CN111607661B - 基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用 - Google Patents

基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用，本发明的引物是针对油茶转录组hAT转座子设计的，设计出来的7对引物具有较高的多态信息含量(PIC)，有良好的多态性，能对油茶品种进行良好区分，本申请印证了利用普通油茶开发hAT转座子标记的可行性，并对普通油茶、越南油茶、香花油茶三个品种的油茶进行遗传多样性分析，不仅能为油茶提供新颖优质的分子标记，也为油茶的分子改良奠定良好基础可为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新引物。

Description

基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用
【技术领域】
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用。
【背景技术】
油茶主要种植在南方亚热带地区，于南方的17个省丘陵地区广泛分布，广西的油茶种植面积、年产量和产业总产值都位于全国第三。我国油茶种植范围广，面积大。但是产量却长期处于低下的状况，其原因包括良种少、水平低、种质资源杂乱等等，根本原因为缺乏良种。虽然在我国研究人员长期的共同努力下，已经取得了很多明显成果，但对油茶品种的改良依旧存在着很多问题。一般而言，遗传育种的方法可以分为常规育种和分子育种两种。分子育种具有育种周期较短、效率高、成本低、针对性强等的优点，促进了油茶产业的快速发展，所以分子育种为改良油茶品种的首要选择方法。目前使用较多的分子标记包括：RAPD，AFLP，ISSR，SRAP和SSR等。然而RAPD的重复性差，AFLP技术操作较为复杂而且对于实验操作人员和实验设备等有较高的要求，ISSR、SRAP存在多态性不丰富的缺点。SSR虽然是共显性分子标记，但是其扩增产物大小相近，容易造成误判。
转座子是一类可移动元件，广泛分布在植物基因组中，其分为Ⅰ型转座子(ClassⅠelements)和Ⅱ型转座子(ClassⅡelements)以及Helitron转座子三大类。Ⅰ型转座子又称为反转座子(retrotransposn)，其在植物的基因组中最为常见。Ⅱ型转座子又叫DNA转座子，DNA转座子是一类转座过程由DNA介导，通过“剪切—粘贴”进行转座的可移动元件。其优点有拷贝数较多、***位点的多态性丰富，适宜用于开发分子标记。而数量比较多的DNA转座子为CACTA、hAT(hobo,Activator and Tam3)以及Mutator-like element(MULE)超家族。其中真核生物中普遍有hAT转座子存在，一些低等植物和无脊椎动物(如果蝇hobo、玉米Ac、金鱼草)中的转座元件具有转座活性，已经被用作高效优质的遗传多样性分析工具。hAT转座子中玉米Ac转座子最先被发现，hAT转座子的特征为：在转座过程中会产生8bp的靶位点重复，大部分hAT转座子的大小都小于4kb，有5-27bp的短反向末端重复。hAT转座子标记为共显性标记，能检测复等位基因，可以将纯合子和杂合子区分开来，重复性好，易于判断读取，可以获得完整的遗传信息，在遗传多样性检测中更具备优势，因此开发共显性的、扩增稳定的优质的普通油茶hAT分子转座子标记，更有利于油茶遗传多样性的研究。
目前还未发现有将hAT转座子应用在油茶方面，所以对转座子的深入了解，对促进油茶遗传育种的理论和技术发展都有很重要的作用。故本研究利用普通油茶已有转录组分析hAT转座子类型及其数量，开发出基于hAT转座子的分子标记，并在普通油茶种质资源库中验证所开发的hAT转座子是否可行。为后续开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的引物。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用，该引物组是基于hAT转座子应用开发的分子标记，该分子标记引物组具有具有拷贝数多，重复性较好，容易产生丰富的遗传多样性、开发的引物具有高度多态性(PIC>0.7)。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组，所述分子标记引物组为下述引物中的任意1对：
CohAT8上游引物：5’-AAACGCAATGTTTGTGAGCA-3’；下游引物：5’-ATTGGAGATTGTCGCTGGAG-3’；
CohAT13上游引物：5’-TGGACTAGTGTCCGTGTTCG-3’；下游引物：5’-GGGGATTGAGTTGCAAGGTA-3’；
CohAT14上游引物：5’-CCAATGAAACTGCCAAACAA-3’；下游引物：5’-GGGGCAGATATGAAGGACAA-3’；
CohAT32上游引物：5’-TACCTCCATGGCTTTGATCC-3’；下游引物：5’-GCGCTTCCTACTTCATTTGC-3’；
CohAT45上游引物：5’-GTTGCACTTGGTGGAAGGTT-3’；下游引物：5’-GACCTGTCCGATCTTTTTGC-3’；
CohAT53上游引物：5’-GTCAGGGGAGGTCCATGTAA-3’；下游引物：5’-GACGATCCTTGTCCCTTGAA-3’；
CohAT56上游引物：5’-GCAAGAATGGGAATGCTGAT-3’；下游引物：5’-TCTCCACCATCTCCGCTAAC-3’。
进一步的，所述引物组能对不同的油茶品种进行聚类分析。
进一步的，所述油茶品种为普通油茶、越南油茶、香花油茶
