Reader(帝肯)进行定量，激发波长为488nm，发射波长为535nm。未处理的细胞用作对照。实验以一式三份进行，结果呈现为平均值±SD，组间差异通过双尾t测试评估，并且统计学显著性被定义为p<0.05。

结果：

[Cn-1-(IV)]-EGFP-dsiRNA缀合物诱导EGFP表达的有效敲低，如下所示：

在血清的存在下，600nM的缀合物将EGFP表达降低至对照的73.7％±1.3(平均值±SD)。在无血清条件下，当细胞分别用10、40和150nM的缀合物处理时，稳健的EGFP敲低由缀合物以剂量依赖性方式诱导，其中EGFP表达被降低至对照的55.0％±2.6％、29.9％±0.5％和7.4％±0.6％(在所有组间比较中p<0.001)。

结论：

本发明的缀合物[Cn-1-(IV)]-EGFP-dsiRNA为用于将大分子dsiRNA构建体跨越磷脂膜递送到细胞中并且用于显著基因沉默的相应诱导的有效部分。

实例6：包含各自根据式(VIII-M)的E、E'和E'的本发明的缀合物在体外基因沉默中的生物学性能；剂量/响应研究：

研究目的：

评价本发明的缀合物[Cn-2-(VIII-M)]，即具有各自根据式(VIII-M)并且连接到25/27个核苷酸的Dicer底物双链体的E、E'和E”部分的dsiRNA的体外生物学性能，被设计成使EGFP基因沉默。

方法：

缀合物[Cn-2-(VIII-M)]的结构如下：

细胞培养：

Hela-GFP和3T3细胞系获自细胞生物实验室。使每种细胞类型的细胞在补充有10％的FBS(吉毕科公司)、100U/ml的青霉素100mg/ml的链霉素(以色列的生物工业公司)和10μg/ml的杀稻瘟素的杜氏改良伊格尔培养基(吉毕科公司)中生长。将细胞维持在具有5％的CO2加湿空气的37℃的孵育箱中。在转染前一天，将细胞接种(40,000个细胞/孔)在24孔黑色板玻璃底部上。第二天，细胞开始用缀合物[Cn-2-(VIII-M)]孵育72小时，浓度为2nM、10nM、20nM、40nM、80nM、150nM和300nM，其中前24小时在无血清的Opti-MEM培养基(赛默飞世尔科技)中孵育，接着在包含10％的血清的培养基中再孵育48小时。转染后72小时测量蛋白表达的下调。为此目的，吸出培养基，并且将细胞用HBSS洗涤。EGFP荧光强度通过Infinite M200-Pro Multimode Reader(帝肯)进行定量，激发波长为488nm，发射波长为535nm。未处理的细胞用作对照。实验以一式三份进行，结果呈现为平均值±SD。使用GraphPad，Prism-5软件绘制基因表达对缀合物浓度的曲线并且计算曲线拟合。

结果：

如图4A和4B所示，对于Hela细胞和3T3细胞两者，观察到明显的剂量/响应，具有高度显著的对数衰减，对两种细胞系用R²≈0.95曲线拟合。对于Hela细胞，IC₅₀发现为13.54nM，与3T3细胞类似，后者表现出的IC₅₀为19.25nM。

结论：

如在体外两个细胞系中检查的，缀合物[Cn-2-(VIII-M)]-EGFP表现出稳健递送到培养基中的细胞中，以及基因沉默的有效诱导，如通过蛋白质水平的评价所评估的。观察到的低纳摩尔EC₅₀值支持这样的概念：每个双链体附接三个E部分的缀合物的设计对于实现基因沉默中的有效生物学性能为有用的。

实例7：包含各自根据式(X)的E和E'部分的本发明的缀合物在体外基因沉默中的生物学性能

研究目的：

评价本发明的缀合物[Cn-1-(X)]，即具有各自根据式(X)并且连接到25/27个核苷酸的Dicer底物双链体的E和E'部分的dsiRNA的体外生物学性能，被设计成使EGFP基因沉默。

方法：

缀合物[Cn-1-(X)]-EGFP-dsiRNA的结构如下：

EGFP-dsiRNA的序列、Hela和3T3细胞两者的细胞培养以及处理方案均如实例5中所述。使用Infinite M200-Pro Multimode Reader(帝肯)对EGFP荧光强度进行定量，激发波长为488nm，发射波长为535nm。未处理的细胞用作对照。实验以一式三份进行，结果呈现为平均值±SD，组间差异通过双尾t测试评估，并且统计学显著性被定义为p<0.05。

结果：

[Cn-1-(X)]-EGFP-dsiRNA缀合物诱导EGFP表达的有效敲低，如下所示：

在Hela细胞中：在血清的存在下，600nM的缀合物将EGFP表达降低至对照的76％±2(平均值+SD)。在无血清条件下，当细胞分别用10、40和150nM的缀合物处理时，EGFP表达的稳健敲低由缀合物以剂量依赖性方式诱导，其中EGFP表达被降低至对照的57.4％±4.8％；32.1％±5.0％；和15.9％±4.2％(在所有组间比较中p<0.001)。

在3T3细胞中：在无血清条件下，当细胞分别用10、40和150nM的缀合物处理时，EGFP表达的显著敲低由缀合物以剂量依赖性方式诱导，其中EGFP表达被降低至对照的91％±2.0％；50.0％±5.0％；和27％±4.0％(在所有组间比较中p<0.001)。

结论：

本发明的缀合物[Cn-1-(X)]-EGFP-dsiRNA为用于将大分子dsiRNA构建体跨越磷脂膜递送到细胞中并且因此用于显著基因沉默的相应诱导的有效部分。

实例8：包含各自根据式(XI)的E和E'部分的本发明的缀合物在体外基因沉默中的生物学性能

研究目的：

评价本发明的缀合物[Cn-1-(XI)]，即具有各自根据式(XI)并且连接到25/27个核苷酸的Dicer底物双链体的E和E'部分的dsiRNA的体外生物学性能，被设计成使EGFP基因沉默。

方法：

缀合物[Cn-1-(XI)]-EGFP-dsiRNA的结构如下：

在Hela细胞中进行研究。EGFP-dsiRNA的序列、细胞培养以及处理方案均如实例5中所述。使用Infinite M200-Pro Multimode Reader(帝肯)对EGFP荧光强度进行定量，激发波长为488nm，发射波长为535nm。未处理的细胞用作对照。实验以一式三份进行，结果呈现为平均值±SD，组间差异通过双尾t测试评估，并且统计学显著性被定义为p<0.05。

结果：

[Cn-1-(XI)]-EGFP-dsiRNA缀合物诱导EGFP表达的有效敲低，如下所示：在血清的存在下，600nM的缀合物将EGFP表达降低至对照的83％±4(平均值±SD)。在无血清条件下，当细胞分别用10、40和150nM的缀合物处理时，EGFP表达的显著敲低由缀合物以剂量依赖性方式诱导，其中EGFP表达被降低至对照的55.2％±10％；34.5％±8％；和15.9％±4.2％(在所有组间比较中p<0.01)。

结论：

本发明的缀合物[Cn-1-(XI)]-EGFP-dsiRNA为用于将大分子dsiRNA构建体跨越磷脂膜递送到细胞中并且因此用于显著基因沉默的相应诱导的有效部分。

实例9：具有多种E、E'和E”部分的本发明的(Cn-1)和(Cn-2)缀合物在体外使EGFP 基因的表达沉默时的生物学性能。

研究目的：

评价由本发明的各种缀合物在体外发挥的基因沉默，所述缀合物具有多种E、E'或E”部分，它们都与通式(I)和(II)相关，由此举例说明式(I)和(II)作为一般的统一结构基序，其使得能够将dsiRNA跨越磷脂膜跨膜递送到细胞中，从而发挥生物活性。