本发明还包括一种基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组的构建方法，所述方法包括提取普通油茶的基因组DNA、对DNA进行测序、对测序完成的DNA序列进行质量检测、提取含有hAT转座元件的序列、根据hAT转座子两端的保守区域合成相应引物、用引物对不同品种的油茶进行扩增，选取具有特异性的引物构建引物组。
进一步的，所述对测序完成的DNA序列进行质量检测的方法为检测N50，N90，GC含量，N含量等信息评估测序质量，选取测序质量高的转录组；去除接头，低质量序列和不确定的碱基；对修剪过的转录组进行组装、延伸。
进一步的，所述引物对不同品种的油茶进行扩增时的PCR反应体系为：ddH2O 3.6μl，2×Taq的PCR Master Mix 5μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，DNA模板1μl；PCR扩增程序为：预变性95℃4min；变性95℃45s，退火60℃45s，延伸72℃45s，33个循环；复性72℃7min；4℃下保存。
本发明还包括基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组的应用，该引物用于检测不同油茶品种的亲缘关系及遗传多样性。
本发明具有如下有益效果：
本发明的引物是针对油茶转录组hAT转座子设计的，设计出来的7对引物具有较高的多态信息含量(PIC)，有良好的多态性，能对油茶品种进行良好区分，本申请印证了利用普通油茶开发hAT转座子标记的可行性，并对普通油茶、越南油茶、香花油茶三个品种的油茶进行遗传多样性分析，不仅能为油茶提供新颖优质的分子标记，也为油茶的分子改良奠定良好基础可为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新引物。
【附图说明】
图1是本发明实施例中油茶的聚类分析图；图中，三角形代表普通油茶品种，方形代表香花油茶，圆形代表越南油茶；
图2是本发明实施例中对油茶亚群进行分析的LnP(D)值曲线图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
一、样品：
本实验所用的样品均来自广西，其中普通油茶来自广西柳州三门江林场，越南油茶来自自广西崇左凭祥县、宁明县，其标记为：鸿鹄分场-桃花岛(T)、马垌村三堂屯(S)、马垌村弄章屯(N)。香花油茶来自广西南宁，标记为XH。共选取具有代表性的不同品种油茶109份进行分析，其中普通油茶25份，越南油茶42份，香花油茶42份。
采集方法：采取人工采摘的方式，从油茶树上采摘1-2片新鲜的叶子，放入自封袋内，做好相应的编号标记。置于实验室-20℃冰箱存放。在本实验中，所采取的新鲜叶子都将作为提取油茶基因组DNA的供试材料。
二、实验仪器：
研磨机、电热恒温水浴锅、高速冷冻离心机、超纯水***、移液枪、PCR仪、稳压稳流电泳仪、电子天平、水平摇床、胶片观察灯。
三、实验药品：
氯仿、NaCl、过硫酸铵、5×TBE、EDTA和Tris、10％AP、TEMED、丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺、硼酸、β-巯基乙醇、硝酸银、氢氧化钠、甲醛、2×Taq PCR Master Mix、液体石蜡。以上所有试剂均为分析纯等级以上。
四、实验软件：
Aspera、FastQC、Trimmonatic、Trinity、RepeatMolder、RepeatMasker、tbtools、Primer3.0
五、实验步骤：
(一)获取油茶转录组数据：
利用Aspera软件从数据库中下载普通油茶转录组的相关数据。利用FastQC软件对测序数据进行质量检测，检测N50，N90，GC含量，N含量等信息评估测序质量，选取测序质量高的转录组；再利用Trimmonatic软件去除接头，低质量序列(Q<13)和不确定的碱基；利用Trinity软件对修剪过的转录组进行组装得到Scanfold，进一步利用cd-hit-est进行延伸。
(二)搜索转座子信息并筛选hAT转座子：
Repeatmasker软件直接在repbase数据库中搜索转座子。RepeatMolder软件根据转座子的定义分析产生一个数据库，把结果合并。用“hAT”作为关键词提取含有hAT的转座子的序列号并转成文本，将文本放入tbtools，提取含有hAT转座元件的序列。
(三)引物设计：
根据hAT转座子两端的保守区域，使用Primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在线对符合条件的hAT转座子序列设计引物。设计引物的主要参数为：(1)引物长度为20～24bp；(2)产物大小为300～500bp；(3)退火温度(Tm值)为60℃左右。最终共设计出60对引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(四)基因组DNA的提取：
取出适量普通油茶的新鲜叶片于液氮中快速粉碎成粉末，用于提取基因组DNA。本实验普通油茶基因组DNA提取步骤参照Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒，提取109个油茶样本叶片基因组DNA。
(五)引物多态性筛选及群体扩增：
抽取6个随机的油茶DNA样品为模板，将上述合成的60对CohAT引物，分别应用于模板上，经过PCR扩增和电泳后，从中筛选出条带清晰、扩增稳定、具有多态性的引物对，最终得出具有良好多态性的引物对如表2所示。
上述PCR扩增体系为：ddH2O 3.6μl，2×Taq的PCR Master Mix 5μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，DNA模板1μl；