方法：

在培养的3T3细胞上进行研究，并且在与本发明的各种缀合物一起孵育后评估EFGP基因的沉默。研究的方法如以上实例5-8所述。孵育进行72小时，其中在前24小时期间在没有血清的情况下进行孵育，此后添加10％的血清。在所有评价中，缀合物的浓度为40nM或150nM。如以上实例中所述，经由ELISA通过测量蛋白质的荧光来评估EGFP表达。在作为对照的未处理的细胞中也测量EGFP表达。被评估的本发明的E部分为(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII-M)、(IX)。如上所述，所有这些部分均与通式(II)有关。另外，合成6个对照E部分并且将其缀合到dsiRNA用于使EGFP基因沉默。对照部分(表3)的结构特征类似于根据通式(II)构建的E部分。然而，它们缺乏与关键结构式(II)的完全一致。

结果：

结果呈现于下表1、2和3中。

表1：缀合物浓度40nM：

表2：缀合物浓度150nM：

表3：缀合物具有对照E部分；在至多400nM的缀合物浓度下检查：

结果汇总：

如表1和表2呈现，所有结构符合通式(I)和(II)的缀合物，尽管具有各种缀合物骨架和E部分，但在检查的纳摩尔浓度(40和150nM)下，仍表现出检查的基因EGFP的稳健沉默。相比之下，所有对照缀合物(表3)都没有表现出基因沉默，即使在以相对高的浓度(至多400nM)下进行测试时。

结论：

由此，此性能曲线支持这样的概念：根据式(I)和(II)的缀合物具有通用和特征性的结构基序，这使得能够将大分子OD跨越磷脂膜有用地递送到细胞中，从而具有有用的生物学性能(在这种情况下，基因沉默)。

实例10：包含各自根据式(VIII-M)的E部分的本发明的缀合物在体外基因沉默中的生物学性能；剂量/响应研究，以及(Cn-1)和(Cn-2)缀合物的比较分析：

研究目的：

评价本发明的缀合物[Cn-1-(VIII-M)]和[Cn-2-(VIII-M)]，即分别具有2个或3个E部分的dsiRNA的体外生物学性能，每个E部分根据式(VIII-M)并且连接到25/27个核苷酸的Dicer底物双链体，被设计成使EGFP基因沉默。

方法：

细胞培养：

3T3细胞系获自细胞生物实验室。使每种细胞类型的细胞在补充有10％的FBS(吉毕科公司)、100U/ml的青霉素100mg/ml的链霉素(以色列的生物工业公司)和10μg/ml的杀稻瘟素的杜氏改良伊格尔培养基(吉毕科公司)中生长。将细胞维持在具有5％的CO2加湿空气的37℃的孵育箱中。在转染前一天，将细胞接种(40,000个细胞/孔)在24孔黑色板玻璃底部上。第二天，细胞开始用缀合物[Cn-1-(VIII-M)]或缀合物[Cn-2-(VIII-M)]孵育48小时，浓度为1nM、2nM、5nM、10nM和40nM，其中前24小时在无血清的Opti-MEM培养基(赛默飞世尔科技)中孵育，接着在包含10％的血清的培养基中再孵育24小时。转染后48小时测量蛋白表达的下调。为此目的，吸出培养基，并且将细胞用HBSS洗涤。

RNA提取和qRT-PCR：

根据制造商的说明，使用PureLink RNA迷你试剂盒(英杰公司)提取总RNA。使用infinite M200-Pro Multimode Reader(帝肯)定量RNA。RNA用高容量cDNA逆转录试剂盒(美国应用生物***公司)逆转录，并且ApoC3 mRNA表达用Syber qRT-PCR程序测量，将其标准化为β-肌动蛋白(Step-one-Plus，美国应用生物***公司)。

结果：

如图5所示，缀合物[Cn-1-(VIII-M)]和缀合物[Cn-2-(VIII-M)]两者诱导EGFP基因表达的稳健沉默，如对于体外3T3细胞所评估的。观察到明显的剂量/响应，具有高度显著的对数衰减，对两种细胞系用R²≈0.97曲线拟合。对于具有2个E部分的缀合物[Cn-1-(VIII-M)](虚线)，IC₅₀发现为2.2nM，而对于具有3个E部分的缀合物[Cn-2-(VIII-M)](实线)，IC₅₀发现为0.8nM(图5)。

结论：

如对以下两种缀合物的检查：缀合物[Cn-1-(VIII)]-EGFP和缀合物[Cn-2-(VIII-M)]，本发明的缀合物发挥稳健的基因沉默，如经由RNA水平的测量所评估的，具有非常低的IC₅₀值。有趣的是，与包含两个E部分的缀合物相比，包含三个E部分[CN-2-(VIII-M)]的缀合物在基因沉默中表现出更高的效力，由较低的IC₅₀值反映(0.8对2.2nM)。此观察结果支持这样的概念：本发明的递送***表现出积极的协同效应，其中每个E部分都有助于并且增强缀合物在基因沉默中的整体性能。

Claims

1.一种缀合物，其具有如式(I)中所阐述的结构：

包括由所述如式(I)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：

E、E'或E”可能相同或不同，各自独立地具有如通式(II)中所阐述的结构：

包括由所述如式(II)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中：

M₁、M₂、M₃、M₄各自分别选自由以下组成的组：N'、N”、不存在、醚、酰胺、酯、硫醚和硫酯；其中N'和N”各自独立地选自由以下组成的组：-N(CH₃)-、-NH-和-N(X)-；其中X为胺的保护基团；M₁、M₂、M₃、M₄可能相同或不同；N'、N”可能相同或不同；

G₁、G₂、G₃、G₄各自独立地代表氢原子或甲基；G基团可能相同或不同；G₁、G₂、G₃或G₄基团中的至少两个为氢原子；

a、b、c、d、e为各自独立地选自由以下组成的组的整数：0、1、2、3、4、5或6，其中0＝不存在；a、b、c、d、e可能相同或不同；

g代表选自以下的整数：0、1、2、3、4或5；

E、E'或E”能够连接到由以下组成的组的任何部分：D；如本文所定义的保护基团(例如，醇的保护基团)；选自由以下组成的组的R或R'基团：氢、磷酸酯基团、硫酸酯基团或羧基基团；和固体支撑物。在本发明的上下文中，E、E'或E”部分能够经由一个或多个点连接到一个D部分；并且W能够同时连接到D和R或R'两者。

2.根据权利要求1所述的缀合物，其中g为0、1或2的整数。

3.根据权利要求1所述的缀合物，其中c和d各自独立地代表1、2或3的整数；c和d可能相同或不同。

4.根据权利要求1所述的缀合物，其中L为二氟苄胺。

5.根据权利要求1所述的缀合物，其中G₁、G₂、G₃、G₄全部为氢原子。

6.根据权利要求1所述的缀合物，其中X为TEOC[氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯]或Fmoc。

7.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(III)中所阐述的结构：

包括由所述如式(III)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与权利要求1中定义的相同的含义。

8.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(IV)中所阐述的结构：

包括由所述如式(IV)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

9.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(V)中所阐述的结构：

包括由所述如式(V)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中N'和N”各自独立地具有与权利要求1中定义的相同的含义。

10.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VI)中所阐述的结构：

包括由所述如式(VI)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中N'和N”各自独立地具有与权利要求1中定义的相同的含义。

11.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VII)中所阐述的结构：

包括由所述如式(VII)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中N'和N”各自独立地具有与权利要求1中定义的相同的含义。

12.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VIII)中所阐述的结构：

包括由所述如式(VIII)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；

其中N'具有与权利要求1中相同的含义。

13.根据权利要求12所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VIII-H)中所阐述的结构：

包括由所述如式(VIII-H)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

14.根据权利要求12所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VIII-M)中所阐述的结构：

包括由所述如式(VIII-M)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

15.根据权利要求12所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(VIII-F)中所阐述的结构：