上述PCR扩增程序为：预变性95℃4min；变性95℃45s，退火60℃45s，延伸72℃45s，33个循环；复性72℃7min；4℃下保存。
(六)数据读取及分析：
将上述PCR扩增反应后进行凝胶电泳检测，之后进行人工读带、记录。选择条带清晰、多态性好的两个位点进行读数，对位点的数值进行大约的估算，缺失值用-9代替。
利用Powermaker V3.25里的summary statistics计算出普通油茶群体的基因多样性(Gene diversity)、杂合度(Heterozygos)和多态信息含量指数(PolymorphismInformation Content，PIC)。再用computer frequnency计算出样本间的遗传距离。用邻接进行聚类分析，构建邻接树(Neighbor-joining tree)，最后利用MEGA6.06(MolecularEvolutionary Genetics Analysis)软件绘制聚类图。
再利用Structure 2.3.4软件分析油茶群体的遗传结构，计算每个个体基因组变异来源于特定群体的概率值Q，对油茶群体进行亚群划分；先把亚群数目K设为2-10，并假定所有位点均为独立位点，将MCMC开始时的不作数迭代设为10,000，再将不作数迭代油茶的MCMC设为100,000，然后根据似然数最大原则选取适合的K值，即为可能的亚群数目。
实验结果：
利用随机选取6份油茶DNA作为PCR扩增的模板，利用60对hAT引物进行扩增，筛选引物的多态性。其中35对引物无条带，25对引物有条带。
表1引物类型
Figure BDA0002561093750000061
Figure BDA0002561093750000071
由表1可知，25对有条带的引物中，其中20对引物都为hAT-Tag1类，5对引物为hAT-Ac类(如表1)，hAT-Tag1类占比为80％，说明在普通油茶转录组hAT转座子中hAT-Tag1这类转座子更适于作为分子标记。
从上述25对引物中选取多态性良好的7对引物进行扩增，具体如表2所示(SEQ：NO：1-14)
表2具有良好多态性的7对引物对
引物名称 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’) 序列表位置
CohAT8 AAACGCAATGTTTGTGAGCA ATTGGAGATTGTCGCTGGAG SEQ：NO：1-2
CohAT13 TGGACTAGTGTCCGTGTTCG GGGGATTGAGTTGCAAGGTA SEQ：NO：3-4
CohAT14 CCAATGAAACTGCCAAACAA GGGGCAGATATGAAGGACAA SEQ：NO：5-6
CohAT32 TACCTCCATGGCTTTGATCC GCGCTTCCTACTTCATTTGC SEQ：NO：7-8
CohAT45 GTTGCACTTGGTGGAAGGTT GACCTGTCCGATCTTTTTGC SEQ：NO：9-10
CohAT53 GTCAGGGGAGGTCCATGTAA GACGATCCTTGTCCCTTGAA SEQ：NO：11-12
CohAT56 GCAAGAATGGGAATGCTGAT TCTCCACCATCTCCGCTAAC SEQ：NO：13-14
对表2的7对引物对利用PowerMarker V3.25进行遗传多样性分析，结果如表3所示：
表3遗传多样性信息
标记名称 等位基因数目 观测数 基因多样性 多态信息含量(PIC) 杂合度
CohAT8 12 109 0.8381 0.8202 0.8257
CohAT13 16 109 0.8542 0.8390 0.8532
CohAT14 12 109 0.7302 0.7028 0.6147
CohAT32 37 109 0.9219 0.9178 0.6697
CohAT45 34 109 0.9346 0.9309 0.7156
CohAT53 13 109 0.8604 0.8464 0.9266
CohAT56 14 109 0.8977 0.8888 0.1193
Mean 19.7143 109 0.8624 0.8494 0.6750
由表3可知，7对CohAT引物共测出138个等位基因，每对引物12～37个，平均每对19个。CohAT45的基因多样度和多态信息含量均是最高的，分别为0.9346和0.9309，这就表明其遗传多样性是最高的。反之，CohAT14的基因多样度和多态信息含量最低，分别为0.7302和0.7028，则说明其遗传多样性最低。7对引物的平均PIC值为0.8494，PIC高则表示引物的多态性丰富，CohAT45的PIC值最高为0.9309，则其多态性最为丰富；CohAT14的PIC值最低为0.7028，其多态性最为匮乏。本研究的平均观测杂合度为0.6750，可以反映出普通油茶的杂合度较高，这说明普通油茶易于进行杂交，产生优良品种。
聚类分析：
根据扩增条带分析结果，利用Powermarker V3.25计算油茶个体间的遗传距离，并对其进行聚类分析；聚类分析图如图1所示：
从图1中可以看出109份样本分为四类，大部分可以较好的按照品种形成聚类分支；这109份样本间的遗传距离范围为0.1429～1.0000平均值为0.7963。样品和样品之前的遗传距离位点共有5885个，其中两样品之间遗传距离最大的共有628个，如15-53-1和18-90-3、15-54-4和17-74-3等等，两个样品之间遗传距离最小的共有7个，如XH-13和XH-14、XH-21和XH-22。