包括由所述如式(VIII-F)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；

其中X为胺的保护基团。

16.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(IX)中所阐述的结构：

包括由所述如式(IX)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与权利要求1中相同的含义。

17.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(X)中所阐述的结构：

包括由所述如式(X)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与权利要求1中相同的含义。

18.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XI)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XI)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与权利要求1中相同的含义。

19.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XII)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XII)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中p、q、k、g各自独立地代表0、1、2、3、4、5或6的整数，其中0意指不存在；p、q、k、g可能相同或不同；Z选自由以下组成的组：不存在、-O-和N”；其中N'和N”各自具有与权利要求1中相同的含义。

20.根据权利要求19所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIIa)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XIIa)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；

其中q为0或1的整数；并且N'具有与权利要求1中相同的含义。

21.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIII)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XIII)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中a、b、c、d、e各自独立地代表0、1、2或3的整数，其中0意指不存在；a、b、c、d和e可能相同或不同；Q选自由以下组成的组：不存在和-O-；N'具有与权利要求1中相同的含义。

22.根据权利要求21所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIIIa)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XIIIa)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中a为1或2的整数；N'具有与权利要求1中相同的含义。

23.根据权利要求1所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIV)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XIV)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中p和q各自独立地为0、1、2、3、4、5或6的整数；p和q可能相同或不同；N'具有与权利要求1中相同的含义。

24.根据权利要求23所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIV-H)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XIV-H)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

25.根据权利要求23所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIV-M)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XIV-M)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

26.根据权利要求23所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XIV-F)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XIV-F)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物，其中X为胺的保护基团。

27.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述L部分为二氟苄胺；并且因此E、E'或E”具有如式(XV)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XV)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与权利要求1中相同的含义。

28.根据权利要求27所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XV-H)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XV-H)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

29.根据权利要求27所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XV-M)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XV-M)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

30.根据权利要求27所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XV-F)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XV-F)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；

其中X为胺的保护基团。

31.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述L部分为四氟苄胺；并且因此E、E'或E”各自具有如式(XVI)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XVI)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中N'具有与式(II)中相同的意义。

32.根据权利要求31所述的缀合物，其中所述L部分为四氟苄胺；并且因此E、E'或E”各自具有如式(XVIH)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XVI-H)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

33.根据权利要求31所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XVI-M)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XVI-M)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

34.根据权利要求31所述的缀合物，其中E、E'或E”具有如式(XVI-F)中所阐述的结构：

包括由所述如式(XVI-F)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；其中X为胺的保护基团。

35.一种前体分子，其包含连接到醇和/或胺的保护基团的根据权利要求1所述的任何E、E'或E”；包括相应的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物、所述盐的溶剂化物和水合物。

36.根据权利要求35所述的前体分子，其包含连接到二甲氧基三苯甲基[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMT)和亚磷酰胺的根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34中任一项所述的E、E'或E”部分。

37.根据权利要求35所述的前体分子，其具有如式(VIII-F)-前体中所阐述的结构：

包括由所述如式(VIII-F)-前体中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

38.根据权利要求35所述的前体分子，其具有如式(VIII-M)-前体中所阐述的结构：

包括由所述如式(VIII-M)-前体中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

39.根据权利要求35所述的前体分子，其具有如式(XIV-F)-前体中所阐述的结构：

包括由所述如式(XIV-F)-前体中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

40.根据权利要求35所述的前体分子，其具有如式(XIV-M)-前体中所阐述的结构：

包括由所述结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

41.根据权利要求35所述的前体分子，其具有如式(XV-F)-前体中所阐述的结构：

包括由所述如式(XV-F)-前体中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

42.根据权利要求35所述的前体分子，其具有如式(XV-M)-前体中所阐述的结构：

43.根据权利要求35所述的前体分子，其具有如式(XVI-F)-前体中所阐述的结构：

包括由所述如式(XVI-F)-前体中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

44.根据权利要求35所述的前体分子，其具有如式(XVI-M)-前体中所阐述的结构：

45.根据权利要求1所述的缀合物，其包含连接到药物的根据式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个的E、E'或E”部分。

46.一种药物组合物，其包含根据权利要求45所述的缀合物和药学上可接受的盐或载体。

47.根据权利要求45所述的缀合物，其中D为寡核苷酸药物(OD)，包括相应缀合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物。

48.根据权利要求47所述的缀合物，其中所述OD为Dicer底物，其为24和27个核苷酸的RNA双链体、25和27个核苷酸的RNA双链体，或27和27个核苷酸的RNA双链体。

49.根据权利要求47所述的缀合物，其组成选自以下选项：(i).所述OD连接到单个E、E'或E”部分；(ii).所述OD连接到两个相同或不同的E部分；(iii).所述OD连接到三个相同或不同的E部分；(iv).所述OD连接到几个(n>3)相同或不同的E部分；并且其中对于每个缀合物，E、E'或E”部分也能够连接到R或R'部分，每个都根据权利要求1中所定义。

50.根据权利要求47所述的缀合物，其中所述OD为siRNA或dsiRNA，所述siRNA或dsiRNA在沿寡核苷酸链的内部位置处包含至少一个E部分；所述内部位置为所述寡核苷酸链的位置#12或位置#14，所述E部分替代相应的核苷酸或者添加到核苷酸序列。

51.根据权利要求47所述的缀合物，其具有如下式(Cn-1)或(Cn-2)中的任一个中所阐述的结构，所述结构包含各自具有所述如式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个中所阐述的结构的E、E'或E”部分：

包括所述相应缀合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，其中R和R'各自根据权利要求1中所定义。

52.根据权利要求47所述的缀合物，其中所述OD为具有如式(Cn-3)中所阐述的结构的反义寡核苷酸(ASO)；其中T和T'各自独立地选自不存在和由以下组成的组：1',2'-二脱氧核糖、核苷酸或其组合；T和T'可能相同或不同；R和R'部分具有与权利要求1中定义的相同的含义：

包括由所述如式(Cn-3)中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物；

53.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(VIII-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(VIII-H)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-1-(VIII-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

54.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(VIII-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(VIII-M)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-1-(VIII-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

55.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(VIII-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(VIII-H)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-2-(VIII-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

56.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(VIII-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(VIII-M)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-2-(VIII-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

57.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XV-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(XV-H)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-1-(XV-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

58.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XV-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(XV-M)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-1-(XV-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

59.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XV-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(XV-H)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-2-(XV-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

60.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XV-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(XV-M)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-2-(XV-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

61.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XVI-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(XVI-H)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-1-(XVI-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

62.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XVI-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-1-(XVI-M)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-1-(XVI-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

63.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XVI-H)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(XVI-H)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-2-(XVI-H)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

64.根据权利要求51所述的缀合物，其中R和R'各自为磷酸酯基团；并且E和E'各自根据式(XVI-M)，所述缀合物具有如下式[Cn-2-(XVI-M)]中所阐述的结构：

包括由所述如式[Cn-2-(XVI-M)]中所阐述的结构表示的化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和金属螯合物，以及所述盐的溶剂化物和水合物。

65.一种用于将药物递送到生物细胞中的方法，其中所述细胞在培养物中或在活体动物或人类受试者中；所述方法包含使所述细胞与根据权利要求45所述的缀合物接触或与根据权利要求46所述的药物组合物接触。

66.一种用于跨越磷脂膜递送药物的方法，其包含将所述药物与根据式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(VIII-H)、(VIII-M)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIIa)、(XIII)、(XIIIa)、(XIV)、(XIV-H)、(XIV-M)、(XV)、(XV-H)、(XV-M)、(XVI)、(XVI-H)、(XVI-M)中的任一个的E、E'或E”部分缀合，以及使所述缀合物与所述磷脂膜接触。

67.一种用于医治医学病症的方法，所述方法包含向有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求46所述的药物组合物。

68.一种用于在磷脂膜中诱导胞吞和/或翻转的方法；所述方法包含使所述膜与本发明的缀合物中的任一种接触。