聚类图说明有三个分支都是来自于同一个品种，但也可以看出有个分支没用很好的按品种形成聚类，各个品种均有，从而形成了比较复杂的遗传关系。从而可以说明目前广西油茶资源处于一个比较混乱的状况。同时由于油茶类植物分类比较混乱，油茶种质资源库中的部分材料(如T-4)可能为香花油茶。
对类群进行群体结构分析：
采用Structure进行群体结构分析，如图2所示：油茶群体的等位变异频率特征类型数目K＝9时，其后LnP(D)最大为-4146.3，故可直接采用K＝9，所以油茶群体应划分为9个亚群。
表4样本标号及亚群分类
Figure BDA0002561093750000081
Figure BDA0002561093750000091
基于表4亚群划分的基础上，对油茶亚群间的遗传距离进行分析得到的结果如表5所示：
表5亚群间的遗传距离
Figure BDA0002561093750000092
由表5可知，亚群4和亚群6的遗传距离最大为0.2326。亚群5和亚群7的遗传距离最小为0.0458。群体4、9均为香花油茶，群体3、6、7均为普通油茶，群体1、2、5、8为越南油茶。而群体1和群体7中均有一个样品为香花油茶，这说明普通油茶、越南油茶和香花油茶可能存在少量的基因交流。
综上所述，本申请引物具有良好的多态性，该引物具有高多态信息含量(PIC)；能对油茶品种进行良好区分，可为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新引物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北部湾大学
<120> 基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaacgcaatg tttgtgagca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attggagatt gtcgctggag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggactagtg tccgtgttcg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggattgag ttgcaaggta 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaatgaaac tgccaaacaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggggcagata tgaaggacaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tacctccatg gctttgatcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcgcttccta cttcatttgc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttgcacttg gtggaaggtt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacctgtccg atctttttgc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtcaggggag gtccatgtaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacgatcctt gtcccttgaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcaagaatgg gaatgctgat 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tctccaccat ctccgctaac 20

Claims (2)

1.基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组，其特征在于，所述分子标记引物组如下：
CohAT8上游引物：5’-AAACGCAATGTTTGTGAGCA-3’；下游引物：5’-ATTGGAGATTGTCGCTGGAG-3’；
CohAT13上游引物：5’-TGGACTAGTGTCCGTGTTCG-3’；下游引物：5’-GGGGATTGAGTTGCAAGGTA-3’；
CohAT14上游引物：5’-CCAATGAAACTGCCAAACAA-3’；下游引物：5’-GGGGCAGATATGAAGGACAA-3’；
CohAT32上游引物：5’-TACCTCCATGGCTTTGATCC-3’；下游引物：5’-GCGCTTCCTACTTCATTTGC-3’；
CohAT45上游引物：5’-GTTGCACTTGGTGGAAGGTT-3’；下游引物：5’-GACCTGTCCGATCTTTTTGC-3’；
CohAT53上游引物：5’-GTCAGGGGAGGTCCATGTAA-3’；下游引物：5’-GACGATCCTTGTCCCTTGAA-3’；
CohAT56上游引物：5’-GCAAGAATGGGAATGCTGAT-3’；下游引物：5’-TCTCCACCATCTCCGCTAAC-3’；
所述引物组能对不同的油茶品种进行聚类分析；
所述油茶品种为普通油茶、越南油茶、香花油茶。
2.如权利要求1所述基于油茶转录组hAT转座子的分子标记引物组的应用，其特征在于，该引物用于检测不同油茶品种的亲缘关系及遗传多样性。
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